RU2416642C1 - Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов - Google Patents
Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2416642C1 RU2416642C1 RU2010104089/10A RU2010104089A RU2416642C1 RU 2416642 C1 RU2416642 C1 RU 2416642C1 RU 2010104089/10 A RU2010104089/10 A RU 2010104089/10A RU 2010104089 A RU2010104089 A RU 2010104089A RU 2416642 C1 RU2416642 C1 RU 2416642C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- virus
- vaccine
- rabbits
- manichino
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 241000714203 Rabbit hemorrhagic disease virus Species 0.000 title abstract description 14
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 title 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 51
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 claims 1
- 241000369733 Lagovirus Species 0.000 claims 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 6
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 abstract description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Показана антигенная и иммуногенная эффективность нового штамма «Манихино-09», используемого для приготовления инактивированной вакцины против ВГБК. Вакцина содержит антигенный материал из штамма «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов, формалин, метабисульфит натрия, гель гидроокиси алюминия в эффективных соотношениях. Штамм депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным наименованием «Манихино-09» - ДЕП вирус геморрагической болезни кроликов. Вирус репродуцируется in vivo на европейском кролике (Oryctolagus cuniculus) старше 1,5 мес возраста, свободных от антител против этого заболевания или имеющих титр антител против ВГБК ниже 1:4. В качестве инактиванта используют 4%-ный раствор формалина (т.е. 1,1-1,4% раствор формальдегида). Для приготовления сорбированной вакцины из адъювантов используют гель гидроокиси алюминия (ГОА). Вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью. 4 табл.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов.
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов - ВГБК (некротический гепатит, геморрагическая пневмония кроликов) - остропротекающая высококонтагиозная болезнь вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб кролиководству.
ВГБК характеризуется явлениями геморрагического диатеза во всех органах кроликов, в особенности в легких и печени. Поражаются кролики старше 1,5-месячного возраста. О заболевании этим вирусом животных других видов и человека не сообщалось. При ВГБК заболеваемость достигает 70-80%, а летальность - 90-100%. Болезнь широко распространена в мире, где есть восприимчивые животные, европейские кролики (Oryctolagus cuniculus).
Экономический ущерб, наносимый ВГБК, складывается из-за высокого процента гибели взрослых особей и молодых кроликов с момента отъема.
Вакцинопрофилактика ВГБК занимает основное место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для вакцинопрофилактики вирусной геморрагической болезни кроликов применяют инактивированные моно- и ассоциированные вакцины. Рекомбинантные вакцины против ВГБК в настоящее время тоже получены, но коммерчески широко не применяются.
Молекулярно-генетические исследования зарубежных ученых за последнее десятилетие показывают, что все штаммы ВГБК (в тех областях, где болезнь была диагностирована) принадлежат к одному серотипу [1-2]. Сравнительное секвенирование выделенных изолятов показывает, что в консервативных областях генома они имеют отличия по аминокислотному составу в пределах от 2 до 5%. Однако выделенные в последнее время температурозависимые изоляты вируса ГБК в Германии, Италии значительно отличаются по гемагглютинирующим свойствам при более низкой температуре +4°С и по аминокислотному составу от ранее известных вирусов ГБК в области Е генома, где у представителей калицивирусов представлены основные антигенные детерминанты.
Известен штамм «Воронежский-87», официально депонированный в коллекциях ФГУ «ВГНКИ» (регистрационный №1652) и ГНУ ВНИИВВИМ для изготовления инактивированных вакцин против ВГБК [3-5].
Однако кролики, привитые вакциной, приготовленной из ранее выделенных изолятов, имеют более низкую степень защиты против выделенных изолятов ВГБК. Поэтому в России необходимо не только вести генетический мониторинг и сравнение гемагглютинирующих и иммунобиологических свойств вновь появляющихся изолятов ВГБК в очагах инфекции, но и иметь в музейных коллекциях штаммы вируса геморрагической болезни кроликов, позволяющих изготавливать из них более эффективные средства специфической профилактики против ВГБК, исходя из эпизоотической ситуации.
Целью настоящего изобретения явилось получение нового производственного и диагностического штамма вируса геморрагической болезни кроликов, сохраняющего свои иммунобиологические свойства после инактивации и пригодного для изготовления высокоиммуногенных вакцинных препаратов, диагностических систем (из неконцентрированного вируса), способных защитить поголовье европейского кролика (Oryctolagus cuniculus) от эпизоотического возбудителя геморрагической болезни кроликов и идентифицировать его при заносе на территорию Российской Федерации.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса геморрагической болезни кроликов, отличающихся геномом и иммунобиологическими свойствами, обладающих высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных, лечебных и диагностических препаратов.
Данный технический результат достигнут получением штамма «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов. Штамм «Манихино-09» является новым и ранее неизвестным.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского Государственного Центра Качества и Стандартизации Лекарственных Средств для Животных и Кормов РОССЕЛЬХОЗНАДЗОРА (ФГУ «ВГНКИ») 19 ноября 2009 года под регистрационным шифром Штамм «Манихино-09».
Штамм «Манихино-09» отличается от ранее депонированного штамма ВГБК «Воронежский-87» на 7% по нуклеотидным последовательностям консервативной области гена VP-60 длинной 398 пар нуклеотидов и на 6% от штамма вируса ГБК «Белгородский-03». Вышеуказанные штаммы, основываясь на результатах филогенетического анализа, относятся к разным геногруппам.
Штамм «Манихино-09» обеспечивает проведение серологической диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов и производство эффективной инактивированной вакцины против ВГБК, создающей надежную защиту диких и домашних европейских кроликов от указанного возбудителя заболевания.
Штамм «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов характеризуется следующими признаками и свойствами.
Таксономическая характеристика заключается в том, что штамм «Манихино-09» имеет форму и размеры, типичные для калицивирусов. В серологических реакциях (РЗГА, РСК, ИФА, РДП) выявляются антигены, общие для всех штаммов вируса геморрагической болезни кроликов. Основные маркерные характеристики штамма «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов приведены в таблице.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения.
Пример 1
Для получения вируса геморрагической болезни кроликов штамм «Манихино-09» используют три ампулы с вирусом, на уровне первого пассажа на кроликах, павших от введения им 10% суспензии печени от кроликов, павших в Московской области в марте 2009 года (инфекционная активность не ниже 104,0 ЛД50/см3). В каждую ампулу вносят стерильный растворитель (дистиллированная вода или физиологический раствор, pH 7,0-7,4) до объема, указанного на этикетке. Затем содержимое ампул объединяют и из общей пробы готовят разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД50/см3. Указанное разведение вируса вводят внутримышечно 5 кроликам в объеме 1,0 см3. Инфицированных кроликов содержат в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных металлических клетках.
У инфицированных кроликов через 15-25 ч отмечают характерные клинические признаки болезни: угнетение, отказ от корма, повышение температуры тела до 40,7°C, носовое кровотечение и гибель в течение 24-96 ч. Трупы животных погружают на 5-10 мин в раствор марганцевокислого калия (1:10000), затем во вскрывочной комнате инфекционного вивария подвешивают на вешалки, снимают шкурки, обрабатывают брюшную полость раствором марганцевокислого калия (1:10000), разрезают брюшные мышцы по белой линии, извлекают печень, отделяют желчный пузырь. Печень используют только от трупов, при вскрытии которых обнаружены специфические патолого-анатомические изменения, свойственные ВГБК: геморрагии в трахее, геморрагическая пневмония, кровоизлияния под капсулой почек, селезенки, печень дряблой консистенции, которая легко рвется и имеет желто-коричневый цвет, местами с красноватым оттенком. Некроз печени и увеличение селезенки - первичные поражения. Острое поражение легких - результат венозного тромбоза, вызывающего острый отек, пенистый серозный или с примесью крови транссудат, который заполняет пеной трахею и выделяется постоянно из ноздрей. Инфаркты наблюдают почти во всех органах, а почки - полностью инфарктны и имеют темно-коричневый цвет.
Материал помещают в стерильные флаконы, плотно укупоривают, снаружи дезинфицируют 5%-ным раствором хлорамина, помещают в термос со льдом и доставляют в стерильный бокс.
Каждый образец печени готовят отдельно, используя отдельную стерильную посуду. Образец печени измельчают ножницами, добавляют стерильный ФСБ (соотношение 1:10 - вес/объем), гомогенизируют в блендере при охлаждении в течение 10 мин. Отбирают в отдельную стерильную пробирку типа «Eppendorf» для идентификации в ПЦР. В оставшийся материал вносят хлороформ (конечная концентрация 2%) и помещают в камеру бытового холодильника на 18 ч при 4°C. После чего суспензию печени центрифугируют в течение 1 ч при 6000 g при 4°C. Супернатант ультрацентрифугируют при 80000 g в течение 2 ч при 4°C, через 20%-й раствор сахарозы. Осадок ресуспендируют в ФСБ 1/100 от начального объема.
Для получения результатов молекулярно-генетической характеристики штамма «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов было проведено нуклеотидное секвенирование консервативной области гена VP-60, длинной 398 пар нуклеотидов.
Нуклеотидное секвенирование участков гена VP60 вируса геморрагической болезни кроликов проводят с использованием типоспецифических праймеров, разработанных для обнаружения вируса методом ПЦР. Выделение специфических продуктов амплификации из агарозного геля или реакционной смеси осуществляют коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «DNA purification kit» (Fermentas, Латвия), с последующей реамплификацией фрагментов при помощи компонентов «BigDye v.3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США). Реакцию с дефектными трифосфатами проводят в параллелях с прямым и обратным праймерами при следующих температурных режимах: 95°C - 10 с, 50°C - 20 с, 60°C - 4 мин - всего 25 циклов. По окончании реакции к смеси добавляют 45 мкл 96% этилового спирта и 2,5 мкл 125 мМ ЭДТА, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10-15 минут. Затем центрифугируют в течение 10-15 минут при 10000 g, надосадочную жидкость выбрасывают, а осадок промывали 75% этиловым спиртом по той же схеме с 10-15 мин экспозицией при комнатной температуре. Осадок после центрифугирования подсушивают, аккуратно растворяют в 10-12 мкл формамида. Полученную смесь денатурируют при 94°C в течение нескольких минут и резко охлаждают во льду. Секвенирование проводят в автоматическом анализаторе Genetic Analyzer 3130XL (Applied Biosystems, США).
Вируссодержащий материал всесторонне исследуют в соответствии с рекомендациями МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (2004) на отсутствие контаминации микоплазмами, бактериями и грибами путем посева на чувствительные питательные среды. Отсутствие контаминации посторонними вирусами и идентификацию вируса геморрагической болезни кроликов определяют методом негативного контрастирования электронной микроскопией. Определяют инфекционную активность на кроликах, гемагглютинирующую активность в РГА, антигенную активность в ТФ ИФА, специфичность в ТФ ИФА и РЗГА и на уровне 2 пассажа на кроликах вирус был расфасован, лиофилизирован и запаян в ампулы под вакуумом и заложен на хранение при температуре не выше минус 40°C в качестве Master seed (M.s.) с титром инфекционной активности не ниже 5,0 lg LD50/см3. Полученному штамму вируса геморрагической болезни кроликов присвоено авторское название «Манихино-09».
Пример 2
С целью определения биологической, антигенной и иммунологической активности вируса геморрагической болезни кроликов штамма «Манихино-09» проводят гипериммунизацию клинически здоровых кроликов из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням хозяйств, живой массой не менее 2,5 кг, согласно 2-ой схеме получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики ВГБК (патент №2077340 от 06 августа 1993 года). Для гипериммунизации кроликов используют тканевую инактивированную вакцину, изготовленную из штамма вируса геморрагической болезни кроликов штамм «Манихино-09» в дозе 0,5 мл на голову. Путь введения препарата животным - внутримышечно. Кратность введения - двукратно, с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй иммунизации от гипериммунизированных животных получают сыворотку крови. Специфическую сыворотку проверяют на активность и специфичность в реакции задержки гемагглютинации. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Приведенные в таблице 1 данные, характеризуют высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность штамма «Манихино-09» вируса геморрагической болезни кроликов при введении в организм лабораторным животным.
Пример 3
Для получения вируса, используемого при изготовлении тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Манихино-09», используют полученную и охарактеризованную матровую расплодку Master seed (M.s.) вируса геморрагической болезни кроликов из вышеуказанного штамма. Изначально готовят разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД50/см3. Указанное разведение вируса вводят внутримышечно кроликам в объеме 1,0 см3. Предварительно сыворотку крови кроликов исследуют на наличие антител к вирусу ВГБК «Манихино-09» в РЗГА при +(4±2)°C и при +(20±2)°C с эритроцитами крови человека 0(I) группы. При наличии специфических антител к указанному вирусу в титре 1:4 и выше кроликов в опыт не берут. Инфицированных кроликов содержат в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных металлических клетках.
Из полученной от павших кроликов печени готовят 10%-ную вирусную суспензию на забуференном физрастворе (pH 7,0-7,4). В материал вносят хлороформ (конечная концентрация 2%) и помещают в холодильник при 4°C на 18 часов. Затем суспензию печени центрифугируют в течение 1 ч при 6000 g при 4°C. Вирусная суспензия, используемая для изготовления тканевой инактивированной вакцины, должна иметь активность в РГА при +(4±2)°C не менее 1:1280-1:2560 ГАЕ.
Инактивацию вируса проводят с помощью 4%-ного раствора формалина. Исходя из концентрации формальдегида готовят 4%-ный раствор формалина (т.е. 1,1-1,4% раствор формальдегида) на стерильной дистиллированной воде. Раствор формалина готовят в стеклянных бутылях в день составления сырья для вакцины и вносят в вирусную суспензию до конечной концентрации 0,14-0,1% формальдегида.
Инактивируют вирус при температуре 27-28°C в течение 3-х суток с периодическим перемешиванием (1 раз в час в течение 5 мин).
Началом инактивации считают время после доведения температуры в емкости до 27-28°C и добавления формалина. После инактивации формалином к суспензии при постоянном перемешивании добавляют метабисульфит натрия (1М раствор) до полной нейтрализации остаточного формальдегида.
Из инактивированного материала брали пробу для проверки стерильности, активности и полноты инактивации. Для проверки полноты инактивации двум кроликам массой 2,5-3,0 кг, не имеющих антител к вирусу геморрагической болезни кроликов, вводят по 3,0 см3 внутримышечно инактивированный материал. Животные в течение 7 суток наблюдения оставались здоровыми.
После окончания инактивации вируссодержащей суспензии в емкость с вирусной суспензией добавляют гель гидрата окиси алюминия (ГОА) с 3% сухого остатка после размола из расчета на 1000 см3 суспензии 150 см3 ГОА (20%) при pH 7,2-7,4 и температуре 4-8°C (патент РФ №2039570 от 20 июля 1995 года). Сорбцию проводят в течение 1-2 часов с периодическим перемешиванием. Вакцину хранят при 8°C до получения результатов контроля препарата. Смесь перед фасовкой перемешивают при температуре 10-12°C в течение 1 часа.
Содержание антигена при +(4±2)°C в дозе вакцины на уровне 640-1280 ГАЕ является его оптимальным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.
Полученную вакцину проверяют на внешний вид, стерильность, уровень pH, полноту инактивации вируса, иммуногенность и безвредность.
Вакцина представляет собой прозрачную жидкость серо-коричневого цвета с рыхлым осадком, образующимся при хранении, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Безвредность препарата определяют путем его введения четырем кроликам внутримышечно по 3 см3. Вакцина считается безвредной, если она не вызывает гибель или заболевания кроликов, а также изменений некротического характера на месте введения в течение 14 суток наблюдения.
Полноту инактивации вируса в вакцине проверяют на 4 кроликах, которым вводят внутримышечно в область средней трети бедра по 3,0 см3.
За кроликами ведут наблюдение в течение 10 дней. Вакцину считают не содержащей инфекционного вируса, если она не вызывает гибели кроликов от вирусной геморрагической болезни в течение 10 суток после введения препарата.
В используемых флаконах с вакциной определяют pH, средняя величина показателей должна быть в пределах 7,2-7,4.
Гемагглютинирующую активность антигена каждой серии вакцины определяют в реакции гемагглютинации (РГА) при +(4±2)°C, с эритроцитами человека 0(I) группы и выражают в гемагглютинирующих единицах. Гемагглютинирующий титр в вакцине должен быть не ниже 8,0 log2, что соответствует разведению 1:256 ГАЕ.
Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что тканевая инактивированная гидроокисьалюминиевая вакцина против ВГБК из штамма «Манихино-09» обладает высокой гемагглютинирующей активностью.
При изучении иммуногенной активности тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Манихино-09» установлено, что у кроликов старше 1,5-2 мес. возраста, привитых однократно внутримышечно в дозе 0,5 мл уже на 5 день после введения препарата индуцируется иммунный ответ, обеспечивающий 90-100% образование гуморальных антител и защиту от заболевания. Экспериментально показано, что одна прививная доза в объеме 0,5 мл содержит не менее 640-1280 ГАЕ. Результаты исследований, представленные в таблице 3, подтверждают высокую эффективность инактивированной вакцины против ВГБК из штамма «Манихино-09».
Таким образом, штамм «Манихино-09», полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления вакцинных препаратов против ВГБК.
| Таблица 1 | |||
| Уровень накопления антител, задерживающих гемагглютинацию при гипериммунизации кроликов инактивированным вирусом ВГБК штамм «Манихино-09» | |||
| № кроликов | Титр антител, задерживающих гемагглютинацию | ||
| До введения | После 1-ой инъекции (log2) | После 2-ой инъекции (log2) | |
| 1 | 0 | 5 | 10 |
| 2 | 0 | 7 | 11 |
| 3 | 0 | 6 | 10 |
| 4 | 0 | 7 | 12 |
| Таблица 2 | ||
| Гемагглютинирующая активность тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины | ||
| № п/п | Серия вакцины | Гемагглютинирующая активность при +(4±2)°C (ГАЕ) |
| 1 | Экспериментальная серия №05-09 от 16.03.2009 | 1:16384 ГАЕ |
| 2 | Производственная серия №16-09 от 24.09.2009 | 1:4096 ГАЕ |
| Таблица 3 | ||||
| Иммуногенная активность тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Манихино-09» | ||||
| № п/п | Наименование испытуемого материала | Титры антител в РЗГА | ||
| До вакцинации (log2) | Через 5 дн. (log2) | Через 14 дн. (log2) | ||
| 1 | Сыворотка вакцинированного кролика | 1 | 4 | 8 |
| 2 | -*- | 0 | 3 | 8 |
| 3 | -*- | 0 | 4 | 9 |
| 4 | -*- | 1 | 4 | 8 |
| 5 | -*- | 0 | 5 | 7 |
| 6 | -*- | 0 | 4 | 8 |
| 7 | -*- | 0 | 4 | 7 |
| 8 | -*- | 1 | 5 | 9 |
| 9 | Сыворотка невакцинированного кролика | 1 | 1 | 0 |
| 10 | Сыворотка невакцинированного кролика | 0 | 0 | 0 |
Источники информации
1. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A.; J. Gen. Virol. - 2002. - Vol.83. - P.2461-2467.
2. Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2004; PART 2; SECTION 2.8.; CHAPTER 2.8.3. RABBIT HAEMORRHAGIC DISEASE.
3. Патент РФ №2077340 от 06 августа 1993 г.
4. Патент РФ №2039570 от 20 июля 1995 г.
5. Авторское свидетельство №294945 от 22.08.1989 г.
Claims (1)
- Штамм вируса геморрагической болезни кроликов, семейства Caliciviridae, род Lagovirus, коллекция ВГНКИ, регистрационное наименование «Манихино-09» - ДЕП для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010104089/10A RU2416642C1 (ru) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010104089/10A RU2416642C1 (ru) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2416642C1 true RU2416642C1 (ru) | 2011-04-20 |
Family
ID=44051345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010104089/10A RU2416642C1 (ru) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2416642C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2523791A1 (es) * | 2013-05-28 | 2014-12-01 | Organización Interprofesional Para Impulsar El Sector Cunícola - Intercun | Cepa del virus hemorrágico de conejo (RHDV) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2039570C1 (ru) * | 1992-05-26 | 1995-07-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов |
| RU2077340C1 (ru) * | 1993-08-06 | 1997-04-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов и набор для диагностики болезни |
| RU2229895C1 (ru) * | 2002-11-18 | 2004-06-10 | Кубанский государственный аграрный университет | Вакцина против вирусной геморрагической болезни кроликов |
-
2010
- 2010-02-09 RU RU2010104089/10A patent/RU2416642C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2039570C1 (ru) * | 1992-05-26 | 1995-07-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов |
| RU2077340C1 (ru) * | 1993-08-06 | 1997-04-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов и набор для диагностики болезни |
| RU2229895C1 (ru) * | 2002-11-18 | 2004-06-10 | Кубанский государственный аграрный университет | Вакцина против вирусной геморрагической болезни кроликов |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2523791A1 (es) * | 2013-05-28 | 2014-12-01 | Organización Interprofesional Para Impulsar El Sector Cunícola - Intercun | Cepa del virus hemorrágico de conejo (RHDV) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101880651B (zh) | 番鸭细小疫苗的制备方法 | |
| CN106267195B (zh) | 一种猪病毒性腹泻三联抗原抗体复合物及其制备方法 | |
| CN103849632B (zh) | 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用 | |
| CN108558995A (zh) | 一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN111073863B (zh) | 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法 | |
| CN108676092B (zh) | 一种防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN113491767A (zh) | 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN112063596A (zh) | 鸽副黏病毒1型ppmv-1/bj-c株及其应用 | |
| CN108969492B (zh) | 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗及其制备方法 | |
| CN108465107B (zh) | 一种鸭2型腺病毒和番鸭细小病毒病二联灭活疫苗 | |
| CN112280750B (zh) | 具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒及其应用 | |
| CN112341539B (zh) | 防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN104888213A (zh) | 一种猪瘟脾淋源复合活疫苗的制备方法 | |
| CN117224667B (zh) | 一种禽流感、新城疫病毒疫苗组合物及其应用 | |
| RU2416642C1 (ru) | Штамм "манихино-09" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов | |
| CN109735504B (zh) | 犬瘟热病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN108939063B (zh) | 一种番鸭三联灭活疫苗 | |
| RU2631925C2 (ru) | Штамм "Шевченко-2014" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных, диагностических и лечебных препаратов | |
| CN111097044A (zh) | 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗 | |
| CN112725288B (zh) | 犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用 | |
| RU2417262C1 (ru) | Штамм "белгородский-03" вируса геморрагической болезни кроликов для изготовления вакцинных и диагностических препаратов | |
| CN108707589A (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒SMU-Z6/1a/SC/2016分离株及其应用 | |
| CN108703952B (zh) | 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用 | |
| RU2294760C2 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а | |
| RU2077340C1 (ru) | Способ получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов и набор для диагностики болезни |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170210 |