CN108703952B - 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用，所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5‑6%的乳糖，余量为水。本发明以猪瘟弱毒毒株作为种毒，通过冻干保护剂和疫苗稀释液的改进，制备得到一种免疫效果好的猪瘟口服弱毒冻干疫苗，所述疫苗能够实现猪瘟强毒病毒的完全保护，产生较高的抗体效价，实现与市售注射疫苗更好/相当的免疫效果，且方便使用。

Description

一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用。
背景技术：
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fevervirus，CSFV）引起的猪的一种急性败血性、高度接触性传染类疾病，以出现高热、全身组织弥散性出血为其典型症状与病理特征。CSF 曾经给全世界养猪业造成重大经济损失，世界动物卫生组织将其规定为必须报告的动物传染病，我国也已将猪瘟定为一类烈性传染病，它属于危害严重、控制和扑灭的动物疫病、并且也需要采取紧急严厉、强制预防的疾病。虽然有些国家已经成功的净化了CSFV，但是全世界大多数养猪地区仍然时有发生，分布于包括亚洲、东欧、俄罗斯以及南美在内的很多国家和地区。通过扑杀与疫苗预防接种相结合的政策，猪瘟已得到有效控制。在我国，CSFV疫苗C 株（CSFV兔化弱毒苗）以及基于疫苗C 株研制的疫苗被广泛使用，近十几年来很少有猪瘟大规模暴发的情况。但零散发病时有发生，并且以非典型、温和型猪瘟和持续带毒为多见，即使是免疫猪群也会感染。
由于仔猪免疫系统不健全，CSFV对仔猪具有传染性强，致死率高等特点。随着我国养殖业的发展，仔猪的猪瘟病毒感染与流行情况出现了上升趋势。猪瘟流行地区，常采用疫苗免疫，或疫苗接种辅助扑灭，以控制本病。猪瘟疫苗按照制备方式不同可分为 3 类:灭活疫苗、弱毒疫苗及基因工程苗。灭活疫苗，以猪瘟结晶紫疫苗为代表。弱毒疫苗:根据培养方式可分为兔源及细胞源:（1）兔源：包括家兔脾淋组织苗、乳兔组织苗等，其中脾淋苗通过用兔化弱毒株(C 株)接种成年兔，收获兔体内含毒浓度高的脾脏和淋巴结制备而成的疫苗；（2）细胞源：通过细胞培养制备而成，包括乳猪肾细胞苗、绵羊肾细胞苗、猪瘟原代细胞苗(BT 细胞)、猪瘟传代细胞苗(ST 细胞)等。基因工程苗，目前仍处于研发注册阶段。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗成本较低、免疫保护率高，是我国目前猪瘟防治主要使用的疫苗种类。我国研制的兔化弱毒疫苗，对各种猪均具有高度安全性和优良免疫原性、效果可靠，接种后1 周可产生免疫力，免疫期>1 年。目前生产上主要采用两种疫苗，即猪瘟细胞活疫苗和猪瘟脾淋活疫苗，均为弱毒疫苗。还有猪三联活疫苗，可同时预防猪瘟、猪丹毒、猪肺疫。局估计，2017年以前，猪瘟疫苗以招采为主，市场规模约7.15亿元；2017年猪瘟疫苗退出政府招采后，猪瘟防疫全面向市场苗过渡。随着优质高价市场苗的普及，预计2020年行业规模将超过13亿元，整体增长接近82%。
猪瘟，其病原猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，单股正链 RNA 病毒，为黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，经研究其基因组为单股正链 RNA，约12.3kb，仅一个大的开放读码框架，由11个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。CSFV通过口腔和鼻腔黏膜进入宿主体内，在起始阶段感染扁桃体，然后随血液和淋巴循环扩散至全身。CSFV 对免疫系统细胞有独特的趋向性，能够引起感染猪只严重的白细胞减少症，这与胸腺、脾脏、淋巴窦以及骨髓内白细胞凋亡有关。
现阶段我国使用的猪瘟疫苗主要有猪瘟兔化弱毒株、家兔脾淋组织苗、乳猪肾细胞苗等注射型疫苗，以皮下或者肌肉注射为主，在疫苗注射过程中需要对猪只进行保定，造成猪的应激活动，对猪只的成长不利。而研制口服疫苗，经口服免疫，可减少对猪只的应激且省时省力。目前，发明专利申请CN201510342782.1公开了一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗、其制备方法及冻干保护剂，所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗包括抗原猪瘟病毒、黏膜佐剂和冻干保护剂，其中，冻干保护剂包括：1～3％明胶，1～3％甘氨酸，余量为水；该猪瘟口服弱毒冻干疫苗能较好的保护CSFV活性，减少活病毒损失，而且在口服免疫小鼠试验中，能诱导更高水平的IgG和IgA抗体，并促进胸腺和脾脏中I型干扰素的表达，具有保护抗原活性、提高口服猪瘟抗原免疫效力的作用，可作为口服猪瘟疫苗保护剂进行产业开发。发明专利申请CN201610903386.6公开了一种猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物，所述疫苗由猪瘟粘膜免疫活疫苗和疫苗稀释液组成；所述猪瘟粘膜免疫活疫苗每头份的量为750～30000RID。所述疫苗稀释液包括以下组份：卡波姆0.1～10g/L以及左旋咪唑0.1～20g/L；所用溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：130～140mM氯化钠、2～3mM氯化钾、1～30mM磷酸氢二钠以及1～5mM磷酸二氢钾。提供的疫苗可以通过滴鼻或口服的方式进行免疫，对高母源抗体仔猪滴鼻免疫后可以刺激仔猪产生特异性的抗体，且在整个检测时期内猪瘟抗体均为阳性，杜绝了母源抗体对仔猪猪瘟病毒免疫的影响，且无免疫空窗期的存在，是一种值得推广的新型猪瘟疫苗。口服疫苗可直接刺激肠粘膜内的淋巴细胞产生大量的Ig A，而且与传统的注射途径相比，口服免疫会有更多的优势，如低成本、更方便、较高的病畜的顺从性，不需要专门人才，并且减少因针头的重复使用而引起的感染。因而，研制猪瘟口服疫苗是预防猪瘟行之有效的方法。
发明内容：
基于目前CSFV的口服疫苗较少，本发明旨在提供一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用，该猪瘟口服弱毒冻干疫苗具有免疫活性高，能够更好的诱导Ig G和Ig A抗体的产生，提高疫苗的保护效力。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括牛血清白蛋白BSA、甘露醇、甘氨酸、乳糖和水。
所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量为水。
所述冻干保护剂的制备方法是：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
所述的猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂的方法是：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
所述的猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂在制备猪瘟口服弱毒冻干疫苗中的应用。
本发明还涉及一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗，包括猪瘟弱毒病毒，冻干保护剂和疫苗稀释液，其特征在于，所述疫苗稀释液中包括黏膜免疫佐剂和免疫增强剂，所述黏膜免疫佐剂包括蜂胶提取物、左旋咪唑和卡波姆，所述免疫增强剂包括黄芪多糖和玉竹多糖。
所述冻干保护剂包括牛血清白蛋白BSA、甘露醇、甘氨酸、乳糖和水。
所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量为水。
所述黏膜免疫佐剂包括蜂胶佐剂、左旋咪唑和卡波姆。
所述疫苗稀释液中包含1.2-1.5g/L的卡波姆，2.4-3.0g/L的左旋咪唑，2-4g/L的蜂胶提取物，2-5g/L的黄芪多糖，1-2g/L的玉竹多糖。
优选的，每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂胶提取物，2-5g的黄芪多糖，1-2g的玉竹多糖。
所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
所述蜂胶提取物采用如下方法制备：称取经冷冻粉碎、过40目筛的蜂胶10g，加入400mL的55%的乙醇溶液中，在60℃下超声波提取15min，超声波功率为480W，而后以3000r/min的速度离心10min，吸取上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠，于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，即得到所述的蜂胶提取物。
所述黄芪多糖和玉竹多糖均为市售产品。例如可以选择购自成都锦泰和生物科技有限公司的人用黄芪多糖，多糖含量≥70%；选择购自上海友思生物技术有限公司的玉竹多糖，多糖含量≥75%。
所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，按照常规方法复苏、传代ST细胞，待ST细胞单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μL稀释后的猪瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后弃去上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养。每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μL上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养；
步骤二，将收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml；
步骤三，冻干保护剂的制备：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量为去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
步骤四，配苗、冻干及分装：在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶，置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
步骤五，成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
步骤六，稀释液制备：每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂胶提取物，2-5g的黄芪多糖，1-2g的玉竹多糖。所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
步骤七，将步骤五制备得到的冻干疫苗和步骤七制备得到的稀释液按一头份的量进行组合，装盒、装箱后保存。
所述的猪瘟活疫苗种毒为猪瘟兔化弱毒株，保藏号为：CVCC AV1412，购自中国兽医药品监察所，滴度为105RID/mL。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
第一，本发明以猪瘟弱毒毒株作为种毒，通过冻干保护剂和疫苗稀释液的改进，制备得到一种免疫效果好的猪瘟口服弱毒冻干疫苗，所述疫苗能够实现猪瘟强毒病毒的完全保护，产生较高的抗体效价，实现与市售注射疫苗更好/相当的免疫效果。并且，本发明的猪瘟口服弱毒冻干疫苗服用方便，更加适合作为仔猪接种用。
第二，本发明研制过程中，通过比较发现，本发明独创性的采用了牛血清白蛋白BSA、甘露醇、甘氨酸和乳糖作为冻干保护剂的主要成分。本发明的冻干保护剂相比对比试验例1-3的冻干保护剂对猪瘟弱毒毒株具有更好的保护作用，采用本发明实施例1或2所涉及的保护剂，其复溶后的病毒TCID50与冻干前接近，而采用对比试验例1-3的冻干保护剂，其病毒的滴度均严重下降，与实施例1或2的滴度相差接近1-2个数量级。特别是对比试验3与实施例1或2相比，其仅仅在于组成成分的用量存在差异，然而，其冻干后的病毒滴度严重低于实施例1或2，表明冻干保护剂中的组分用量对冻干保护作用特别重要；而对比试验1和2分别相比实施例1或2少添加了甘露醇或者甘氨酸，然而，其冻干效果也大打折扣，以上试验结果比较表明，冻干保护剂的原料组成对于冻干保护作用至关重要。也表明，本发明的冻干保护剂在冻干疫苗的制备中具有预料不到的保护效果。
第三，本发明的研制过程中，着重对疫苗稀释液进行了改进，其包括卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖、玉竹多糖，其中卡波姆作为一种聚合物，在水溶液中可以形成凝胶，具有缓释的功效，其还可以与疫苗形成复合物阻止动物体液内的抗体中和疫苗的作用；而左旋咪唑，作为常用的免疫佐剂，具有增强免疫的作用；蜂胶提取物，能增强抗原诱导的特异性及非特异免疫作用，提高动物机体的免疫功能；黄芪多糖，玉竹多糖是天然多糖类成分，有研究表明其都具有增强免疫的作用，黄芪多糖能够提高接种动物的免疫机能，玉竹多糖能有效包裹抗原，促进疫苗的缓释，持久的刺激机体产生免疫应答有关，当玉竹多糖的剂量与疫苗的剂量达到一定比例时，玉竹多糖能有效包裹抗原，少于或大于一比例则难以包裹疫苗，难以形成稳定的复合物，因此佐剂与疫苗的配比显得十分重要。而本发明中通过大量的试验，得到了合适比例的黄芪多糖和玉竹多糖，以及其他成分的配比，通过实验表明，本发明的疫苗稀释液能够增强小鼠体内的细胞和体液免疫反应，产生持久的IgG和IgA抗体水平，更适合用作猪瘟弱毒口服疫苗。
总而言之，本发明以猪瘟弱毒毒株作为种毒，通过冻干保护剂和疫苗稀释液的改进，制备得到一种免疫效果好的猪瘟口服弱毒冻干疫苗，所述疫苗能够实现猪瘟强毒病毒的完全保护，产生较高的抗体效价，实现与市售注射疫苗更好/相当的免疫效果。
附图说明：
图1：本发明实施例5中的猪瘟口服弱毒冻干疫苗口服免疫小鼠的诱导血清IgG水平；
图2：本发明实施例5中的猪瘟口服弱毒冻干疫苗口服免疫小鼠的诱导黏膜IgA水平。
具体实施方式：
下面将结合具体实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗，包括猪瘟弱毒病毒，冻干保护剂和疫苗稀释液，其特征在于，所述疫苗稀释液中包括黏膜免疫佐剂和免疫增强剂，所述黏膜免疫佐剂包括蜂胶提取物、左旋咪唑和卡波姆，所述免疫增强剂包括黄芪多糖和玉竹多糖。
所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水。
每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.2g卡波姆，2.4g左旋咪唑，4g蜂胶提取物，5g的黄芪多糖，2g的玉竹多糖。
所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
所述蜂胶提取物采用如下方法制备：称取经冷冻粉碎、过40目筛的蜂胶10g，加入400mL的55%的乙醇溶液中，在60℃下超声波提取15min，超声波功率为480W，而后以3000r/min的速度离心10min，吸取上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠，于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，即得到所述的蜂胶提取物。
所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法包括如下步骤：
步骤一，按照常规方法复苏、传代ST细胞（购自中国兽医药品监察所），待ST细胞单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μL稀释后的猪瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后弃去上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养。每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μL上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养；
步骤二，将收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml；
步骤三，冻干保护剂的制备：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
步骤四，配苗、冻干及分装：在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶，置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
步骤五，成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
步骤六，稀释液制备：每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.2g卡波姆，2.4g左旋咪唑，4g蜂胶提取物，5g的黄芪多糖，2g的玉竹多糖。所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
步骤七，将步骤五制备得到的冻干疫苗和步骤七制备得到的稀释液按一头份的量进行组合，装盒、装箱后保存。
实施例2：一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗，包括猪瘟弱毒病毒，冻干保护剂和疫苗稀释液，其特征在于，所述疫苗稀释液中包括黏膜免疫佐剂和免疫增强剂，所述黏膜免疫佐剂包括蜂胶提取物、左旋咪唑和卡波姆，所述免疫增强剂包括黄芪多糖和玉竹多糖。
所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、6%的乳糖，87%的去离子水。
每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.5g的卡波姆，3.0g的左旋咪唑，2g的蜂胶提取物，3g的黄芪多糖，1.5g的玉竹多糖。
所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
所述蜂胶提取物采用如下方法制备：称取经冷冻粉碎、过40目筛的蜂胶10g，加入400mL的55%的乙醇溶液中，在60℃下超声波提取15min，超声波功率为480W，而后以3000r/min的速度离心10min，吸取上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠，于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，即得到所述的蜂胶提取物。
所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法包括如下步骤：
步骤一，按照常规方法复苏、传代ST细胞（购自中国兽医药品监察所），待ST细胞单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μL稀释后的猪瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后弃去上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养。每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μL上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养；
步骤二，将收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml；
步骤三，冻干保护剂的制备：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、6%的乳糖，87%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
步骤四，配苗、冻干及分装：在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶，置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
步骤五，成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
步骤六，稀释液制备：每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.5g的卡波姆，3.0g的左旋咪唑，2g的蜂胶提取物，3g的黄芪多糖，1.5g的玉竹多糖。所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
步骤七，将步骤五制备得到的冻干疫苗和步骤七制备得到的稀释液按一头份的量进行组合，装盒、装箱后保存。
实施例3：一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗，包括猪瘟弱毒病毒，冻干保护剂和疫苗稀释液，其特征在于，所述疫苗稀释液中包括黏膜免疫佐剂和免疫增强剂，所述黏膜免疫佐剂包括蜂胶提取物、左旋咪唑和卡波姆，所述免疫增强剂包括黄芪多糖和玉竹多糖。
所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水。
每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.4g卡波姆，2.8g左旋咪唑，3g蜂胶提取物，2g的黄芪多糖，1g的玉竹多糖。
所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
所述蜂胶提取物采用如下方法制备：称取经冷冻粉碎、过40目筛的蜂胶10g，加入400mL的55%的乙醇溶液中，在60℃下超声波提取15min，超声波功率为480W，而后以3000r/min的速度离心10min，吸取上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠，于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，即得到所述的蜂胶提取物。
所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法包括如下步骤：
步骤一，按照常规方法复苏、传代ST细胞（购自中国兽医药品监察所），待ST细胞单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μL稀释后的猪瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后弃去上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养。每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μL上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养；
步骤二，将收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml；
步骤三，冻干保护剂的制备：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
步骤四，配苗、冻干及分装：在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶，置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品。
步骤五，成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用。
步骤六，稀释液制备：每升所述疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.4g卡波姆，2.8g左旋咪唑，3g蜂胶提取物，2g的黄芪多糖，1g的玉竹多糖。所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用。
步骤七，将步骤五制备得到的冻干疫苗和步骤七制备得到的稀释液按一头份的量进行组合，装盒、装箱后保存。
实施例4：猪瘟口服弱毒冻干疫苗复溶后TCID50的测定
为了验证冻干保护剂对于猪瘟病毒的保护作用，设置以下对照试验例，与实施例1-2的冻干保护剂进行比较：
表1 实施例1-2以及对照试验例的冻干保护剂的组成
Figure 152142DEST_PATH_IMAGE002
基于上表分别按照实施例1的步骤一到五，制备得到猪瘟口服弱毒冻干疫苗半成品。对上述半成品进行TCID50测定。具体测定方法为：
将ST细胞消化后铺于96孔细胞板中，24h后待细胞长至80-90％，将CSFV细胞毒进行10倍梯度稀释，然后每孔接种100μL病毒液，每个稀释度重复8个孔，并设定空白对照；37℃吸附1h，然后弃去细胞上清，加入200μL含2％FBS的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；3-5d后，弃去96孔细胞板中上清培养液，PBS洗涤2遍；每孔加入100μL预冷的70％乙醇，-20℃固定细胞15min；弃去固定液，用PBS洗细胞2遍，每孔加入100μL1％TritonX-100，4℃孵育10min；弃去孔内液体，PBS洗涤2遍，每孔加入100μL鼠抗CSFV多克隆抗体(1:100稀释)，37℃湿盒孵育2h；弃去一抗，PBS洗3遍，每孔加入100μL 羊抗鼠IgG二抗(1:2500稀释)，37℃孵育45min；弃去二抗，PBS洗3遍，然后在荧光显微镜下观察，并按Reed-Muench法计算TCID50。
将以上制备得到的猪瘟口服弱毒冻干疫苗半成品用原体积复溶，并测定CSFV滴度。结果如下表2，其中实施例1步骤四的“在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶”经测定，其CSFV的效价为107.2TCID50/mL：
冻干前 实施例1 实施例2 对比试验1 对比试验2 对比试验3
TCID<sub>50</sub>/mL 10<sup>7.2</sup> 10<sup>6.8</sup> 10<sup>6.5</sup> 10<sup>5.4</sup> 10<sup>4.4</sup> 10<sup>4.8</sup>
表2 实施例1-2以及对照试验例的冻干保护剂对猪瘟病毒的保护作用
基于以上猪瘟口服弱毒冻干疫苗复溶后TCID50的测定结果可知，本发明的冻干保护剂相比对比试验例1-3的冻干保护剂对猪瘟弱毒毒株具有更好的保护作用，采用本发明实施例1或2所涉及的保护剂，其复溶后的病毒TCID50与冻干前接近，而采用对比试验例1-3的冻干保护剂，其病毒的滴度均严重下降，与实施例1或2的滴度相差接近1-2个数量级。特别是对比试验3与实施例1或2相比，其仅仅在于组成成分的用量存在差异，然而，其冻干后的病毒滴度严重低于实施例1或2，表明冻干保护剂中的组分用量对冻干保护作用特别重要；而对比试验1和2分别相比实施例1或2少添加了甘露醇或者甘氨酸，然而，其冻干效果也大打折扣，以上试验结果比较表明，冻干保护剂的原料组成对于冻干保护作用至关重要。也表明，本发明的冻干保护剂在冻干疫苗的制备中具有预料不到的保护效果。
实施例5：猪瘟口服弱毒冻干疫苗的免疫效果评价
基于猪瘟口服弱毒冻干疫苗的免疫效果评价的需要，设置以下对照试验例，与实施例1-2的疫苗稀释液进行比较，其中实施例1和2按以上记载实施例1-2制备，而对比试验4-6与实施例1的差异仅在于疫苗稀释液不同：
表3实施例1-2以及对照试验例的疫苗稀释液的组成（单位：g/L）
卡波姆 左旋咪唑 蜂胶提取物 黄芪多糖 玉竹多糖
实施例1 1.2 2.4 4.0 5.0 2.0
实施例2 1.5 3.0 2.0 3.0 1.5
对比试验4 1.2 2.4 5.0 0 4.0
对比试验5 1.2 2.4 4.0 6.0 0
对比试验6 1.2 2.4 2.0 7.0 2.0
评价方法：
1)实验动物分组：小鼠共70只，每组10只，随机分成7组，分别为对照组、实施例1组、实施例2组、对比试验4组、对比试验5组、对比试验6组。
2)免疫剂量：口服免疫，1头份/只，每只小鼠喂服100μL。免疫前，每只小鼠灌服5％NaHCO3中和胃酸，2周后，进行二免，共免疫2次。
3)样品的采集与处理：
血清的制备：分别在第0、7、14、22、29天断尾采血，采集的血样置于4℃过夜，然后5000rpm离心5min，收集血清用于检测。
粪便样品的收集：分别在第0、7、14、22、29天收集各组小鼠粪便，并称取相同重量的粪便，用400μl PBS溶解，10000rpm离心5min，收集上清用于检测。所有样品保存在-20℃，备用。
4)间接ELISA检测血清IgG、肛拭子IgA抗体水平
包被：全病毒疫苗作为包被抗原，置4度包被16小时后甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液200μl，静置3min倒掉，在吸水纸上拍干，共计洗涤4次。
封闭：每孔加入含5％脱脂乳的PBST 200μl，置37℃封闭2小时后清洗4次。
加入样品：血样用含5％脱脂乳的PBST进行20倍稀释，血清1:20稀释、肛拭子1:5稀释。各取100μl加入到板孔，每个样设2孔，置37℃孵育1.5h后清洗4次。
加入二抗：加入以含5％脱脂乳的PBST稀释的相应酶标抗体(Goat anti-MouseIgG、Goat anti-Mouse IgA)，每孔100μl，置37℃作用1h后清洗。
显色：每孔加入配制好的显色液50μl，于37℃避光显色10分钟。
终止：每孔加入终止液50μl，10分钟内用酶标仪450nm波长测定结果。
5)结果分析：ELISA结果显示，在一免后7天，本发明实施例1、2组小鼠的IgG水平较其他组有极显著的增高，在历次检测中，本发明实施例1和2组小鼠的IgG水平较其他组均有极显著的增高 (参见图1)。
间接ELISA检测小鼠粪便IgA抗体水平，结果参见图2 ，可以看出，一免7天、14天后，不同配方组小鼠的粪便IgA水平基本一致，但在二免7天后，本发明实施例1和2的小鼠的IgA水平与其他组相比有极显著的提高。
综上表明，本发明的疫苗稀释液能够增强小鼠体内的细胞和体液免疫反应，产生持久的IgG和IgA抗体水平，本发明的疫苗稀释液更适合用作猪瘟弱毒口服疫苗。
实施例6：疫苗对断奶仔猪的安全性试验
对本发明三个实施例制备的疫苗进行断奶仔猪安全性试验。购买无猪瘟抗体21日龄断奶仔猪70头，随机分为7组，分别标记为1～7组，其中第1、2、3组分别接种单剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID)，4、5、6组分别接种10倍剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(100000RID)，7组接种稀释液2ml。所有组均采用灌喂口服的方法接种疫苗。接种后每天观察仔猪采食并测定体温。
结果表明使用单计量和10倍剂量的疫苗接种后各组动物体温正常，采食正常，由此表明该疫苗对断奶仔猪非常安全。
实验例7：疫苗对初生仔猪的安全性试验
对本发明三个实施例制备的的疫苗进行安全性试验。购买3日龄仔猪70头，随机分为7组，分别标记为1～7组，其中第1、2、3组分别接种单剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID)，4、5、6组分别接种5倍剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(50000RID)，7组接种稀释液2ml。所有组均采用口服灌喂接种。接种后每天观察仔猪吃乳并测定体温。
将实施例1-3的猪瘟口服弱毒冻干疫苗分别以正常剂量、大剂量免疫3日龄健康仔猪，各免疫10头，免疫后28天内，疫苗免疫猪喂奶、饮水、精神状况均正常，体温正常，均无不良临床反应，表明该疫苗对初生仔猪非常安全。
实施例8：猪瘟口服弱毒冻干疫苗效力检验----中和抗体水平检测
抗体测定用3～5日龄健康易感仔猪（猪瘟CSFV抗原抗体均为阴性）20头，分为4组，试验组分别接种单剂量的实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID)，对照组灌喂生理盐水，接种14日后，连同对照猪5头一并采血，分离血清，测定猪瘟病毒中和抗体（采用购自上海蓝基生物科技有限公司的猪瘟病毒中和抗体体外诊断试剂盒）。免疫组猪中和抗体均应不低于1:16，对照组猪中和抗体均应不高于1:4。具体结果如下表4：
表4 实施例1-3疫苗免疫后的中和抗体检测结果
免疫仔猪头数 免疫14天后猪中和抗体效价
实施例1 5头 5/5≥1:32
实施例2 5头 5/5≥1:32
实施例3 5头 5/5≥1:32
对照组 5头 5/5＜1:2
以上结果表明，采用本发明实施例1-3的疫苗接种，均能获得1:32以上的中和抗体效价，达到了较好的免疫效果。
实施例9：猪瘟口服弱毒冻干疫苗效力检验----免疫仔猪攻毒保护结果
对本发明三个实施例1-3制备的猪瘟口服弱毒冻干疫苗进行免疫效力实验。购买3日龄猪瘟母源抗体阳性仔猪20头，随机分为4组，每组5头，分别编号1～4组，其中1、2、3组接种实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID)的疫苗各1头份，4组接种疫苗稀释液。均为口服灌喂接种。接种后28天(32日龄)所有猪肌肉注射猪瘟检验用强毒石门血毒，1ml/头，猪瘟攻毒后连续观察14天并记录各组发病和死亡情况。结果如下表5：
表5 实施例1-3疫苗免疫后的免疫仔猪攻毒保护结果
免疫仔猪头数 保护效果
实施例1 5头 5/5保护
实施例2 5头 5/5保护
实施例3 5头 5/5保护
对照组 5头 5/5发病、死亡
结果表明，攻毒后实施例1、2、3组仔猪精神状态、体温、采食正常，免疫对照组发病率和死亡率均为0/5，保护率为5/5，而对照发病率组为5/5，死亡率为5/5，保护率为0/5。
实施例10：疫苗的免疫持续期实验
对本发明三个实施例制备的疫苗进行免疫持续期的测定，购买3日龄猪瘟母源抗体阳性仔猪25头，随机分为5组，每组5头，组1-3分别接种实施例1，实施例2和实施例3疫苗(10000RID，2ml)三个批次的疫苗各一头份，第4组接种疫苗稀释液。均为口服灌喂。接种后35天进行第二次接种，进行第二次免疫，口服灌喂相应疫苗1头份(10000RID)，对照组接种同等剂量的稀释液。第5组免疫实施例1的疫苗一次，即第一次免疫时与第一组免疫方式一样，第二次免疫时该组接种同等剂量的稀释液。分别在3、14、28、50、70、90、120、150、180日龄采集血清，使用猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒(美国IDEXX生物科技有限公司)按照试剂盒说明书进行抗体测定。
接种流程如下表6所示：
表6 接种流程
Figure 193916DEST_PATH_IMAGE004
免疫检测结果如下：
表7不同日龄组别抗体阳性率（阳性数/总数）
3日 14日 28日 50日 70日 90日 120日 150日 180日
组1 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
组2 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
组3 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
组4 5/5 4/5 3/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
组5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
结果表明，免疫组在3～180日龄猪瘟抗体均为阳性，而对照组组4在3日龄全部为阳性， 14日龄-50日龄部分仔猪为阴性，70日龄及此后对照组所有实验猪抗体均为阴性。根据以上结果，使用本发明制备的疫苗进行单次免疫或2次免疫抗体持续期至少为180天即6个月。
实施例11：
本发明猪瘟口服弱毒冻干疫苗与市售的猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源）免疫效力比较试验。
1. 材料
猪瘟口服弱毒冻干疫苗，实施实例1中的疫苗制品；
猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源），重庆澳龙生物制品有限公司（批号：20170007,20头份）
2. 试验分组
用实施例1的猪瘟口服弱毒冻干疫苗、市售批号为20170007的猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源），对30日龄健康易感仔猪（CSFV的抗原抗体均为阴性）进行接种，其中实施例1采用口服灌喂接种，市售疫苗根据说明书要求采用肌肉注射的方式进行接种。每种疫苗接种的仔猪数量见表8，接种14d后分别进行采血，并于采血当天用强毒攻击。阴性对照组的10头不作免疫，分为2组，分别用于两种病毒攻毒的阴性对照。三个疫苗组分别设有一组（5头）空白对照组，只免疫不进行攻毒。具体分组情况见表8。
表8 试验分组情况表
Figure 35970DEST_PATH_IMAGE006
分别参照实施例8中方法进行效力检验。按照试验分组情况，对免疫后14d的45头猪分别采血，分离血清，测定猪瘟病毒的中和抗体。按照实施例9的方法进行免疫仔猪攻毒保护试验，具体试验结果如下：
表9 免疫效力比较试验结果
Figure 493496DEST_PATH_IMAGE008
由以上试验结果可知，本发明的猪瘟口服弱毒冻干疫苗与市售的批号为20170007的猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源）能实现基本相同的保护效果，都能实现仔猪的免疫保护，但是经中和抗体检测试验，表明本发明的猪瘟口服弱毒冻干疫苗能够刺激仔猪产生更高浓度的中和抗体，更加有利于仔猪的免疫保护。
以上具体实施方式用于对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，以上实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

Claims (4)

1.一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括牛血清白蛋白BSA、甘露醇、甘氨酸、乳糖和水；所述冻干保护剂包括质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量为水。
2.根据权利要求1所述的猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂的制备方法是：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
3.一种制备权利要求2所述的猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂的方法，其特征在于，制备方法是：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5%的乳糖，88%的去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用。
4.权利要求1-2中任一项所述的猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂在制备猪瘟口服弱毒冻干疫苗中的应用，其特征在于，所述猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，按照常规方法复苏、传代ST细胞，待ST细胞单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μL稀释后的猪瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后弃去上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养；每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μL上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养；
步骤二，将收获的病毒液混合取样后按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法进行RID的测定，测定结果显示混合样大于5×105RID/ml；
步骤三，冻干保护剂的制备：将质量百分含量为3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量为去离子水，混合均匀后经高压灭菌备用；
步骤四，配苗、冻干及分装：在冻干保护剂中按照10000RID每头份的量加入一定量的猪瘟弱毒病毒液，混匀后分装为2ml/瓶，置于冻干机内，经预冻、升华过程冻干疫苗形成成品；
步骤五，成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》附录规定的方法对成品进行无菌检验、霉菌检验、支原体检验、安全性检验和效力检验均合格，置于2～8℃保存备用；
步骤六，稀释液制备：每升疫苗稀释液含有：130mM氯化钠，3.0mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钠，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂胶提取物，2-5g的黄芪多糖，1-2g的玉竹多糖；所述疫苗稀释液的制备方法为：按以上用量将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、卡波姆、左旋咪唑、蜂胶提取物、黄芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每头份3-5mL的规格分装后，于121℃高压灭菌20min后备用；
步骤七，将步骤五制备得到的冻干疫苗和步骤六制备得到的稀释液按一头份的量进行组合，装盒、装箱后保存。
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