CN108704129A - 一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法 - Google Patents

一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法。本发明的一种冻干保护剂，包括质量百分比如下组分组成：蔗糖，卡波姆，PEG8000，丙氨酸，L‑半胱氨酸，硫酸锌，酶解明胶，余量为水。本发明的一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)病毒储存液制备；(2)疫苗制备，制得猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。本发明通过添加冻干保护剂，降低了病毒保存和冻干过程中的损伤，提高了产品在保存和使用中的稳定性；本发明不仅实现了储运过程中冷藏保存，保存期延长到2‑8℃保存36个月，可以进行口服免疫，有效减少免疫应激发生。

Description

一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TEGV)引起的一种多发高度接触性急性肠道传染病，以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常100％)为特征。猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。TGE和PED在我国广泛流行，冬春季节经常在猪群中发生，是猪的常见多发病之一。这两种病在临床症状、流行病学上极为相似，具有发病急、传播快、流行广和各年龄猪只均可感染的特点。
免疫猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗是控制上述两种传染病的重要手段。目前疫苗生产和使用中还存在一些问题：一是半成品病毒液保存时间短(-20℃保存期仅2个月)，病毒滴度下降快；二是产品保存条件要求高(需在-20℃保存，保存期18个月)，储运成本高，由于目前储运条件限制，疫苗储运过程中不稳定，病毒滴度下降快，影响免疫效果；三是免疫方式单一，疫苗仅能采用肌肉注射，免疫过程猪只可能产生免疫应激反应，尤其以仔猪为严重，免疫效果不理想。因此，亟需开发一种新的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种稳定性好、免疫应激小、免疫效果好的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法。
本发明所述的技术问题是以下述技术方案实现的：本发明的一种冻干保护剂，包括质量百分比如下组分组成：
进一步地，所述的冻干保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述的保护剂A是将卡波姆、PEG8000、硫酸锌溶解于水中，除菌后备用；所述的保护剂B是将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶溶解于水中，除菌后备用。
本发明的一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)病毒储存液制备：将新收获的猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均按体积比10:1-10:2的比例加入部分保护剂A，充分混匀，制成病毒储存液，置-20℃以下保存；
(2)疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按两种半成品病毒液与冻干保护剂体积比1：1加入剩余保护剂A和保护剂B，置37℃下搅拌0.5-1小时，使其充分混匀，定量分装，冷冻真空干燥，制得猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。
进一步地，在步骤(2)中，所述的冻干保护剂包括质量百分比的如下组分组成：
进一步地，在步骤(2)中，所述的冻干保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述的保护剂A由卡波姆、PEG8000、硫酸锌组成，将卡波姆、PEG8000、硫酸锌溶解于水中，除菌后备用；所述的保护剂B由蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶组成，将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶溶解于水中，除菌后备用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明在半成品病毒液储存时加入保护剂,有效延长半成品的保存期，保证半成品病毒在常温状态下生物学活性的维持，实现了常温直接融化疫苗半成品，生产工序更简化，且降低了能耗。
(2)在冻干保护剂中添加卡波姆，并与PEG8000、丙氨酸等最适配比，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中的损伤，且提高了成品疫苗在保存和使用中的稳定性。
(3)本发明方法制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗保存条件由原来-20℃保存变成2～8℃保存，保存期36个月，37℃保存期15天，在降低产品储运要求和成本的同时，提高了成品疫苗的质量及其应用的便捷性。
(4)本发明方法制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗不仅可以注射免疫，而且可以口服免疫，口服免疫直接作用于靶器官(肠道)，有效地增强免疫效果和减少免疫应激发生。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
以下实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；
以下实施例中疫苗毒株选用猪传染性胃肠炎病毒HB08株、猪流行性腹泻病毒ZJ08株；市场有售猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(HB08株+ZJ08株)，可从疫苗中获得病毒；瑞普(保定)生物药业有限公司的批准文号：兽药生字030381109，福州大北农生物技术有限公司的批准文号：兽药生字(2015)130141109。本发明方法不限于这两种毒株，适用于该类病毒任何毒株。
实施例1
本发明的一种冻干保护剂，包括质量百分比如下组分组成：
所述的冻干保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述的保护剂A是将卡波姆、PEG8000、硫酸锌溶解于水中，除菌后备用；所述的保护剂B是将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶溶解于水中，除菌后备用。
本发明的一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)病毒储存液制备：将新收获的猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均按体积比10:1的比例加入部分保护剂A，充分混匀，制成病毒储存液，置-20℃以下保存；
(2)疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按两种半成品病毒液与冻干保护剂体积比1：1加入剩余保护剂A和保护剂B，置37℃下搅拌1小时，使其充分混匀，定量分装，冷冻真空干燥，制得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
本发明的一种冻干保护剂，其特征在于包括质量百分比如下组分组成：
本发明的一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)病毒储存液制备：将新收获的猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均按体积比10:2的比例加入部分保护剂A，充分混匀，制成病毒储存液，置-20℃以下保存；
(2)疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按两种半成品病毒液与冻干保护剂体积比1：1加入剩余保护剂A和保护剂B，置37℃下搅拌0.5小时，使其充分混匀，定量分装，冷冻真空干燥，制得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
本发明的一种冻干保护剂，其特征在于包括质量百分比如下组分组成：
本发明的一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)病毒储存液制备：将新收获的猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均按体积比10:1.2的比例加入部分保护剂A，充分混匀，制成病毒储存液，置-20℃以下保存；
(2)疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按两种半成品病毒液与冻干保护剂体积比1：1加入剩余保护剂A和保护剂B，置37℃下搅拌0.8小时，使其充分混匀，定量分装，冷冻真空干燥，制得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗。
实施例4
冻干保护剂的制备
卡波姆、蔗糖和PEG8000等冻干保护剂组方原料均为常规试剂，市场上有售。
配制1000ml冻干保护剂1：称取蔗糖100g，卡波姆1g，PEG80001g，丙氨酸0.5g，L-半胱氨酸3g，硫酸锌0.1g，酶解明胶20g。配制时将卡波姆、PEG8000、硫酸锌加入去离子水中并定容至500ml，充分溶解,制成保护剂A，除菌后备用；将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶加入去离子水中并定容至500ml，充分溶解，制成保护剂B，除菌后备用。
配制1000ml冻干保护剂2：称取蔗糖120g，卡波姆4g，PEG800010g，丙氨酸1.5g，L-半胱氨酸1g，硫酸锌0.8g，酶解明胶5g。配制时将卡波姆、PEG8000、硫酸锌加入去离子水中并定容至500ml，充分溶解,制成保护剂A，除菌后备用；将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶加入去离子水中并定容至500ml，充分溶解，制成保护剂B，除菌后备用。
实施例5
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备
由瑞普(保定)生物药业有限公司生产部提供猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒两种半成品病毒液(按照农业部公告第2323号(以下简称“公告”)制备而成)。
(1)病毒储存液的制备
将新收获的猪传染性胃肠炎病毒半成品病毒液、猪流行性腹泻病毒半成品病毒液各1份(每份500ml)分别与冻干保护剂1中的保护剂A按照体积比10:1充分混匀(分别加入保护剂A 50ml)，制成病毒储存液1-T、病毒储存液1-P；将猪传染性胃肠炎病毒半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液各1份(每份500ml)分别与冻干保护剂2中的保护剂A按照体积比10:2充分混匀(分别加入保护剂A 100ml)，制成病毒储存液2-T、病毒储存液2-P；设立不添加保护剂的半成品病毒液作为空白对照，置于-20℃保存。并于保存0、2、4和12个月时分别测定病毒含量。不同保存期病毒储存液病毒含量检测结果如表1所示。
表1
单位：lg(TCID50/ml)
组别 0月 2月 4月 12月
病毒储存液1-T 7.5 7.5 7.3 7.1
病毒储存液2-T 7.5 7.3 7.2 7.2
对照-T 7.5 6.8 5.8 5.4
病毒储存液1-P 7.2 7.0 6.9 6.8
病毒储存液2-P 7.2 7.0 7.0 6.7
对照-P 7.2 6.9 5.6 5.0
添加冻干保护剂1和冻干保护剂2的两组病毒储存液在-20℃的条件下保存12个月时病毒含量只下降了0.5lg(TCID50/ml)；而对照组病毒含量下降迅速，其在保存4个月时病毒含量已低于“公告”要求(制苗用的半成品病毒液病毒含量应≥6.0lg(TCID50/ml))，为不合格产品。因此，添加保护剂A能够有效延长半成品病毒液的保存期(至12个月)，为生产高效价的二联活疫苗提供保障。
(2)疫苗制备
将两种病毒储存液室温放置，至完全融化，然后均按半成品病毒液与冻干保护剂1：1的体积比(V：V)，在病毒储存液1(病毒储存液1-T和病毒储存液1-P各550ml)中加入冻干保护剂1的保护剂A(400ml)和保护剂B(500ml)，在病毒储存液2(病毒储存液2-T和病毒储存液2-P各600ml)中加入冻干保护剂2的保护剂A(300ml)和B(500ml)，置37℃下搅拌0.5小时，使其充分混匀，进行定量分装，冷冻真空干燥，制成疫苗1和疫苗2。同时将按“公告”方法制备的常规苗作为对照。
(3)疫苗稳定性测定
检测冷藏保存的稳定性：每批取20瓶，于冻干前、冻干后2～8℃放置0、6、12、24和36个月时随机取样测定病毒含量，3瓶/次，以猪传染性胃肠炎为例，测定结果见表2。
检测37℃保存的稳定性：每批取15瓶，于37℃放置0、5、10和15天时随机取样测定病毒含量，3瓶/次，以猪流行性腹泻为例，测定结果见表3。
不同保存期疫苗猪传染性胃肠炎病毒含量检测结果(2～8℃保存)如表2所示：
表2
单位：lgTCID50/头份)
组别 冻干前 0月 6月 12月 24月 36月
疫苗1 5.8 5.5 5.3 5.5 5.3 5.1
疫苗2 5.8 5.5 5.5 5.3 5.3 5.1
常规苗对照 5.8 5.3 5.0 4.3 4.0 3.5
不同保存期疫苗猪流行性腹泻病毒含量检测结果(37℃保存)如表3所示：
表3
单位：lg(TCID50/头份)
由以上结果可以看出：采用本发明方法制备的两组活疫苗，2～8℃条件下保存36个月其病毒含量只下降0.4lg(TCID50/头份)，病毒含量高于“公告”要求(≥5.0lg(TCID50/头份)，因此在冷藏条件下保存期可长达36个月；常规苗对照在2～8℃条件下保存，病毒含量下降较快，保存期仅为6个月。本发明制备的疫苗在37℃条件下保存15天其病毒含量下降0.5lg(TCID50/头份)，病毒含量达到“公告”规定，保存期可达15天；而常规苗对照37℃条件下保存，病毒含量迅速下降，保存期不足5天。
实施例4疫苗效力评价
健康易感母猪所产的5日龄仔猪40头，分成2组，20头/组，每组进行称重，1组口服本发明疫苗1头份，另一组肌肉注射本发明疫苗1头份，同时另设立常规疫苗对照(口服和肌注)2组和空白对照1组。14日后，每组进行称重，每组取10头仔猪，分别口服猪传染性胃肠炎病毒组织强毒和猪流行性腹泻病毒组织强毒，每头1.0ml，隔离饲养，连续观察7日。结果见表4和表5。
不同免疫途径对仔猪增重的影响如表4所示：
表4
免疫途径 免前体重(Kg) 免后14日体重(Kg) 增重(Kg)
本发明疫苗口服组 22.3 60.8 38.5
本发明疫苗肌注组 22.5 53.3 30.8
常规疫苗肌注组 22.4 52.6 30.2
常规疫苗口服组 22.6 59.7 37.1
空白对照组 22.3 59.5 37.2
不同免疫途径对疫苗保护效果的影响如表5所示：
表5
从表4可以看出，肌肉注射方式对仔猪有应激，对仔猪生长有一定影响，而口服免疫则影响较小；从表5可看出本发明疫苗无论是口服还是肌注方式免疫，均可对猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻2种病毒强毒攻击提供10/10保护，对照0/10保护，保护效果良好；而常规疫苗免疫，肌肉注射8/10～9/10保护(保护效果较好)，口服仅2/10～3/10保护(保护效果差)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种冻干保护剂，其特征在于，包括质量百分比如下组分组成：
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的冻干保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述的保护剂A是将卡波姆、PEG8000、硫酸锌溶解于水中，除菌后备用；所述的保护剂B是将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶溶解于水中，除菌后备用。
3.一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)病毒储存液制备：将新收获的猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均按体积比10:1-10:2的比例加入部分保护剂A，充分混匀，制成病毒储存液，置-20℃以下保存；
(2)疫苗制备：将病毒储存液室温放置，至完全融化，然后按两种半成品病毒液与冻干保护剂体积比1：1加入剩余保护剂A和保护剂B，置37℃下搅拌0.5-1小时，使其充分混匀，定量分装，冷冻真空干燥，制得猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗。
4.根据权利要求3所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的冻干保护剂包括质量百分比的如下组分组成：
5.根据权利要求3所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的冻干保护剂包括保护剂A和保护剂B，所述的保护剂A由卡波姆、PEG8000、硫酸锌组成，将卡波姆、PEG8000、硫酸锌溶解于水中，除菌后备用；所述的保护剂B由蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶组成，将蔗糖、丙氨酸、L-半胱氨酸和酶解明胶溶解于水中，除菌后备用。
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