CN112724258A

CN112724258A - 靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法

Info

Publication number: CN112724258A
Application number: CN201911036963.6A
Authority: CN
Inventors: 刘启颂
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法。所述复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在所述没食子酸和所述裂解肽之间的MMP‑2特异性识别降解的多肽底物。在该复合多肽分子中，带负电的没食子酸小分子可有效中和裂解肽的正电性和裂膜活性，从而可以有效防止裂解肽在体内循环过程中对正常细胞的损害，而当复合多肽分子进入癌组织后，由于癌细胞会分泌大量MMP‑2蛋白，该MMP‑2蛋白会识别降解连接在没食子酸和裂解肽之间的多肽底物，从而释放出自由的裂解肽，这样可以实现靶向杀死癌细胞的效果。

Description

靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法。

背景技术

在恶性肿瘤的治疗中，化疗一直占据着不可替代的地位，但其在临床上的治疗效果有限，主要原因在于肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。因此，如何发展一种可克服耐药性的治疗方案是癌症治疗中的重要问题。

基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMPs)是一组依赖Ca²⁺、Zn²⁺等金属离子作为辅助因子的细胞外酶，在细胞外基质的降解中起重要作用。MMP-2是MMPs家族成员之一，MMP-2属于明胶酶类，主要通过特异性降解肿瘤细胞突破基底膜(BM)的主要成分IV、V型胶原而在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。

裂解肽(Lytic Peptide)可以裂解生物膜，可以破坏对人类有害的癌细胞、细菌等的细胞膜，因而在治疗癌症、细菌感染等方面具有很好的前景。而且裂解肽与常规化疗试剂不同，它的作用机制中不涉及到特定的胞内组分，而是针对于生物普遍必须的生物膜，因此不容易出现耐药性等问题。目前对裂解肽的机理研究认为：裂解肽插入生物膜，寡聚形成孔道，进而破坏细胞膜，杀死细胞；由于生物膜由带负电的磷脂双分子层构成，因此，正电性和两亲性是裂解肽的必要特征。

然而，裂解肽对正常细胞也有杀伤作用，裂解肽在体内循环中，亦会作用于正常细胞，导致裂解肽不能很好地靶向杀死癌细胞。因此，现有技术有待改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法，旨在解决裂解肽不能靶向杀死癌细胞的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子，所述复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在所述没食子酸和所述裂解肽之间的MMP-2特异性识别降解的多肽底物。

本发明提供的复合多肽分子包括没食子酸和裂解肽，而且通过MMP-2特异性识别降解的多肽底物将两者连接；在该复合多肽分子中，带负电的没食子酸小分子可有效中和裂解肽的正电性和裂膜活性，从而可以有效防止裂解肽在体内循环过程中对正常细胞的损害，而当复合多肽分子进入癌组织后，由于癌细胞会分泌大量MMP-2蛋白，该MMP-2蛋白会识别降解连接在没食子酸和裂解肽之间的多肽底物(即MMP-2特异性识别降解的多肽底物)，从而释放出自由的裂解肽，这样可以实现靶向杀死癌细胞的效果。

本发明另一方面提供一种上述复合多肽分子的制备方法，该制备方法包括采用多肽固相合成法合成所述复合多肽分子。

本发明提供的复合多肽分子的制备方法工艺简单成本低，可以在多肽固相合成仪上实现，最终得到的复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在没食子酸和裂解肽之间的MMP-2特异性识别降解的多肽底物，可以实现靶向杀死癌细胞的效果。

附图说明

图1为本发明实施例中复合多肽分子的结构示意图；

图2为本发明实施例中复合多肽分子在癌组织中靶向作用示意图；

图3为本发明实施例中裂解肽对癌细胞MG-63的作用效果图；

图4为本发明实施例中裂解肽对正常细胞293-T的作用效果图；

图5为本发明实施例中复合多肽分子对正常细胞293-T的作用效果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子，如图1所示，该复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在所述没食子酸和所述裂解肽之间的MMP-2特异性识别降解的多肽底物。

本发明实施例提供的复合多肽分子包括没食子酸和裂解肽，而且通过MMP-2特异性识别降解的多肽底物将两者连接；在该复合多肽分子中，带负电的没食子酸小分子可有效中和裂解肽的正电性和裂膜活性，从而可以有效防止裂解肽在体内循环过程中对正常细胞的损害。如图2所示，当该复合多肽分子进入癌组织后，由于癌细胞会分泌大量MMP-2蛋白，该MMP-2蛋白会特异性识别降解连接在没食子酸和裂解肽之间的多肽底物(即MMP-2特异性识别降解的多肽底物)，从而释放出自由的裂解肽，这样可以实现靶向杀死癌细胞的效果。

没食子酸亦称“五倍子酸”、“棓酸”，结构式如下所示：学名“3,4,5-三羟基苯甲酸”，分子式为C₇H₆O₅，广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中，是自然界存在的一种多酚类化合物，其在食品、生物、医药等领域有广泛的应用；现有研究表面其还具有一定抗肿瘤活性。

因裂解肽具有正电性和两亲性，其对正常细胞也有杀伤作用。因此，本发明实施例中，通过将负电性的没食子酸与正电性的裂解肽复合，形成中性的复合多肽小分子，这样在体内循环过程中对正常细胞无损害。而没食子酸和裂解肽之间通过MMP-2特异性识别降解的多肽底物连接，通过癌细胞高表达MMP-2蛋白的现象，实现靶向杀死癌细胞的作用，因此通过结合该没食子酸和MMP-2特异性识别降解的多肽底物实现本发明靶向杀死癌细胞的目的，具有安全、可靠，特异性强的特点。

因MMP-2在各种癌细胞中均有分泌，因此该MMP-2特异性识别降解的多肽底物可以被各种癌细胞识别降解，所以本发明实施例的复合多肽分子对能分泌MMP-2蛋白的各种癌细胞均具有杀伤力，如宫颈癌、非小细胞肺癌、人食管癌、乳腺癌、卵巢癌、人骨肉瘤等多种癌对癌细胞。

在一个实施例中，所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物具体如SEQ.ID.No.1所示的氨基酸序列。所述裂解肽具体如SEQ.ID.No.2、SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5所示的氨基酸序列中的至少一种；具体序列如下：

SEQ.ID.No.1:XPLGLAG(Acp-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly)；其中，X为氨基己酸(Acp)；

SEQ.ID.No.2:KLAKKLAKLAK(Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)；

SEQ.ID.No.3:KLUKKLUKLUK(Lys-Leu-Aib-Lys-Lys-Leu-Aib-Lys-Leu-Aib-Lys)；

SEQ.ID.No.4:KLAKLAKKLAKLAK(Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)；

SEQ.ID.No.5:KLUKLUKKLUKLUK(Lys-Leu-Aib-Lys-Leu-Aib-Lys-Lys-Leu-Aib-Lys-Leu-Aib-Lys)；其中，U为α-氨基异丁酸(α-aminoisobutyric acid，Aib)，替代对应序列的丙氨酸。

具体地，所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物为SEQ.ID.No.1。该SEQ.ID.No.1中含有不同手性构型的氨基酸，包括D构型和L构型，由于D构型氨基酸为非天然氨基酸(即氨基己酸)，在体内循环中不易被水解，因此该多肽底物具体应用时，在体内稳定性更佳。

具体地，所述裂解肽为SEQ.ID.No.2，或SEQ.ID.No.3，或SEQ.ID.No.4，或SEQ.ID.No.5。优选地，所述裂解肽为SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.5。该SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.5中含有不同手性构型的氨基酸，包括D构型和L构型，由于D构型氨基酸为非天然氨基酸(即α-氨基异丁酸)，在体内循环中不易被水解，因此该裂解肽具体应用时，在体内稳定性更佳。

在一个实施例中，所述没食子酸的羧基和所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物的N-端氨基缩合偶联，即直接将没食子酸的羧基和MMP-2特异性识别降解的多肽底物的N-端氨基通过缩合反应形成偶联。或者，所述没食子酸与所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物之间可以间接连接，具体底，通过1-3个氨基酸进行偶联。优选地，所述1-3个氨基酸为1-3个甘氨酸，有利于复合多肽分子的合成。

在一个实施例中，所述裂解肽与所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物之间通过肽键连接，即裂解肽的N-端氨基与MMP-2特异性识别降解的多肽底物的C-端羧基缩合形成肽键偶联，这样裂解肽与MMP-2特异性识别降解的多肽底物形成一条肽链，便于合成。

另一方面，本发明实施例还提供了上述复合多肽分子的制备方法，该制备方法包括采用多肽固相合成法合成所述复合多肽分子。

多肽固相合成中：首先底物与树脂连接，然后在砂芯漏斗中进行反应，可以很方便的分离固相和液相，当反应结束树脂(固相)留在砂芯漏斗中，试剂等(液相)则流走。等反应完毕，运用三氟乙酸(TFE)等将底物从树脂上切下即可。具体接肽过程中：氨基酸反应当量数为树脂反应位点数量的3-5倍；溶胀、洗涤、脱保护、封尾溶剂或试剂量均为控制树脂反应位点浓度为0.3M时的体积；洗涤流程依次为二氯甲烷(DCM)、氮-甲基吡咯烷(NMP)、DCM、NMP、DCM，各洗约10sec；浸泡、脱保护、洗涤、封尾、偶联等过程均鼓空气泡起到搅拌作用；脱保护过程中，加入脱保护试剂(piperidine:NMP＝1:4)脱保护10min×2次；剪切过程中，按照每100mg树脂1mL加入剪切试剂(TFA:1-(三异丙基硅基)吡咯:H₂O＝95:2.5:2.5)，在旋转摇床上反应1-2h，滤去树脂所得液体氮气吹干后按照每100mg树脂1.5mL加入冷冻的沉淀试剂(乙醚)，沉淀离心后小心倒去上清液，干燥后所得白色固体或淡黄色油状物供下一步反应或待表征。

本发明实施例提供的复合多肽分子的制备方法工艺简单成本低，可以在多肽固相合成仪上实现，最终得到的复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在没食子酸和裂解肽之间的MMP-2特异性识别降解的多肽底物，可以实现靶向杀死癌细胞的效果。

在一实施例中，合成所述复合多肽分子之后，还包括利用高效液相色谱进行分离纯化的步骤。具体分离过程：将从树脂上剪切下的多肽溶解，用0.2μm滤膜过滤，通过C18反向柱进行分离，流动相为水和乙腈，收集多肽峰(紫外波长为225nm监测)。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1裂解肽作用效果研究

裂解肽通过裂解生物膜，可以破坏对人类有害的癌细胞以及正常细胞，这一现象可以通过CCK-8活性测试验证。

(1)将5000-8000个人骨肉瘤细胞MG-63种于96-孔板中，在含10％FBS的DMEM中培养过夜，培养条件为37℃，5％的CO₂，然后用溶于10％FBS的DMEM的不同浓度(0、5μM、10μM、20μM)的裂解肽(有四种，分别为：SEQ.ID.No.2，SEQ.ID.No.3，SEQ.ID.No.4，SEQ.ID.No.5)置换培养基，继续培养24小时后，通过CCK-8试剂检测细胞存活率。

结果发现上述四种裂解肽在5μM浓度以上，均可有效杀死半数癌细胞，说明裂解肽具有很好的抗癌活性。而裂解肽SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.5含有非天然氨基酸α-氨基异丁酸，具有更好的稳定性，因此效果更佳，如图3所示(3-2为裂解肽SEQ.ID.No.3，3-4为裂解肽SEQ.ID.No.5)。

(2)将5000-8000个人肾上皮细胞293-T种于96-孔板中，在含10％FBS的DMEM中培养过夜，培养条件为37℃，5％的CO₂，然后用溶于10％FBS的DMEM的不同浓度(0、5μM、10μM、20μM)的裂解肽(以SEQ.ID.No.5为例)置换培养基，继续培养24小时后，通过CCK-8试剂检测细胞存活率。

结果如图4所示，该裂解肽在5μM浓度以上，亦能杀死将近半数的293-T细胞，由此可知裂解肽对正常细胞亦有毒性；由于裂解肽通过破裂细胞膜杀伤细胞，因此其对普通细胞亦有相似的活性。

实施例2复合多肽分子作用研究

将5000-8000个人肾上皮细胞293-T种于96-孔板中，在含10％FBS的DMEM中培养过夜，培养条件为37℃，5％的CO₂，然后用溶于10％FBS的DMEM的不同浓度(0、5μM、10μM、20μM)的复合多肽分子(其中，MMP-2特异性识别降解的多肽底物为SEQ.ID.No.1，裂解肽为SEQ.ID.No.5)置换培养基，继续培养24小时后，通过CCK-8试剂检测细胞存活率。

结果如图5所示，由于没食子酸通过负电荷中和了裂解肽的正电荷，因此有效抑制了复合多肽分子对正常细胞的杀伤效果。

综合上述实施例可知：本发明实施例通过引入没食子酸中和裂解肽的正电性，有效降低了其副作用，可实现靶向杀死肿瘤细胞/癌细胞的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市第二人民医院

<120> 靶向杀死癌细胞的复合多肽分子及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Acp Pro Leu Gly Leu Ala Gly

1 5

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Leu Aib Lys Lys Leu Aib Lys Leu Aib Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Leu Aib Lys Leu Aib Lys Lys Leu Aib Lys Leu Aib Lys

1 5 10

Claims

1.一种靶向杀死癌细胞的复合多肽分子，其特征在于，所述复合多肽分子包括没食子酸、裂解肽、以及连接在所述没食子酸和所述裂解肽之间的MMP-2特异性识别降解的多肽底物。

2.如权利要求1所述的复合多肽分子，其特征在于，所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物具体如SEQ.ID.No.1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的复合多肽分子，其特征在于，所述裂解肽具体如SEQ.ID.No.2、SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5所示的氨基酸序列中的至少一种。

4.如权利要求2所述的复合多肽分子，其特征在于，所述裂解肽具体如SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.5所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4任一项所述的复合多肽分子，其特征在于，所述没食子酸的羧基和所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物的N-端氨基缩合偶联。

6.如权利要求1-4任一项所述的复合多肽分子，其特征在于，所述没食子酸与所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物之间通过1-3个氨基酸进行偶联。

7.如权利要求6所述的复合多肽分子，其特征在于，所述1-3个氨基酸为1-3个甘氨酸。

8.如权利要求1-4任一项所述的复合多肽分子，其特征在于，所述裂解肽与所述MMP-2特异性识别降解的多肽底物之间通过肽键连接。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的复合多肽分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括采用多肽固相合成法合成所述复合多肽分子。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，合成所述复合多肽分子之后，还包括利用高效液相色谱进行分离纯化的步骤。