CN116162130B - 一种抗酶解型的纳米抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗酶解型的纳米抗菌肽及其制备方法和应用。其氨基酸序列为Nap‑^DNal‑Nal‑Dab‑Dab‑NH₂。选择Nap作为疏水支架提供疏水作用力，选择Nal作为疏水氨基酸与Nap组成疏水区域；选择Dab提供正电荷，选择非天然氨基酸以避免蛋白酶的水解；将D型氨基酸^DNal放在N端，与第二个氨基酸Nal处于同一平面用于自组装。并公开了该抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用。本发明的抗菌肽Nap‑Dab对病原菌具有较强的抑制作用，而且溶血活性较低，治疗指数达到28.5，具有较强的抗蛋白酶能力，在蛋白酶处理后抑菌活性保持不变，具有成为抗生素替代品的应用潜力。

Description

一种抗酶解型的纳米抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解型的纳米抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是由动植物机体或微生物分泌的一系列小肽物质，通常由5-100个氨基酸组成，因其独特的膜破裂机制使细菌的获得性耐药趋势降低，因此被誉为抗生素最有前景的替代品。然而天然AMPs的细胞毒性较高、生理环境下的稳定性差仍然是制约其应用于饲料添加剂的重要因素。

抗菌肽对蛋白酶消化的敏感性在临床医学、药物开发及畜牧应用中受到很大限制。尤其对肠道蛋白酶消化的不稳定性，可能使抗菌肽完全无效。因此，抗菌肽的分子改良的重点是增强其抵抗蛋白酶水解的能力，并应保留其化学稳定性和低细胞毒性的特点，以增加其临床应用的潜力。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab，其结构更加稳定，能够降低生理环境下蛋白酶的切割速率或无视蛋白酶的进攻，进一步完善抗菌肽的应用潜力。

本发明所采用的技术方案如下：一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab，其氨基酸序列为Nap-^DNal-Nal-Dab-Dab-NH₂，其中，Nap为1-萘乙酸，^DNal为D型1-萘基丙氨酸，Nal为1-萘基丙氨酸，Dab为2,4-二氨基丁酸,其C端采用-NH₂酰胺化。

进一步的，如上所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab，分子式如式(Ⅰ)所示，

进一步的，如上所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab的自组装条件为：浓度为7.78-256uM，37℃孵育24小时。

本发明的另一目的是提供一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab的制备方法，如下：

(1)选择1-萘乙酸Nap作为疏水支架提供疏水作用力，选择1-萘基丙氨酸Nal作为疏水氨基酸与1-萘乙酸Nap组成疏水区域；选择2,4-二氨基丁酸Dab提供正电荷满足抗菌肽的基本条件，同时选择非天然氨基酸以避免蛋白酶的水解；

(2)将D型氨基酸^DNal放在N端，与第二个氨基酸Nal处于同一平面以促进整体分子自组装，多肽结构采取类表面活性剂模式以降低细胞毒性；

(3)用固相化学合成法合成该多肽，得出抗菌肽序列为：Nap-^DNal-Nal-Dab-Dab-NH₂，再经过抑菌活性的测定、溶血活性的测定及蛋白酶稳定性的测定，最终命名为抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab。

本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用

本发明具有如下优点及有益效果：合成工艺简单，生产成本低廉，Nap-Dab生物学活性强且抵抗蛋白酶的效果显著，通过结合非天然氨基酸系统与纳米自组装系统来躲避蛋白酶的攻击；对制备的纳米抗菌肽进行抑菌活性、溶血活性、蛋白酶稳定性测定，发现Nap-Dab对常见的病原菌具有较强的抑制作用，对红细胞几乎没有溶血，而且在蛋白酶条件测试下具有较强的抵抗力，具有较高的应用价值，治疗指数达到28.5，具有成为抗生素替代品的应用潜力。

附图说明

图1纳米抗菌肽Nap-Dab的反相高效液相色谱图；

图2纳米抗菌肽Nap-Dab的质谱图；

图3纳米抗菌肽Nap-Dab的荧光光谱图；

图4纳米抗菌肽Nap-Dab的临界聚集浓度测定图；

图5纳米抗菌肽Nap-Dab的纳米形貌图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗酶解纳米抗菌肽的设计

(1)选择1-萘乙酸Nap作为疏水支架提供疏水作用力，选择1-萘基丙氨酸Nal作为疏水氨基酸与1-萘乙酸组成疏水区域；选择2,4-二氨基丁酸Dab提供正电荷满足抗菌肽的基本条件，同时选择非天然氨基酸以避免蛋白酶的水解；

(2)将D型氨基酸^DNal放在N端，与第二个氨基酸Nal处于同一平面以促进整体分子自组装，多肽结构采取类表面活性剂模式以降低细胞毒性。

抗菌肽Nap-Dab的氨基酸序列如下：

表1 肽的氨基酸序列

实施例2

固相化学合成法合成抗菌肽

a.树脂溶胀：多肽合成从C端到N端依次合成，称Fmoc-Dab-OH-Wang树脂倒入反应柱中浸泡30分钟，抽干。

b.脱保护：树脂浸泡30分钟后，抽掉溶液，然后脱保护，用哌啶进行脱保护反应30分钟。c.称料：在脱保护30分钟内，根据所做的量，算出每步需要的氨基酸，缩合剂，NMM的反应的量，然后进行称量下一步氨基酸。

d.脱保护洗涤：脱保护30分钟后，抽掉哌啶然后用DMF洗6遍，洗完6遍检测脱保护颜色，并记录。

e投料：洗完脱保护，检测完，按照顺序，依次加入称量好的料，然后加入少许反应液，然后加入碱和NMM。调气均匀，用DCM冲掉反应柱内壁上黏住的树脂，然后记录反应时间，反应30分钟。

f.反应后洗涤：将反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次。

g.检测：反应三十分钟后，抽掉反应液，用DMF洗3遍后检测，检查是否反应完全。

h.合成完毕后的洗涤和干燥：上述多肽，抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割。

切割：将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时。

过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。

洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次，

干燥：将以洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量，待纯化。

纯化：使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，加入反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析(如图1所示)，抗菌肽的纯度大于95％(如图2所示)。

实施例3

抗菌肽的生物学活性测定

1.抑菌活性的测定：采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(MIC)。将对数期的细菌稀释至10⁵CFU/mL。将50μL不同浓度的肽(肽的终浓度为1-128μM)和同等体积的细菌悬液添加到96孔板样孔中，同时以仅为培养基的孔作为阴性对照和细菌与培养基的孔作为阳性对照，然后将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。用酶标仪在OD值为492nm处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，Nap-Dab对于常见病原菌表现出较高的抑菌活性。

2.溶血活性的测定：收集新鲜的人红细胞悬浮液，并用无菌PBS(pH 7.4)稀释10倍。将50μL不同浓度的肽(肽的终浓度为1-256μM)和同等体积的红细胞悬浮液置于96孔板各孔中，阳性对照为使用0.1％ Triton X-100处理后的人红细胞悬浮液，阴性对照为未处理的人红细胞悬浮液。将96孔板置于37℃恒温培养箱孵育1小时。然后在4℃条件下离心5分钟(1000g)后从混合物中收集50μL上清液，并转移至新的96孔板中，用酶标仪在OD值为570nm处测定吸光度值。溶血率使用下列公式计算：

溶血率(％)＝[(样品OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)/(阳性对照OD₅₇₀—阴性对照OD₅₇₀)]×100％最小溶血浓度是抗菌肽引起15％溶血率时的浓度。检测结果见表3。

表3 抗菌肽溶血活性及治疗指数

抗酶解纳米抗菌肽Nap-Dab在检测范围内未表现出溶血活性，使用最小溶血浓度和最小抑菌浓度的几何平均数的比值计算其治疗指数，治疗指数达到28.5。

实施例4

纳米抗菌肽蛋白酶稳定性的测定

为了检测肽的抗蛋白酶的能力，使用10mg/mL的胃、胰、糜蛋白酶与肽(2.56mM)等体积混合，在37℃下孵育1小时，用未经过蛋白酶处理的肽作为对照，然后用测定最小抑菌浓度的方法(如实施例3步骤所述)测定最小抑菌浓度。

表4 蛋白酶处理后的Nap-Dab对E.coli 25922的最小抑菌浓度(μM)

通过表4可以看出，三种蛋白酶对E.coli 25922的抑菌活性没有发生变化，说明Nap-Dab具有较强的蛋白酶稳定性。

实施例5

抗菌肽的纳米表征

1、临界聚集浓度测定：为了检测抗菌肽形成纳米结构的能力，临界聚集浓度(CAC)使用1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)荧光探针测定。将1μL ANS(终浓度为1mM，溶解于100％ DMF中)加入不同浓度的多肽(溶解于去离子水中)，37℃孵育15min。将混合样品转移到96孔板上，使用F-4500荧光分光光度计(日立，日本)，激发波长为369nm，荧光光谱从发射波长为440nm监测到550nm。随后使用Origin软件计算多肽的CAC值。检测结果见图3-4。

随着浓度的上升，纳米抗菌肽Nap-Dab在440-550nm内荧光强度逐渐上升，表明溶液中存在纳米大分子，初步判定了纳米结构的形成，随后使用Origin软件拟合分析Nap-Dab的CAC值为7.78uM。

2、纳米形貌分析：为了进一步分析Nap-Dab的纳米形貌，将肽(2.56mM)在去离子水中稀释至7.78、32和256μM浓度，37℃培养箱中孵育24小时。将样品沉积在包碳网上，采取日立h-7800TEM(Hitachi,Japan)在100KV下用1％磷钨酸负染色15秒观察。检测结果见图5。纳米抗菌肽Nap-Dab在7.78μM形成细窄的纤维样，浓度达到32μM时形成纳米纤维厚度和长度增大，当浓度进一步提高到256μM时，多肽转变为更加紧密的球状胶束和纳米纤维的结合体。

Claims (4)

1.一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab，其特征在于，其氨基酸序列为Nap-^DNal-Nal-Dab-Dab-NH₂，其中，Nap为1-萘乙酸，^DNal为D型1-萘基丙氨酸，Nal为1-萘基丙氨酸，Dab为2,4-二氨基丁酸，其C端采用-NH₂酰胺化，其分子式如式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab的自组装方法，其特征在于，其自组装条件为：浓度为7.78-256μM，37℃孵育24小时。

3.根据权利要求1所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab的制备方法，其特征在于，方法如下：

(1)选择1-萘乙酸Nap作为疏水支架提供疏水作用力，选择1-萘基丙氨酸Nal作为疏水氨基酸与1-萘乙酸Nap组成疏水区域；选择2,4-二氨基丁酸Dab提供正电荷满足抗菌肽的基本条件，同时选择非天然氨基酸以避免蛋白酶的水解；

(2)将D型氨基酸^DNal放在N端，与第二个氨基酸Nal处于同一平面以促进整体分子自组装，多肽结构采取类表面活性剂模式以降低细胞毒性；

(3)用固相化学合成法合成该多肽，得出抗菌肽序列为：Nap-^DNal-Nal-Dab-Dab-NH₂，再经过抑菌活性的测定、溶血活性的测定及蛋白酶稳定性的测定，最终命名为抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab。

4.根据权利要求1所述的一种抗酶解型的纳米抗菌肽Nap-Dab在制备治疗革兰氏阴性菌或/和革兰氏阳性菌的感染性疾病的药物中的应用。