CN106344917A - 猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物及该疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物及其制备方法，所述猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物由猪瘟活疫苗和疫苗稀释液组成；所述猪瘟活疫苗每头份含猪瘟疫苗株病毒含量为750～30000RID。

Description

猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物及该疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物及该疫苗的制备方法。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种世界性的高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疾病目录。在我国，猪瘟是威胁养猪业的重大病毒性传染病之一。我国于1954年成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)也称猪瘟C株，推广应用至今，取得了显著成效，猪瘟发病率和感染率逐年下降，但仍在我国几乎所有的养猪地区成地方流行性。我国科学家研制的HCLV弱毒疫苗是世界上最有效、应用范围最广的猪瘟疫苗。以此疫苗免疫为基础，欧美发达国家使用HCLV毒株成功根除了猪瘟病毒。我国于1956年提出了消灭猪瘟的规划，然而到现在60年过去了，猪瘟仍在我国不间断地流行，消灭猪瘟仍然还有一段路要走。
在临床上，猪瘟疫苗广泛运用，规模化猪场种猪猪瘟免疫覆盖率基本达到100％，因此初生仔猪通过初乳可以获得被动免疫，其被动免疫持续时间与种猪免疫状态密切相关。种猪抗体效价较高的子代小猪母源抗体可以持续到10周甚至更长时间。被动免疫力的存在虽然在一定程度上保护力仔猪免受猪瘟野毒的感染，但是也给猪瘟免疫带来了干扰。当仔猪母源抗体效价较高时使用疫苗免疫，进入体内的疫苗可快速被母源抗体中和而导致免疫失败。基于该原因，在临床上要获得比较好的免疫效果，需要对仔猪进行母源抗体的监测以指定符合特定猪场的免疫程序。但即便如此，由于仔猪个体差异也会造成仔猪的母源抗体的极大差异，因此使用该种方法免疫后依然有部分仔猪无法得到较好的免疫效果。
除此之外，由于猪瘟弱毒疫苗免疫后抗体产生慢，在免疫后有一段时间的免疫空窗期(即抗体阴性时间)，由于免疫空窗期的存在，加剧了猪瘟感染野毒的风险。
因此，提供一种能杜绝母源抗体对仔猪猪瘟病毒免疫的影响、且无免疫空窗期的存在的新型猪瘟疫苗势在必行。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗由猪瘟粘膜免疫活疫苗和疫苗稀释液组成；
所述猪瘟粘膜免疫活疫苗每头份的量为750～30000RID。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗，所述疫苗稀释液包括以下组份：
卡波姆0.1～10g/L以及左旋咪唑0.1～20g/L；
所用溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：
130～140mM氯化钠、2～3mM氯化钾、1～30mM磷酸氢二钠以及1～5mM磷酸二氢钾。
本发明采用的疫苗稀释液中的主要成分为卡波姆和左旋咪唑，其中左旋咪唑具有增强免疫的作用，卡波姆是一种多聚物，在水溶液中形成凝胶，具有缓释的功能，该物质还可以与疫苗形成复合物阻止动物体液内的抗体中和疫苗的作用。
一种猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒进行培养得到病毒液，收获病毒液并测定病毒液效价后，按照750～30000RID每头份的量将所述病毒液添加到耐热冻干保护剂中冻干即得成品；
优选的，所述猪源传代细胞系包括猪肾传代细胞或猪睾丸传代细胞。
本申请所用猪源传代细胞系是猪肾细胞或猪睾丸细胞，购于中国兽医药品监察所，由畜禽生物制品四川省重点实验室检验保存。
本发明创制出一种猪瘟的粘膜免疫疫苗，使用该疫苗可以通过滴鼻或口服的方式进行免疫，对高母源抗体仔猪滴鼻免疫后可以刺激仔猪产生特异性的抗体，且在整个检测时期内猪瘟抗体均为阳性，杜绝了母源抗体对仔猪猪瘟病毒免疫的影响，且无免疫空窗期的存在，是一种值得推广的新型猪瘟疫苗。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，所述向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒时的比例为：每100ml培养液接种0.1ml～1.5ml种毒。
所述种毒为猪瘟兔化弱毒株，保藏号为：CVCC AV1412，购自中国兽医药品监察所，滴度为105RID/ml。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，所述向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒进行培养得到病毒液的操作包括：
1)、向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒，34℃～37℃培养44h～52h；
2)、换液，34℃～37℃培养48h～96h后收获病毒液。
进一步优选的，在步骤1)中，培养时所用的培养液为含3％～10％猪瘟专用血清的MEM培养基。
进一步优选的，在步骤2)中，培养时所用的培养液为含1％～3％猪瘟专用血清的MEM培养基。
猪瘟专用血清购自呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司；MEM培养基购自Thermo Fisher Scientific。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，重复步骤2)多次；
更优选的，重复步骤2)8～12次。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，将每次收获病毒液分别编号后置于-15℃～-25℃保存。
优选的，如上所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，病毒液效价大于5×105RID/mL。
上述多次收获病毒液后，将得到的病毒液混合取样后再进行病毒液效价的测定。
兔体感染量(RID)测定法将疫苗稀释后经耳缘静脉注射试验兔，通过测定兔体温变化判定疫苗效价，是我国使用最为广泛的猪瘟活疫苗效检方法。该方法可直接检测猪瘟疫苗中的活病毒含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
使用本发明提供的疫苗可以通过滴鼻或口服的方式进行免疫，对高母源抗体仔猪滴鼻免疫后可以刺激仔猪产生特异性的抗体，且在整个检测时期内猪瘟抗体均为阳性，杜绝了母源抗体对仔猪猪瘟病毒免疫的影响，且无免疫空窗期的存在，是一种值得推广的新型猪瘟疫苗。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、按照常规方法复苏、传代猪睾丸细胞系(ST细胞)，将传代后生长良好的ST细胞使用细胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)进行消化，使用含3％猪瘟专用血清的MEM培养基分散细胞，进行细胞计数后按照适宜的浓度接种培养瓶或发酵罐。按照培养液体积的0.1％接种猪瘟种毒，34～37℃培养。
2、培养52小时后，去除细胞培养液，使用1％血清的MEM培养基代替；继续培养96小时后进行第一次病毒液收获，收获后加入等量的1％血清的MEM培养基，连续收获8次。将收获的病毒液分别编号后置于-15℃～-25℃保存。
3、将8次收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml。
4、耐热保护剂的制备：将耐热保护剂各组分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明胶等按照一定比例配制后经高压灭菌备用。
5、配苗、冻干及分装：在耐热保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟半成品，混匀后分装为2ml/瓶，加盖后置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
6、成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
7、稀释液制备：每1L稀释液含有：130mM氯化钠、2mM氯化钾、30mM磷酸氢二钠、1mM磷酸二氢钾、0.1g卡波姆、20g左旋咪唑。
该疫苗稀释液的制备方法为：
将以上物质溶解于注射用水中，按一定体积分装后于106～121℃高压灭菌25分钟后备用。
实施例2
1、按照常规方法复苏、传代猪睾丸细胞系(ST细胞)，将传代后生长良好的ST细胞使用细胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)进行消化，使用含10％猪瘟专用血清的MEM培养基分散细胞，进行细胞计数后按照适宜的浓度接种培养瓶或发酵罐。按照培养液体积的1.5％接种猪瘟种毒，34～37℃培养。
2、培养44小时后，去除细胞培养液，使用3％血清的MEM培养基代替；继续培养40小时后进行第一次病毒液收获，收获后加入等量的3％血清的MEM培养基，连续收获12次。将收获的病毒液分别编号后置于-15℃～-25℃保存。
3、将12次收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml。
4、耐热保护剂的制备：将耐热保护剂各组分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明胶等按照一定比例配制后经高压灭菌备用。
5、配苗、冻干及分装：在耐热保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟半成品，混匀后分装为2ml/瓶，加盖后置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
6、成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
7、稀释液制备：每1L稀释液含有：140mM氯化钠、3mM氯化钾、1mM磷酸氢二钠、5M磷酸二氢钾、10g卡波姆、0.1g左旋咪唑。
该疫苗稀释液的制备方法为：
将以上物质溶解于注射于水中，按一定体积分装后于106～121℃高压灭菌25分钟后备用。
实施例3
1、按照常规方法复苏、传代猪睾丸细胞系(ST细胞)，将传代后生长良好的ST细胞使用细胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)进行消化，使用含10％猪瘟专用血清的MEM培养基分散细胞，进行细胞计数后按照适宜的浓度接种培养瓶或发酵罐。按照培养液体积的1％接种猪瘟种毒，34～37℃培养。
2、培养48小时后，去除细胞培养液，使用2％血清的MEM培养基代替；继续培养72小时后进行第一次病毒液收获，收获后加入等量的2％血清的MEM培养基，连续收获10次。将收获的病毒液分别编号后置于-15℃～-25℃保存。
3、将10次收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml。
4、耐热保护剂的制备：将耐热保护剂各组分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明胶等按照一定比例配制后经高压灭菌备用。
5、配苗、冻干及分装：在耐热保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟半成品，混匀后分装为2ml/瓶，加盖后置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
6、成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
7、稀释液制备：每1L稀释液含有：137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾、1g卡波姆、5g左旋咪唑。
该疫苗稀释液的制备方法为：
将以上物质溶解于注射于水中，按一定体积分装后于106～121℃高压灭菌25分钟后备用。
实验例1疫苗对断奶仔猪的安全性试验
对本发明三个实施例制备的疫苗进行断奶仔猪安全性试验。购买无猪瘟抗体21日龄断奶仔猪35头，随机分为7组，分别标记为1～7组，其中第1、2、3组分别接种单剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID，2ml)，4、5、6组分别接种5倍剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(50000RID，10ml)，7组接种稀释液2ml。所有组均采用颈部肌肉注射的方法接种疫苗。接种后每天观察仔猪采食并测定体温。
结果表明使用单计量和5倍剂量的疫苗接种后各组动物体温正常，采食正常，接种后接种部位无肉眼可见变化，接种后2周触摸无硬物感，由此表明该疫苗对断奶仔猪非常安全。
实验例2疫苗对初生仔猪的安全性试验
对本发明三个实施例制备的3个批次的疫苗进行安全性试验。购买3日龄仔猪35头，随机分为7组，分别标记为1～7组，其中第1、2、3组分别接种单剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID，2ml)，4、5、6组分别接种2倍剂量的HC2015001，HC2015002和HC2015003疫苗(20000RID，2ml)，7组接种稀释液2ml。所有组均采用滴鼻接种，每只鼻孔接种1ml。接种后每天观察仔猪吃乳并测定体温。
结果表明使用单计量和2倍剂量的疫苗接种后各组动物体温正常，吃乳正常。由此表明该疫苗对断奶仔猪非常安全。
实验例3疫苗的免疫效力实验
对本发明三个实施例制备的3个批次的疫苗进行免疫效力实验。购买3日龄猪瘟母源抗体阳性仔猪20头，随机分为4组，每组5头，分别编号1～4组，其中1、2、3组接种实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID，2ml)三个批次的疫苗各1头份，4组接种疫苗稀释液。均为滴鼻接种，每只猪每个鼻孔接种1ml。接种后28天(32日龄)所有猪肌肉注射猪瘟检验用强毒石门血毒，1ml/头，猪瘟攻毒后连续观察14天并记录各组发病和死亡情况。
结果表明，攻毒后实施例1、2、3组仔猪精神状态、体温、采食正常，免疫对照组发病率和死亡率均为0/5，保护率为5/5，而对照发病率组为5/5，死亡率为5/5，保护率为0/5。
实验例4疫苗的免疫持续期实验
对本发明三个实施例制备的3个批次的疫苗进行免疫持续期的测定，购买3日龄猪瘟母源抗体阳性仔猪25头，随机分为5组，每组5头，分别编号G1～G5组，其中G1、G2、G3组接种实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID，2ml)三个批次的疫苗各一头份，G4组接种疫苗稀释液。均为滴鼻接种，每只猪每个鼻孔接种1ml。接种后35天进行第二次接种，分别肌肉注射接种对应批次的疫苗1头份(10000RID，2ml)，对照组接种同等剂量的稀释液。G5组免疫实施例1批次的疫苗，第一次免疫时与第一组免疫方式一样，第二次免疫时该组不免疫。分别在3、15、28、56、70、90、120、150、180日龄采集血清，使用猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒(美国IDEXX生物科技有限公司)按照试剂盒说明书进行抗体测定。
结果表明，免疫组在3～180日龄猪瘟抗体均为阳性，而对照组G4在3日龄、15全部为阳性，28日龄部分仔猪为阴性，56日龄及此后对照组所有实验猪抗体均为阴性。根据以上结果，使用本发明制备的疫苗进行单次免疫或2次免疫抗体持续期至少为180天即6个月。各组抗体阳性率变化趋势见表1所示。
表1免疫后猪瘟抗体阳性率变化趋势
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗由猪瘟粘膜免疫活疫苗和疫苗稀释液组成；
所述猪瘟粘膜免疫活疫苗每头份的量为750～30000RID。
2.根据权利要求1所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗，其特征在于，所述疫苗稀释液包括以下组份：
卡波姆0.1～10g/L以及左旋咪唑0.1～20g/L；
所用溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：
130～140mM氯化钠、2～3mM氯化钾、1～30mM磷酸氢二钠以及1～5mM磷酸二氢钾。
3.一种猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒进行培养得到病毒液，收获病毒液并测定病毒液效价后，按照750～30000RID每头份的量将所述病毒液添加到耐热冻干保护剂中冻干即得成品；
优选的，所述猪源传代细胞系包括猪肾传代细胞或猪睾丸传代细胞。
4.根据权利要求3所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，所述向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒时的比例为：每100ml培养液接种0.1ml～1.5ml种毒。
5.根据权利要求3所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，所述向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒进行培养得到病毒液的操作包括：
1)、向猪源传代细胞系中接种猪瘟种毒，34℃～37℃培养44h～52h；
2)、换液，34℃～37℃培养40h～96h后收获病毒液。
6.根据权利要求5所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，培养时所用的培养液为含3％～10％猪瘟专用血清的MEM培养基。
7.根据权利要求5所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，培养时所用的培养液为含1％～3％猪瘟专用血清的MEM培养基。
8.根据权利要求5～7任一项所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，重复步骤2)多次。
9.根据权利要求8所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，将每次收获病毒液分别编号后置于-15℃～-25℃保存。
10.根据权利要求3所述的猪瘟粘膜免疫活疫苗的制备方法，其特征在于，病毒液效价大于5×105RID/mL。
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