JP2010510785A - 転移物特異的ペプチドおよびそれらの診断および治療への適用 - Google Patents

Abstract

本発明は特にヒトの肝転移細胞を特異的に認識するペプチド配列に関する。本発明は核酸のコードを前記ペプチドに用いる使用、並びに前記ペプチドのコンジュゲートおよび配合物を診断および治療目的に用いる使用も含む。

Description

本発明の技術水準
本発明は腫瘍転移細胞、特に肝転移細胞に非常に特異的なペプチド、およびそれらの診断および治療分野における適用を含む。

本発明の技術的背景
腫瘍および転移
腫瘍形成はいくつかの細胞が悪性に向かって徐々に進行する多段階の過程である。新生物の分野における実際の知見は、癌がゲノムの動的な変化によって誘発される疾患であることを強調している。それらの変異を通して、腫瘍細胞は生物の生理学的機能を制御する様々な機構からの独立を獲得する。結果として、それらは（１）連続的に増殖すること、（２）新しい血管の形成のための内皮細胞の動員を誘発すること、および（３）元とは異なる器官に定着することが可能になる。

腫瘍細胞の増殖能は基本的に２つの機構に起因する。第一に、正常細胞が静態から動態に転換するために分裂促進因子が必要である一方、増殖細胞は腫瘍細胞において成長因子受容体の突然変異および／または過剰発現がリガンドの存在から独立して増殖カスケードを誘発し得る。さらには、多くの場合において、腫瘍細胞はそれらが感応性のある可溶性因子の合成能を獲得する。従って、自己分泌刺激が備わり、それがさらに該腫瘍の成長を強化する。腫瘍における細胞成長の脱調節の他の現象は、アポトーシス（プログラム細胞死）への耐性である。この機構、生理学的発現の間の成長および器官のリモデリングにおける基礎的な機構が誘発されて、不可逆性のゲノム損傷の場合においても異常細胞集団の拡大が回避される。しかしながら、いくつかの細胞はこの種の保護を回避して独立し、従って突然変異の伝搬およびその結果としての新生物の進行に好ましくなる。

原発腫瘍塊は少数の細胞で構成され、且つ適切な養分供給および酸素の支持によって持続しない限り、直径２ｍｍより大きく成長できない。これは脈管形成、既存の血管からの新しい毛細血管の形成が腫瘍細胞それ自身によって強く刺激されている段階である。脈管形成制御の正と負との信号間の不均衡は積極的に増殖している腫瘍塊を貫き且つ養分を供給する血管網の新形成をもたらす。腫瘍血管は、栄養物の供給と並んで、悪性細胞を体内の他の部位に向かって運搬する機能を有している。

腫瘍増殖は不可逆性の段階に向かって進行し、その典型的な特徴は転移である。この過程において、先駆細胞が原発腫瘍塊から逸脱する。腫瘍を満たす毛細管内に入った後、それらは血流に達し、該血流がそれらを誘発部位から離れた領域に運搬して、そこでそれらが二次腫瘍を生じさせる。

転移の発生は、器官の内因子（全般的な状況、免疫応答の完全性）と腫瘍細胞の特異的な特徴（局在化、サイズおよび組織学的パターン）との間の相互作用に関する複雑な生物学的事象を表す。微視的な原発部位からの腫瘍細胞の拡散は、最初は局地的で、遠心的な拡散に至る。細胞間の接続および細胞外基質を分解するプロテアーゼを生成することによって、腫瘍細胞はほとんど抵抗力のない解剖学的構造および組織（脂肪組織、神経鞘、骨髄）に浸潤する。

転移性の拡散に対する第一の障害物は、比較的不浸透性の構造、例えば器官被膜、軟骨あるいは骨膜、髄膜の存在によって提供される。それらの境界を越えて行くことの難しさゆえに、離れた部位における転移は以下のように要約される段階を経なければならない：（１）腫瘍毛細管網内に"血管内異物侵入"と呼ばれる機構によって入ること、（２）血流を通した輸送、（３）目的とする内皮の特異的認識、（４）毛細管から"血管外遊出"と呼ばれる機構によって抜け出すこと、および（５）活性の脈管形成によって支持される転移物の発現。

播種の成功は解剖学的特性、および宿主器官の血行力学因子、および腫瘍細胞が被る血管内の内皮との相互作用に依存する。最も一般的な拡散経路は、管（リンパ管および血管）および体腔の空隙である。リンパ管は基底板の不在ゆえに非常に容易に貫通される。従って、腫瘍細胞は容易にリンパ節内に移動し、その後、リンパの静脈接続を通って静脈系に入る。静脈浸潤がより一般的であったとしても、管内への移動は動脈系と静脈系との両方に影響し得る。なぜなら、静脈の循環が器官から放出された流束を収集するからである。典型的な例は肺への体静脈あるいは肝臓への門脈である。接種転移はその代わりに、胸の胸膜腔および腹部の腹膜腔および骨盤に関する。最も一般的に巻き込まれる部位は腹膜であり、そこでは肝静脈の閉塞に起因する液体の流入の後、腫瘍細胞が腹水中に集められる。胃、結腸、膵臓および卵巣癌は通常、この系を取る。

腫瘍転移細胞は、転移それ自身への様々な方法に寄与する特異的な分子決定因子を発現する。転移の分布は不規則ではなく、それぞれの腫瘍が優先的な宛先を有し、これは臓器向性として知られている。肝臓は結腸直腸腫瘍の標的器官であり、骨は前立腺および卵巣腫瘍の標的器官であり、肺は精巣、骨および乳腺腫瘍の標的器官である。肺および肝臓は、それらの濾過機能および非常に多数の毛細血管の存在ゆえに、事実上、全ての器官から転移を受け、且つ腫瘍コロニーを主に脳および骨に向かって送りもする。

肝臓は転移性病変の一般的な部位である。その理由は肝区域の機能的および構造的組織内を探らなければならない。血液を腹部の内臓に排出する門脈は、原発腫瘍由来の細胞を血流に乗って（ｖｅｉｃｕｌａｔｅｄ）肝臓に運ぶ導線を意味する。循環している腫瘍細胞の肝臓内皮への吸着は、転移初期の発症段階である。肝転移物はそれらの血栓細胞による肝実質の浸潤の結果として発生する。

大容積の肝血流（心血流の約２５％）および類洞の特定の顕微解剖学的構造は肝播種に好発する因子である。原発腫瘍は胃腸管、即ち結腸、直腸、胃、膵臓、胆道および腸に局在化し得る。それらに乳腺および肺の腫瘍も追加される。

結腸直腸腫瘍
一般に該疾患の進行性の展開を該腫瘍の身体浸潤の程度によって特徴付けられる段階に分割する様々な種類の分類法が存在する。臨床的研究の初期に提案されたＴｈｅ Ｄｕｋｅｓ ａｎｄ ＭＡＣ（修正アストラー・カラー）分類法は今ではあまり使用されていない。一般に、ＴＮＭ（腫瘍 リンパ節 転移）分類法が好ましく、それは４つの連続的な期：
・ Ｉ期：腫瘍が粘膜および粘膜下組織に限定されている
・ ＩＩ期：腸壁のより深い層に進展
・ ＩＩＩ期：漿膜（ｓｉｅｒｏｓａ）下およびリンパ節の浸潤
・ ＩＶ期：転移
を含む。

現在のところ、より一般的な治療方法は手術、化学治療および放射線治療である。臨床的な取り組みの種類は、病理がどの期にあるのかによって選択される。一般に、下記のプロトコル：
・ Ｉ期：手術（結腸造瘻術）
・ ＩＩ期：手術を化学治療と併用し得る
・ ＩＩＩ期： 手術を全ての場合で化学治療と併用する
・ ＩＶ期：手術および／または化学治療を用いた待機療法
を使用する。

肝臓は原発結腸直腸癌によって最も頻繁に転移増殖される部位である。現在、治癒の可能性のある唯一の治療は、転移物の手術による除去である。しかしながら、肝手術の方法が徐々に効果的になってきているのにもかかわらず、肝臓転移のあるほとんどの患者には、腫瘍塊の拡張のせいで手術を適用できない。

癌治療のための種々の方法：腫瘍血管の攻撃
現在使用されている化学治療薬剤は全医学分野の中で最も狭い治療ウインドウを有する薬剤内にある。結果として、投与される抗腫瘍薬剤の用量は正常細胞におよぼす有害な影響によって制限される。この難しさを、細胞毒薬剤に腫瘍自身を標的にさせることによって克服できる。癌生物学において、且つ腫瘍医学において、これが長年のゴールであるにしても、今のところ、薬剤の標的投与が可能だと知られている例はほんの少ししかない。例えば、腫瘍抗原に対する単クローン抗体の使用はわずかしか成功していない。なぜなら、わずかな腫瘍抗原のみが公知で、且つ一般に抗体は組織内に充分に侵入しないからである。さらには、腫瘍細胞は一般に不安定であり、且つ成長に有利な突然変異が累積するので、腫瘍細胞を標的とした治療は一般に耐性細胞のクローン選択によって追随される。

腫瘍血管網を標的にした治療は、従来の治療に関連する問題のいくつかを克服することを可能にする。腫瘍血管系内の内皮細胞は脈管形成の（ａｎｏｇｉｏｇｅｎｉｃ）血管に特異的な分子を発現する。血管の標的はいくつかの利点を提供する。第一に、内皮の内層は容易に接触可能である。それに対して、腫瘍を標的とした薬剤は長い距離を拡散し、きつく結合した腫瘍細胞内および非常に密な間質内に侵入する必要があり、非常に高い間質の圧力が対照をなしている。第二に、腫瘍細胞はその増殖を血液供給に依存しているので、血管に向けた腫瘍治療は全内皮細胞の破壊をもたらさないですむ。実際に、内皮標的治療は内因性の増幅機構を有している。最後に、内皮細胞は二倍体であり且つ形質転換されないので、それらが表面受容体の発現を緩める、あるいは突然変異およびクローン進化によって薬剤耐性を獲得することはありそうにない。いくつかの内皮マーカーが最近識別された。それらの分子の中には、いくつかのインテグリン、特にαｖβ３およびαｖβ５およびそれらと同源のリガンドを有する内皮チロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦ受容体および様々なＶＥＧＦ、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｉｅｔｉｎｓ））がある。

ヒト腫瘍のマウスモデルを標的にしたペプチド：腫瘍内皮マーカーの発見
種々の動物モデルにおいてインビボで実施されたファージディスプレイ研究によって、腫瘍血管新生を選択的に標的にできるペプチド配列が同定されている。それらの配列は腫瘍内皮およびその特異的な分子決定因子を特徴付け、且つ腫瘍治療における生物工学的適用を開発するために妥当な道具であると証明されている。

このやり方で、反復ペプチド配列、例えばＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）およびＮＧＲ（アスパラギン−グリシン−アルギニン）が同定されている。ＲＧＤモチーフは細胞外基質のいくつかのタンパク質の配列内に埋め込まれ、且つインテグリンとのそれらの相互作用部位を表す。ＲＧＤ−４Ｃと名付けられた、ＣＤＲＧＤＣＦＣ配列を示すファージは乳腺腫瘍を特異的に標的にでき、且つαｖβ３およびαｖβ５インテグリンを選択的に結合できる。インビトロ実験はＲＧＤ含有ペプチドが細胞−細胞接着を阻害し、従ってアポトーシスを誘発することを実証した。従って、ＲＧＤペプチドはさらなる修飾をしないで、抗脈管形成薬剤としてはたらき、細胞基質の相互作用の破壊の後、細胞死を導くことができると考えられる。ＲＧＤと比較して低い親和性であっても、ＮＧＲペプチドもインテグリンを結合する。ＮＧＲ配列に特異的な受容体は他の膜タンパク質、アミノペプチダーゼ Ｎ （ＡＰＮ）において同定に成功しており、それは活性の脈管形成において血管構造内で過剰発現し、且つ静止内皮中で検知できない。ＡＰＮに特異的な抗体がマウスにおいて低酸素症によって誘発される網膜の新血管新生を阻害できることが実証されている。同様に、抗ＡＰＮ抗体で治療されたマウスはコントロール群と比較して強く退縮した乳腺腫瘍を有する。

他の一連の研究において、ＮＧ２プロテオグリカンを特異的に結合するペプチドが同定され、それはＨＭＰ（ヒトメラノーマプロテオグリカン）のマウスの同族体であり、分子量メラノーマ関連抗原としても公知である。このプロテオグリカンは主にグリア前駆細胞、骨格筋および軟骨によって発現される。分化の後、ＮＧ２表面発現は消失する。成人においてその存在は、グリア芽細胞腫、軟骨肉腫（ｃｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）、メラノーマおよびいくつかの白血病の中のいくつかの腫瘍の種類における活性な脈管形成における血管に制限される。悪性メラノーマを有するヌードマウスにおいて、ドキソルビシンと共役の抗ＮＧ２抗体は腫瘍の成長を抑制する。

抗腫瘍薬剤としてのペプチド
細胞外基質のリモデリングは内皮活性化と新生の浸潤との両方に一般的であり、且つ基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）と呼ばれる特異的な酵素のはたらきを必要とする。腫瘍において過剰発現するそれらのプロテアーゼは、形態形成の間の細胞移動および組織のリモデリング事象のとき以外、正常細胞にはほとんど存在しない。２つのかかるプロテアーゼ、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼ Ａ；７２Ｋｄ）およびＭＭＰ−９（ゼラチナーゼ Ｂ；９２Ｋｄ）であって、脈管形成および転移能においてより厳密に必要とされるプロテアーゼであるものの合成阻害剤は、ファージディスプレイによって単離されている。この研究から、最も表現されるクローンがＣＸ６Ｃライブラリから得られるＬＲＳＧＲＧ配列を発現することが示される。ＣＸ９コレクションから同定される他のタンパク質ファミリーは、ＨＷＧＦモチーフを有するものである。ＨＷＧＦモチーフを含有する可溶性ペプチドはインビトロでＭＭＰ−９に対して阻害活性を示す。それらのペプチドは、腫瘍細胞株およびヒトの臍帯に由来する内皮細胞の移動を阻害する。インビボで、それらは腫瘍の成長を阻害することにおいて、且つ転移の発生を防ぐことにおいて有効である。

生物工学的に革新的な抗腫瘍治療におけるペプチドの使用
前記のように、腫瘍内皮マーカーあるいは腫瘍細胞に特異的に結合するペプチドをマウスにおける治療プロトコルに用いることに成功している。第二の方法を、ＲＧＤ−４ＣおよびＣＮＧＲＣペプチドを化学治療薬剤ドキソルビシンと共役させ、そしてこの化合物をマウスの乳腺腫瘍の治療に使用して調査した。この治療を被検した動物は６ヶ月まで生存し、それはこの化合物が原発腫瘍と転移発現との両方を高い効力および全身性の投与と比べて低い毒性で阻害できることを実証している。

第三の一連の適用において、２つの機能性ドメインを有するキメラペプチドを製造した。前者は選択的に標的細胞に結合し、且つ内在化できる。後者は体液中ではあるが細胞内環境においてのみアポトーシス促進性、非毒性である。ミトコンドリア膜の破壊およびアポトーシスの誘発を起こす働きをする１００より多くのペプチドが存在する。それらの中で１４アミノ酸の配列を選択し、ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫはＤ−エナンチオマーの形態において強い抗生能を有することが実証されている。ペプチドＲＧＤ−４ＣおよびＣＮＧＲＣはこのペプチドに結合されている。それらの化合物がミトコンドリア変性を起こし、且つアポトーシス状態の典型的な形態学的変形物、例えば核構造の凝縮および分裂にみちびくことが見出されている。それらの結果はインビボで確認されており、抗腫瘍剤を投与されたマウスは大きさの減少した腫瘍を示し、且つ数ヶ月の間生存する。

本発明の一般的な記載
転移の発生は腫瘍の進行において好ましくない予後因子である。従って、早期の転移を（非顕在の寸法のものも）検知し、且つ攻撃できる方法を開発するのが基本である。ほとんどの場合において、現在診断に用いられている病理組織学的方法は、もう治療できないときに転移物の局在化を追跡することを可能にする。さらには、治療の観点からは、現在の方法は主に化学治療薬剤の非特異性の毒性のせいで制限されている。

転移細胞は、原発腫瘍とそれらが局在化している組織との両方と比較して独特の特徴を有している。同様に、腫瘍血管細胞（内皮細胞）は正常な静止細胞とは異なる。特に、著しい修飾は、表面上で分子が発現あるいは修飾されて新しい環境への適合に有利になる細胞表面を必要とする。しかしながら、従来の方法の研究はそれらの修飾の多様度の問題に対応するには非効率であることが証明されている。

本発明は現状の技術水準の課題を克服するための解決策を提供する目的を有している。

本発明によれば、この目的を従属請求項内に定義されたペプチド、特に配列番号１〜２０１に示される配列を含むペプチドによって達成できる。本発明はかかるペプチドを治療および診断分野において用いる使用にも関する。該従属請求項は、本発明に関してここで与えられる技術的進歩の一部である。

好ましくは、本発明は肝転移細胞を特異的に認識するペプチドに関する。本発明はかかるペプチドのコンジュゲートおよび配合物を、診断用薬剤（例えばラベル）あるいは治療薬剤（例えば化学治療、放射性同位体、トキシン）と結合させて、それぞれインビトロとインビボとの両方における肝転移細胞の局在化のために、および腫瘍を有する対象における治療のために、用いる使用にも関する。

本発明は転移細胞に対して、特に肝転移細胞に高い結合選択性を有するペプチドを提供でき、従ってインビトロとインビボとの両方においてかかる細胞の効率的な局在化を可能にし、そのためそれらを肝臓内に転移している腫瘍、より具体的には結腸直腸癌が原発のものの診断と治療との両方に効果的に用いることができる。

本発明のいくつかのペプチドは共通配列モチーフ、例えばＧＧＧ、ＲＧＬ、ＧＲＬ、ＧＳＧ、ＬＧＲ、ＧＬＳ、ＳＡＤ、ＹＥＤ、ＬＲＳおよび／またはＧＳＧＳを共有する。好ましい共通配列モチーフはＬＲＳである。

治療的アプローチを超えて、肝転移細胞を選択的に認識するペプチドは転移物それ自身を同定するために有用な手段を表す。それらのペプチドの小さいサイズはこの種の用途に非常に有利である。例えば、本発明による放射性核種あるいは蛍光性体とコンジュゲートしたペプチドを、潜伏腫瘍を有する患者あるいは非特異的な放射線診断結果を有する患者に使用できる。さらには、それらをインビボ用途、例えば磁気共鳴あるいはＴＡＣに使用する前に、適した分子とコンジュゲートさせて、任意の公知の視覚化技術、特に個々の身体領域に適した技術によってそれらを視覚化できる。

配合技術およびコンジュゲートの投与は当該技術分野で公知であり、且つここで詳細な記載は必要ではなく、本発明の理解のために不可欠ではない。

本発明の発明者らはプロテオミック法（ファージディスプレイ）を使用して、結腸直腸癌腫からの二次的なヒトの肝転移物に由来する細胞の表面上に発現する分子決定因子を特徴付けた。かかる技術は、それらの細胞上に排他的に存在する膜分子と相互作用できるペプチドの単離を可能にする。正常組織内あるいは原発腫瘍内には存在しない分子決定因子を認識するペプチドの同定は、かかるペプチドを診断と治療との両方の用途に使用することを可能にする。診断の観点からは、適切に標識化されたそれらのペプチドを、症状発現前の段階においても、肝転移物の検知に使用できる。治療の観点からは、それらを化学治療薬剤とコンジュゲートさせて標的治療のプロトコルを設定することが可能である。

図の簡単な説明
図１は本発明による肝転移細胞を結合するペプチドの配列を示し、特に配列番号１〜７は、患者１６、１７および１８における実験において選択され、深く研究されているペプチドを表す。配列番号８〜１９は患者２からのサンプル上でＩＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号２０〜３９は患者６からのサンプル上でＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号４０〜６４は患者７からのサンプル上でＩＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号６５〜７８は患者８からのサンプル上でＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号７９〜９５は患者１６からのサンプル上でＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号９６〜１０７は患者１６からのサンプル上でＩＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１０８〜１０９は患者１７からのサンプル上でＩＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１１０〜１１８は患者１８からのサンプル上でＩＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１１９〜１２２は患者１９からのサンプル上でＩＶラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１２３〜１４０は患者９からのサンプル上でＩＶラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１４１〜１５２は患者２１からのサンプル上でＩＶラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１５３〜１７０は患者２３からのサンプル上でＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１７１〜１８６は患者５からのサンプル上でＩＶラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。配列番号１８７〜２０１は患者８からのサンプル上でＩＩラウンドの選択において選択されたペプチドを表す。

図２はファージＤＮＡ内のオリゴヌクレオチド挿入物を配列決定するために使用されたプライマーのヌクレオチド配列を示す。

図３はＧＳＴ配列に融合したペプチドＧＩＹＲＬＲＳに結合したタンパク質を分離させたポリアクリアミドゲルの写真を示す。

発明の詳細な説明
ここで本発明を限定されない例として詳細に説明する。

本発明で同定されたペプチドは診断と治療との両方の分野において分子ツールとして使用できる。臨床腫瘍学における実際の治療法は低い選択性によって特徴付けられることがよく知られている。血流内を循環する化学治療剤は、腫瘍塊以外には、活性増殖における全ての体細胞集団に影響する。それに対して、特定の細胞型に特異的な表面受容体によって特異的に認識されるペプチドは、化学治療薬剤をその種の細胞に優先的に向かわせることができる。従って本発明に記載するペプチドは、肝転移物への薬剤標的剤として都合良く用いられる。

さらには、検出分子によって標識化したペプチドを治療分野で使用できる。現在、周囲の組織からの非常に早発の転移病変の分解能が可能な検出技術が使用されている。標識化ペプチドの腫瘍細胞の検出への使用を活用した技術は、その代わりに、それらの細胞を他から区別する分子差に基づいている。本発明によるペプチドはヒトの肝転移の１つの細胞ですら検出できる。

本発明のペプチドにおいて採取されたデータは下記のように要約できる：
１）本発明において選択されたペプチドは互いの間で高い配列相同性を共有し、それは選択の特異性を示す。
２）本発明のペプチドは肝組織に特異的な、および／または新生物病理学に関連するタンパク質中に存在するモチーフと高い相同性を有する。
３）結合アッセイから、該ペプチドが原発と培養との両方のヒトの肝転移細胞上で暴露された表面分子に対して高い特異性を有している一方、それらは好ましくは正常な肝臓の原発細胞に対して、あるいは原発腫瘍あるいは他の種の転移の細胞株に対しては親和性を示さないことが明らかである。
４）本発明のペプチドは、転移の期、それぞれの患者に関する臨床的パラメータまたは他の特徴から独立に肝転移の細胞に全体的に結合し、従って良好な診断−予後および治療の候補手段である。

Ａ 定義
本明細書内で使用される際、単数形は１つあるいはそれより多くを意味するものとする。本請求項内で使用される際、用語"含む"に関連して、単数形は１つあるいはそれより多くを意味するものとする。ここで使用される"他の"は、少なくとも２番目あるいはそれ以降の項目を意味するものとする。

１．標的成分
"標的成分"は、器官、組織、特定の細胞型、罹患組織あるいは腫瘍を含む動物内の特定の部分への物質の局在化あるいは結合を強化するために使用できる様々なタイプのアフィニティ試薬を包含する用語である。標的成分はペプチド、ペプチドミメティック、ポリペプチド、抗体、抗体様分子、核酸、アプタマーおよびそれらの断片を含んでよい。特定の実施態様において、標的成分は、それらの細胞の表面タンパク質への結合によって、即ち、経膜的あるいは表面に付随したあるいは分泌されたあるいは細胞外基質に付随したタンパク質への結合によって、結腸癌腫の二次的な肝転移細胞への物質の局在化を強化し得る。本発明の標的成分、例えば標的ペプチドあるいは抗体、並びにそれらの変形物および断片の選択的結合は、標的成分が標的（例えば結腸癌腫の二次的な肝転移細胞）に結合し、無関係の細胞に著しく結合しない場合である。標的成分は標的と実質的に相同性ではない他のタンパク質とも結合しているとしても、かかるタンパク質が抗体のペプチド標的の断片あるいはドメインとの相同性を共有している限り、選択的に結合しているとみなされる。この場合、標的に結合している標的成分は交差反応性の何らかの程度にかかわらず、選択的であると理解される。一般的には、交差反応性の程度を測定でき、且つ標的への結合から区別できる。

２．標的ペプチド
"標的ペプチド"は、器官、組織あるいは細胞型への選択的局在化によって特徴付けられるアミノ酸の連続した配列を含むペプチドであり、それは特異的な組織あるいは細胞型において特異的に発現あるいは生成される細胞外タンパク質あるいは分子との特異的結合を含む。

３．受容体
標的ペプチドに対する"受容体"は、限定されずに、標的ペプチドに結合する任意の分子あるいは分子複合体を含む。受容体の限定されない例は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、炭水化物、多分子構造および１つあるいはそれより多くの分子の特定の配座を含む。好ましい実施態様において、"受容体"は標的器官、組織あるいは細胞型内の血管を形成している細胞の管腔表面上に存在する自然発生分子あるいは分子の複合体である。より具体的には、"受容体"は標的器官、組織あるいは細胞型内への血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する自然発生分子である。

４．アミノ酸残基
"アミノ酸残基"は当該技術分野で公知の任意の天然アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体あるいはアミノ酸ミメティックを示す。タンパク質残基は一般に、アミノ酸残基の配列に割り込む非アミノ酸がなく、連続している。特定の実施態様において、アミノ酸配列は１つあるいはそれより多くの非アミノ酸を含んでよい。特定の実施態様において、アミノ酸配列は１つあるいはそれより多くの非アミノ酸を含んでよい。特定の実施態様において、本発明のペプチド配列に１つあるいはそれより多くの非アミノ酸によって割り込ませてもよい。修飾アミノ酸あるいは異常アミノ酸は限定されずに、Ａａｄ，２−アミノアジピン酸、ＥｔＡｓｎ，Ｎ−エチルアスパラギン、Ｂａａｄ，３−アミノアジピン酸、Ｈｙｌ，ヒドロキシリジン、Ｂａｌａ，ベータアラニン、ベータ−アミノ−プロピオン酸、ＡＨｙｌ，アロ−ヒドロキシリジン、Ａｂｕ，２−アミノ酪酸、３Ｈｙｐ，３−ヒドロキシプロリン、４Ａｂｕ，４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、４Ｈｙｐ，４−ヒドロキシプロリン、Ａｃｐ，６−アミノカプロン酸、Ｉｄｅ，イソデスモシン、Ａｈｅ，２−アミノヘプタン酸、Ａｌｌｅ，アロ−イソロイシン、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、ＭｅＧｌｙ，Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｂａｉｂ，３−アミノイソ酪酸、Ｍｅｌｌｅ，Ｎ−メチルイソロイシン、Ａｐｍ，２−アミノピメリン酸、ＭｅＬｙｓ，６−Ｎ−メチルリシン、Ｄｂｕ，２，４−ジアミノ酪酸、ＭｅＶａｌ，Ｎ−メチルバリン、Ｄｅｓ，デスモシン、Ｎｖａ，ノルバリン、Ｄｐｍ，２，２’−ジアミノピメリン酸、Ｎｌｅ，ノルロイシン、Ｄｐｒ，２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｏｒｎ，オルニチンおよびＥｔＧｌｙ，Ｎ−エチルグリシンを含む。Ｄ−アミノ酸も含む。

５．タンパク質あるいはペプチド
用語"タンパク質あるいはペプチド"は、天然タンパク質中に見出される２０の通常アミノ酸の少なくとも１つ、あるいは少なくとも修飾アミノ酸あるいは異常アミノ酸によって構成されるアミノ酸配列を含む。

６．架橋試薬
二官能基型"架橋試薬"は、アフィニティ基質の調整、多種多様な構造の修飾および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、および構造的研究を含む様々な目的のために広範囲にわたって使用されている。２つの同一の官能基を有するホモ二官能基型試薬は、高分子あるいは高分子のサブユニットの同一のものと異なるものとの間の架橋を誘発すること、およびポリペプチドのリガンドのそれらに特異的な結合部位への連結を誘発することにおいて、非常に効率的であると証明されている。ヘテロ二官能基型試薬は、２つの異なる官能基を含有する。２つの異なる官能基の反応性の差を利用することによって、架橋を選択的且つ順序的に制御できる。二官能基型架橋試薬をそれらの官能基、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異性の基の特異性によって分けることができる。それらの中で、遊離アミノ基を対象とした試薬は、それらが市販されていること、合成の容易さ、およびそれらが適用される際の穏やかな反応条件のために特に普及してきている。ヘテロ二官能基型架橋試薬の大部分は一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含有する。

７．抗体
ここで使用される際、用語"抗体"は、任意の免疫性結合剤、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥあるいは抗体様分子を広く示すと意図されている。一般に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜならそれらは生理学的環境において最も一般的な抗体であるからであり、且つそれらは実験室の設備において最も容易に作製できるからである。抗体を製造および特徴付ける手段も、当該技術分野でよく知られている。ここでは "抗体"を、抗原結合領域を有する抗体と類似した任意の分子と定義し、抗体断片、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。

８．核酸
本発明によれば、"核酸"は標的ペプチド、標的抗体、治療ポリペプチド、融合タンパク質あるいは他のタンパク質あるいはペプチドをコードし得る。該核酸をゲノムＤＮＡ、補助ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）あるいは合成ＤＮＡから誘導できる。ここで使用される用語"核酸"は、一本鎖および二本鎖分子、並びにＤＮＡ、ＲＮＡ、化学的に修飾された核酸および核酸類似体を含む。本発明の目的では、核酸はコードされたタンパク質あるいはペプチドの長さによって一部分が決定されるほとんど全てのサイズのものであってよいと考えられる。標的ペプチド、標的抗体、および融合タンパク質は、適正なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされ得ると考えられる。標準コドン表を使用する所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および製造は当業者にはよく知られている。

９．送達手段
本発明による標的ペプチドの投与のためにいくつかの送達手段、とりわけ、リポソームおよび水中油あるいは油中水マイクロエマルジョン系を使用できる。該リポソームおよびマイクロエマルジョン、および他のマイクロ送達系を当該技術分野でよく知られている方法によって製造できる。リガンドを共有結合的にリポソーム表面上の部位に結合させられる。それらの部位の数および表面密度を特異的なリポソーム配合物および／またはリポソーム型を用いることによって調整できる。該リポソーム表面は非共有結合用の部位も有してよい。リガンドとリポソームとの共有結合性コンジュゲートを形成するために、架橋試薬が効力および生体適合性について研究されている。架橋試薬はグルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、および二官能基型オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む。

Ｂ．タンパク質およびペプチド
１．ペプチド
１つの実施態様において、本発明は転移細胞、好ましくは肝転移細胞を選択的に結合できるペプチドの使用を必要とする。該ペプチドは配列番号１〜２０１に定義された配列の単一コピー、あるいはかかる配列が随意にアミノ酸リンカー配列によって連結された多重の同一のコピーまたは異なるコピーを含んでよい。

それらの比較的小さいサイズのおかげで、本発明の標的ペプチドをよく知られた技術によって溶液中あるいは固体担体上で合成できる。一般に約６から３５〜４０までのアミノ酸の短いペプチドをそれらの技術を用いて容易に製造できる。選択的に、組み換えｃＤＮＡ技術を使用でき、その際、本発明のペプチドをコードするヌクレチオ配列を発現ベクターの中に挿入し、固有の宿主細胞に形質転換もしくはトランスフェクションし、そしてタンパク質発現に適した条件下で培養する。

本発明のペプチドは天然アミノ酸残基からなってよいか、あるいは少なくとも１つの修飾あるいは異常アミノ酸残基を含み得る。本発明のペプチドは直鎖あるいは環状ペプチドであり得る。本発明のペプチドは好ましくは約６から約１００まで、好ましくは約３５〜４０までのアミノ酸あるいはアミノ酸ミメティックの長さを有する。

２．ペプチドミメティック
本発明の他の実施態様は"ペプチドミメティック"の使用を必要とする。ミメティックはタンパク質の二次構造模倣成分である分子を含有するペプチドである。ペプチドミメティックに対する割合は、タンパク質ペプチド主鎖が主に該アミノ酸の側鎖を配向させる機能を有して、分子の相互作用、例えば抗体と抗原との相互作用を助ける事実にある。ペプチドミメティックは天然分子内と同じように分子の相互作用を可能にする。それらの原理を活用して、本発明に記載された標的ペプチドの自然特性の大部分を有するが修飾及び場合によっては改善された特徴を有する第二世代の分子を作ることができる。ペプチドミメティックの例は、それが模倣するペプチド配列と比較して、反転した配列においてＤ−アミノ酸によって形成される逆行性反転した（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｔｅｄ）ペプチドである。本発明のペプチドミメティックは好ましくは約６から約１００まで、好ましくは約３５〜４０までのアミノ酸あるいはアミノ酸ミメティックの長さを有する。

３．融合タンパク質
本発明のペプチドは融合タンパク質の成分の１つとしても使用できる。

融合タンパク質は、そのＮ−および／またはＣ−末端で随意にペプチドリンカーを介して標的ペプチドとは異種の第二のポリペプチドあるいはタンパク質と融合した標的ペプチドの配列全体あるいは部分を含む。例えば、融合タンパク質は他のタンパク質のシグナル配列を含んで、異種の宿主内で組み換えタンパク質の発現を可能にする。他の有用な融合タンパク質は免疫活性ドメイン、例えば抗体エピトープを含んで、融合タンパク質の精製を容易にする。融合部位あるいはその直近での切断部位、例えばタンパク質切断部位の取り込みは、精製の後の外生ドメインの除去を助ける。他の有用な融合タンパク質は、機能性ドメイン、例えば酵素の活性部位、糖鎖形成ドメイン、細胞の宛先指定シグナル、あるいは膜貫通領域を含む。

本発明の１つの実施態様において、融合タンパク質を、治療活性を有するタンパク質あるいはペプチドに融合した標的ペプチドによって作製する。融合タンパク質中に取り込まれ得るタンパク質あるいはペプチドの例は、細胞増殖抑制性タンパク質、細胞毒性タンパク質、アポトーシス促進剤、抗脈管形成剤、ホルモン、サイトカイン、成長因子、ペプチド薬剤、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、主要組織適合性複合体のタンパク質、細胞接着タンパク質および結合タンパク質を含む。かかる例は限定するわけではなく、本発明に従って事実上、任意のタンパク質あるいはペプチドを、標的ペプチドを含む融合タンパク質中に取り込むことができると理解される。融合タンパク質を製造する方法はよく知られている。かかるタンパク質は、例えば二官能基型の架橋試薬を使用した化学結合によって、融合タンパク質全体の新規合成によって、あるいは標的ペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のタンパク質あるいはペプチドをコードするＤＮＡ配列へ取り付け、次に融合タンパク質全体を発現させることによって製造できる。

４．抗体
本発明の異なる実施態様において、本発明の標的ペプチド対象物に対する抗体を製造するのが望ましい。

この目的に対して、標的ペプチドあるいはそれらが結合する分子を、１つあるいはそれより多い薬剤にスペーサー、ポリスペーサーあるいは誘導体化されたアミノ酸によってカップリング、結合、共役結合あるいは化学的に結合させ、標的ペプチドに結合する少なくとも１つの標的ペプチドあるいは分子を含む複合体を製造できる。これを二価あるいは多価の複合体を製造するやり方で、あるいはワクチンにおいて実施できる。かかる複合体の製造方法は当業者にはよく知られており、且つヒトへの投与に適用できる、即ち、薬理学的に認容性である。好ましい薬剤は担体、例えばヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。得られる抗体は、例えば転移細胞表面上で機能性タンパク質を結合および／または抑制することによって、診断と治療との両方に使用できる。

抗体分子の効率を改善するために、それらを少なくとも１つの系あるいは分子、例えばその検出を可能にする分子に結合あるいは複合させてもよい。かかる分子の限定されない例は酵素、放射性核種、アプタマー、蛍光ラベル、リン光性分子、化学発光分子、発色団、発光分子、着色粒子、あるいはリガンド、例えばビオチンを含む。

Ｃ．診断および治療コンジュゲート
本発明の実施態様において、特異的な生物活性剤を本発明に従って１つあるいはそれより多くの標的ペプチドに結合させて、器官、組織あるいは細胞型内に特異的に放出させることが望ましい。以下に本発明に従って標的ペプチドに結合できる薬剤のいくつかの例を示す。

本発明によるコンジュゲートを、目的の治療あるいは診断薬剤への標的ペプチドの直接コンジュゲートによって、あるいは架橋試薬を使用して目的のペプチドと分子との間に結合を設けることによって製造できる。

１．サイトカイン
用語"サイトカイン"は、他の細胞上で細胞間の媒介物質としてはたらく１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称である。かかるサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、成長因子および従来のポリペプチドホルモンである。該サイトカインの中に含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、プロレラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝性成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−アルファおよびベータ、ミュラー管阻害物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、例えばＮＧＦ−ベータ、血小板成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔ−リガンドあるいはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴである。ここで使用される際、用語"サイトカイン"は天然由来あるいは組み換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。

２．ケモカイン
"ケモカイン"は一般に化学誘引物質としてはたらき、免疫作動体細胞をケモカイン発現部位に入れる。特定のケモカイン遺伝子を、例えばサイトカイン遺伝子との組み合わせで発現させ、他の免疫系成分の治療部位への加入を強化するのが有利であり得る。サイトカインは限定されずにＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータおよびＩＰ−１０を含む。熟練した当業者は、化学誘引効果を有するとして知られ且つ用語ケモカインの下でも分類される特定のサイトカインを認識している。

３．イメージング剤
特定の実施態様において、本発明の標的部を肝転移の画像化および診断に使用するイメージング剤に取り付けてもよい。

いくつかのイメージング剤がそれらをタンパク質あるいはペプチドに結合させる方法と同様によく知られている。イメージング剤の限定されない例は、常磁性イオン、例えばクロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）を含み、ガドリニウムを用いるのが特に好ましい。他の情況、例えばＸ線イメージングにおいて有用なイオンは、限定されずに、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩＩ）を含む。

イメージング剤あるいは治療剤として使用する放射性同位体は、²¹¹アスタチン、¹⁴炭素、⁵¹クロム、³⁶塩素、⁵⁷コバルト、⁵⁸コバルト、⁶⁷銅、¹⁵²Ｅｕ、⁶⁷ガリウム、³水素、¹²³ヨウ素、¹²⁵ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹¹¹インジウム、⁵⁹鉄、³²リン、¹⁸⁶レニウム、¹⁸⁸レニウム、⁷⁵セレン、³⁵硫黄、^99mテクネチウム（ｔｅｃｈｎｅｔｉｃｕｍ）および⁹⁰イットリウムを含む。

特定の実施態様において、特許請求されたタンパク質あるいはペプチドを、発色基質との接触で発色生成物を生成する第二の結合リガンドあるいは酵素（酵素標識）に結合できる。適した酵素の例はウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（セイヨウワサビ）水素ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含む。好ましい第二の結合リガンドはビオチン、アビジンあるいはストレプトアビジン化合物である。かかるラベルの使用は当業者によく知られている。

さらなる実施態様において標的成分を、効力を発するようにナノ粒子と結合できる。ナノ粒子は限定されずに、コロイド状金および銀ナノ粒子を含む。金属ナノ粒子は可視光領域で色を示す。ナノ粒子のさらなる例は磁気ナノ粒子である。

４．治療剤
特定の実施態様において治療剤を、効力を発するように標的ペプチドあるいは溶融タンパク質に結合して、例えば肝転移の腫瘍脈管構造に選択的に送達させ得る。使用に適切な薬剤あるいは因子は、アポトーシス、細胞死、細胞静止および／または抗脈管形成を誘発する任意の化学化合物を含んでよく、該化合物は例えば下記のものである。

・ プログラム細胞死あるいはアポトーシスの調節剤。Ｂｃｌタンパク質およびそのファミリーの他のメンバーがアポトーシスに関与し、且つアポトーシスの作用薬あるいは拮抗薬として分類される。例えば、Ｂｃｌ−２およびそのファミリーの他のメンバー（例えばＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ．−Ｗ、Ｂｃｌ−Ｓ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）がアポトーシス促進性である一方、他のもの（例えばＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）は抗アポトーシス性である。

・ 脈管形成抑阻害剤。特定の実施態様において、本発明は抗脈管形成剤、例えばアンギオテンシン、ラミニン、ペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテアーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板第４因子、ＩＰ−１０、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子あるいはミノサイクリンに、効力を発するように結合した標的成分の投与に関し得る。

・ 細胞毒性剤。化学治療（細胞毒性）剤を使用して、癌を含む様々な疾患状態を治療できる。ほとんどの化学治療剤はアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、コルチコステロイドホルモン、有糸分裂阻害剤およびニトロソウレア、ホルモン剤、その他の薬剤およびそれらの任意の類似物あるいは誘導変形物に分類される。

・ アルキル化剤。アルキル化剤はゲノムＤＮＡと直接的に相互作用して細胞の増殖を防止する薬剤である。この分類の化学治療薬剤は細胞周期の全ての期に影響する薬剤を表し、即ち、それらは発生期特異性がない。アルキル化剤は限定されずに、窒素マスタード、エチレンイミン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレアあるいはトリアジンを含んでよい。それらは限定されずに、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン（ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）およびメルファランを含む。

・ 代謝拮抗剤。代謝拮抗剤はＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨害する。アルキル化剤とは異なり、それらは特異的にＳ期の間の細胞周期に特異的に影響する。代謝拮抗剤を様々な分類、例えば葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体および関連する阻害化合物に分化できる。代謝拮抗剤は限定されずに、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ゲムシタビン、およびメトトレキセートを含む。

・ 天然産物。天然産物は一般に元は天然源から単離され、且つ薬理学的活性を有しているとして特定された化合物を示す。かかる化合物、それらの類似体および誘導体を天然源から単離し、当業者に公知の任意の技術によって化学的に合成あるいは組み換えて製造できる。天然産物は有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、酵素および生物応答調節剤としてかかる分類を含む。

・ 有糸分裂阻害剤。有糸分裂阻害剤は、細胞分裂に必要なタンパク質合成あるいは有糸分裂のいずれかを阻害できる植物アルカロイドおよび他の天然薬剤を含む。それらは細胞周期の中の特定の期の間にはたらく。有糸分裂阻害剤は例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンを含む。タキソイドはトネリコ（ａｓｈ ｔｒｅｅ）、イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮から単離された関連化合物の類である。タキソイドは限定されずに化合物、例えばドセタキセルおよびパクリタキセルを含む。パクリタキセルはチューブリンを（ビンカアルカロイドによって使用された部位とは別の部位で）結合し、且つ微小管の集合を促進する。ビンカアルカロイドは薬理学的活性を有すると識別されている植物アルカロイドの一種である。それらはかかる化合物をビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンとして含む。

・ 抗生物質。特定の抗生物質が抗菌活性と細胞毒活性との両方を有していることがよく知られている。それらの薬剤は化学的に酵素および有糸分裂を阻害することによって、あるいは細胞膜を変えることによってＤＮＡと干渉する。それらの薬剤は期特異性がなく、従ってそれらは細胞周期のすべての期で作用する。細胞毒抗生物質の例は、限定されずにブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびイダルビシンを含む。

・ その他の細胞毒性剤。前記の分類に入らないその他の細胞毒性剤は限定されずに、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノインを含む。白金配位錯体はかかる化合物をカルボプラチンおよびシスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）として含む。例示的なアントラセンジオンはミトキサントロンである。例示的な置換ウレアはヒドロキシウレアである。例示的なメチルヒドラジン誘導体はプロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）である。それらの例は限定されず、且つ任意の公知の細胞毒性、細胞増殖抑制性あるいは細胞破壊性剤が標的ペプチドに取り付けられ、且つ標的器官、組織あるいは細胞型に本発明の主旨の範疇で投与できると考えられる。

Ｄ．核酸
本発明による核酸は標的ペプチド、標的抗体、治療ポリペプチド、融合タンパク質あるいは他のタンパク質あるいはペプチドをコードできる。該核酸はゲノムＤＮＡ、補助ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡあるいはＲＮＡから選択できる。

１つの実施態様において本発明は、本発明によるペプチドを発現するベクターを遺伝子治療に用いる使用を含む。遺伝子治療ベクターは、効力を発するように発現制御配列に結合した本発明の少なくとも１つのペプチドあるいはポリペプチドをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ配列を含むいくつかの導入遺伝子を含み得る。

遺伝子治療を使用して治療遺伝子を発現させ、例えば新血管新生を強化あるいは減少できる。ＤＮＡはｃＤＮＡ、インビトロ重合ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、部分的プラスミドＤＮＡ、ウィルス由来の遺伝物質、直鎖ＤＮＡ、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、組み換えＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、あるいはそれらの群の誘導体の形態であり得る。ＲＮＡはオリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核内ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（伝達ＲＮＡ）、インビトロ重合ＲＮＡ、組み換えＲＮＡ、キメラ配列、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（小干渉性ＲＮＡ）、リボザイムあるいはそれらの群の誘導体の形態であり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの機能と干渉するポリヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドは限定されずに、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその種のものを含む。ＳｉＲＮＡは典型的には１５〜５０塩基対および好ましくは２１〜２５塩基対を含有し、且つ細胞内で発現される標的遺伝子あるいはＲＮＡと同一あるいはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。該ポリヌクレオチドは、細胞内でのその存在あるいは発現が細胞遺伝子あるいはＲＮＡの発現あるいは機能を変える配列であってもよい。さらには、ＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖、二本鎖、三本鎖、あるいは四本鎖であってよい。

材料および方法

本発明による肝転移細胞を結合するペプチドの配列を示す図である。 ファージＤＮＡ内のオリゴヌクレオチド挿入物を配列決定するために使用されたプライマーのヌクレオチド配列を示す図である。 ＧＳＴ配列に融合したペプチドＧＩＹＲＬＲＳに結合したタンパク質を分離させたポリアクリアミドゲルの写真を示す図である。

ファージディスプレイ方法論
ファージディスプレイは８０年代半ばにミズーリ大学のＧｅｏｇｅ Ｓｍｉｔｈによって開発された技術である。その原理は、事実上、全ての可能なアミノ酸順列が表されるコレクションあるいはライブラリから選択するペプチドにある。かかるペプチドを、どんな性質および複雑性であれ、標的を特異的に結合するそれらの能力に基づいて選択する。該ファージディスプレイ方法論はスクリーニングのラウンドおよび結合された粒子の増幅を、多様性の低減および結合特異性の増加を得る目的で必要とする。

ファージライブラリの構成は、大腸菌に感染できる繊維状バクテリオファージの使用を必要とする。それらのファージの独特の特性は、分子生物学技術で操作できる環状一本鎖ＤＮＡゲノムを有することである。かかるライブラリにおいて、該ペプチドは無作為な外因性のオリゴヌクレオチドの転写および翻訳から得られ、それはウィルス性ＤＮＡ中にカプシドタンパク質ｐＩＩＩのための遺伝子から上流でクローニングされる。細菌に電気穿孔法によってそれらの構築物を形質転換し、従ってそれらは組み換えファージの集団を生成し、そのそれぞれがｐＩＩＩタンパク質との融合物として種々のペプチドを含み得る。この系を用いて、各配列が１００〜１，０００倍までになる約１０⁸〜１０⁹ペプチドの多様性を有するライブラリを生成することが可能である。配列の縮退が完全であれば（Ｘｎ、ここでＸ＝任意のアミノ酸、ｎ＝アミノ酸の数）、２０のアミノ酸のそれぞれは、配列内に含まれる同一の理論的確率を有する。他の可能性は、アミノ酸について固定した位置を確立することである。ライブラリはしばしば、該ペプチドの両端の好ましい部位に位置するシステインによって特徴付けられるか、あるいは無作為な残基内に差し込まれ、その中で分子間のジスルフィド架橋が形成されて該ペプチドを環状にする。挿入物を環状にすることは配列のより良好な露出を可能にする。

省略形および溶液

試薬
使い捨てプラスチック材料：ファルコン、エッペンドルフ
培地および他の細胞培養試薬：高グルコースＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ−１６４０：Ｓｉｇｍａ； ＤＭＥＭおよびハムＦ１２： Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ； ＦＣＳ： Ｇｉｂｃｏ； コラゲナーゼ： Ｒｏｃｈｅ； Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン溶液： Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅ； 細菌培養のための液体培地および抗生物質： ＬＢ：Ｓｉｇｍａ； ＴＢ： Ｇｉｂｃｏ； ｋａｎ ａｎｄ Ｔｅｔ： Ｓｉｇｍａ； 免疫組織化学のための試薬： ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ。

外科サンプル
外科サンプルは癌研究治療研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ＩＲＣＣ）、カンディオーロ（ＴＯ）、イタリアの腫瘍外科部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ）の外科患者に由来する。本研究への参加に対する書面での合意を全てのドナーから得た。

それぞれの患者について、１サンプルの正常な肝臓および１つの肝転移物を入手した。サンプルはサイズ、外観、色、血管新生、壊死領域の存在、および脂質凝集体の蓄積（脂肪変性によって誘発される変性度合いの指標）に関して形態学的に異なっていた。組織における違いは、疾患の進行の種々の期、原発腫瘍の転移部位、病原性の工程で生じる他の可能性のある原因または疾患、あるいは個々のばらつきに関する他の理由と関連する。

サンプルを外科的除去の後、直ちに処理し、組織をばらばらにし、そして単細胞を抽出してその上で実験を実施した。全ての操作を無菌性の層流の下で実施した。サンプルをメスで小容積のＰＢＳ中で切断した。ＰＢＳ中に収集した懸濁液を３分間、１００ｒｐｍで室温にて遠心分離し、そしてその沈殿物を５ｍｌのコラゲナーゼ中で再懸濁した（０．２５質量／容積％、ＤＭＥＭ中）。該組織断片の消化を、この懸濁液を攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートして行った。該サンプルを再度遠心分離して細胞径より小さい全ての微粒子（脂質凝集物、細胞の一部分）、または造血薬由来のより小さい細胞を除去した。沈殿物をＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、直径４５μｍを有するフィルター上で濾過し、ビルケル計算盤（Ｂｕｅｒｋｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）内で計数し、そして１０⁶／ｍｌの濃度のＤＭＥＭ／ＦＣＳ／ＨＥＰＥＳ中で再懸濁させた。

顕微鏡検査の際、組織の解離および細胞精製の後、一次細胞集団が不均質に現れ、そして該幹細胞および腫瘍細胞とは異なる他の細胞型が区別された。それらの中で、赤血球および造血薬由来の他の細胞；線維芽細胞は、実質の結合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖａｌ）構造；分析した組織の血管の内側を覆う内皮細胞に由来する。

細胞系統
本発明の実験のために、表１に示すヒトの細胞系統を使用した。

表１

細胞培養用培地
細胞系統の維持および成長のために、細胞型に依存して種々の培地を使用した：
・ ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨｅｐＧ２、ＢＴ−４７４およびＭＣＦ−７細胞を、１０％のＦＣＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン（４０ｍＭ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭ中で培養した。

・ ＮＩＣ−Ｈ６３０、ＮＣＩ−Ｈ８７、ＮＣＩ−Ｈ１６８８、Ｃａｐａｎ−１およびＣａｐａｎ−２細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｌ−グルタミン（４０ｍＭ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を有するＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。

・ Ａ５４９およびＡＧＳ細胞を、１０％のＦＣＳ、Ｌ−グルタミン（４０ｍＭ）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を有するハムＦ１２中で培養した。

細胞培養
培養を１０％のＤＭＳＯを有するＦＣＳ溶液中で液体窒素内で貯蔵した細胞から開始した。３７℃で素早く解凍した後の細胞を、５％のＣＯ₂を用いて３７℃で加湿した培養器内の１００×２０ｍｍの皿内で培養した。培地の完全な交換を３〜４日おきに行った。８０〜９０％の集密度が達成されたら、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして０．０５％のトリプシン、２ｍＭのＥＤＴＡの溶液を用いて、３７℃で3分間、インキュベートすることによって剥離する。１０％のＦＣＳを有する過剰な容積の培地を、その後添加し、そして細胞を１００ｒｐｍで３分間の沈殿によって収集する。上清を除去し、該沈殿物を完全培地内で再懸濁させ、そして４つの新しい皿に等分した。

ファージディスプレイの実験のために、細胞を１０ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ内で洗浄し、そして同一の溶液中で、３７℃で３分間、インキュベートした。該細胞懸濁液をその後、ＰＢＳ内に１０ｍｌの総容積で回収した。ビルケル計算盤内での計数の後、細胞を１×１０⁶／ｍｌの最終濃度のＤＭＥＭ／ＦＣＳ／ＨＥＰＥＳ中で再懸濁させた。

ファージライブラリ
ファージディスプレイの実験のために、ＣＸ₇ＣおよびＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃ型の２つの環状ライブラリ、およびＣＸ₉型の１つの直鎖ライブラリを使用した。それらのライブラリにおいて、挿入物を５つの同一のコピーにおいて、融合ペプチドとしてｐＩＩＩタンパク質のＮ−末端基で発現させる。カプシド表面付近で挿入物のシステインはファージタンパク質に共有結合し、ＣＸ₇Ｃライブラリの場合は、逆側でシステインとのジスルフィド結合を形成できる。結果として、ペプチドが環化される。該ＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃライブラリにおいては、その代わりに種々の組み合わせのジスルフィド架橋が形成され、それは多重の閉環およびトリペプチドモチーフの露出をみちびく。

該ＣＸ₉ライブラリは直鎖で、且つ末端アミノ酸が同様にシステインである場合以外は環化しない。ファージライブラリをＴＢＳ中、４℃で１０¹⁰〜１０¹²ＴＵ／ｍｌの濃度で保存している。

細菌培養のための液体培地およびプレート
ＬＢ：この培地を、Ｋａｎを補って２０μｇ／ｍｌの最終濃度にし、大腸菌株Ｋ９１ｋａｎを増幅するか、あるいはＫａｎおよびＴｅｔ、共に２０μｇ／ｍｌを補って感染の後に細菌を増幅した。

ＴＢ：この液体培地を、Ｋ９１ｋａｎ細菌を感染にコンピテントにするのに使用し、且つＫａｎを補って２０μｇ／ｍｌの最終濃度にした。

プレート：細菌を以下：１５質量／容積％の細菌用寒天を有するＬＢ、およびＫ９１ｋａｎ成長用のＫａｎ（２０μｇ／ｍｌ）、あるいは感染細菌成長用のＫａｎ（２０μｇ／ｍｌ）およびＴｅｔ（４０μｇ／ｍｌ）から構成される半固体基材上のペトリプレート内で増幅した。

細胞上でのライブラリ選択
ファージディスプレイに関する全ての工程に対して、文献中で公知のプロトコルを使用した。特に、全細胞のパニングのための方法は記載されたプロトコルに由来するが、数回の試験の後、適用の最適化のためにそれを分析において系に適合させた。

第一ラウンド。１マイクロリットルのライブラリを５×１０⁵個の新鮮な転移細胞と一緒に、５００μｌの総容積でＤＭＥＭ／ＦＣＳ／ＨＥＰＥＳ中で１６時間、４℃で緩やかに振盪しながらインキュベートした。その後、同一の培地で４回の洗浄を実施し、弱く結合しているファージあるいは溶液中に残留しているファージを除去する。該洗浄を１ｍｌの同一の培地の中で実施する。

次のラウンド。次の選択ラウンドにおいて、ラウンドＩから得られた５０μｌのファージを、同一の患者からの正常な肝臓の５×１０⁵個の細胞と一緒に、５００μｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳ／ＨＥＰＥＳ中でインキュベートした。この陰性の予選択工程を、室温で１時間、穏やかに振盪しながら持続し、そして２度繰り返した。その後、その上清を２つの部分に分割し、それらを５×１０⁵個の正常な肝細胞あるいは肝転移細胞の両方にそれぞれ添加した。その２つの細胞懸濁液を４℃で２時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、記載したように洗浄した。結合したファージを、コンピテントな細菌に感染させることによって収集した。

細菌感染およびファージ増幅
細菌を、Ｋａｎを有する１０ｍｌのＴＢ中、３７℃で２〜３時間、振盪しながら、それらが６００ｎｍの波長で１．５〜２．０の光学密度に達するまで増幅させた。その後、１ミリリットルのコンピテントな細菌を１００μｌの細胞懸濁液に洗浄の後で添加した。感染を室温で１時間持続した。インキュベーションの最後に、細菌の一部をＬＢ−寒天およびＴｅｔを有するペトリプレート上に全く同一にプレーティングし、そして３７℃で１６時間インキュベートした。この系はファージ感染細菌のみを増殖させられる。なぜなら、該ファージのみがこの抗生物質に耐性を有するからである。基質結合ファージに関するＴＵを、それぞれのプレートのコロニーの計数で評価した。ここで我々はこの値を用語"アウトプット量"で示す。

細菌の残留分を、ＴｅｔおよびＫａｎを有する１０ｍｌのＬＢに添加し、そして３７℃で１６時間、振盪しながら増殖させる。

ファージ精製
この工程を選択ラウンドから誘導されたファージ集団と単独のファージクローンとの両方の精製に使用した。該細菌培養物を４℃で１０分間、５，０００ｒｐｍで遠心分離して細菌を除去した。現時点で上清中にあるファージを０．１５容積のＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて４℃で１時間、沈殿させ、そして４℃で１５分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。該上清液を傾瀉した後、そのペレットを４℃で５分間、６，０００ｒｐｍでさらに遠心分離することによって圧縮し、その後、５００μｌのＴＢＳ中で１０分間振盪することによって再懸濁させた。砕片を除去するために、該懸濁液をその後、室温で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。ファージ集団を収集し、そして４℃で貯蔵した。

ファージ滴定
該滴定はそれぞれのラウンドの最初のＴＵの量、または単クローンの滴定量（ここで我々が"インプット量"として示す量）を評価することを可能にする。該滴定を実施するために、元のファージ懸濁液から表２に記載された希釈液を製造した。

表２

１×１０^-6、１×１０^-7および１×１０^-8の希釈度であるサンプル（６）、（７）および（８）の１００μｌを、寒天およびＴｅｔを有するペトリプレート上に取った。プレートを３７℃で１６時間、インキュベートした。その後、総ＴＵ数をコロニーの計数によって、且つ総容量に対して評価した。

単クローン結合評価
それらの評価を、１０⁹ＴＵのそれぞれのクローンのインプット量を用いて、肝転移細胞系統からの細胞（標的）および正常な肝臓からの細胞（ネガティブコントロール）に対して実施した。それらの実験のアウトプット量を、ファージ自身に起因する非特異性の相互作用の尺度を与える、非挿入ファージ、ｆｄ−ｔｅｔへの結合について正規化した。結合の増加を、標的の正規化したアウトプット量とネガティブコントロールの正規化したアウトプット量との間の割合として評価した。材料の入手が可能である場合、全ての実験を少なくとも３回繰り返した。

クローンの単離および増幅
転移細胞に結合されるファージの数の間に、正常な肝細胞に結合されるファージと比較して著しい増加が観測された場合、単クローンを単離してそれらの挿入物の配列を同定し、且つそれらの結合特異性を評価した。クローン増幅のために、単コロニーからの細菌をＫａｎおよびＴｅｔを有する５ｍｌのＬＢ中で、３７℃で１６時間、振盪しながら増殖させた。その後、ファージを上記のように精製した。

ファージカプシドを機械的に分解するために、製造元によってＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓと命名された樹脂ビーズを使用した。それらの使用の前に、該ビーズをＴＢＳ中に１：１の容積／容積比で再懸濁させる。それぞれのクローンに対して、２００μｌのファージ懸濁液１０μｌのビーズに添加して、そして３０秒間ボルテックスする。４００ｒｐｍで３分間の遠心分離の後、１９５μｌの上清液を収集し、そして同一の分解サイクルを行う。最後に、１５０μｌの上清を、ＴＥを用いて４１０μｌまで満たし、そしてＤＮＡを０．１容積のｐＨ５．５の酢酸ナトリウム、および２．２容積の１００％エタノールを用いたインキュベーションによって沈殿させた。ＤＮＡを１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集し、７０％のエタノールで洗浄し、そして超純Ｈ₂Ｏ中で再懸濁させた。ＤＮＡの量を、波長２６０ｎｍでのその吸収を読み取ることとＴＡＥ中の１％アガロースゲル上での電気泳動との両方によって評価した。

配列決定のためのサンプル調製
８００ｎｇのファージＤＮＡに相当する１０マイクロリットルの溶液を３ｐｍｏｌの以下のプライマー：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号２０２）を用いてインキュベートし、それはオリゴヌクレオチド挿入物のすぐ下流の領域に相当する。

配列分析
ヌクレオチド配列をペプチド配列に翻訳するために、我々はソフトウェアＤＮＡｓｉｓ Ｖ２．５を使用した。

ファージを用いた免疫組織化学のプロトコル
組織のサンプルをＯＣＴ中に包埋させ、そして−８０℃で貯蔵する。実験のために、それらを−２０℃のクライオスタットを使用して切断する。

組織を１０μｍのスライドに切断した。その後、該スライドをＯＣＴが完全に除去されるまでＰＢＳで５分間処理した。組織を室温で１０分間、ＰＢＳ中の４％のＰＡＦ中で固定し、その後ＰＢＳ中で５分間洗浄し、そしてＰＢＳ中の５０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌを用いて２０分間、インキュベートした。

組織ペルオキシダーゼをその後、Ｈ₂Ｏ中の３％のＨ₂Ｏ₂を用いて１０分間、暗所にて室温で処理することによって不活性化した。次に、ＰＢＳ中で５分間、一度洗浄した。

非特異性の相互作用部位を、該サンプルを"ＤＡＫＯ ｂｌｏｃｋ"試薬中で３０分間、室温でインキュベートすることによってブロックした。その後、ファージを"ＤＡＫＯ希釈液"試薬中に添加して希釈し（１×１０^６〜５×１０⁶の総ＴＵ）、インキュベーションを４℃で終夜、持続させた。ＴＢＳ中でそれぞれ５分ずつ、４回の洗浄後、ウサギ多クローン性抗Ｍ１３ファージ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｂ７７８６）を用いてサンプルを染色し、室温で１時間、"ＤＡＫＯ ｄｉｌｕｅｎｔ"試薬中で１：５００に希釈した。

標識付けを第二の"ＤＡＫＯ ｅｎｖｉｓｉｏｎ"抗ウサギ抗体を使用して実施し、ＡＥＣ基質を用いて５分間現像し、そして次にマイヤーヘマトキシリンを用いてコントロール染色（ｃｏｎｔｒｏ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした。

ＧＳＴ融合ペプチド精製
選択したペプチドのいくつかを大腸菌内でＧＳＴとの融合タンパク質として標準的な精製プロトコルを使用して製造した。該細菌の調製および溶解：
１． 細菌を接種させ、そして３０℃で終夜、２０ＴＢ／Ａｍｐ液体培地中で増殖させる；
２． 細菌を３００ｍｌのＴＢ／Ａｍｐ液体培地内に３０℃で移す；１時間振盪する；
３． ＩＰＴＧを添加し（最終濃度１ｍＭ）、そして２時間インキュベートする；
４． ４℃で１５分間、５，０００ｒｐｍで遠心分離する；
５． 細菌を１０ｍｌの緩衝液Ａ中で再懸濁させる；
６． ４℃で２０分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離する；
７． 沈殿物を５ｍｌ再懸濁させ、それぞれ３５％の出力で２０秒間、４パルスを用いて細菌を音波粉砕する；
８． ４℃で２０分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を収集する。

グルタチオン−アガロース樹脂の調製
９． ２５０μｌの樹脂を蒸留Ｈ₂Ｏ中で１時間、回転させながら水和する；
１０． 緩衝液Ａ中で該樹脂を３回洗浄し、そして最後にそれを等容積の緩衝液Ａ中で再懸濁させる。

組み換えタンパク質の精製：
１１． ２５０μｌの樹脂を工程８のサンプルに添加する；
１２． ４℃で１時間、回転させる；
１３． 緩衝液Ａ中で３回洗浄する；
１４． 電気泳動によって濃度を評価し、次にクーマシーブルー染色を行う。

ＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動のための重合混合物（表３）。

表３

クーマシーブルー染色
１． 該ゲルを、クーマシーブルーを用いて３０〜４５分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートする；
２． ４５％メタノール−１０％酢酸中で脱染する；
３． 水中で再水和させ、最終的に紙の上で乾燥させる。

細胞溶解
２０個の１００×２０ｍｍの皿のＨｅｐＧ２（ヘパトーム）あるいはＮＣＩ−Ｈ６３０（結腸直腸癌腫の二次的な肝転移）細胞を機械的にＰＢＳ中で剥離し、そして２容積の緩衝液Ｈ中で１０％のグリセロールおよび０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０を用いて再懸濁させた。それらの懸濁液を４℃で３０分間、攪拌しながらインキュベートし、その後、４℃で３０分間、２，５００ｒｐｍで遠心分離した。タンパク質濃度をＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって、製造元の教示に従って評価した。

プルダウンアッセイ
樹脂に結合したＧＳＴペプチドを、乳汁と一緒に４℃で終夜、インキュベートし、そして緩衝液Ａ中で７回洗浄した。全タンパク質溶解産物の１０ｍｇを４℃で１時間、１２μｇのＧＳＴ樹脂を用いて２回インキュベートして、ＧＳＴあるいは樹脂に非特異的に結合しているタンパク質を除去した。該プルダウンアッセイを未結合タンパク質に対して１２μｇのＧＳＴペプチド樹脂を用いて４℃で終夜実施した。

緩衝液Ａ中で４回の洗浄の後、ＧＳＴ−ペプチド−樹脂複合体に結合したタンパク質を２０ｍＭのグルタチオン中で、４℃で３０分間溶出させ、そして４℃で２分間、３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集した。

その上清液を１０％のポリアクリルアミド変性ゲルにロードした。このゲルをその後、クーマシーブルー溶液を用いて染色し、そして特異的な結合を収集し、そして質量分析および（標準的なプロトコルを用いた）マイクロシーケンシングによって分析した。

結果
ヒト肝転移に対して特異性のあるペプチドモチーフの探索
ヒト肝転移に特異的に結合するペプチドを見つけるために、ファージライブラリスクリーニングを、外科的に患者の肝臓から除去された正常な肝臓および転移サンプルに由来する懸濁させた細胞において実施した。この段階で、種々の患者からの１１組のサンプルを使用した（患者２、５、６、７、８、１６、１７、１８、１９、２１、２３）。原発腫瘍として脳血管腫を有する患者８を除く、ほぼ全てのサンプルにおいて、肝転移は結腸あるいは直腸の原発腫瘍の二次的なものであった（表４）。

表４

選択に使用された患者の臨床パラメータを表４に示す。患者２、６、７（２実験）、１６、１７、１８、１９および２１に対してはＣＸ₇Ｃライブラリを使用し、患者８に対してはＣＸ₇ＣとＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃライブラリとの両方を２つの異なる転移サンプルに対して使用し、患者２３に対してはＣＸ₉ライブラリを使用した。それぞれの実験に対して、４ラウンドの選択および増幅を実施した。

スクリーニング実験で得られたペプチド配列の分析
肝転移細胞およびネガティブコントロール（巨視的に健康な肝臓組織）に結合している割合において著しい増加を我々が観察したそれぞれの実験において、２０個のファージクローンを増幅し、そして精製した。それぞれのクローンのＤＮＡを精製し、そして配列を決定してペプチドモチーフを導出した。選択されたペプチドを図１に示す。

いくつかの配列が同一の実験と種々の患者のサンプルで実施された実験との両方において特に表される。患者２、５、６、７、８、２１および２３に対して実施した実験において、共通配列、特にトリペプチド／テトラペプチドモチーフを共有するペプチドを選択した（ＧＧＧ、ＲＧＬ、ＧＲＬ、ＧＳＧ、ＬＧＲ、ＧＬＳ、ＳＡＤ、ＹＥＧ、ＧＥＧＳの中で）。患者１６、１７および１８において実施した実験において、我々はより重複した配列を見出した。それらの実験において、先述されたものと高い相同性を有するモチーフが同様に現れる。最も重複しているペプチドはＬＲＳである。

選択された配列の分析
実験１６、１７および１８において得られた配列、特にＡＲＰＧＬＲＳ（配列番号１）、ＭＲＹＡＬＲＳ（配列番号２）、ＬＲＰＧＬＲＳ（配列番号３）、ＬＲＳＧＳＧＳ（配列番号４）、ＶＲＳＧＲＧＳ（配列番号５）、ＧＩＹＲＬＲＳ（配列番号６）およびＧＶＹＳＬＲＳ（配列番号７）の研究に焦点を絞った。それらのペプチドおよび公知のタンパク質の中で配列相同性を識別するために、ＢＬＡＳＴデータバンクにおける調査を行った。それらの分析から、著しい数のペプチドが細胞外基質のタンパク質との、および細胞付着性／運動性の分子との配列相同性を共有していることが明らかになった。

細胞系統に対する結合実験
選択された挿入物が肝転移物において特に発現する表面決定因子に対して特異的なリガンドかどうかを評価するために、７個のクローンを表１に記載した細胞系統で試験した。結果の要約を表５および６に示す。

この研究モデルにおいて、選択されたペプチド配列は原発腫瘍由来の細胞に結合しない（ＢＴ−４７４を除く）。それに対して、それらの配列は優先的に肝転移由来の細胞に結合する（７個中６個のクローンが原発結腸腫瘍の二次的な肝転移の細胞に結合し、７個中３個のクローンが原発胃腫瘍あるいは肺腫瘍の二次的な肝転移細胞に結合する）。

表５

表６

一次細胞での結合実験
選択された挿入物が、ヒト肝転移内で遍在の表面決定因子に対して特異的であるかどうかを評価するために、７個の選択されたクローンを肝転移の一次細胞で同一の患者の正常な肝臓と比較して試験した。それらの結合性評価のために、９人の患者からのサンプル（２０、２１、２２、２５、２６、２７、２８、３１、３２）を、細胞系統に関して記載されたものと同一の条件で使用した。結果の要約を表７に示す。

表７

第一の実験において、精製工程の準備段階に対して少ない細胞数のせいで、いくつかのクローンの結合のみが評価された。一般に、３つの評価をそれぞれのサンプルに対して実施した。それらの実験全てから、普遍的な診断マーカーとしてのほとんどの機能的クローンがＭＲＹＡＬＲＳ配列（配列番号２）を表示するものではなく、それは２つの評価（２７、２８）において陰性の結果を与える一方、全てのサンプル上ではたらくクローンは配列ＡＲＰＧＬＲＳ（配列番号１）、ＬＲＰＧＬＲＳ（配列番号３）、ＧＩＹＲＬＲＳ（配列番号６）およびＧＶＹＳＬＲＳ（配列番号７）を暴露するものであることが明らかになる。興味深いことに、新鮮な細胞での実験において、培養された細胞系統を用いて実施された実験よりも結合の増加が非常に高いことが示される。

組織サンプル上での結合オーバーレイ実験
配列ＧＩＹＲＬＲＳ（配列番号６）およびＧＶＹＳＬＲＳ（配列番号７）を有するファージを用いた結合オーバーレイアッセイを６４の組織サンプル（３７の異なる患者からの腫瘍および転移細胞）、肝転移および同源の健常組織の１８サンプル、原発結腸腫瘍の４サンプル、原発直腸腫瘍の２サンプル、健常結腸の２サンプル、原発乳腺腫瘍の３サンプル、同源の大網転移を有する原発卵巣腫瘍の６サンプル（１つはシグマ転移を有する）、２つの直腸結腸腫瘍の二次的な肺転移および２つの腎腫瘍の二次的な肺転移で実施する。全てのアッセイの結果を表８に示す。

表８

受容体精製
転移細胞の表面上に特異的に存在する分子の検索を、ＮＣＩ−Ｈ６３０（基質として、７つのファージのうち６つの結合に対して陽性）およびＨｅｐＧ２（コントロールとして、全てのファージの結合に対して陰性）を使用したプルダウン実験によって実施した。該プルダウンを、ＧＳＴタンパク質との融合物として存在するペプチドＧＩＹＲＬＲＳ（配列番号６）を使用して実施した。この実験を３回繰り返した。ＧＩＹＲＬＲＳ−ＧＳＴ結合タンパク質を分離し、且つクーマシーブルーで染色された変性ポリアクリアミドゲルを図３に示す。該図において、ＭＭ、分子量マーカー、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２細胞の溶解産物、ＮＣＩ−Ｈ６３０、ＮＣＩ−Ｈ６３０細胞の溶解産物、数字２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５は標準的な分子量を示し、１〜９の数字は分析されたバンドを示す。質量分析によってタンパク質を同定した。

実現および実施態様の詳細は、記載された特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、ここに記載且つ説明したよりも広範囲であることは明白である。

参考文献

Claims (40)

1. 転移細胞に選択的に結合できるペプチドにおいて、
   

   

   

   

   

   から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
2. 転移細胞が、ヒト肝転移細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
3. ＧＧＧ、ＲＧＬ、ＧＲＬ、ＧＳＧ、ＬＧＲ、ＧＬＳ、ＳＡＤ、ＹＥＤ、ＬＲＳおよび／またはＧＳＧＳから選択される配列モチーフを有する、請求項１あるいは２に記載のペプチド。
4. 配列モチーフＬＲＳを有する、請求項３に記載のペプチド。
5. 環状ペプチドである、請求項１から４までのいずれか１項に記載のペプチド。
6. 少なくとも１つの修飾アミノ酸、異常アミノ酸、および／またはＤ−立体配置のアミノ酸を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載のペプチド。
7. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の転移細胞に選択的に結合できる少なくとも１つのペプチドおよび少なくとも１つの分子を含むコンジュゲート。
8. 少なくとも１つの分子が薬剤、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗脈管形成剤、ホルモン、サイトカイン、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、例えばＦａｂ断片の中から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のコンジュゲート。
9. 抗脈管形成剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテアーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、血小板第４因子、ＩＰ−１０、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナルペプチド、アクチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子およびミノサイクリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のコンジュゲート。
10. アポトーシス促進剤が、エトポシド、セラミドスフィンゴミエリン、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、ファス、ファスリガンド、ｆａｄｄ、ｆａｐ−１、ｔｒａｄｄ、ｆａｆ、ｒｉｐ、リーパ（ｒｅａｐｅｒ）、アポプチン、インターロイキン２変換酵素およびアネキシンＶからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のコンジュゲート。
11. サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−ガンマ（ＩＦ−ガンマ）、ＩＦ−アルファ、ＩＦ−ベータ、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のコンジュゲート。
12. 少なくとも１つの分子が、ウィルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、ナノ粒子、酵母細胞および哺乳動物細胞から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のコンジュゲート。
13. ウィルスが、アデノウィルス、レトロウイルス、アデノ関連ウィルスおよびレンチウイルスから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のコンジュゲート。
14. 少なくとも１つの分子が、診断用薬であることを特徴とする、請求項７に記載のコンジュゲート。
15. 診断用薬が、インビボ用途の診断用薬であることを特徴とする、請求項１４に記載のコンジュゲート。
16. 診断用薬が、常磁性イオンあるいは放射性同位体から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のコンジュゲート。
17. 診断用薬が、インビトロ評価用診断用薬であることを特徴とする、請求項１４に記載のコンジュゲート。
18. 転移細胞に選択的に結合できるペプチドであって、
    

    

    

    

    

    によって構成される群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸。
19. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の転移細胞に特異的に結合できる少なくとも１つのペプチドを含む配合物。
20. 少なくとも１つのペプチドが、薬剤とコンジュゲートされていることを特徴とする、請求項１９に記載の配合物。
21. 薬剤が、肝転移細胞上で細胞毒性、細胞増殖抑制性、アポトーシス促進性あるいは抗脈管形成効果を有することができる治療剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の配合物。
22. 薬剤が、アルキル化剤、代謝拮抗物質あるいは抗生物質であることを特徴とする、請求項２０に記載の配合物。
23. 少なくとも１つのペプチドが、診断用薬とコンジュゲートされていることを特徴とする、請求項２０に記載の配合物。
24. 診断用薬が、インビボ用途の診断用薬であることを特徴とする、請求項２３に記載の配合物。
25. 診断用薬が、インビトロ評価用診断用薬であることを特徴とする、請求項２３に記載の配合物。
26. 医薬配合物である、請求項１９から２５までのいずれか一項に記載の配合物。
27. 少なくとも１つの認容性の担体および／または賦形剤を含む、請求項１９から２５までのいずれか一項に記載の配合物。
28. 請求項１から６までのいずれか一項に記載のペプチドを、腫瘍、特に結腸腫瘍を有する患者の転移細胞の局在化のための診断用配合物の製造に用いる使用。
29. 転移細胞が肝転移細胞であることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
30. 配合物が、インビボ用途であることを特徴とする、請求項２８あるいは２９に記載の使用。
31. 配合物が、インビトロ評価用であることを特徴とする、請求項２８あるいは２９に記載の使用。
32. 請求項１から６までのいずれか一項に記載のペプチドを、腫瘍を有する被験体における抗腫瘍治療用薬剤の製造に用いる使用。
33. 請求項１８に記載の核酸を、腫瘍を有する被験体における抗腫瘍治療用薬剤の製造に用いる使用。
34. 抗腫瘍治療が遺伝子治療であることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
35. 転移細胞に選択的に結合できるペプチドであって、（１）転移細胞あるいは転移細胞を含有する組織をそれぞれのファージがカプシドタンパク質内に組み込まれる非相同ペプチド配列を示す複数のファージと接触させ、（２）前記細胞あるいは組織に結合していないファージを除去し、（３）前記細胞あるいは組織に結合しているファージを単離し、且つ、随意に（４）非相同ペプチド配列を同定することを含む方法によって得られるペプチド。
36. 転移細胞が肝転移細胞であることを特徴とする、請求項３５に記載のペプチド。
37. 肝転移細胞が、原発結腸直腸腫瘍に由来することを特徴とする、請求項３６に記載のペプチド。
38. ＧＧＧ、ＲＧＬ、ＧＲＬ、ＧＳＧ、ＬＧＲ、ＧＬＳ、ＳＡＤ、ＹＥＤ、ＬＲＳおよび／またはＧＳＧＳから選択される配列モチーフを有する、請求項３５から３７までのいずれか一項に記載のペプチド。
39. 配列モチーフＬＲＳを有する、請求項３８に記載のペプチド。
40. 請求項３３から３５までのいずれか一項に記載のペプチドにおいて、ペプチドが、
    

    

    

    

    

    によって構成される群から選択される少なくとも１つの配列を含むことを特徴とするペプチド。

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