CN115028704B - 一种抗酶解抗菌肽n1及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗酶解抗菌肽N1及其制备方法和应用。抗菌肽N1的序列为：Nal‑Ala‑Ala‑DArg‑Ile‑Ile‑Leu‑DArg‑Trp‑DArg‑Phe‑Arg，其中，Nal为β‑萘基丙氨酸，DArg为D‑型精氨酸。本发明以两栖类蛙源衍生肽W8的序列为基础，合理使用D‑型精氨酸对胰蛋白酶切割位点正电荷氨基酸进行修饰，同时在序列氨基端引入β‑萘基丙氨酸进一步提高抗酶解肽的抗菌活性，得到抗酶解抗菌肽N1。该抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。本发明有效提高了抗酶解和抗菌活性，提高了其在实际生产中的应用潜力与价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解抗菌肽N1及其制备方法和应用。
背景技术
随着抗生素耐药性(AMR)感染给人类健康带来的威胁越来越大，寻找新型、更稳定、可靠的抗生素替代物迫在眉睫。抗菌肽因具备抗菌活性强、杀菌速率快、耐药性低等优势成为替抗领域的研究热点。但是抗菌肽体内稳定性差，易被胃肠道蛋白酶消化水解，从而限制了抗菌肽的进一步发展与应用。近年来，研究者们通过多种策略如利用自然氨基酸合理排布、D-型氨基酸修饰酶切位点、脯氨酸(Pro)保护等来规避蛋白酶消化水解。然而，这些策略在提高抗菌肽抗酶解能力的同时大多面临着抗菌活性减弱的现象，甚至由广谱抗菌肽转变为只杀革兰氏阴性菌的窄谱抗菌肽。因此，设计出一条具有广谱且高效抗菌活性的抗酶解肽势在必行。
发明内容
基于以上存在的问题，提供一种全新的抗酶解抗菌肽N1，能够避免胰蛋白酶的消化水解，并且在不改变短肽抗酶解能力的前提下提高整体的抗菌活性，为实现抗菌肽在体内高效应用取得了阶段性进步。
本发明所采用的技术方案如下：一种抗酶解抗菌肽N1，其序列为：Nal-Ala-Ala-DArg-Ile-Ile-Leu-DArg-Trp-DArg-Phe-Arg，其中，Nal为β-萘基丙氨酸，DArg为D-型精氨酸。
本发明的另一目的是提供以上所述的一种抗酶解抗菌肽N1的制备方法，如下：以两栖类蛙源衍生肽W8的序列：AARIILRWRFR为基础，并以胰蛋白酶选择地水解由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽键为依据,通过使用D-型精氨酸替代精氨酸得到多肽D1，序列为AArIILRWrFr，r为D-型精氨酸，其次在多肽D1序列的氨基端引入β-萘基丙氨酸,设计得到优化模板(Nal)nAArIILrWrFR，n＝0，1，2，3，Nal为β-萘基丙氨酸，当n＝1时，得到多肽N1；对多肽N1采用固相化学合成法合成，对合成后的多肽N1进行抗菌活性和胰蛋白酶稳定性检测，最后命名为抗菌肽N1。
本发明的另一目的是提供以上所述的一种抗酶解抗菌肽N1在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果及优点如下：通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌活性、蛋白酶稳定性检测，发现抗菌肽N1对大肠杆菌、鲍氏不动杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌、李斯特菌等革兰氏阳性菌均有明显的抑制作用。此外，在模拟胰液环境中，抗菌肽N1保持高保留率和较强的抗菌活性。综上所述，N1是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为抗菌肽N1的质谱图；
图2为抗菌肽D1的质谱图；
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽的设计：
为了避免胰蛋白酶的消化水解，合理使用D-精氨酸(D-Arg)替换L-精氨酸(L-Arg),同时在序列氨基端引入非自然氨基酸：β-萘基丙氨酸(Nal)以保证抗酶解肽具有良好的抗菌活性，设计出抗酶解抗菌肽模板(Nal)nAArIILrwrFR,n＝0,1,2,3,r＝D-Arg,n＝0时设计得到的多肽命名为D1,n＝1时设计得到的多肽命名为N1，氨基酸序列如表1所示。
表1多肽D1和N1氨基酸序列
N1为具有12个氨基酸的短肽，电荷数为+4。D1为具有11个氨基酸的短肽，电荷数为+4。
实施例2
将上述多肽使用多肽合成仪器进行合成，方法微固相化学合成法，具体步骤为：
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：抗菌肽抗菌活性及抗蛋白酶水解能力的测定
1、抗菌活性测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象或用酶标仪检测492nm处光吸收值确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，在抗酶解肽D1氨基端添加一个萘基丙氨酸后，得到的短肽N1对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌活性均明显增强。
2、抗蛋白酶水解能力测定：抗菌肽与模拟胰液在37℃环境下孵育不同时间(1，2，4和8h)后，按照抗菌活性测定的方法，将与模拟胰液孵育后的抗菌肽与菌液混合于无菌96孔培养板中，测定抗菌肽在模拟胰液环境中最小抑菌浓度是否发生改变。对照组为没有经过模拟胰液处理的抗菌肽，测试结果见表3。
表3模拟胰液处理后抗菌肽N1抑制大肠杆菌活性
通过表3可以看出，在模拟胰液环境中孵育8h，相比于抗酶解抗菌肽D1，在氨基端添加一个β-萘基丙氨酸后，抗菌肽N1抗菌活性增加一倍，表明在序列氨基端合理添加β-萘基丙氨酸能够提高抗酶解肽的抗菌活性。
以上结果显示，通过合理使用D-型氨基酸可以有效提高抗菌肽的抗蛋白酶水解能力，从而提高抗菌肽的稳定性。同时，适当引入非自然氨基酸β-萘基丙氨酸(Nal)能够进一步提高抗酶解肽的抗菌活性，发现N1具有非常强的抗蛋白水解稳定性，与模拟胰液(含有10mg/mL胰蛋白酶)孵育8h后，肽的保留率较高且仍具有较强的抑制大肠杆菌活性。以上结果表明设计得到的抗酶解抗菌肽N1在实际生产中具有较大的应用潜力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种抗酶解抗菌肽N1及其制备方法和应用
<140> 2022102594545
<141> 2022-03-16
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> D型精氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> D型精氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> D型精氨酸
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> β-萘基丙氨酸化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> D型精氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> D型精氨酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> D型精氨酸
<400> 2
Ala Ala Xaa Ile Ile Leu Xaa Trp Xaa Phe Arg
1 5 10
Claims (3)
1.一种抗酶解抗菌肽N1，其特征在于，其序列为：
Nal-Ala-Ala-DArg-Ile-Ile-Leu-DArg-Trp-DArg-Phe-Arg，其中，Nal为β-萘基丙氨酸，DArg为D-型精氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种抗酶解抗菌肽N1的制备方法，其特征在于，方法如下：以两栖类蛙源衍生肽W8的序列：AARIILRWRFR为基础，并以胰蛋白酶选择地水解由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽键为依据,通过使用D-型精氨酸替代精氨酸得到多肽D1，序列为AArIILrWrFR，r为D-型精氨酸，其次在多肽D1序列的氨基端引入β-萘基丙氨酸,设计得到优化模板(Nal)nAArIILrWrFR，n＝0，1，2，3，Nal为β-萘基丙氨酸，当n＝1时，得到多肽N1；对多肽N1采用固相化学合成法合成，对合成后的多肽N1进行抗菌活性和胰蛋白酶稳定性检测，最后命名为抗菌肽N1。
3.根据权利要求1所述的抗酶解抗菌肽N1在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病的药物中的应用。
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