CN104784686A

CN104784686A - Tgev、pedv二联活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN104784686A
Application number: CN201410022451.5A
Authority: CN
Inventors: 王贵华; 侯艳红; 赵亚荣; 于萍萍; 刘明明; 满坤; 陈翠云; 卢会英
Original assignee: BEIJING KEMUFENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd; FUZHOU DA BEI NONG BIOTECH Co Ltd; Veterinary Medicine Research Center Of Beijing Da Bei Nong Science And Technology Group Co Ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: ANIMAL MEDICINE RESEARCH CENTER OF BEIJING DABEINONG SCIENCE & TECHNOLOGY GROUP; Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN104784686B

Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联活疫苗及其制备方法。本发明采用自行分离、致弱、保存的一株猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株和一株猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株，分别在ST细胞和VeroE6细胞上进行病毒增殖，再向检验合格的病毒液中加入冻干保护剂进行配苗、冷冻干燥。该二联活疫苗能够有效预防目前临床上流行的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种疾病。

Description

TGEV、PEDV二联活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒二联活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE）是引起猪腹泻的一种重要接触性病毒性肠道传染病，发病快，对2周龄以内仔猪有高度致死率，几乎能达到100%。5周龄以上的猪病死率较低，但是由于腹泻的影响，生长慢，饲料报酬低，造成严重的经济损失。该病1946年由Doyle等人确定了病原。从60年代末起，我国许多省市有该病流行。

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea, PED）是引起猪腹泻的一种高度急性、接触性病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物抵抗猪流行性腹泻病毒，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均属冠状病毒科成员，二者引起的临床症状疾病的流行特点均及其相似，但是却没有免疫学和血清学相互交叉反应。猪群可单一或混合感染这两种病毒。为防控猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻，国内外专家做了很多研究，但目前仍无特效药物。

免疫接种是防制该病的重要手段，国内外有使用疫苗的报道，但是效果不尽人意。尤其近几年，原来的疫苗对猪腹泻病的保护越来越差，临床上不断出现腹泻病例，这除了加强饲养管理外，尽快研制出一种能够有效防制猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的疫苗已成当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供由本发明人自行分离、致弱、保存的一株猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株和一株猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株，利用两毒株制备一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，用于防制目前流行的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种疾病。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联活疫苗，其含有猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株和猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株，所述的猪传染性胃肠炎病毒HB08株的保藏号为CGMCC No.7807，病毒含量为10^6.5~10^8.0TCID₅₀/ml，所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株的保藏号为CGMCC No.7806，病毒含量为10^6.5~10^7.5TCID₅₀/ml。

在本发明的实施方案中，所述二联活疫苗还含有冻干保护剂。

其中，所述的冻干保护剂优选为蔗糖明胶保护剂，其中明胶浓度2%~6%，蔗糖浓度10%~35%。

从河北省某猪场送检猪传染性胃肠炎抗原阳性的病料中分离到TGEV。将分离到的猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代，从第125代开始ORF3基因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失，至165代稳定缺失81个核苷酸。从第125代开始，TGEV 对仔猪失去致病性；将TGEV 145代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象

将125~165代致弱毒株种毒命名为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为：CGMCC No.7807。

从浙江某猪场送检猪流行性腹泻抗原阳性的病料中分离到PEDV。将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero E6细胞上连续传代，从第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，至第145代均保持稳定缺失49个核苷酸序列。从第105代开始，PEDV 对仔猪失去致病性；将PEDV 125代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象

将105~145代致弱毒株种毒命名为猪流行性腹泻病毒 ZJ08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为：CGMCC No.7806。

本发明还提供所述二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1）、分别制备猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株病毒液；

2）、将制备的TGEV和PEDV病毒液按照1:1~1:2的比例混匀后按7:1的比例加入冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，即得。

其中，将猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株分别以0.5%~5%的接毒量接毒到生长良好的单层培养细胞ST和Vero E6细胞上，35℃~37℃吸附0.5~1.5小时后，补足细胞生长维持液，继续培养，当CPE达到80%~90%时收毒，获得猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株的病毒液。

本发明还提供所述的二联活疫苗在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

将本发明制备的二联活疫苗经肌肉注射3～5日龄TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产仔猪5头，每头10头份，连续观察14日，仔猪均无不良反应。

将本发明制备的二联活疫苗免疫TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3～5日龄仔猪10头，各肌肉注射疫苗1头份（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），接种14日后，将10头仔猪分成2组，每组5头，其中一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪传染性胃肠炎病毒pl株1ml；另一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株1ml，均观察7日。结果二联苗接种猪均100%获得保护，而对照组则100%发病死亡。

将本发明制备的二联活疫苗与市售商品苗进行对比试验，结果经本发明免疫的仔猪对强毒攻击的保护率比市售商品苗的保护率高20个百分点。

附图说明

图1 TGEV CPE图片（400×）。

图2 TGEV 分离毒S基因PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阴性对照。

图3 TGEV分离毒ORF3基因PCR扩结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2：阴性对照。

图4 不同代次TGEV ORF3序列比对。

图5 PEDV CPE图片（400×）。

图6 PEDV 分离毒S基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNA Marker DL2000。

图7 PEDV分离毒ORF3基因PCR扩结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNA Marker DL2000。

图8 不同代次PEDV（ZJ08株）ORF3序列比对。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 弱毒株来源

一、猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株

取河北某猪场猪传染性胃肠炎抗原阳性病料，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的ST细胞，同时设置空白细胞作为对照。传至第17代时出现明显、稳定的CPE变化（图1）。根据S基因设计检测引物对：S-F:5’-TATTTGTGGTYTTGGTYGTAATGC-3’；S-R: 5’-GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3’，以95℃45S、50℃45S、72℃1min进行32个循环后，72℃延伸5min。扩增S基因片段为886bp，结果见图2。

扩增ORF3序列的引物为：

ORF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3’

ORF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3’

扩增的片段的大小为1202bp（图3）

将分离到的猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至165代。将第165代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为886bp。

TGEV ORF3基因序列在第20代、40代、70代、100代处于比较稳定的的状态，有个别碱基的变化，但没有改变氨基酸；而第125代开始ORF3基因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失（起始密码子前30个核苷酸、后51个核苷酸连续81个核苷酸缺失），第125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸（序列如SEQ ID No.5所示）。结果如图4。

按现行《中国兽药典》附录对第125~165代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离到的TGEV 125-165代TGEV致弱株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No. 7807，保藏时间是2013年6月28日。

二、猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株

取浙江某猪场猪流行性腹泻抗原阳性病料，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的Vero E6细胞，同时设置空白细胞作为对照。传至第24代时出现明显、稳定的CPE变化（图5）。根据S基因设计检测引物对：正向引物为5’-GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’；反向引物为5’-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3’， 95℃预变性5min，95℃ 45s 、50℃ 1min、72℃ 2min进行32个循环后，72℃5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图6。

扩增ORF3序列的引物为：

ORF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG

ORF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA

扩增的ORF3的片段的大小为：833 bp（图7）。

将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero E6细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。

PEDV ZJ08株ORF3基因序列在第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，至第145代均保持稳定缺失49个核苷酸序列，如SEQ ID No. 10所示。结果如图8。

按现行《中国兽药典》附录对第105~145代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离致弱的105~145代致弱株种毒命名为PEDV ZJ08株，其微生物保藏号是CGMCC No. 7806；保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所。

实施例2 弱毒株特性

一、猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株

将第125代及165代病毒分别用DMEM液稀释至10^3.0 TCID₅₀/ml，与等量的TGEV特异性血清混合，置37℃中和1小时，接种长满ST细胞单层的96孔细胞板6孔，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和仅接种细胞维持液的阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变。结果试验组细胞无病变，而病毒对照组出现典型CPE变化。

将猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株第145代种毒以10^7.0TCID₅₀/头的剂量接种3日龄健康仔猪3头，观察10日后剖杀，刮取肠绒毛及内容物，用5倍（重量:体积）无菌生理盐水制备悬液，再以口服的方式接种健康仔猪。同时选取3头相同条件的仔猪，不做任何接种，与接种悬液的3头猪同圈饲养，在同圈后3日、7日、10日、14日、21日检测同居感染情况（RT-PCR方法与实施例2中提到的方法相同），并于同居后7日、14日、21日检测TGEV 中和抗体水平。按此方法连传5代，结果表明，在5代中，接种仔猪均未出现腹泻症状，剖检未见病理变化。表明猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株在5代以内未出现毒力返强现象，不能发生同居感染，在猪体内具有很好的稳定性。

二、猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株

将第105代及145代病毒分别用DMEM液稀释至10^3.0 TCID₅₀/ml，与等量的TGEV特异性血清混合，置37℃中和1小时，接种长满ST细胞单层的96孔细胞板6孔，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和仅接种细胞维持液的阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变。结果试验组细胞无病变，而病毒对照组出现典型CPE变化。

将猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株第125代种毒采用与本实施例中猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株相同的方案检验，在猪体传代5次，检验毒株的稳定性。结果表明，在5代中，接种仔猪均未出现腹泻症状，剖检未见病理变化，未发生同居感染情况。表明猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株在5代以内未出现毒力返强现象，在猪体内具有很好的稳定性。

三、安全性

将猪传染性胃肠炎弱毒HB08株第165代和猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株第145代稀释为10^6.0TCID₅₀/ml（10头份），每种病毒分别选用3日龄仔猪5头，经肌肉注射，每头1ml，观察14天，对照组5头注射相同剂量的生理盐水；另外，选产前一个半月的怀孕母猪5头，每头肌肉注射20头份，对照组母猪5头，注射相同剂量的生理盐水；观察母猪的采食、体温、腹泻及流产等指标，并统计母猪的产仔数。

结果显示大剂量注射上述两种病毒对仔猪和母猪均无任何影响，没有出现发烧、腹泻和局部炎症等情况，母猪未发生流产、死胎等繁殖障碍，试验组与对照组无明显差异，母猪产仔数在9-15头，属于正常范围。试验表明本发明两个弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。

四、免疫原性

选用3日龄TGEV 、PEDV抗体阴性仔猪20头，平均分成ABCD四组，A组肌肉注射TGEV 第125代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），B组肌肉注射TGEV 第165代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），C组肌肉注射PEDV第105代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）， D组肌肉注射PEDV第145代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；再选相同条件仔猪10头做对照（E组），注射相同剂量的生理盐水。接种14日后，AB组及E组5头猪同时口服1000×MID/ml的猪传染性胃肠炎病毒pl株（甘肃省畜牧兽医研究所提供第5代组织强毒）1ml，CD组及E组另5头猪同时口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml，观察7天，结果ABCD 四组猪均100%保护，对照组猪均全部发病。

实施例3 二联疫苗的制备

一制苗用病毒液的制备

用猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株第155代和猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株第135代毒种分别接种生长良好的单层细胞ST和Vero E6，弃去细胞生长液，按照2%的接毒量接毒，37℃吸附1小时后，补足细胞生长维持液，继续培养。CPE达到80%时收毒，于-20℃/室温冻融3次，将同一批病毒混合在一起。采用此方法制备2批疫苗的病毒液，同时抽样进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和病毒含量的测定。选用病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml的病毒液用于制苗。

二配苗与冻干

将制备的TGEV和PEDV病毒液按照1:1的比例混匀后，按7:1的比例加入蔗糖明胶常规冻干保护剂，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥。

实施例4 二联疫苗成品检验

一疫苗性状及纯净性检验

2批疫苗按现行《中国兽药典》进行性状、剩余水分、真空度、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验等项目的检测，均符合兽用生物制品通则的规定。

二安全检验

将疫苗用灭菌生理盐水稀释为每毫升含10头份（每头份病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），肌肉注射3～5日龄TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产仔猪5头，每头1ml，连续观察14日，仔猪均无不良反应。

三效力检验

（一）将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含1头份（10^5.0TCID₅₀/ml），然后用DMEM作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 4个稀释度。

1）猪传染性胃肠炎病毒含量测定每个稀释度分别加入等量的PEDV特异性阳性血清，置37℃中和1小时，接种于已长成良好ST细胞单层的96孔培养板，每个稀释度接种6孔，35℃~37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果每头份病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀。

2）猪流行性腹泻病毒含量测定每个稀释度分别加入等量的TGEV特异性阳性血清，置37℃中和1小时，接种于已长成良好Vero E6细胞单层的96孔培养板，每个稀释度接种6孔，35℃~37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果每头份病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀。

（二）免疫攻毒取TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3～5日龄仔猪10头，各肌肉注射疫苗1ml（1头份，病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），观察14日。将10头仔猪分成2组，每组5头，其中一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪传染性胃肠炎病毒pl株（甘肃省畜牧兽医研究所提供第5代组织强毒）1ml；另一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml，均观察7日。结果二联苗接种猪均100%获得保护，而对照组则100%发病死亡。

四与同类疫苗的比较试验

取3～5日龄TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的仔猪20头，随机均分成2组，每组10头。一组经肌肉注射本发明二联活疫苗，每头1头份（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），命名为免疫1组；一组经后海穴注射原商品化疫苗，每头1头份（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）,命名为免疫2组；同时选取相同条件仔猪20头作为对照，等分为2组，分别经肌肉和后海穴注射生理盐水1ml，见表1。

接种后14日，将两个免疫组每组10头仔猪分成2组，每组5头，其中一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪传染性胃肠炎病毒pl株（甘肃省畜牧兽医研究所提供第5代组织强毒）1ml；另一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml，均观察7日，免疫1组使用猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（HB08株+ZJ08株）免疫后，经组织强毒攻击，没有仔猪发病，保护率达到100%；免疫2组使用市售疫苗免疫后，经组织强毒攻击有1只仔猪出现临床症状且发生死亡，对流行毒株产生了80%的保护，而各对照组全部发病，见表2。本发明制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（HB08株+ZJ08株）免疫动物后免疫效力略高于同类产品。

表1 效力试验设计和分组情况

组别	制品名称	接种剂量（头份/头）	仔猪数量（头）	攻击强毒	攻毒量(1000×MID/ml)
						免疫1组	本发明二联活疫苗（HB08株+ZJ08株）	1	10	TGEV强毒pl株/PEDV强毒p55株	1
免疫2组	市售疫苗	1	10	TGEV强毒pl株/PEDV强毒p55株	1
						对照组	/	/	20	TGEV强毒pl株/PEDV强毒p55株	1

表2 各组发病和死亡情况

注：“/”表示未注射疫苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心

福州大北农生物技术有限公司

北京科牧丰生物制药有限公司

北京大北农科技集团股份有限公司

<120> TGEV、PEDV二联活疫苗及其制备方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatttgtggt yttggtygta atgc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggctgtttgg taactaattt rcca 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattgaaaaa gtgcacgtcc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caacaggaac cagaaaaatg a 21

<210> 5

<211> 1121

<212> DNA

<213> TGEV ORF3

<400> 5

attgaaaaag tgcacgtcca ttaaatttaa aatgttaatt ttattatctg ctataatagc 60

atttgttgtt aaggatgatg aataaagtcc ttaagacttg attgtgcata ctttgctgta 120

actcttaaag tagaatttaa gactggtaaa ttacttgtgt gtataggttt tggtgacaca 180

cttcttgcgg ctagggataa agcatatgct aagcttggtc tctccattat tgaagaagta 240

aacacacaaa atccaaagca ttaagtgtta caaaacaatt aaagagagat tatagaaaaa 300

ctgtcattct aaacttcatg cgaaaatgat tggtggactt tttcttaata ctctgagttt 360

tgtaattgtt agtaaccatt ctattgttaa taacacagca aatgtgcatc atataaaaca 420

agaacgtgtt atagtacaac agcatcaggt tgttagtgct agaacacaaa attattaccc 480

agagttcagc atcgctgtac tttttgtatc ttttctagct ttgtaccgta gtacaaactt 540

taagacgtgt gtcggcatct taatgtttaa gattttatca atgacacttt taggacctat 600

gcttatagca tatggttact acattgatgg cattgttaca acaactgtct tatctttaag 660

atttgcctac ttagcatact tttggtatgt taatagtagg tttgaattta ttttatacaa 720

tacaacgaca ctcatgtttg tacatggcag agctgcaccg tttaagagaa gttctcacag 780

ctctatttat gtcacattgt atggtggcat aaattatatg tttgtgaatg acctcacgtt 840

gcattttgta gaccctatgc ttgtaagcat agcaatacgt ggcttagctc atgctgatct 900

aactgtagtt agagcagttg aacttctcaa tggtgatttt atttatgtat tttcacagga 960

gcccgtagtc ggtgtttaca atgcagcctt ttctcaggcg gttctaaacg aaattgactt 1020

aaaagaagaa gaagaagacc gtacctatga cgtttcctag ggcattgact gtcatagatg 1080

acactggaat ggtcattagc atcattttct gggtcctgtt g 1121

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggatactttg gcctcttgtg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcactcgga ttactcacag c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcctagactt caaccttacg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtgacaagt gaagcacaga 20

<210> 10

<211> 626

<212> DNA

<213> PEDV ZJ08 ORF3

<400> 10

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct 60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt 240

ctttttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc tggcgctata 300

aaaatgcgct ctttattatc tttaatacta cgacactttc tttcctcaat ggtaaagcag 360

cttattatga cggcaaatcc attgtgattt tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg 420

gcaactcttt tgttgctttc gttagtagca ttgacttgta tctagctata cgtgggcggc 480

aagaagccga cctacagctg ttgcgaactg ttgagcttct tgatggcaag aagctttatg 540

tcttttcgca acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag 600

acgagtatgc tacaattagt gaatga 626

Claims

1.猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联活疫苗，其含有猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株和猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株，所述的猪传染性胃肠炎病毒HB08株的保藏号为CGMCC No.7807，病毒含量为10^6.5~10^8.0TCID₅₀/ml，所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株的保藏号为CGMCC No.7806，病毒含量为10^6.5~10^7.5TCID₅₀/ml。

2.如权利要求1所述的二联活疫苗，其特征在于，还含有冻干保护剂。

3.如权利要求2所述的二联活疫苗，其特征在于，所述的冻干保护剂为蔗糖明胶保护剂，其中明胶浓度2%~6%，蔗糖浓度10%~35%。

4.权利要求1~3任一项所述的二联活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株分别以0.5%~5%的接毒量接毒到生长良好的单层培养细胞ST和Vero E6细胞上，35℃~37℃吸附0.5~1.5小时后，补足细胞生长维持液，继续培养，当CPE达到80%~90%时收毒，获得猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株的病毒液。

6.权利要求1~3任一项所述的二联活疫苗在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。