CN115925990B - 一种衍生自猪导管素的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种衍生自猪导管素抗菌肽及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，其序列如SEQ ID No.1所示，制备方法：通过在猪导管素Tritrpticin的氮端用GGG片段连接QRQEQR序列，得到杂合多肽RET，用固相化学合成法合成该多肽RET；进一步的，提供该抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用；该抗菌肽具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下未能引起10％的红细胞溶血；猪小肠上皮细胞IPEC‑J2在64μmol/L肽浓度下的存活率达到80％以上，综上，抗菌肽RET具有成为抗生素替代物的发展潜力。
Description
技术领域
本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自猪导管素的抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是生物体内广泛存在的一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，在动物，尤其是获得性免疫系统不健全的动物抵御外界微生物侵袭的过程中发挥了重要的作用。抗菌肽杀菌速度快且不易产生耐药性。因此，抗菌肽的研究已成为药物开发领域的研究热点，在细菌感染的药物开发方面有着广阔的应用前景。
目前，上千种抗菌肽已经从各种动植物体中提取出来，但因为其存在溶血、细胞毒性等副作用和体内稳定性差等缺点，很难实现临床应用。如何进一步获得抗菌性能好，生物相容性高，稳定性高的抗菌肽是领域内急需解决的问题。猪导管素Tritrpticin抗菌肽，对革兰氏阴性及阳性细菌具有较强的抗菌活性，但是其溶血值过高，细胞毒性大，本身不利于作为抗菌药物的使用。
发明内容
基于以上问题，本发明的目的在于公开一种衍生自猪导管素Tritrpticin的抗菌肽，对猪导管素Tritrpticin进行改造获得一种新的抗菌肽，提高猪导管素Tritrpticin的细胞选择性，在不降低抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性。
本发明的目的是这样实现的：一种衍生自猪导管素的抗菌肽RET，其序列如SEQ IDNo.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，
本发明的另一目的是提供如上所述的一种衍生自猪导管素菌抗菌肽RET的制备方法，方法如下：在猪导管素Tritrpticin的氮端使用序列GGG连接QRQEQR片段，杂合得到螺旋结构的多肽RET，用固相化学合成法合成该多肽RET，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其正电荷含量为5个，疏水值为-1.41；再经过抗菌活性的测定、溶血活性的测定及真核细胞毒性的测定，命名为抗菌肽RET。
本发明的另一目的是提供一种衍生自猪导管素抗菌肽RET在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的革兰氏阳性菌为：金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
进一步的，所述的革兰氏阴性菌为：大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或绿脓杆菌。
本发明的有益效果及优点如下：本发明的提高了猪导管素Tritrpticin细胞选择性，在不降低抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性。对抗菌肽RET进行抗菌和溶血活性检测，发现RET对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等五种菌种具有高效的抑制作用，且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下造成8.72％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血；且在64μmol/L肽浓度下猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的存活率83.7％。综上所述，RET是一种具有较高应用价值的抗菌肽，具备成为抗生素替代物的发展潜力。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽RET的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽RET的高效液相质谱图。
图3为本发明的抗菌肽RET与蜂毒素ME的溶血活性对比图。
图4为本发明的抗菌肽RET和蜂毒素ME对猪小肠上皮细胞的细胞毒性影响对比图。
具体实施方式
下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明：
实施例1
抗菌肽的设计
猪导管素Tritrpticin的氨基酸序列为：VRRFPWWWPFLRR；
通过在猪导管素Tritrpticin的氮端通过GGG片段连接QRQEQR，杂合获得的多肽命名为RET，其氨基酸序列为QRQEQRGGGVRRFPWWWPFLRR，为α螺旋结构；抗菌肽的氨基酸序列如表1所示。
表1氨基酸序列
分子式如式(Ⅰ)所示，
多肽RET的电荷数为+5，疏水值为-1.41。
实施例2
固相化学合成法合成RET抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(OD492nm)处测定光吸收值，,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，RET对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较高的抑菌活性。
表3短肽的最小溶血浓度MHC(μM)、平均最小抑菌浓度GM(μM)和选择指数SI值
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mLPBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，每组浓度3个重复。在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3。
通过图3可以看出，RET在检测范围内未表现出溶血活性，于对照组蜂毒素ME呈显著性差异。
3、真核细胞毒性的测定：采用MTT法，通过猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行细胞毒性检测。
(1)培养基的制备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的猪小肠上皮细胞IPEC-J2，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。
(2)待用细胞的试验处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×104的50μL细胞悬液。
(3)抗菌肽处理：另附96孔板第一孔内加10μL抗菌肽并倍比稀释后，取出50μL肽液加入原96孔板1-10孔，11孔加50μL完全培养基，12孔加100μL完全培养基。恒温培养4h；
(4)毒性检测：取50μL 5mg/mLMTT溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加150μLDMSO(二甲基亚砜)，酶标仪OD570nm测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。检测结果见图4。
通过图4可以看出，肽RET在检测范围内未表现出对猪小肠上皮细胞的毒性，于对照组蜂毒素ME呈显著性差异。
Claims (4)
1.一种衍生自猪导管素的抗菌肽RET，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，
2.根据权利要求1所述的一种衍生自猪导管素菌抗菌肽RET的制备方法，其特征在于，方法如下：在猪导管素Tritrpticin的氮端使用序列GGG连接QRQEQR片段，杂合得到螺旋结构的多肽RET，用固相化学合成法合成该多肽RET，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其正电荷含量为5个，疏水值为-1.41；抗菌活性的测定、溶血活性的测定及真核细胞毒性的测定，命名为抗菌肽RET。
3.根据权利要求1所述的一种衍生自猪导管素抗菌肽RET在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或绿脓杆菌。
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