CN111097044A - 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗 - Google Patents

犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN111097044A
CN111097044A CN201911308460.XA CN201911308460A CN111097044A CN 111097044 A CN111097044 A CN 111097044A CN 201911308460 A CN201911308460 A CN 201911308460A CN 111097044 A CN111097044 A CN 111097044A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leptospira
canine
dogs
inactivated vaccine
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911308460.XA
Other languages
English (en)
Inventor
金扩世
贺亚奇
张良婷
李登亮
胡义彬
李晓亮
李三鹏
尚川川
商云鹏
赵�卓
王力
江厚生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Centre Biology Co ltd
Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Centre Biology Co ltd
Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Centre Biology Co ltd, Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd filed Critical Beijing Centre Biology Co ltd
Priority to CN201911308460.XA priority Critical patent/CN111097044A/zh
Publication of CN111097044A publication Critical patent/CN111097044A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗。本发明采用我国分离的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒流行株经灭活后加入佐剂研制而成。本发明涉及病原体的分离培养、鉴定、灭活方法、生产工艺、疫苗保存和免疫方法。犬三联灭活疫苗用于预防犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病，免疫犬后可产生较高的抗体，对强毒攻击具有很好的保护作用。钩端螺旋体为人畜共患传染病，犬为人类的伴侣动物，宠物犬与人类密切接触，因此，该三联灭活疫苗具有较好的社会效益和重要的公共卫生意义。

Description

犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭 活疫苗
技术领域
本发明属于生物制品领域。本发明涉及犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒病三联灭活疫苗的研制和应用。
背景技术
犬钩端螺旋体病是由致病性的钩端螺旋体(Leptospira)引起的一种人畜共患传染病。导致犬发生本病的主要血清型为犬型钩端螺旋体(L.canicola)和黄疸出血型钩端螺旋体(L.icterohemorrhagia)。犬感染后主要表现为高热、黄疸、出血性素质、流产等症状。该病多发生于热带及亚热带地区。钩端螺旋体对各种年龄的犬均可感染，潜伏期4～14天。急性病例可突然发生，不食、呕吐、体温升高、精神沉郁、呼吸困难、粘膜黄疸、出血，一般发病3天内因机体衰竭死亡。亚急性症状以发热、呕吐、厌食、脱水、黄疸为特征，病犬粘膜可见有不规则的出血斑和黄疸。慢性症状多以急性或亚急性症归转而来，常以肝、肾及胃肠道症状为主。钩端螺旋体病为世界流行最广泛的人兽共患传染病之一，犬属动物是钩端螺旋体的易感动物，家犬与人、畜相处密切，对诊断和防止人、畜钩端螺旋体病感染和传播，具有重要的公共卫生意义。
犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCV)引起的犬病毒性传染病。犬冠状病毒呈圆形或椭圆形，直径为80～100nm，表面具有长约20nm的纤突为特征。犬冠状病毒基因组为单股RNA病毒，RNA在复制时采用独特的套式转录，因基因组的错配率和重组率都很高,从而导致冠状病毒的变异株多。犬冠状病毒可感染所有品种和各种年龄的犬(以幼犬受害严重)，是犬的一种多发性、急性胃肠道传染病，传染源主是病犬，传播途径主要是通过污染的饲料、饮水，经消化道感染。该病发病急、传染快、病程短、死亡率高，常与犬细小病毒或轮状病毒混合感染，使病情加剧，因急性腹泻和呕吐而脱水迅速死亡。临床上主要表现为频繁地呕吐、腹泻、沉郁、厌食，是危害养狗业的重要病毒性传染病。犬冠状病毒病呈世界性分布和流行，冠状病毒也是犬传染性呼吸道综合症(CIRD)的重要病原。因此，对犬冠状病毒病的预防具有重要意义。
犬三联灭活苗采用在我国自行分离的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋和犬冠状病毒流行毒株，经过对毒株培养、灭活方法、生产工艺研究，研制犬三联灭活苗，免疫犬后可完全保护强毒攻击。
目前国内外有关于犬钩端螺旋体疫苗研究和产品，但目前无犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗。为了达到注射一次同时预防和控制钩端螺旋体病和犬冠状病毒病的目的，研制该犬三联灭活疫苗具有良好的市场前景和推广应用价值。
发明内容
随着人们生活水平的不断提高，养犬不断扩大，宠物犬进入千家万户，犬作为人类的伴侣动物，宠物犬与人类密切接触。犬是钩端螺旋体易感动物，容易携带和传播钩端螺旋体病原，同时可以传播给所接触的易感人群，因此对犬进行钩端螺旋体的预防具有重要的公共卫生意义。犬冠状病毒分布广，并对所有品种和各种年龄的犬均易感，发病率高。本发明研制的犬三联灭活疫苗，可有效的预防和控制犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病的发生和流行。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供一种犬三联灭活疫苗，其包含灭活的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒，以及药学上可接受的佐剂。
所述犬型钩端螺旋体：黄疸出血型钩端螺旋体：犬冠状病毒：佐剂的比例为3:3:3:1。优选的，所述佐剂为605佐剂。
所述犬型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCC NO:18505，所述黄疸出血型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCC NO:18506，和/或所述犬冠状病毒的保藏编号为CGMCC NO:18507。
本发明提供一种所述的犬三联灭活疫苗的生产方法，其生产工艺流程包括：菌毒种分离鉴定、培养→测定毒价→收毒→灭活→安全、效力检验→按比例配苗→加佐剂→分装→成品检验→贴签包装。
建立了犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体培养方法。用改良Korthof培养基进行传代培养，培养温度28～30℃，培养7～14d，在暗视野显微镜检查400倍观察计数，每毫升的活菌数可达109/mL。
犬冠状病毒采用MDCK细胞进行培养传代，单层细胞接种，病毒毒价每毫升可达106.8TCID50。分离株犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体生物学和分子生物学鉴定。
分离株犬冠状病毒生物学和分子生物学鉴定。
钩端螺旋体菌的灭活，采用100:2.5(V/V)的比例加入0.1M BEI，在室温(25℃左右)下灭活30h。
犬冠状病毒的灭活，采用100:2.0(V/V)的比例加入0.1M BEI，在室温(25℃左右)下灭活30h。
三联灭活苗各组份的配比，黄疸出血型钩端螺旋体：犬型钩端螺旋体：犬病毒：605佐剂为3：3：3：1。
三联灭活苗分装，无菌分装，每瓶2.0mL。三联灭活苗保存2～8℃避光保存，保存期24个月。
本发明提供所述的犬三联灭活疫苗或所述的犬三联灭活疫苗的生产方法得到的犬三联灭活疫苗在制备用于预防和/或治疗犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和/或犬冠状病毒病的药物中的用途，所述疫苗可用于各种类型的犬，包括怀孕犬。
三联灭活苗免疫犬后攻毒保护，免疫犬后用同种强毒攻，可使免疫犬5/5保护。
三联灭活苗的免疫程序和免疫剂量为6～8周龄犬首次免疫，每次颈部皮下注射2.0mL，免疫两次，间隔2～3周。免疫期为一年，以后每年免疫一次。
本发明提供一种分离的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2或3所示。
本发明涉及的生物材料资源信息。
本发制苗所用的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒菌毒株为本公司自主分离鉴定和保存，并于2019年9月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCCNO:18505，CGMCC NO:18506，CGMCC NO:18507。
本发明的优点：
1、针对性强：所述犬三联灭活疫苗可同时预防犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和犬冠状病毒病。
2、生产工艺简单：所述犬三联灭活疫苗各成分可单独生产，对设备要求不高，适合于工业化大规模生产。
3、所述犬三联灭活疫苗的生产成本低，有利于我国普遍推广应用。
附图说明
图1：钩端螺旋体OmpLl基因扩增电泳图谱。
图2：犬冠状病毒RNA凝胶电泳图谱。
具体实施方式
1、犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的分离与鉴定
(1)采集、培养与形态学鉴定：
分别在河北和北京地区养犬场用灭菌容器采集凝似病犬新鲜犬尿液,经0.45μm的微孔滤膜过滤除菌后，无菌操作加于改良Korthof培养基，置28～30℃培养箱中培养，分别于5、7、10、14天取培养液暗视野显微镜检查，可见钩端旋体生长后并转接至新鲜改良Korthof培养基内继续培养，待生长良好作进行一步鉴定。
经过分离菌株的培养特性、形态学鉴定，分离株为典型的钩端螺旋体形态，菌体折光一致，两端或一端弯曲成钩状，运动活泼，沿菌体长轴旋转，菌体中央部分较僵直，两端比较柔软，有扭转运动现象。在暗视野显微镜下，菌体像一串发亮的细小链珠。
染色鉴定：均为革兰氏染色阴性。
革兰氏和银染色检均可见典型C型、S型或L型的钩端螺旋体。
分别用黄疸出血型、犬型、流感伤寒型、秋季热型、波摩那型钩端螺旋体标准犬血清进行血清凝集试验，其中河北分离株只与黄疸出血型钩端螺旋体呈明显凝集反应，与其它型钩端螺旋体呈阴性反应；北京分离株只与犬型钩端螺旋体呈明显凝集反应，与其它型钩端螺旋体呈阴性反应。
(2)分子生物学鉴定：
参照发表的钩端螺旋体OmpLl基因序列，设计扩增一对引物，由北京生工合成，P1：5’-AAGGAGAATTCAATGATCCGTAACA-3’，P2：5’-TTGATTGAATTCTTAGAGTTGGTGTTTATA-3’。扩增片段大小为961bp(如图1所示)。
分别取分离培养钩端螺旋体的培养液，13000r/min 4℃离心15min，收集菌体，并将沉淀悬浮于蒸馏水中，洗涤2次，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：98℃加热300S，96℃变性60S，55℃退火30S，72℃延伸60S，循环35次，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像仪中观察，结果均得到与预期一致的条带。
序列测定和分析：将扩增的PCR产物经生工测序，所测核苷酸序列用DNAstar软件进行分析，并与已公布的相同钩端螺旋体核苷酸序列进行比较。河北分离株与黄疸出血型钩端螺旋体同源性较高，同源性为99％。
北京分离株与犬型钩端螺旋体同源性较高，同源性为96％，而两分离株之间同源性为同源性为87.3％。
河北株黄疸出血型钩端螺旋体核苷酸序列(SEQ ID NO:1)
北京株犬型钩端螺旋体核苷酸序列(SEQ ID NO:2)
结果河北分离株确定为犬黄疸出血型钩端螺旋体，北京分离株确定为犬型钩端螺旋体。
(3)钩端螺旋体毒力：
①对豚鼠毒力：用体重120～180g的豚鼠9只，分成3组，其中两组分别用分离的犬型钩端螺旋体菌株和黄疸出血型钩端螺旋体菌株每只豚鼠经皮下注射已培养7～14天(在显微镜下400倍观察菌数为每视野90～100条活菌数)培养物2.0mL。另3只豚鼠注射2.0mL生理盐水对为对照，分别饲料，注射后观察10天。结果攻毒豚鼠均在观察期间发病死亡，对照建活。
②对犬毒力试验：取15只6～8周龄钩端螺旋体抗体阴性犬，分成3组，每组5只犬，其中1，2组分别用分离的两株钩端螺旋体攻毒，每只犬颈部皮下注射6.0mL(显微镜下放大400倍观察活菌数为每视野90～100条)攻毒，3组为对照组用生理盐水代替。攻毒后观察21天，结果两个攻毒组犬均5/5发病，分别有4/5和5/5犬死亡。对照犬均健活。结果表明：犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体对犬均具有较强的毒力。
③黄疸出血型钩端螺旋体对犬免疫原性试验：用6～8周龄钩端螺旋体抗体阴性犬10只，分成2组，每5只，一组用培养7～14天的黄疸出血型钩端螺旋体培养物制成的灭活疫苗进行免疫，每只犬注射0.5mL(灭活前每视野在显微镜下放大400倍观察菌数为90～100条，按抗原与佐剂9:1比例加入605佐剂配成单价苗)。另5只对照犬用生理盐水代替同时注射。间隔21天再注射一次，二免后21天，所有犬用培养7～14天的黄疸出血型钩端螺旋体培养物6.0mL(每视野在显微镜下放大400倍观察菌数为90～100条)攻毒，攻毒后观察21天。
结果：免疫犬在观察期间5只犬均无钩端螺旋体临床症状，对照组犬分别于攻毒3～5天后5只犬均呈现钩端螺旋体临床症状，分别在攻毒后5～8天内死亡，剖解为典形钩端螺旋体病理变化。
④犬型钩端螺旋体对犬免疫原性试验：用6～8周龄钩端螺旋体抗体阴性犬10只，分成2组，每5只，一组用培养7～14天的钩端螺旋体培养物制成的灭活疫苗进行免疫，每只犬注射0.5mL(灭活前每视野在显微镜下放大400倍观察菌数为90～100条；按抗原与佐剂9:1比例加入605佐剂配成单价苗)。另5只对照犬用生理盐水代替同时注射。间隔21天再注射一次，二免后21天，所有犬用培养7～14天的犬型钩端螺旋体培养物6mL(每视野在显微镜下放大400倍观察菌数为90～100条)攻毒，攻毒后观察21天。
结果：免疫犬在观察期间均正常，无钩端螺旋体症状，对照组犬分别于攻毒3～6天后5只犬均呈现钩端螺旋体临床症状，分别在攻毒后5～9天内死亡，剖解为典形钩端螺旋体病理变化。
2、犬冠状病毒的分离与鉴定
(1)犬冠状病毒的分离：从北京一宠物医院疑似犬冠状病毒病发病犬采集新鲜的粪便，用PBS(0.01M，pH值7.6)作4倍稀释，经5 000r/min离心10min后取上清液，加双抗作用4h，用0.2μm的滤膜过滤除菌，接种于长成单层的MDCK细胞，37℃感作1h，加入含2％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养，培养3～4天形成典型细胞病变(CPE)，培养5～6天当CPE达到75％以上收获，并进行传代培养。
(2)病毒形态学特征：将收获的病毒培养液8000r/min离心10min后，取上清进行电镜观察,结果具有典型冠状病毒特征。
(3)病毒血清学鉴定：分离的冠状病毒株不能凝集犬、鸡、猪、豚鼠、绵羊、兔及人的红细胞，也无红细胞吸附特性。
(4)特异性阳性血清鉴定：分离株冠状病毒可被CCV特异性阳性血清所中和。
(5)病毒RT-PCR扩增鉴定：
①引物设计：根据已发表的CCV的S基因核苷酸序列设计一对引物，由北京生工生物公司合成。CCVF1 5’-CCATTAATAGTGAACTGTTAGG-3’，CCVF2 5’-CTAAAT
GTTCTGTACTATTGAACGCC-3’。扩增片段大小为514bp。
②病毒RNA提取：按试剂盒操作，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，53.5℃退火45S，72℃延伸45S，35个循环；72℃延伸10min。取产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外凝胶图像系统观察，结果扩增出条带与设计大小相符(如图2所示)。
③序列测定：将扩增的病毒PCR产物经生工测序，并与已发表的CCV株病毒相同核苷酸序列进行比较分析，该分离株与其它CCV病毒株同源性为96％，表明所分离的病毒为一株CCV病毒株。北京株冠状病毒株核苷酸序列(SEQ ID NO:3)
④病毒毒力鉴定：用6～8周龄CCV抗原抗体阴性的易感犬10只，其中5只犬用CCV病毒6×106.0TCID50/mL攻毒，另5只注射生理盐水作为对照。攻毒后观察21天。结果攻毒组5/5犬出现冠状毒病症状，对照犬均健活。
⑤病毒免疫原性：用6～8周龄CCV抗原抗体阴性的易感犬20只，分为4组，每组5只犬，1组灭活前病毒滴度为1×106.0TCID50，2组灭活前病毒滴度为1×105.0TCID50，3组灭活前病毒滴度为1×104.0TCID50，灭活后抗原与佐剂均为9:1比例加入605佐剂配成疫苗，于颈部皮下注射进行免疫试验，免疫剂量均为每只犬每次1mL；间隔21天各组用相同剂量重复注射一次。另5只犬注射生理盐水作为对照犬。二免后21天时用CCV株强毒6mL(1×106.0TCID50)对所有犬攻毒，攻毒后观察21天。
结果：第1组和第2组免疫犬均无任何临床症状，保护率为5/5；第3组免疫犬攻毒后一只出现CCV临床症状，护率为4/5。对照犬攻毒后均表现CCV临床症状，其中一只犬于攻毒后第9天死亡，剖解为典型CCV病变。
3、三联灭活疫苗的配制：
按犬型钩端螺旋体：黄疸出血型钩端螺旋体：犬冠状病毒灭活抗原3:3:3比例进行混合为总抗原。
按总抗原：佐剂9:1(v:v)加入605佐剂，充分搅拌均匀，定量分装，每瓶2.0mL，密封瓶口，贴上标签标，2～8℃保存。
4、三联灭活疫苗成品检验
(1)外观检验：观察疫苗的颜色、性状，观察底部应无沉淀，应无分层及析出。
(2)pH值测定：按现行《中华人民共和国兽药典》2015年版三部附录检进行检测，pH值为6.4～7.2。
(3)稳定性检测：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现析出和分层。
(4)无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》2015年版三部附录检进行检测，应无细菌、霉菌、支原体。
(5)三联灭活疫苗成品安全检验
①一次单剂量不同途经注射安全试验
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性的6～8周龄健康易感犬15只，随机分成3组，每组5只，1、2组用分别三联灭活苗颈部肌肉注射和皮下注射1个免疫剂量(2.0mL)，3组犬注射生理盐水作为空白对照。注射后观察21天，观察所有犬的局部反应、精神、食欲、体温与粪便等变化。
皮下和肌肉注射结果表明：皮下注射对犬无刺激和不良反应轻，肌肉注射对犬注射部位有轻微红肿，2～3天完全消失。所以该疫苗免疫时，选择皮下注射免疫方式。
②单剂量重复注射安全试验
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性的6～8周龄健康易感犬10只，随机分成2组，每组5只，用三联灭活疫苗颈部皮下注射1个免疫剂量(2.0mL)，间隔21天重复注射一次，连续注射3次。另5只犬注射生理盐水作为空白对照。三次注射后观察21天，观察所有犬的局部反应、精神、食欲、体温与粪便等变化。
结果：所有犬经三次注射后均未出现任何不良临床反应，表明三次单剂量重复注射对犬安全，无任何不良反应。
③超剂量注射安全试验
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性的6～8周龄健康易感犬10只，随机分成2组，每5只，用三联灭活疫苗颈部皮下注射2个免疫剂量(4.0mL)，另5只犬注射生理盐水作为对照。注射后观察21天，观察犬的局部反应、精神、食欲、体温与粪便等变化。
结果：注射疫苗犬仅在注射部位有轻微红肿症状，经过2～3天后逐渐消失，未出现任何其它不良临床反应，对犬安全，无明显的不良反应。
④对怀孕犬安全性试验
用怀孕母犬10只，随机分成2组，每组5只犬。于产前30天左右颈部皮下注射三联灭活疫苗2个免疫剂量(4.0mL)，另一对照组犬注射生理盐水作为对照。注射后观察母犬的临床变化至分娩，包括有无早产、流产、死胎、弱胎等情况以及仔犬的成活、生长发育等。
结果：所有犬均正常分娩发育，无流产和死胎，仔犬均成活、生长发育正常。表明该疫苗两倍剂量注射怀孕母犬安全。
(2)三联灭活疫苗对犬免疫效力试验
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性的6～8周龄比格犬30只。随机分成2组，一组用三联灭活疫苗颈部皮下注射1个免疫剂量(2.0mL)，另一组犬注射生理盐水作为对照。第一次免疫后间隔21天重复免疫注射1次，第2次免疫后21天时，取5只免疫犬和5只对照犬同时分别用黄疸出血型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬冠状病毒株强毒6×106TCID50进行攻毒试验。攻毒后观察21天，观察各组犬攻毒后的体温、食欲、精神、粪便等临床症状和剖解病理变化。
结果：三联灭活疫苗免疫犬后犬黄疸出血型钩端螺旋体、犬型钩端螺旋体强毒攻毒和犬冠状病毒强毒攻毒保护均达到5/5保护。
(3)三联灭活疫苗最小免疫剂量
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性的6～8周龄健康的比格犬30只，随机分成6组，每5只犬，用三联灭活疫苗颈部皮下注射，第一组注射疫苗1.0mL/犬、第二组注射疫苗1.5mL/犬、第三组注射2.0mL/犬，另三组犬注射疫苗生理盐水作为对照组，第一次免疫后间隔21天重复免疫注射1次，第2次免疫后21天时分别取5只免疫犬和5只对照犬，同时分别用黄疸出血型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬冠状病毒强毒6×106TCID50进行攻毒试验。攻毒后观察21天，观察各组犬体温、食欲、精神、粪便等临床症状和剖解病理变化。
结果：第一组犬免疫保护率为4/5，第二组和第三组犬免疫保护率均为5/5。表明该三联灭活疫苗最低免疫剂量为每只犬注射1.0mL疫苗，为了达到更好的免疫保护效果，规定免疫剂量为2.0mL。
(4)三联灭活疫苗免疫犬后抗体消长规律、免疫程序和免疫期
用犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒抗原抗体阴性6～8周龄的比格犬30只，试验组15只，对照组15只。试验组犬用三联灭活疫苗颈部皮下注射1个免疫剂量，第一次免疫后间隔21天以相同剂量重复免疫1次。分别于一免后7d、14d、21d和二免后7d、14d、21d、30d、60d、120d、180d、240d、300d、360d、420d采血，分离血清，分别检测犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体抗体MAT值和犬冠状病毒血清抗体SN值，于免疫后第420d时分别用黄疸出血型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬冠状病毒强毒6×106TCID50进行攻毒试验。攻毒后观察21天，观察犬体温、食欲、精神、粪便等临床症状和剖解病理变化。
抗体检测结果：三联灭活疫苗免疫犬后不同时间的抗体检测结果表明，对犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体抗体一免后7日开始产生抗体，二免后抗体MAT值继续升高，30天达到峰值(1:2560)，至420天仍在保护水平以上。对犬冠状病毒抗体一免后7日开始产生抗体，二免后14天SN抗体值达到保护性抗体，并于21天达到峰值(1:256)，至免疫后420天仍在保护水平以上。
攻毒结果：三联灭活疫苗免疫420天后分别用犬黄疸出血型钩端螺旋体、犬型钩端螺旋体、犬冠状病毒强毒进行攻毒，对黄疸出血型钩端螺旋体攻毒保护率为4/5，对犬型钩端螺旋体保护率为5/5、犬冠状病毒攻毒保护率为5/5。
免疫程序的确定：三联灭活疫苗对6～8周龄犬免疫，一免后7天开始产生抗体，二免后21天后达到峰值，免疫后420天仍维持较高的水平。免疫程序确定为6～8周龄犬首次免疫二次，间隔21天，以后每年免疫一次。
免疫期的确定：三联灭活疫苗二免后420天抗体效价仍保持较高水平，攻毒试验达到免疫保护，为了确保免疫效果，规定免疫期为1年(360天)。
(5)仔犬通过母源抗体获得被动免疫力和免疫期试验
用三联灭活疫苗免疫后的3只母犬所产仔犬中随机各选5只仔犬，共15只，分别在出生后7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天采血检测黄疸出血型钩端螺旋体和犬型钩端螺旋体抗体MAT值，检测犬冠状病毒中和抗体SN。
经过对15只仔犬出生后不同时间抗体检测结果表明，仔犬获得的黄疸出血型钩端螺旋体和犬型钩端螺旋体保护性母源抗体可维持出生后56天(MAT值≧1:320)，之后迅速下降；仔犬获得的犬冠状病毒保护性母源抗体可维持出生后63天(SN值≧1:60)，之后迅速下降。
三联灭活疫苗免疫母犬后所产仔犬可以通过母源抗体获得被动免疫保护力，其保护抗体持续期为出生后56天，56天以后抗体效价迅速下降。因此，为了使仔犬能产生完全保护性抗体，对仔犬的首次免疫日期确定为出生后6～8周龄。
(6)三批疫苗保存期间常规检验
三批疫苗在2～8℃条件下保存，分别在保存后第3、6、9、12、18、24、30个月随机取样按照质量标准要求进行物理性状、外观、剂型、pH值、稳定性检测，并在保存30个月时进行免疫效力试验。
外观检验：三批疫苗均为透明性液体，无沉淀，无分层及析出。
pH值测定：按现行《中华人民共和国兽药典》2015年版三部附录检进行检测，三批疫苗pH值分别为6.4、6.5、7.2。
稳定性检测：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，无析出和分层。
无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》2015年版三部附录检进行检测，三批疫苗均无其它细菌、霉菌、支原体生长。
(7)三批疫苗保存期安全性检验
取2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗分别于犬颈部皮下接种6～8日龄犬5只，2mL/只，检测注射后24h、48h、7天体温变化，连续观察21天。
结果：所有犬注射后均无任何不良临床反应，均健活，表明该三联灭活疫苗保存30个月后免疫犬安全，无不良副作用。
(8)三批疫苗效力检验
用2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗经颈部皮下注射接种6～8周龄犬15只，2.0mL/只，间隔21日按照相同方法和剂量免疫1次，第2次免疫后21天时分别用黄疸出血型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬型钩端螺旋体菌6mL(显微镜下放大400倍观察每视野90～100条活菌数)、犬冠状病毒强毒4×106TCID50进行攻毒。攻毒后观察21天，观察各组犬体温、食欲、精神、粪便等临床症状和剖解病理变化，计算攻毒保护率。
攻毒结果：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬均可以提供较好的保护力，攻毒保护率均达到5/5保护。
综上表明：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬安全、可靠、稳定、有效。为了给靶动物提供更好的保护力，规定该疫苗的保存期为24个月。
Figure BDA0002323835800000111
Figure BDA0002323835800000121
<110>北京华夏兴洋生物科技有限公司
北京生泰尔科技股份有限公司
<120>犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗
<160>3
<210>1
<211>961
<212>DNA
<213>L.icterohemorrhagia
<400>1
atgatatgta acataagtaa ggcattgctc attttagccg tagcattatc ttcggctgca 60
agcttaagtg caactacata tgcaattgta ggatttgggt tacagttaga cctaggacaa 120
ttaggaggaa ctatcactaa agatggttta gacgctgcca ctcattatgg accagttcga 180
tcgtccaata cctgcaccgt aggtccaagt gatcctgctt gtaatcaaaa cccagcaaaa 240
cctacaggtg aaggaaatta tataggagtt gctcctagaa atcggattcc tgctgaaggc 300
agattaatca cccttgatag aaccactggt ggtgccatca atgcaagaag cactaaaggc 360
gccatggtcg gacctaattt gatggtaggt tatgagtccg actttggtaa atatttttcc 420
tggagagttg ctgcaggtaa tactcaaaaa tcttccggag gtgttacaat tccagacatc 480
gctggttata atattgtaga tatgacctgg ccacatagtt ctatcgtcat tcctgcagcc 540
gttggtatca aattgaatgt tactgaagac gctgcaatat atgccatatg gtttaaacta 600
ttccaatggt ggatggagtt aaaatggatc taacaatatc aaaggtggtt acgatatttt 660
aactgcagcg ggagcgggag ctgttgcgaa tttcaccagc gatccttccg atccagtcac 720
gactcgtgaa cacgttcgat ttagttattc tggaattgct cctaactttc caattggaac 780
tcaggccaga gtaaccgata aaggacacgt cttcattgaa ttagaaacga tcatgtctgc 840
tgcgtatgca gttggtacta ctcaatctgg tccaggagct acgaaccttt ctccttttcc 900
agcatatccg atcgttgtcg gtggacaaat ctacagattc ggccgtaacc acgaactcta 960
c 961
<210>2
<211>961
<212>DNA
<213>L.canicola
<400>2
atgatccgtc tcataagtaa ggctttgctc ataatagccg atgggttatc ttcggctgca 60
agcctaagtg caataacata tgcaattgta ggatttgggt tacagttaga cctaggacaa 120
ttagctcgaa ccatcaccaa agacggttta acgctgccac tcaaattgga ccagttcgat 180
cgtccaatac ctgcaccgta ggtccaagtg atcctgcttg tccttaaaac ccagccgaac 240
ctacaggtga aggaaattaa tatggagttg ctcctagaat tgcgattcct gctgaaaaca 300
gattaatcac ccttgataga accactggtg gtgccatcaa tgcaagaagc actaatccgg 360
ccatggtcgc tccaaatttg atggtaggtt atgagtccga ctttggtaaa taatttaact 420
ggagagttgc tgcagaatat actccaaaaa tttccggagg cgttacaaag gcggacatcg 480
ctggttataa tattgtagat atgacctggg ctttagttct atcgtcattc ctgcaaccgt 540
tggtatcaaa ttgaatgtta ctgaagacgc tgcaatatat atgggagcag gtttaaacta 600
tttcaatggt ggatggagtt taaatggatc taacaatatc aaaggtggtt acgcgcgttt 660
aactgcagcc ggagcgggag ctgttgcgaa tttactgagc ctacgaaccg atccagtaac 720
tactcgtgaa cacgttcgat ttagaacttc tggaattgct ccaaactttt taattggaac 780
tcaggccaga gtaaccgatt aaggacacga attcattgaa ttagaaacga tcatgtctgc 840
tgcgtatgca gttggtccaa ctcaatctgt tggaagagct acgaaccttt acacttttcc 900
agcatagagg atcgttgtcg gtgaataaat ctacagattc ggttataaac acgaactctt 960
a 961
<210>3
<211>513
<212>DNA
<213>Canine coronavirus
<400>3
ctgttttgtc aaacgtgttg attggtcaat tgtgtaccct tttattgaca acgaagaaaa 60
gatcaataag ctggtcgcat agtacagtca catgtcatga aagctgctct gaaaattttt 120
aatcctgctg caattcacga tgtgggtaat cccaaaggca tccgttgtgc tacaacacca 180
ataccatggt tttgttatga ccgtgatcct attaataaca atgttagatg tctggagtat 240
gactatatgg tacatggtca aatgaatggt cttatgttgt tttggaactg taatgtggac 300
atgtacccag agttctcaat tgtttgtagg tttgatactc gaactcgctc taaattatct 360
ttagaaggtt gtaatggtgg tgcattgtat gtaaacaatc atgctttcca cacaccagct 420
tatgatagaa gagcatttgc taagcttaaa ccaatgccat tcttctacta tgatgatagg 480
tagttgtgaa cttgttgatg ggcaattaaa cta 513

Claims (10)

1.一种犬三联灭活疫苗，其包含灭活的犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体和犬冠状病毒，以及药学上可接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的犬三联灭活疫苗，其中犬型钩端螺旋体：黄疸出血型钩端螺旋体：犬冠状病毒：佐剂的比例为3:3:3:1；优选的，所述佐剂为605佐剂。
3.根据权利要求1或2所述的犬三联灭活疫苗，其中所述犬型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCC NO:18505，所述黄疸出血型钩端螺旋体的保藏编号为CGMCC NO:18506，和/或所述犬冠状病毒的保藏编号为CGMCC NO:18507。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的犬三联灭活疫苗的生产方法，其生产工艺流程包括：菌毒种分离鉴定、培养→测定毒价→收毒→灭活→安全、效力检验→按比例配苗→加佐剂→分装→成品检验→贴签包装。
5.根据权利要求4所述的生产方法，所述犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的培养工艺包括：用改良Korthof培养基进行传代培养，培养温度28～30℃，培养7～14d，在暗视野显微镜检查400倍观察计数，使上述两种钩端螺旋体菌生长达109/mL。
6.根据权利要求4所述的生产方法，所述犬冠状病毒采用MDCK细胞进行培养传代，单层细胞接种，病毒毒价每毫升达到106.8TCID50。
7.根据权利要求4-6任一项所述的生产方法，所述犬型钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的灭活，采用100:2.5(V/V)的比例加入0.1M BEI，在室温下灭活30h；所述犬冠状病毒的灭活，采用100:2.0(V/V)的比例加入0.1M BEI，在室温下灭活30h。
8.根据权利要求1-3任一项所述的犬三联灭活疫苗或根据权利要求4-7任一项所述的生产方法得到的犬三联灭活疫苗在制备用于预防和/或治疗犬型钩端螺旋体病、黄疸出血型钩端螺旋体病和/或犬冠状病毒病的药物中的用途，所述疫苗可用于各种类型的犬，包括怀孕犬。
9.根据权利要求1-3任一项所述的犬三联灭活疫苗，根据权利要求4-7任一项所述的生产方法或权利要求8所述的用途，所述犬三联灭活疫苗在注射后对犬注射部位无明显的刺激反应，可产生较强的抗体，强毒攻击可达5/5的保护，免疫期可达1年以上。
10.一种分离的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2或3所示。
CN201911308460.XA 2019-12-18 2019-12-18 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗 Pending CN111097044A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911308460.XA CN111097044A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911308460.XA CN111097044A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111097044A true CN111097044A (zh) 2020-05-05

Family

ID=70423625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911308460.XA Pending CN111097044A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111097044A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115477700A (zh) * 2022-10-31 2022-12-16 吉林大学 一种抗钩端螺旋体卵黄抗体及其制备方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115477700A (zh) * 2022-10-31 2022-12-16 吉林大学 一种抗钩端螺旋体卵黄抗体及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101117627B (zh) 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用
CN101514334B (zh) 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用
US8277814B2 (en) Avian Astrovirus
CN103849632B (zh) 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用
CN104513827A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒株、其弱毒疫苗株及应用
CN106947746B (zh) 鸡传染性支气管炎致弱疫苗株ldl-t株及其应用
CN110872578B (zh) 一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN104788561A (zh) 抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法
CN113491767A (zh) 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法
CN108465107B (zh) 一种鸭2型腺病毒和番鸭细小病毒病二联灭活疫苗
CN108135993A (zh) 用于先天性震颤的瘟病毒疫苗
CN106190988B (zh) 猫嵌杯病毒ch-jl5株灭活疫苗
CN110859956B (zh) 一种犬细小病毒灭活疫苗及其制备方法
CN110846284B (zh) 一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用
CN106854647B (zh) 鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用
CN116218707B (zh) 一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用
CN111097044A (zh) 犬型钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、犬冠状病毒三联灭活疫苗
CN104130981A (zh) 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用
CN108939063B (zh) 一种番鸭三联灭活疫苗
CN110314228B (zh) 猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法
CN114395536B (zh) 一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用
CN111110839B (zh) 一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
CN110079509B (zh) 一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法
CN108660117B (zh) 一种导致肉鸡关节炎的新型鸡呼肠孤病毒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination