CN106540240A

CN106540240A - 抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用

Info

Publication number: CN106540240A
Application number: CN201610979355.9A
Authority: CN
Inventors: 高荣; 万小平; 陈骞; 王泽洲; 胡立博; 黎凌; 陈建林; 吕学斌; 李江凌
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: CN106540240B

Abstract

本发明公开了抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用。本发明所提供的抗菌肽融合细胞因子CAMPILs为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的CAMPILs可以促进淋巴细胞、红细胞和白细胞的增殖，抑制致病微生物的生长，促进非特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)及疾病特异抗体的分泌，提高动物的免疫能力与存活率。

Description

抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用。

背景技术

养殖业(畜牧业和水产)为大农业的重要组成部份，是我国农业现代化和农村经济发展、社会稳定的重要根基之一，欧美先进国家养殖业均十分发达，都在大农业中占50％以上的比重。它为人类提供肉、奶、蛋、皮毛等高档食品及重要轻纺原料，畜产品是人们优质蛋白质、矿物质、维生素等营养物质的主要来源，其安全性直接关系到人类的身体健康。由于近年来畜产品引起的中毒、疾病传染等恶性事件不断发生，如欧洲的疯牛病、口蹄疫、亚洲的禽流感等，对畜牧生产和食品加工业造成了重大影响。动物疫病已成为影响畜产品安全、人类身体健康和社会稳定及广大农牧民增收致富的重要因素。在我国养殖业中，重要的动物传染性疾病多达30多种；我国现在不仅旧病未消灭，而且新病不断涌现，动物传染病的平均发病率和死亡率高达15－20％和8－10％左右，每年给我国的养殖业造成至少400多亿元的直接经济损失。现代人类正面临病原微生物感染难于控制的严峻挑战。因此高效防治传染性疾病和促进动物健康生长是保障我国养殖业提高经济效益和可持续发展的核心所在，也是保护人民食品卫生和生命健康迫切需要解决的重大科技难题；更是我国畜牧业面对世界范围的大市场，突破“绿色壁垒”，参与国际市场竞争，树立新形象的必然选择。

养殖业目前是我国农业和农村经济发展的主要支柱，2014年我国生猪出栏量达到7亿多头，猪肉产量达5670多万吨；四川的养殖业产值占农业总值的54％左右，对农民收入和农村发展影响重大。作为养殖业最重要基础之一的饲料工业也获得了巨大的进步，目前我国2014年猪用配合饲料产量达到8456万吨，浓缩料3000余万吨，添加剂预混合饲料近1000万吨。成为世界第二大生产国，四川饲料工业发展迅速，全省饲料总产量2013年工业饲料总产量达到1067.90万吨，其中猪饲料达到656.62万吨，占61.49％；禽料312.16万吨，占29.23％；水产饲料79.64万吨，占7.46％。

现在限制我国养殖业进一步发展和提高经济效益的主要问题是动物疾病的控制、动物产品质量提高和优质廉价饲料的开发生产。我国出口动物产品因检疫和药残质量较低，出口所占比例很低，如猪肉为23万多吨，仅占国际贸易量的4％左右。尤其是四川动物饲料的豆粕等蛋白质原料的90％和玉米等能量饲料原料的70％均依赖外部供给，这就严重制约了我省的畜牧业生产发展和经济效益的提高。因此，如何利用高新生物技术开发高效特色生物饲料，充分利用本地饲料资源，减少饲料中抗生类素添加剂的使用，克服动物产品的药残危害，保障绿色有机动物食品的生产，保护人民群众生命健康安全，已成为当代亟需解决的重大科技和社会经济难题。

目前中国畜禽养殖业随着集约化程度提高，畜禽养殖规模和养殖密度日益扩大，迫于控制30多种传染性病原感染传播扩散的压力，尤其是禽流感和呼吸繁殖综合症等烈性病相继循环爆发，使抗生素等药物添加剂在饲料的滥用情况非常严重，畜禽疾病和抗生素饲料添加剂的公害问题已经成为制约我国畜禽养殖业发展水平和经济效益提高的瓶颈。饲料抗生素添加剂的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，并且畜禽机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环，畜禽各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展。

动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区06年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也将严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高动物的免疫能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质在制备提高动物免疫能力产品中的应用；所述蛋白质是一种抗菌肽-融合细胞因子，其名称为CAMPILs，是如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与CAMPILs相关的生物材料在制备提高动物免疫能力产品中的应用；所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码CAMPILs的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码CAMPILs的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码CAMPILs的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2编码序列1所示的CAMPILs。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码CAMPILs的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CAMPILs的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CAMPILs且具有CAMPILs功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码CAMPILs的核酸分子的表达盒(CAMPILs基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CAMPILs的DNA，该DNA不但可包括启动CAMPILs基因转录的启动子，还可包括终止CAMPILs基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的载体构建含有所述CAMPILs基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pGAPZα A载体。

B3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码CAMPILs的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pG-P。所述pG-P为将pGAPZα A载体的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的CAMPILs基因，得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为毕赤酵母SMD1168。

上述应用中，所述重组微生物可为将含有编码CAMPILs的核酸分子的表达盒导入酵母中得到的重组微生物。所述重组微生物具体可为将含有CAMPILs表达盒的重组载体导入酵母中得到的重组微生物。在将重组载体导入所述酵母中，可直接将重组载体导入所述酵母中，也可现将重组载体线性化后再导入所述酵母中。所述酵母可为毕赤酵母SMD1168。

在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为将所述pG-P导入毕赤酵母SMD1168中得到的重组微生物。所述重组微生物的制备方法具体包括：将所述pG-P线性化，得到线性化pG-P；将所述线性化pG-P导入毕赤酵母SMD1168中，得到重组微生物，该重组微生物的名称为SMDpG-P。

上述应用中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述C1-C3中任一应用：

C1、CAMPILs或所述生物材料在提高动物免疫能力中的应用；

C2、所述重组微生物的发酵产物在制备提高动物免疫能力产品中的应用；

C3、所述重组微生物的发酵产物在提高动物免疫能力中的应用。

上述应用中，所述重组微生物的发酵产物可按照包括如下步骤的方法制备：培养所述重组微生物，使CAMPILs的编码基因表达，得到所述重组微生物的发酵产物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1-X4中任一产品：

X1、CAMPILs；

X2、所述生物材料；

X3、生物制剂，含有下述X3a、X3b或X3c：

X3a、CAMPILs；

X3b、所述生物材料；

X3c、所述重组微生物的发酵产物；

X4、用于提高动物免疫能力的成套试剂，由上述X1、X2或X3与抗生素组成。

上述产品中，所述生物制剂可以X3a、X3b或X3c为活性成分，还可以将X3a、X3b或X3c与其他可以提高动物免疫能力的物质组合在一起的组合物为活性成分。

上述产品中，所述重组微生物的发酵产物可按照包括如下步骤的方法制备：培养所述重组微生物，使CAMPILs的编码基因表达，得到所述重组微生物的发酵产物。

上述产品中，所述抗生素可为氨苄霉素和/或卡那霉素。

为解决上述技术问题，本发明还提供了提高动物免疫能力的方法，所述方法可包括对动物施用CAMPILs、所述生物材料或所述生物制剂，提高所述动物的免疫能力。

本发明中，所述提高动物免疫能力可为下述M1-M6中的任一种：

M1、抑制致病微生物的生长；

M2、促进免疫细胞的增殖；

M3、促进疫苗的免疫应答；

M4、促进细胞免疫和/或体液免疫；

M5、促进抗体的分泌；

M6、促进血红蛋白的分泌。

所述致病微生物可为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪肺炎支原体、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或猪瘟病毒(HCV或CSFV)，如大肠杆菌标准菌(G^-)、大肠杆菌耐药菌(G^-)、金黄色葡萄球菌标准菌(G⁺)或金黄色葡萄球菌耐药菌(G⁺)。

所述免疫细胞可为淋巴细胞(如CD4+或CD8+)、红细胞或白细胞。

所述抗体可为IgG、IgG1和/或IgG2a。所述抗体具体可为所述致病微生物的抗体。

所述疫苗具体可为针对所述致病微生物的疫苗。

本发明中，所述提高动物免疫能力具体可为提高所述动物对所述致病微生物的免疫能力，如提高对引发猪气喘病(MP)的猪肺炎支原体的免疫能力、对引发猪繁殖和呼吸障碍综合征(PRRS)的PRRSV的免疫能力或对引发猪瘟的猪瘟病毒(HCV或CSFV)的免疫能力。

本发明中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物具体可为猪或小鼠。

本发明中，所述提高动物免疫能力产品均可为提高动物免疫能力的药物。

实验证明，本发明的抗菌肽CAMPILs及含有CAMPILs基因的重组酵母的发酵产物具有以下作用：促进淋巴细胞、红细胞和白细胞的增殖，施用抗菌肽CAMPILs的动物体内淋巴细胞、红细胞和白细胞含量可提高10％以上；明显抑制致病微生物的生长，施用抗菌肽CAMPILs的致病微生物的量可降低达20％以上；促进非特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)及疾病特异抗体的分泌，施用抗菌肽CAMPILs的动物体内非特异性抗体和疾病特异抗体的含量可提高40％-60％；促进免疫相关基因的表达，进而提高动物的免疫能力与存活率，施用抗菌肽CAMPILs的动物存活率可提高60％以上。表明，可以利用本发明的抗菌肽CAMPILs及含有CAMPILs基因的重组酵母的发酵产物提高动物的免疫能力。

附图说明

图1为SMDpG-P中目的基因的RT-PCR结果。

图2为SMDpG-P中目的基因在蛋白质表达水平的检测结果。

图3为酵母菌株SMDpG-P发酵上清液和细胞裂解液猪淋巴母细胞增殖的影响。

图4为SGP对大肠杆菌标准菌的抑制作用。

图5为SGP对大肠杆菌耐药菌的抑制作用。

图6为SGP对金黄色葡萄球菌标准菌的抑制作用。

图7为SGP对金黄色葡萄球菌耐药菌的抑制作用。

图8为不同组别小鼠外周血红细胞在不同的处理下随时间的变化。

图9为不同组别小鼠外周血白细胞在不同的处理下随时间的变化。

图10为不同组别小鼠外周血血红蛋白在不同的处理下随时间的变化。

图11为不同组别小鼠外周血每10000个细胞里CD4+淋巴细胞的变化。

图12为不同组别小鼠外周血每10000个细胞里CD8+淋巴细胞的变化。

图13为不同组别小鼠外周血非特异性抗体IgG的变化。

图14为不同组别小鼠外周血非特异性抗体IgG1的变化。

图15为不同组别小鼠外周血非特异性抗体IgG2a的变化。

图16为不同组别小鼠外周血PRRS特异性抗体含量。

图17为不同组别小鼠外周血MP特异性抗体含量。

图18为不同组别小鼠外周血抗菌肽CAMP基因表达水平。

图19为不同组别小鼠外周血抗菌肽CRP4基因表达水平。

图20为不同组别小鼠外周血Th1型细胞因子TNF-α基因表达水平。

图21为不同组别小鼠外周血Th2型细胞因子IL4基因表达水平。

图22为不同组别小鼠外周血TLR型细胞因子TLR1基因表达水平。

图23为不同组别小鼠外周血免疫记忆相关因子IL7基因表达水平。

图24为不同组别小鼠外周血反馈调节基因TGF-β基因表达水平。

图8-图24中PRRS表示猪蓝耳病疫苗，MP表示支原体疫苗。

图25为不同组别小鼠经大肠杆菌攻毒实验后存活率。PRRS表示PRRS疫苗。

图26为各组仔猪净增重量。

图27为各组仔猪料肉比。

图28为仔猪生长期间红细胞的动态变化图。

图29为仔猪生长期间外周血中CD8+T淋巴细胞的动态变化图。

图30为仔猪生长期间外周血中CSF特异性抗体的动态变化图。

图31为仔猪生长期间外周血中PRRSV特异性抗体的动态变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pGAPZα A载体为Invitrogen公司产品，产品目录号为V20020。

下述实施例中的毕赤酵母SMD1168为Invitrogen公司产品，产品目录号为C17500。

下述实施例中的长白猪为四川省种猪性能测定中心简阳基地产品。

下述实施例中的藏猪为四川省种猪性能测定中心简阳基地产品。

下述实施例中的大肠杆菌标准菌(G^-)为ATCC(America Type CultureCollection)产品，产品目录号为25922。

下述实施例中的大肠杆菌耐药菌(G^-)为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室产品，公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的金黄色葡萄球菌标准菌(G⁺)为ATCC(America Type CultureCollection)产品，产品目录号为29213。

下述实施例中的金黄色葡萄球菌耐药菌(G⁺)为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室产品，公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的雌性ICR小鼠为四川省人民医院实验动物研究所产品。

实施例1、抗菌肽(CAMPILs)具有抑菌作用

本发明提供了一种抗菌肽，名称为CAMPILs，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，编码CAMPILs的核苷酸序列如序列2所示。

一、重组酵母SMDpG-P的制备

1、重组菌的制备

将pGAPZα A载体的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的CAMPILs基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pGAPZα A-P(简称pG-P)。pG-P能表达序列1所示的抗菌肽(CAMPILs)。

用AvrII酶切pG-P，得到线性化pG-P；将线性化pG-P导入毕赤酵母SMD1168中，筛选得到基因组中插入线性化pG-P的重组酵母，将该重组酵母命名为SMDpG-P。

用AvrII酶切pGAPZα A，得到线性化pGAPZα A；将线性化pGAPZα A导入毕赤酵母SMD1168中，筛选得到基因组中插入线性化pGAPZα A的重组酵母，将该重组酵母命名为SMDpG。

2、重组菌中目的基因在RNA水平上的表达检测

将SMDpG-P接种在含有100μg/ml Zeocin的YPD培养基中28℃，200rpm过夜培养，离心，得到SMDpG-P菌体。提取SMDpG-P菌体总RNA，用引物对(F：5’-GAAGCTGAATTCATGTATAAGATGCAGCTCTTGT-3’和R：5'-CGGTGTTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGAT-3')检测SMDpG-P中目的基因的表达量。用毕赤酵母SMD1168与SMDpG作为对照，结果显示，SMD1168与SMDpG中无目的条带，SMDpG-P中有目的条带，表明SMDpG-P中的CAMPILs基因得到了表达(图1)。图1中，泳道M为DNA分子量标准，泳道1和2均为SMDpG-P。

3、重组菌中目的基因在蛋白质水平上的表达检测

将SMDpG-P接种在含有100μg/ml Zeocin的YPD培养基中28℃，200rpm发酵培养，分别在发酵不同时间取发酵液进行离心，取上清液，用HIS-Tag的ELISA试剂盒检测上清液中的目的蛋白，用毕赤酵母SMD1168作为阴性对照。结果如图2所示，在发酵72小时目的蛋白的表达量最高。图2中，阴性对照为毕赤酵母SMD1168，SGP、SG2P与SG46P表示不同批次制备的产品(利用SMDpG-P发酵得到的上清液)。

二、SMDpG-P发酵产物体外生物学活性检测

1、SMDpG-P重组酵母发酵上清液和细胞裂解液的制备

按照如下方法进行发酵：

(1)将步骤一的SMDpG-P(以下简称SGP)接种于3mL培养基1(培养基1为向YPD培养基中加入博来霉素(Zeocin)得到的博来霉素的浓度为100mg/mL的液体培养基)中，28℃，200rpm培养过夜活化菌种。

(2)取300μL步骤(1)得到的菌液接种于含30mL YPD培养基的100mL三角瓶中，28℃，200rpm摇床发酵培养48h(OD₆₀₀为25)。

(3)取5mL步骤(2)得到的菌液，于12 000×g下离心2min，将得到的上清液命名为SGP发酵上清液，将得到的沉淀命名为沉淀1。

(4)用2mL PBS重悬洗涤步骤(3)的沉淀1，12 000×g离心2min，弃上清液后重复洗涤一次，将洗涤后的沉淀重选于500μL蜗牛酶溶液(蜗牛酶溶液为向无菌超纯水中加入蜗牛酶得到的蜗牛酶的浓度为20mg/mL的溶液)中，37℃作用30min,12 000×g离心2min，弃上清液，将得到的沉淀用1ml PBS重悬后，在液氮速冻3s，然后在37℃水浴中浸泡至冰冻菌液完全融解，重复液氮速冻与37℃水浴融解3次，12 000×g离心2min，弃沉淀，将得到的上清液命名为SGP细胞裂解液，-20℃冰箱备用。

(5)SGP发酵上清液和SGP细胞裂解液进行酶处理:先用pH试纸测SGP发酵上清液和SGP细胞裂解液的pH，再用2mol/L NaOH和1mo/L HCl分别调SGP发酵上清液和SGP细胞裂解液到胰蛋白酶的最适作用pH7.0以及胃蛋白酶的最适作用pH 2.0,加入胰蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液使其酶终浓度为0.5mg/mL，37℃水浴酶反应1h，得到胰蛋白酶处理的SGP发酵上清液、胰蛋白酶处理的SGP细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SGP发酵上清液和胃蛋白酶处理的SGP细胞裂解液，于-20℃冰箱备用。

按照上述方法，将SMDpG-P替换为SMDpG(以下简称SG)，其他步骤均不变，分别得到SG发酵上清液、SG细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SG发酵上清液、胰蛋白酶处理的SG细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SG发酵上清液和胃蛋白酶处理的SG细胞裂解液，于-20℃冰箱备用。

按照上述方法，将SMDpG-P替换为毕赤酵母SMD1168(以下简称SMD)，其他步骤均不变，分别得到SMD发酵上清液、SMD细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SMD发酵上清液、胰蛋白酶处理的SMD细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SMD发酵上清液和胃蛋白酶处理的SMD细胞裂解液，于-20℃冰箱备用。

2、SMDpG-P发酵产物对淋巴细胞增殖的影响

2.1、长白猪淋巴细胞的制备

在无菌条件下，用采血管(含EDTA-2K抗凝)采取长白猪前腔静脉外周血5mL，按照猪淋巴细胞分离液(使用前37℃预热分离液并充分震荡混匀)操作步骤进行分离长白猪淋巴细胞。

2.2、SMDpG-P发酵产物体外生物学活性检测

(1)将上述分离的猪淋巴细胞培养24h后，将培养皿中的长白猪淋巴母细胞转移至干净的15mL无菌离心管中，1500rpm室温离心15min收集细胞体。

(2)用RPMI1640完全培养基(含青链霉素双抗、10％胎牛血清)洗涤细胞，反复2次，1500rpm室温离心15min收集细胞沉淀。

(3)用含20mg/mLα-MM的RPMI1640完全培养基重选细胞并调整细胞个数为约6×10⁶个/mL，得到细胞悬浮液。

(4)按照排版向96孔细胞板每孔中加入75μL步骤(3)的细胞悬浮液、45μL样品液和30μL含20mg/mLα-MM(甲基甘露糖苷)的RPMI1640完全培养基。其中样品液分别为步骤1的SGP发酵上清液、SGP细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SGP发酵上清液、胰蛋白酶处理的SGP细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SGP发酵上清液、胃蛋白酶处理的SGP细胞裂解液以及SG发酵上清液、SG细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SG发酵上清液、胰蛋白酶处理的SG细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SG发酵上清液、胃蛋白酶处理的SG细胞裂解液、SMD发酵上清液、SMD细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SMD发酵上清液、胰蛋白酶处理的SMD细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SMD发酵上清液和胃蛋白酶处理的SMD细胞裂解液，每孔一种样品液，每种样品液三个复孔。分别采用只含有20mg/mLα-MM的RPMI1640完全培养基、PBS和步骤(3)的细胞悬浮液中作为空白对照。放置于5％CO₂、37℃细胞培养箱培养48h。

(5)取出96孔细胞板，每孔加入15μL CCK8(广州奕源生物科技有限公司)轻轻混匀后放入5％CO₂、37℃细胞培养箱继续培养2h，取出96孔细胞板，用酶标仪(Bio-Reader3350)检测每孔OD₄₅₀。

酵母菌株SGP与SG的发酵上清液和细胞裂解液对激猪淋巴母细胞增殖情况结果如图3所示(步骤(3)的细胞悬浮液中作为空白对照)。未经处理的SMD发酵上清液与SMD细胞裂解液以及经蛋白酶处理的SMD发酵上清液与SMD细胞裂解液的结果与相应的SG的结果基本无差异。在未经蛋白酶处理和经胰蛋白酶与胃蛋白酶处理下，与对照组空载毕赤酵母SG发酵上清液相比，SGP发酵上清液刺激猪淋巴母细胞得到的淋巴细胞均显著增加(P<0.05)；与对照组空载毕赤酵母SG细胞裂解液相比，SGP细胞裂解液刺激猪淋巴母细胞得到的淋巴细胞均显著增加(P<0.05)。未经蛋白酶处理和经胰蛋白酶与胃蛋白酶处理的SGP发酵上清液刺激猪淋巴母细胞得到的淋巴细胞间均无显著差异(P>0.05)，未经蛋白酶处理和经胰蛋白酶与胃蛋白酶处理的SGP细胞裂解液刺激猪淋巴母细胞得到的淋巴细胞间也均无显著差异(P>0.05)。表明，酵母菌株SGP及蛋白质CAMPILs可以显著刺激猪淋巴细胞增殖(P<0.05)。图3中，未处理表示未经蛋白酶处理的发酵上清液与细胞裂解液。

3、SMDpG-P发酵产物抑菌活性的检测

测定抗菌肽对大肠杆菌标准菌(G^-)(以下简称为S-G^-)、大肠杆菌耐药菌(G^-)(以下简称为R-G^-)、金黄色葡萄球菌标准菌(G⁺)(以下简称为S-G⁺)、金黄色葡萄球菌耐药菌(G⁺)(以下简称为R-G⁺)抑菌情况，具体方法如下：

首先将4种细菌菌株接种活化并培养其处于指数生长期(OD₆₀₀大约为0.5)，然后用LB培养液稀释到OD₆₀₀约0.005，将稀释后的菌液接种到96孔细胞培养板上，100μL/每孔，每个96孔细胞培养板一种细菌。

针对每个含有细菌的96孔细胞培养板按照以下方式处理：将100μL样品液加入实验孔中轻轻混匀，每个样品设3个重复孔，其中样品液分别为步骤1的SGP发酵上清液(即未处理的SGP发酵上清液)、SGP细胞裂解液(即未处理的SGP细胞裂解液)、胰蛋白酶处理的SGP发酵上清液、胰蛋白酶处理的SGP细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SGP发酵上清液、胃蛋白酶处理的SGP细胞裂解液，并将步骤1的SG发酵上清液、SG细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SG发酵上清液、胰蛋白酶处理的SG细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SG发酵上清液、胃蛋白酶处理的SG细胞裂解液、SMD发酵上清液、SMD细胞裂解液、胰蛋白酶处理的SMD发酵上清液、胰蛋白酶处理的SMD细胞裂解液、胃蛋白酶处理的SMD发酵上清液和胃蛋白酶处理的SMD细胞裂解液作为相应的空对照。每种菌均设四种抗生素梯度作为阳性对照，每种菌均设只加LB培养液作为阴性对照，并设不含菌的LB培养液作为空白对照。

将96孔细胞培养板置37℃培养箱孵育2h、16h后，分别用酶标仪(Bio-Reader3350)检测每孔OD₄₅₀值。

S-G^-和S-G⁺的四种抗生素梯度均如表1所示，R-G^-和R-G⁺的四种抗生素梯度均如表2所示。

表1、标准菌株抗生素梯度

注：表1中，“——”表示不含卡那霉素。

表2、耐药菌株抗生素梯度

结果显示，对于这四种菌中的每一种菌，SG的各种样品液与SMD的各种样品液的OD450与阴性对照的OD450的在2h与16h时均无显著差异，表明SG与SMD对对这四种菌均无抑制作用；SGP的各种样品液的OD450在2h与16h时均显著低于相应时间下的空对照的OD450(P<0.05)，6h时的结果如图4-图7所示，图4-图7中，空对照均为SG发酵上清液，未经蛋白酶处理和经胰蛋白酶与胃蛋白酶处理的SGP发酵上清液均与相应处理的SGP细胞裂解液间无显著差异(P>0.05)，表明，SGP的各种样品液及抗菌肽(CAMPILs)对这四种菌均有抑制作用，并且SGP的各种样品液及抗菌肽(CAMPILs)与抗生素(氨苄霉素和卡那霉素)联用时的抑菌效果更好。图4-图7中，SMDpG-P发酵上清均表示SGP发酵上清液，SMDpG-P发酵沉淀均表示SGP细胞裂解液。

实施例2、SMDpG-P发酵产物在小鼠体内生物学活性研究

1、发酵产物的准备

将实施例1步骤一的SMDpG-P(以下简称SGP)活化并接种于含30mL YPD培养基的100mL三角瓶中，在30℃，220rpm下培养48h，使OD₆₀₀约为25，得到SGP发酵液。

按照上述方法，将SMDpG-P替换为实施例1步骤一的SMDpG(以下简称SG)，其他步骤均不变，得到SG发酵液。

2、实验ICR小鼠分组

取80只18-20g 3周龄健康雌性ICR小鼠，随机分组8组，每组10只小鼠，组别编号为1-8，其中1组、4组、7组为SG阴性对照组，3组和6组为疫苗阴性对照组，2组、5组和8组为实验组。

3、小鼠饲养和疫苗接种

按照分组情况，用灌胃针将每次新鲜发酵液送至小鼠胃内，0.6mL/只，将第一次灌胃记为灌胃第0天，每隔两天灌胃一次，连续4周(即分别在灌胃第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天、第24天和第27天灌胃相应的发酵液，每次灌胃量均为0.6mL/只)。为保证重组蛋白不被代谢每次动物灌胃前要进行新鲜重组毕赤酵母菌液发酵。

接种疫苗时，只在灌胃第7天时肌肉注射(肌注)，0.2mL/只。具体操作如下所示(表3)，其中，猪繁殖和呼吸障碍综合征(PRRS)疫苗(蓝耳疫苗)和猪气喘病(MP)疫苗均为四川省华派生物制药有限公司产品。

表3、小鼠灌胃、疫苗接种剂量

表3中，灌胃均为发酵液的接种方式，0.6mL/只均为发酵液的接种剂量；肌注均为疫苗的接种方式，0.2mL/只均为疫苗的接种剂量。

分别在灌胃第0天灌胃前、灌胃第7天、灌胃第14天、灌胃第21天和灌胃第28天采取每只小鼠尾静脉血，进行如下实验内容：30μL全血与30μL生理盐水混匀后在血球计数仪做血常规；50μL全血做流式细胞测定；100μL全血提取RNA后实时定量免疫相关基因；100μL全血加1mL TRIZOL剧烈混匀-80℃保存备用；200μL全血低速离心收集血浆检测抗体。

4、攻毒实验

将大肠杆菌标准菌(G^-)接种于含0.1mg/ml氨苄霉素和0.1mg/ml卡那霉素LB液体培养基里活化，将活化后的新鲜菌液接种于LB液体培养基中37℃，1500rpm培养至对数期离心收集菌体，用新鲜的LB液体培养基将其重悬至5.0×10⁵CFU/ml，得到大肠杆菌发酵液。预实验摸索大肠杆菌发酵液对3周龄健康雌性ICR小鼠的半致死剂量，大肠杆菌发酵液对3周龄健康雌性ICR小鼠的半致死剂量为0.1ml。在灌胃第30天在每组中随机选取5只小鼠腹腔注射大肠杆菌发酵液，每只小鼠的注射量均为半致死剂量，腹腔注射当天也为攻毒后第0天。每24h观察一次小鼠的发病情况，并统计小鼠存活率，解剖观察死亡的小鼠内部器官的变化。

将大肠杆菌标准菌(G^-)接种于含0.1mg/ml氨苄霉素和0.1mg/ml卡那霉素LB液体培养基里活化，将活化后的新鲜菌液接种于LB液体培养基中37℃，1500rpm培养至对数期离心收集菌体，用新鲜的LB液体培养基将其重悬至5.0×10⁵CFU/ml，得到金黄色葡萄球菌发酵液。预实验摸索金黄色葡萄球菌发酵液对3周龄健康雌性ICR小鼠的半致死剂量，金黄色葡萄球菌发酵液对3周龄健康雌性ICR小鼠的半致死剂量为0.2ml。在灌胃第30天对每组中剩余的未注射大肠杆菌发酵液的5只小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌发酵液，每只小鼠的注射量均为半致死剂量，腹腔注射当天也为攻毒后第0天。每24h观察一次小鼠的发病情况，并统计小鼠存活率，解剖观察死亡的小鼠内部器官的变化。

5、实验结果分析

每组小鼠外周血红细胞、白细胞、血红蛋白变化分别如图8、9、10所示，图8-10中，空白对照表示SG发酵液，CAMPILs发酵产物表示SGP发酵液。结果显示，实验组小鼠外周血白细胞、血红蛋白的含量均显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(P<0.05)，都在免疫后21或28天达到峰值。红细胞含量较两个阴性对照组有所增加(P>0.05)。说明SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)能有效地刺激免疫细胞增殖。

参照流式细胞操作步骤处理样品，避光低温上机检测Th(CD4+淋巴细胞)、Tc(CD8+淋巴细胞)细胞数量。图11、12显示随机选取小鼠外周血每10000个细胞里CD4+和CD8+淋巴细胞的变化。由图可知，经免疫接种后的实验小鼠外周血CD4+和CD8+的含量均显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(P<0.05)，都在免疫后21或28天达到峰值。说明SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)具有刺激实验小鼠免疫应答的功能。

将低速离心收集的血浆按照ELISA试剂盒的操作步骤检测非特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a，并检测特异性抗体MP抗体、PRRS抗体的抗体滴度，采用的试剂盒分别为小鼠免疫球蛋白G1(IgG1)ELISA试剂盒(货号69-210245)、小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒(货号59-20037)、小鼠免疫球蛋白G(IgG2a)ELISA试剂盒(货号69-210250)、猪支原体抗体elisa试剂盒(货号69-40349)、猪蓝耳病毒ELISA试剂盒(货号69-40262)，以上各试剂盒均为武汉默沙克生物科技有限公司产品。图13、14、15显示经免疫接种后的实验小鼠外周血血清中IgG、IgG1、IgG2a水平较SG阴性对照组与疫苗阴性对照组显著增加(P<0.05)，都在免疫后14或21天达到峰值。说明SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)能刺激免疫小鼠体内产生更多的IgG、IgG1、IgG2a抗体。图16、17显示了经免疫接种后的实验小鼠外周血血清中PRRSV和MP(支原体)的抗体滴度。随着时间的增加，各个组的抗体滴度逐渐下降，但是实验组显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(P<0.05)。说明了SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)可以显著提高疫苗的免疫应答效果。

检测小鼠免疫相关基因在RNA水平上的表达情况，小鼠免疫相关基因及引物如表4所示，内参为肌动蛋白β-actin。

表4、定量引物

CRAMP和CRP4属于抗菌肽Cathelicidin和Defensin两个家族。结果如图18、19，总体显示，免疫接种后，实验组小鼠的基因表达水平均较SG阴性对照组与疫苗阴性对照组显著增加(P<0.05)，CAMP和CRP4基因的表达水平都在免疫后21天达到峰值。结果表明，SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)可以同时促进小鼠分泌产生更多抗菌肽。

TNF-α是重要的Th1型细胞因子，主要参与Th1细胞的分化和细胞免疫，其动态变化如图20所示，实验组显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(P<0.05)，且在免疫接种后第21天达到峰值。Th2细胞分泌IL4细胞因子，参与机体的体液免疫，其动态变化如图21所示，实验组显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(P<0.05)，且在21至28天达到峰值。结果表明，SMDpG-P发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)能够同时促进细胞免疫和体液免疫。

图22为TLR1基因表达水平的动态变化，结果显示免疫接种后，TRL1基因的表达水平明显上升(P<0.05)，且实验组小鼠的TLR基因表达水平较SG阴性对照组与疫苗阴性对照组显著增加(P<0.05)，在免疫后21天达到峰值。

图23为免疫记忆相关基因IL7表达水平的动态变化，总体显示，免疫接种后，实验组小鼠的基因表达水平均较SG阴性对照组与疫苗阴性对照组显著增加(P<0.05)，基因的表达水平都在免疫后35天达到峰值。

TGF-β主要由适应性调节T细胞分泌产生，对机体的免疫功能有重要的调节该功能。图24为TGF-β基因表达水平的动态变化，总体显示，免疫接种后，实验组小鼠的基因表达水平均较对照组显著增加(P<0.05)，TGF-β基因的表达水平在免疫后21天达到峰值。

攻毒后第5天，针对腹腔注射大肠杆菌发酵液的小鼠，实验组的小鼠存活率显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组(图25)，针对腹腔注射金黄色葡萄球菌发酵液的小鼠，实验组的小鼠存活率显著高于SG阴性对照组与疫苗阴性对照组，说明实验组的SGP及抗菌肽(CAMPILs)能够有效的保护小鼠，使其对大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)的抵抗力显著增强。对死亡小鼠经过解剖发现，大肠杆菌致死的小鼠腹腔内消化道有明显病变，脾脏发黑，肝脏发黑，金黄色葡萄球菌感染致死的小鼠腹腔内消化道无明显病变，脾脏发黑，肝脏正常。

实施例3、SMDpG-P发酵产物在仔猪体内生物学活性研究

1、发酵产物的准备

将实施例1步骤一的SMDpG-P(以下简称SGP)活化并接种于含30mL YPD培养基的100mL三角瓶中，在30℃，220rpm下培养48h，使OD₆₀₀约为40，得到SGP发酵液。

2、实验动物饲喂发酵液

选取17头体重约8kg的45日龄健康藏猪，其由四川省种猪性能测定中心简阳基地提供，随机分为实验组(9头)与对照组(8头)。对实验组每头猪饲喂步骤1的SGP发酵液，对对照组每头猪饲喂步骤1的SG发酵液，饲喂量均为12.5ml/kg体重，喂养28天，每隔1天饲喂一次，将第一次饲喂前一天记为喂养0天。分别在喂养0天、7天、14天、28天、42天对所有仔猪采血前腔静脉血3-4mL于含有EDTA-K2真空管中，其后用于血样的免疫细胞变化，在喂养0天、28天、56天对所有仔猪称重。

实验仔猪体重及料肉比变化：

在喂养0天、14天、28天和42天对各组实验仔猪进行称重，结果(图26)显示，实验组仔猪在喂养14天、28天和42天平均增加的体重分别为对照组的1.72、1.38和1.19倍，差异均达到显著水平(P＜0.05)。计算仔猪生长料肉比，料肉比＝消耗饲料(即发酵液)(mL)/体重增加量(kg)，结果(图27)显示，实验组仔猪在喂养14天、28天和42天的料肉比分别为对照组的0.93、0.97和0.90倍，差异均达到显著水平(P＜0.05)。说明SGP及抗菌肽(CAMPILs)可以更有效地促进仔猪对饲料的消化吸收。

实验仔猪外周血红细胞数量的动态变化：

将在喂养0天、14天、28天和42天取的血样按组别混合在一起，用常规血细胞分析仪测量血样中红细胞的数量。结果(图28)显示，在喂养0天、14天、28天和42天SGP实验组红细胞数量显著高于SG对照组(P<0.05)。说明SGP发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)可以有效地增加使用对象的外周血免疫细胞数量，从而增强免疫。

实验仔猪外周血CD8+T淋巴细胞亚群的检测：

将在喂养0天、14天、28天和42天取的血样按组别混合在一起，用于流式细胞检测外周血中CD8+T淋巴细胞亚群的数量，采用Mouse Anti-Porcine CD8a-SPRD(SouthernBiotech公司，货号4520-13)和1μl Mouse Anti-Porcine CD3ε-FITC(Southern Biotech公司，货号4510-02)进行，具体步骤如下：

(1)取新鲜抗凝猪仔静脉血100μl(白细胞数量约为10⁵-10⁷个)，加入60μl生理盐水；

(2)吸取2μl Mouse Anti-Porcine CD8a-SPRD(Southern Biotech公司，货号4520-13)和1μl Mouse Anti-Porcine CD3ε-FITC(Southern Biotech公司，货号4510-02)至1.5mlEP管中，混匀，孵育20min；

(3)流式细胞仪专用试管中加入0.2ml 10x红细胞裂解液，再加入1.8mlPBS，将孵育好的血液加入裂解液中，裂解5min,待血细胞裂解完全；

(4)1500rpm离心5min,弃上清。加入2mlPBS,吹打混匀，悬浮细胞；

(5)1500rpm离心5min,弃上清，留约150μl PBS轻轻吹打混匀，共洗涤1-2次，洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍；

(6)用150μl PBS吹打混匀细胞待检测。

结果(图29)显示，在喂养0天、14天、28天和42天，SGP实验组CD8+T淋巴细胞数量均显著高于SG对照组(P<0.05)。说明SGP发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)可以有效地刺激仔猪的免疫应答功能。

CSF和PRRSV特异性抗体的ELISA检测：

将低速离心收集的血浆按照ELISA试剂盒(猪瘟抗体(CSF Ab)elisa试剂盒、猪蓝耳病毒ELISA试剂盒)的操作步骤检测特异性抗体。

图30和31分别为仔猪生长期间外周血中猪瘟(CSF)特异性抗体(猪瘟抗体)和PRRSV特异性抗体(PRRSV抗体)的动态变化图，图中明显可见，在喂养0天、14天、28天和42天，SGP实验组中两种特异性抗体的数量均显著高于SG对照组(P<0.05)。说明SGP发酵产物及抗菌肽(CAMPILs)可以显著地增强疫苗的免疫应答，从而增加疫苗的保护率。

<110> 四川大学

<120> 抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Tyr Lys Met Gln Leu Leu Cys Cys Ile Ala Leu Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Met Ala Asn Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Thr Lys Lys

20 25 30

Gln Leu Glu Pro Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Lys Glu Val

35 40 45

Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Asp Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Val

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Gly Val Leu Asn Leu Gly Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Asp Ser Ala Asn Ile Lys Glu Ser Met Asn Asn Ile Asn Val

100 105 110

Thr Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Phe Lys Cys Glu Tyr

115 120 125

Asp Asp Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr

130 135 140

Phe Cys Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Gly Ser Gly Glu Gly Arg

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

165 170 175

Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala

180 185 190

Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile

195 200 205

Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp

210 215 220

Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe

225 230 235 240

Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser

245 250 255

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr

260 265 270

Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro

275 280 285

Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Gly

290 295 300

Lys Arg Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Arg Arg Phe Pro Trp

305 310 315 320

Trp Trp Pro Phe Leu Arg Arg Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Arg

325 330 335

Ile Ile Asp Leu Leu Trp Arg Val Arg Arg Pro Gln Lys Pro Lys Phe

340 345 350

Val Thr Val Trp Val Arg Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Arg Gly

355 360 365

Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val Gly Arg

370 375 380

Gly

385

<210> 2

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60

gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120

ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180

acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240

gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300

gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360

gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420

aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga ctggaagcgg agagggcagg 480

ggaagtcttc taacatgcgg ggacgtggag gaaaatcccg ggccaatgag atttccttca 540

atttttactg cagttttatt cgcagcatcc tccgcattag ctgctccagt caacactaca 600

acagaagatg aaacggcaca aattccggct gaagctgtca tcggttactc agatttagaa 660

ggggatttcg atgttgctgt tttgccattt tccaacagca caaataacgg gttattgttt 720

ataaatacta ctattgccag cattgctgct aaagaagaag gggtatctct cgagaaaaga 780

gaggctgaag ctaggagacg tccccgaccc ccatatttgc caaggccaag gccacctccg 840

tttttcccac caaggttgcc accacgtatc ccaccagggt tcccaccaag gttcccacca 900

cggttccccg gaaaacgggg atccggagat gacgatgaca aggtacgacg tttcccatgg 960

tggtggcctt tcttgcgacg tggatccgga gatgacgatg acaagaggat tattgacttg 1020

ttgtggagag tacgtcggcc acagaaaccc aaatttgtga ctgtatgggt cagaggatcc 1080

ggagatgacg atgacaagag gggaggtcgc ctgtgctatt gtaggcgtag gttctgcgtc 1140

tgtgtcggac gaggatag 1158

Claims

1.蛋白质在制备提高动物免疫能力产品中的应用；所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在制备提高动物免疫能力产品中的应用；所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述重组微生物为将含有编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子的表达盒导入酵母中得到的重组微生物。

5.下述C1-C3中任一应用：

C1、权利要求1中所述蛋白质，或权利要求2-4中任一所述生物材料在提高动物免疫能力中的应用；

C2、权利要求2-4中任一所述重组微生物的发酵产物在制备提高动物免疫能力产品中的应用；

C3、权利要求2-4中任一所述重组微生物的发酵产物在提高动物免疫能力中的应用。

6.根据权利要求1-5中任一所述应用，其特征在于：所述提高动物免疫能力为下述M1-M6中的任一种：

M1、抑制致病微生物的生长；

M2、促进免疫细胞的增殖；

M3、促进疫苗的免疫应答；

M4、促进细胞免疫和/或体液免疫；

M5、促进抗体的分泌；

M6、促进血红蛋白的分泌。

7.根据权利要求6中所述应用，其特征在于：所述致病微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪肺炎支原体、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒或猪瘟病毒；

所述免疫细胞为淋巴细胞、红细胞或白细胞；

所述抗体为IgG、IgG1和/或IgG2a。

8.根据权利要求1-7中任一所述应用，其特征在于：所述动物为H1-H3中的任一种：

H1、哺乳动物；

H2、猪；

H3、小鼠。

9.下述X1-X4中任一产品：

X1、权利要求1中所述蛋白质；

X2、权利要求2-4中任一所述生物材料；

X3、生物制剂，含有下述X3a、X3b或X3c：

X3a、权利要求1中所述蛋白质；

X3b、权利要求2-4中任一所述生物材料；

X3c、权利要求2-4中任一所述重组微生物的发酵产物；

10.提高动物免疫能力的方法，包括对动物施用权利要求1中所述蛋白质、权利要求2-4中任一所述生物材料或权利要求9所述生物制剂，提高所述动物的免疫能力。