CN114395536B - 一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用。所述禽腺病毒三价疫苗包括禽腺病毒4型疫苗株QYH2019‑YN、禽腺病毒8型疫苗株QYH2020‑HB和禽腺病毒11型疫苗株QYH2020‑SY。本发明提供了一种禽腺病毒三价疫苗，由最新分离得到的禽腺病毒4型疫苗株、禽腺病毒8型疫苗株和禽腺病毒11型疫苗株制备得到，其对于4、8和11型禽腺病毒及其引起的鸡包涵体肝炎和心包积液‑肝炎综合征具有有效的预防作用。

Description

一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种禽腺病毒4、8 和11型三价疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV-I)属于腺病毒科，禽腺病毒属。禽腺病毒是常见的传染病病原，广泛存在于多种禽类的呼吸道和消化道，仅少数禽腺病毒具有致病性，多数腺病毒可在禽体内复制，但并不表现出临床症状或症状非常轻微，在混合感染时，腺病毒可成为条件性病原，可以使鸡群呈隐性感染或作为继发病原引起鸡群发病和死亡。
禽腺病毒根据群特异性抗原的不同分为I、II、III三个亚群，目前 I亚群中有5个种、12个血清型，分别为A(血清1型)、B(血清5型)、 C(血清4型)、D(血清2型、血清3型、血清9型和血清11型)、E(血清6型、血清7型和血清8型)。临床上I亚群禽腺病毒可引起鸡包涵体肝炎和心包积液-肝炎综合征(安卡拉病)，其中，心包积液-肝炎综合症(安卡拉病)是由I亚群禽腺病毒中的血清4型所导致的传染性疾病；包涵体肝炎则是由I亚群禽腺病毒中的其余血清型所引起。目前，大多数禽腺病毒I型病毒的致病性还未完全明确，不同血清型的致病性有较大差异。II亚群是火鸡出血性肠炎和鸡大脾病的病原，III亚群引起鸡产蛋下降综合症。
禽腺病毒对外界环境具有很强的抵抗力，其复杂的传播方式使其近年来快速传播与流行，给国内家禽养殖业造成较大的影响和损失。血清4型禽腺病毒引起的心包积液－肝炎综合症，又称“安卡拉病”，该病一年四季均能发生，夏秋季节多发。病毒主要存在于鸡的眼、上呼吸道以及消化道，通过种蛋、鸡胚垂直感染，也能通过粪便、飞沫水平传播。死亡鸡90％以上有明显的心包积水，积水量可多达20毫升，颜色淡黄而澄清，心包呈水囊状，心脏畸形，松弛柔软。肝脏肿大，质脆，外观呈浅黄至深黄色，并有坏死灶，肝细胞可见有嗜碱性核内包涵体。该疾病主要发生于3-5周龄的肉鸡，肉杂鸡、麻鸡、种鸡和蛋鸡，死亡率在10％～80％不等，一般在30％左右。
血清8和11型禽腺病毒也是近几年来我国禽腺病毒主要流行的血清型，主要引起鸡的包涵体肝炎。血清8和11型禽腺病毒毒力弱于血清4型禽腺病毒，主要感染3-8周龄的各种鸡只，总体死亡率通常在10％以下，但有时可达到30％。该病的特征性病理变化为包涵体肝炎，表现为肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆易碎，肿胀、呈脂肪变性，表面有不同程度的出血点或出血斑，伴发局灶性坏死，在肝细胞核内可见嗜碱性或嗜酸性的包涵体，边缘较大而清晰，呈圆形或形状不规则。
虽然心包积液-肝炎综合征和包涵体肝炎在病理组织变化上十分相似，但引起这两种疾病的禽腺病毒并不相同，在流行规律和病变特征上也存在一定差异，而且禽腺病毒不同血清型之间交叉保护比较弱。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用。
本发明从多种禽腺病毒感染组织样品分离得到三种禽腺病毒疫苗株，包括有禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN、禽腺病毒8型疫苗株 QYH2020-HB和禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY。
本发明针对这三种疫苗株进行了生物保藏，保藏信息如下：
针对禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，保藏编号：CGMCC No.45063，分类命名：禽腺病毒I群4型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
针对禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB，保藏编号：CGMCC No.45064，分类命名：禽腺病毒I群8型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
针对禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY，保藏编号：CGMCC No.45065，分类命名：禽腺病毒I群11型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
本发明进一步提供所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，或所述禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB，或所述禽腺病毒11型疫苗株 QYH2020-SY在制备用于预防种禽腺病毒的疫苗中的应用。
第二方面，本发明提供一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗，同时包括所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，所述禽腺病毒8型疫苗株 QYH2020-HB，和所述禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY。
进一步地，所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN的病毒含量为抗原含量为107.0～107.5TCID50/mL；和/或，所述禽腺病毒8型疫苗株 QYH2020-HB的病毒含量为107.0～107.5TCID50/mL；和/或，所述禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY的病毒含量为107.0～107.5TCID50/mL。
进一步地，还包括疫苗佐剂；
所述疫苗佐剂包括矿物油、硬脂酸铝和司本80。
进一步地，以重量份计，所述疫苗佐剂包括矿物油90～100份、硬脂酸铝1～5份和司本80 3～10份。
本发明进一步提供所述禽腺病毒三价疫苗的制备方法，包括：
(1)混合矿物油、硬脂酸铝和司本80；
(2)混合灭活的所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN、所述禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB、所述禽腺病毒11型疫苗株 QYH2020-SY和吐温80；
(3)混合步骤(1)和(2)的产物。
进一步地，步骤(2)中所述吐温-80的用量为整个体系的3～10％。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种禽腺病毒三价疫苗的制备方法，包括：
(1)油相制备
取矿物油90～100份，硬脂酸铝1～5份，混合均匀并加热至80～85℃后，再加3～10份司本80，至温度达到115℃时维持30～45分钟后冷却；
(2)水相制备
将灭活的禽腺病毒4型病毒液、禽腺病毒8型和禽腺病毒11型病毒液混合；取混合病毒液90～100份灭菌的3～10份吐温80，充分混匀；
(3)乳化
将步骤(1)中制备得到的油相和步骤(2)中制备得到的水相以 (1～3)：1的比例在3000～4000r/min条件下搅拌25～35分钟。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明从分离鉴定的流行毒株中筛选出的免疫原性好，病毒滴度高，且经过噬斑纯化，病毒纯净性好的病毒株作为禽腺病毒三价灭活疫苗的制苗毒株，通过最佳接种剂量和最适收获时间等培养条件的优化，培养出效价稳定的4、8和11型禽腺病毒。
(2)本发明提供的禽腺病毒三价疫苗对4、8和11型禽腺病毒引起的鸡包涵体肝炎、心包积液-肝炎综合征具有预防作用。
(3)本发明提供的禽腺病毒疫苗的生产工艺、安全性、免疫评价等研究结果表明该疫苗安全性好，免疫效果稳定。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的不同代次QYH2019-YN株株Hexon基因序列比较结果。
图2为本发明实施例1提供的不同代次QYH2020-HB株Hexon基因序列比较结果。
图3为本发明实施例1提供的不同代次QYH2020-SY株Hexon基因序列比较结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：禽腺病毒野毒株的分离与筛选
1、禽腺病毒野毒株的分离与鉴定
本发明在辽宁、河北、黑龙江、山东、河南、江苏、云南和宁夏等地收集多份疑似禽腺病毒感染组织样品，患病鸡只主要表观剖检病变：(1)可见心包腔中积聚约5～10mL不等的淡黄色清亮水样或胶冻样液体；(2)肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆易碎，肿胀、呈脂肪变性，肝脏颜色较浅，有局部坏死性病灶，肾脏苍白、肿大、出血等。
本发明采集出现典型症状和病理变化的肝脏组织，称重量后分别按照1:3的重量比加入灭菌的PBS剪碎研磨，4℃条件12000r/min 离心10min，无菌过滤后，经卵黄囊接种5日龄SPF鸡胚各5枚，0.2mL/ 枚。弃去24h内死亡的鸡胚，以后每隔24h观察1次，收取死亡鸡胚的尿囊液及胚体，至192小时取出所有鸡胚尿囊液及胚体，组织捣碎，留样进行PCR检测，剩余病毒分离物置于-70℃保存备用。
2、PCR扩增鉴定
取分离毒接种鸡胚后的尿囊液，按常规方法进行病毒基因组 DNA的提取。进行PCR检测，扩增hexon基因。在紫外灯照射下切取特异性条带，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。连接并转化于大肠杆菌感受态细胞。将阳性样品进行hexon基因测序，并进行遗传进化分析。
3、样品进行纯净度检测
利用已建立的PCR，RT-PCR等检测方法，对分离毒株中是否含其他常见杂病毒进行检测。检测项目包括禽流感病毒、网状内皮增生症病毒、禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒(NDV)、马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒、禽痘病毒和呼肠孤病毒等。
本发明按常规方法配制不同浓度(0.8％～2％)的鸡、鸭和大鼠红细胞。检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果显示，分离病毒均不具有凝集鸡、鸭和大鼠红细胞的能力，即使改变不同红细胞的浓度也不能使之凝集。减蛋综合症病毒能够凝集鸡、鸭的红细胞，但不能使大鼠的红细胞发生凝集。
4、病毒滴度测定
将分离到的病毒液在离心管中用Waymouth培养基将病毒液作连续10倍的稀释至10-10。将10-5～10-10稀释度的病毒液接种到细胞LMH 细胞长势良好的96孔板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μL，置CO2培养箱吸附2小时后加入细胞维持液，继续培养168小时，观察细胞病变，出现细胞病变者判为阳性，按Reed-Muench法计算 TCID50。
基于以上初步分离及鉴定的病毒液，根据病毒纯净性以及增殖能力，筛选出1株2018年分离自云南的禽腺病毒4型病毒，命名为 QYH2019-YN株；1株2020年分离自河北的禽腺病毒8型病毒，命名为QYH2020-HB株；1株2020年分离自辽宁沈阳的禽腺病毒11 型病毒命名为QYH2020-SY株。
本发明针对这三个毒株进行了生物保藏，具体的保藏信息如下：
针对禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，保藏编号：CGMCC No.45063，分类命名：禽腺病毒I群4型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
针对禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB，保藏编号：CGMCC No.45064，分类命名：禽腺病毒I群8型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
针对禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY，保藏编号：CGMCC No.45065，分类命名：禽腺病毒I群11型，保藏单位：中国普通微生物保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2021年12月17日。
5、病毒噬斑纯化
将QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株病毒液分别在离心管中，用Waymouth培养基将病毒液作连续10倍稀释至 10-7。将10-5～10-7稀释度的病毒液接种到LMH细胞长势良好的6孔培养板中，每孔接种2mL，置CO2培养箱吸附2小时后，弃去病毒液，用PBS洗涤2遍去除未吸附的病毒，加入含2％低熔点琼脂糖的 Waymouth培养基，置4℃冰箱放置10min，待琼脂凝固后倒置在CO2培养箱中继续培养，待细胞培养板中出现病毒蚀斑后，挑取单个蚀斑接种长势良好的LMH细胞，进行病毒增殖。每个毒株各挑选蚀斑5 个，然后测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的克隆毒株，作为基础种毒F1代，并通过LMH细胞连续传代至15代。
实施例2：QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株鉴定及性质
1、无菌检验
按照现行《中国兽药典》附录进行检验，QYH2019-YN株、 QYH2020-HB株和QYH2020-SY株F1代种毒样品分别接种后，无菌生长。
2、病毒含量测定
将QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株F1代病毒液10倍系列稀释至10-10，取10-5-10-10四个稀释度，分别接种LMH 细胞长势良好的96孔培养板，置37℃，5％CO2孵育2小时后，加入维持液，继续培养168小时。168小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明QYH2019-YN株F1种毒的病毒含量为108.67TCID50/0.1mL， QYH2020-HB株株F1种毒的病毒含量为108.25TCID50/0.1mL，QYH2020-SY株F1种毒的病毒含量为107.75TCID50/0.1mL。
3、QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株稳定性评价
分别对QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株F1、F5、F10和F15病毒液提取病毒DNA，并分别对Hexon基因进行扩增和测序，序列比对结果显示：QYH2019-YN株、QYH2020-HB 株和QYH2020-SY株各代次的Hexon基因同源性为100％，表明 QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株遗传稳定性好，结果见图1、图2和图3。
4、外源病毒检测
分别将QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株收获的病毒液用无菌PBS稀释至107TCID50/0.1ml，0.15％甲醛灭活后，加入油佐剂乳化，颈部皮下进行接种10日龄SPF鸡，0.2mL/羽，21天后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42日采血分离血清，分别使用血凝抑制试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、中和试验和免疫荧光试验等方法，检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、鸡马立克病毒、禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒和鸡痘病毒的抗体阳性率。结果表明：血清中除检测到禽腺病毒抗体外，无其它病毒抗体，证明种毒纯净，无其它外源病毒的污染(表1)。
表1外源病毒血清学检验结果
5、QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株毒力测定
(1)致细胞病变作用
分别将QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株F1、 F5、F10和F15代病毒液，接种于单层LMH细胞，接种量为0.1％，置 37℃，5％CO2培养，接种后每12小时观察一次，观察至168小时，记录细胞病变，结果显示QYH2019-YN株，接种后24小时左右逐渐开始出现细胞病变，接种48小时后，约有80-90％细胞崩解。QYH2020-HB 株，36小时逐渐开始出现细胞病变，接种72小时后，约有80-90％细胞崩解。QYH2020-SY株，36小时逐渐开始出现细胞病变，接种84小时后，约有80-90％细胞崩解。
(2)对SPF鸡致病力
将40只14日龄SPF鸡随机分成4组，每组10只，静脉接种 QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株病毒液，每只 0.2mL(病毒含量为107.0TCID50/0.1ml)，另一组10只，接种等量的灭菌生理盐水做为正常对照组。接种后每天观察各组鸡只临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。
QYH2019-YN组接种第1天后鸡只开始发病死亡，3天内全部死亡，病鸡羽毛蓬松，采食减少，扎堆，精神萎靡。剖检可见心包积液明显，心包腔中有黄色清亮水样或果冻样液体。肝脏肿大、质脆，外观呈浅黄至深黄色，并有坏死灶。肾脏肿大。腺胃乳头出血，腺胃与肌胃交界处出血尤为明显。
QYH2020-HB组接种第2天后鸡只开始发病，发病鸡只精神沉郁，羽毛散乱，并在3天后开始出现死亡，接种后第7天存活鸡只逐渐恢复到正常状态，死亡率达到60％。病死鸡剖检可见肝脏呈土黄色，肿胀、质脆易碎，呈典型的包涵体肝炎症状，肾脏有尿酸盐沉积。
QYH2020-SY组接种2天后鸡只开始发病，发病鸡只精神沉郁，羽毛散乱，并在3天后开始出现死亡，接种后第7天存活鸡只逐渐恢复到正常状态，死亡率达到50％。病死鸡剖检可见肝脏呈土黄色，肿胀、质脆易碎，呈典型的包涵体肝炎症状。
接种生理盐水对照组鸡只的精神状态、采食和饮水均正常，100％存活。
表2禽腺病毒4、8和11型对14日龄SPF鸡的致病性试验
实施例3：QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株最佳接种量和收获时间
1、最适接种量
将QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株种毒分别按照1:100、1:1000和1:10000接种于长势良好的单层LMH细胞上，每个样品重复3次，置37℃，5％CO2培养，观察细胞病变，当80-90％以上的细胞病变后，收获病毒液，反复冻融2次后，采用real-time PCR 方法测定培养物中病毒颗粒，选取浓度最高者确定最佳接种剂量。结果表明：QYH2019-YN株按1:1000，QYH2020-HB株和QYH2020-SY 株按1:100接种，病毒效价最高。
2、最佳收获时间
根据最佳接种剂量试验结果，选择最佳接种剂量，接种于长势良好的单层LMH细胞上，分别在接毒后24、48、72、96、120、144、 168和192小时后，冻融3次，收集细胞培养物，采用real-time PCR 方法测定培养物中病毒颗粒，选取浓度最高者确定最佳收获时间。结果表明：结果表明：QYH2019-YN株按1:1000比例接种后72h收获病毒液，病毒效价最高。QYH2020-HB株和QYH2020-SY株按1:100 接种后72h收获病毒液，病毒效价最高。
实施例4：抗原制备及半成品检验
1、生产用抗原的制备
(1)抗原制备
按照实施例3确定的最佳接种量和病毒收获时间，向长势良好的 LMH细胞分别接种QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和 QYH2020-SY株病毒液，置于37℃，5％CO2培养，当细胞病变达80-90％以上时，冻融2次，收获病毒液，并留样进行检测。
待检样品根据现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，支原体检验，外源病毒检验，应无细菌、真菌、支原体、外源病毒污染，并且灭活前病毒含量QYH2019-YN株每0.1ml病毒液含量应≥108.5TCID50， QYH2020-HB株和QYH2020-SY株每0.1ml病毒液含量应≥107.5TCID50，灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。
2、半成品检验
(1)无菌检验，按现行《中国兽药典》附录，对灭活后的 QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株进行无菌检验，应无菌生长。
(2)灭活检验检
QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株病毒培养液用最终含量为0.15％的甲醛，37℃灭活24小时。灭活完成后取样做无菌检验及灭活检验，置2～8℃保存，应不超过7日。取3批灭活病毒培养液，按1％接种长势良好的LMH细胞24孔培养板中，37℃培养、5％CO2，每12小时观察一次，观察至168小时，其后盲传1 代，检测样品孔应均不出现细胞病变，判定为灭活完全。
实施例5：疫苗制备及检验
1、疫苗制备
(1)油相制备：取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备。
(2)水相制备：将灭活的禽腺病毒4型病毒液、禽腺病毒8型和禽腺病毒11型病毒液混合，使三价疫苗中每种毒株的抗原含量不低于107.0TCID50；取混合抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀。
(3)乳化,取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min搅拌5分钟，8000r/min搅拌15分钟，完成乳化制备。
(4)定量分装，加盖密封，并贴标签，置2～8℃保存。
2、疫苗的安全试验
(1)最小使用日龄不同途径一次单剂量接种安全试验
将70只7日龄SPF鸡分成4组，1～3组免疫组各为20只，第4 组对照组10只，1～3组免疫组每组再分成两小组各10只SPF鸡，通过不同的免疫途径(肌肉注射或颈部皮下注射)分别接种禽腺病毒4、 8和11型三价灭活疫苗，批次分别为20201001、20201002和20201003，剂量为0.5mL/只；对照组10只颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。各组鸡在同条件下分别饲养管理，连续观察14日；如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变；观察活鸡有无不良反应。14 天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验，结果见表3。
表3最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验结果
(2)单剂量重复接种安全性试验
将40只10日龄SPF鸡分成4组，每10只，通过颈部皮下注射禽腺病毒4、8和11型三价灭活疫苗，批次分别为20201001、20201002 和20201003，剂量为0.5mL/只；对照组10只颈部皮下注射0.5mL/ 只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日；观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。于第一次免疫后14天再以同样剂量重复接种，继续观察14天，观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。对鸡只的局部炎症、组织病变等进行评判。第二次免疫后14 天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。单剂量重复接种安全性试验，结果见表4。
表4单剂量重复接种的安全性试验结果
(3)一次超剂量接种安全性试验
将40只10日龄SPF鸡分成4组，每10只，通过颈部皮下注射禽腺病毒4、8和11型三价灭活疫苗，批次分别为20201001、20201002 和20201003，剂量为2.0mL/只；对照组10只颈部皮下注射2.0mL/ 只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日，将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。超剂量接种的安全性试验，结果见表5。
表5超剂量接种的安全性试验结果
疫苗批号 免疫日龄 试验鸡数 免疫剂量 免疫途径 结果判定
20201001 21 10只 2mL 颈部皮下 正常
20201002 21 10只 2mL 颈部皮下 正常
20201003 21 10只 2mL 颈部皮下 正常
对照 21 10只 2mL 颈部皮下 正常
3、疫苗效力试验
取10日龄SPF鸡120只，分成12组，每10只，1～6组分别颈部皮下接种3批禽腺病毒4、8和11型三价灭活疫苗(批号为： 20201001、20201002和20201003)，每只0.5mL。同时设非免疫攻毒对照组，颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。于免疫后14天采集血清，用琼扩方法检测抗体，并分别静脉注射2×107.0TCID50的禽腺病毒QYH2019-YN株、QYH2020-HB株和QYH2020-SY株，连续观察14日。如有死亡，对死亡鸡只进行剖检，攻毒14后将全部存活鸡只逐一剖检，观察内脏有无病变。结果表明：免疫禽腺病毒4、8 和11型三价灭活疫苗组鸡只精神状态、采食、饮水等正常，解剖后各脏器正常，未出血心包积液或包涵体肝炎症状，具体结果见表6。
表6免疫效力检验结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，其特征在于，所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN的保藏编号为：CGMCC No.45063。
2.一种禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB，其特征在于，所述禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB的保藏编号为：CGMCC No.45064。
3.一种禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY，其特征在于，所述禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY的保藏编号为：CGMCC No.45065。
4.权利要求1所述的禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN，或权利要求2所述的禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB，或权利要求3所述的禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY在制备用于预防禽腺病毒的疫苗中的应用。
5.一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗，其特征在于，同时包括灭活的权利要求1所述禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN、灭活的权利要求2所述禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB和灭活的权利要求3所述禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY。
6.根据权利要求5所述的禽腺病毒4、8和11型三价疫苗，其特征在于，还包括疫苗佐剂；
所述疫苗佐剂包括矿物油、硬脂酸铝和司本80。
7.根据权利要求6所述的禽腺病毒疫苗，其特征在于，以重量份计，所述疫苗佐剂包括矿物油90~100份、硬脂酸铝1~5份和司本80 3~10份。
8.权利要求5-7任一项所述的禽腺病毒三价疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
（1）混合矿物油、硬脂酸铝和司本80；
（2）混合灭活的禽腺病毒4型疫苗株QYH2019-YN、禽腺病毒8型疫苗株QYH2020-HB、禽腺病毒11型疫苗株QYH2020-SY和吐温80；
（3）混合步骤（1）和（2）的产物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述吐温-80的用量为整个体系的3~10%。
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