CN109055320B

CN109055320B - 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用

Info

Publication number: CN109055320B
Application number: CN201810951178.2A
Authority: CN
Inventors: 赵�卓; 尚川川; 胡义彬; 贺亚奇; 商云鹏; 吴峰; 郭小燕; 张爽; 李晓亮; 王顺山; 金扩世; 王力; 江厚生
Original assignee: Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Huaxia Xingyang Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109055320A

Abstract

本发明涉及一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用。该毒株命名为cb2株，已于2016年6月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.12657。本发明将分离得到的传染性支气管炎病毒强毒株进行鸡胚适应驯化，获得了高滴度适合鸡胚生长的病毒株。利用该毒株可以建立稳定的发病模型，并且该毒株保持良好的特异性和免疫原性，可用于疫苗的生产制备。将本发明毒株灭活后制备成灭活疫苗进行免疫效力和安全性评价试验，结果表明疫苗对靶动物安全，无疫苗引起的局部和全身不良反应，而且能够有效预防肾型和呼吸型传染性支气管炎病毒引起的感染。

Description

一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用

技术领域

本发明属于预防兽医学兽医生物制品领域，具体涉及鸡传染性支气管炎病毒毒株及其疫苗组合物，尤其涉及鸡传染性支气管炎的病毒株在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，该病毒属冠状病毒科冠状病毒属。传染性支气管炎病毒感染鸡后出现：咳嗽、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。本病毒对环境抵抗力不强，对普通消毒药过敏，对低温有一定的抵抗力。

传染性支气管炎病毒具有很强的变异性，目前世界上已分离出30多个血清型。在这些毒株中多数能使气管产生特异性病变，但也有些毒株能引起肾脏病变和生殖道病变。本病自然感染的潜伏期为36小时或更长一些。本病的发病率高，雏鸡的死亡率可达25％以上，但6周龄以上的死亡率一般不高，病程一般多为1～2周，雏鸡、产蛋鸡、肾病变型的症状不尽相同。

目前中国大部分地区的免疫鸡群和非免疫鸡群中均存在传染性支气管炎病毒感染，而且多以呼吸型和肾型IBV为主。传染性支气管炎作为严重危害我国养鸡业的重大传染病之一，给我国养殖业带来了新的威胁，近年来普遍出现许多新的变异株。传染性支气管炎灭活疫苗的常规疫苗，现在世界各国广泛使用的M41血清型的灭活苗或其鸡胚适应弱毒H120株和H52株。但是由于目前IBV变异，导致的血清型增多，现有疫苗株均只能为相应的血清型提供保护，而传染性支气管炎的弱毒疫苗如果使用和操作不当，或者连续使用数年后存在一定的致病性和作为突变的主体或重组变异的供体，造成毒株的变异，使得传染性支气管炎的防治增加更大的难度。因此，研制传染性支气管炎病毒流行株灭活疫苗对鸡传染性支气管炎的防治具有重大的实际意义和广阔的市场开发前景。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株新的鸡传染性支气管炎疫苗株(病毒纤突蛋白S1遗传进化关系上QX株相近)，但研究表明该疫苗株制备的灭活疫苗不仅能够有效抵抗目前我国主要流行传染性支气管炎强毒株(QX型或类QX型)的攻击，还可以有效预防呼吸型传染性支气管炎病毒的感染，从而提供良好的免疫保护效力。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎病毒疫苗株，命名为cb2株，分类命名为传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)，微生物保藏号为CGMCC No.12657，保藏时间为2016年06月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

本发明所涉及的传染性支气管炎疫苗株cb2株其病毒纤突蛋白S1亚基的基因序列进化关系分类如附图1所示。S1基因是传染性支气管炎病毒的主要保护性基因，能够刺激机体产生中和抗体，S1基因也是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，且其高变区主要位于S1基因内，因此本发明涉及毒株的S1基因序列，本发明疫苗株所具有的纤突蛋白S1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，由SEQ ID NO:2编码。

将本发明的鸡传染性支气管炎病毒cb2株接种鸡胚收获鸡胚尿囊液灭活后，采用白油佐剂和605佐剂制备成灭活疫苗：

(1)进行安全性评价。鸡传染性支气管炎灭活疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量接种7日龄SPF鸡，观察14日，所有鸡只全部健活，精神正常、饮食正常，均无疫苗引起的局部和全身不良反应。白油佐剂和604佐剂灭活疫苗常规剂量接种7日龄商品肉鸡，接种后14日，鸡群无呼吸道症状，无气管啰音，无疫苗引起的局部和全身不良反应。

(2)进行效力评价。鸡传染性支气管炎灭活疫苗常规剂量免疫21日龄SPF鸡，免疫后21日，白油佐剂疫苗201501批，传染性支气管炎HI抗体几何平均值为6.8log2；605佐剂疫苗201502批，传染性支气管炎HI抗体几何平均值为7.1log2；利用传染性支气管炎病毒cb2株和M41株分别以滴鼻途径进行攻毒，结果显示，空白组10只鸡，9只出现精神沉郁、气管啰音、拉白色粥状稀便等临床症状，3只鸡死亡，剖检显示，出现明显的“花斑肾”症状。白油佐剂疫苗组201501批和605佐剂疫苗组201502批攻毒保护率分别达到9/10、10/10。为了进一步证明本发明的创造性，本发明与已经上市销售的经过农业部批签发的2个生产厂家的商品疫苗(批号分别为：140627和140409)进行安全性和效力对比，结果显示商品苗对cb2株的攻毒保护仅达到4/10和3/10，对M41株的攻毒保护仅达到6/10和5/10。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明将分离筛选驯化的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株cb2株可用于鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备，该病毒株疫苗对靶动物安全，能够有效抵抗传染性支气管炎强毒株的攻击，对有效预防控制呼吸型和肾型鸡传染性支气管炎病毒的感染具有重要意义。

同时本发明疫苗相比较商品疫苗在免疫效力方面有明显的优势。而且本发明与已公开的序列同源性最接近的CN201410837138.7专利数据进行比较，在免疫效力方面也具有显著的效果，对比专利CN201410837138.7研究结果显示，免疫剂量为0.5ml/只，攻毒保护可达到8/10以上保护，而且还是在采用传染性支气管炎活疫苗H120株先进行基础免疫，然后采用专利所述疫苗加强免疫后的攻毒保护率。而本发明专利疫苗免疫剂量仅为0.3ml/只，而且只进行一次免疫即可达到9/10以上保护。

附图说明

图1为cb2株病毒纤突蛋白S1亚基的基因序列进化关系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

以下实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明鸡传染性支气管炎病毒cb2株的分离鉴定

1.1病毒分离

在山东某养殖场出现疑似传染性支气管炎症状病例，病死鸡剖检显示气管有粘液、气管堵塞、“花斑肾”明显。初步确诊为传染性支气管炎病毒引起发病死亡。采集病死鸡的气管、肾脏和肺脏混合、剪碎、研磨，按W/V为1:5比例用无菌PBS稀释，冻融3次，3800rpm离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液以0.2ml/胚剂量经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚。鸡胚接种后置37℃孵化器继续孵化，孵育24h后观察鸡胚存活情况，24小时内死亡鸡胚视为非特异死亡，弃去不用，连续孵化48小时，收获尿囊液。按照相同方法连续传代4代，作为原始种毒，进行冷冻干燥处理进行保存。结果显示，第1～4代鸡胚尿囊液均无血凝性，并且对鸡胚有明显的致发育迟缓，致侏儒胚现象出现。

1.2病毒纯净性检验

将1～4代毒种按现行《中国兽药典》进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.3病毒含量

将1～4代病毒液用灭菌生理盐水将毒种作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，24小时以前死亡鸡胚弃去不计，24～144小时之间死亡的鸡胚随时取出，于4℃冰箱冷藏24小时。打开鸡胚，观察鸡胚是否出现失水、蜷缩、发育迟缓等症状，如果出现则判为感染；当不是很明显时，可进行称重，比较其重量差异，用剪刀剪除胎儿体外的附属物，并用吸水纸吸干胎儿表面的液体。如果重量比对照组最轻胚胎重量少2g以上，可判定为感染，计算鸡胚半数感染量(EID₅₀)。结果各代次病毒液每0.2ml病毒含量均不低于1×10^6.0EID₅₀。

1.4特异性

用灭菌生理盐水将毒种稀释至103.5EID50/0.1ml，与等量抗鸡传染性支气管炎特异性血清混合，在20～25℃作用1小时，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml。置37℃观察24～144小时，应不引起特异死亡及鸡胚病变，至少有8枚以上鸡胚健活。

1.5 IBV分离株S1基因的克隆与测序

按照TRIzol的说明方法从第4代鸡胚尿囊液提取病毒RNA。应用RT-PCR的方法扩增病毒S1基因。将回收后的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。分析病毒S1基因序列，并与GenBank中的参考毒株进行序列比对。结果见SEQ ID NO:2编码序列。

1.6病毒的鸡胚驯化

将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔内接种10或11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml。选接种后30～48小时之间死亡且病痕明显的鸡胚置4℃保存过夜，分别收获鸡胚尿囊液，装于灭菌容器内，按上述方法对传染性支气管炎病毒进行连续传至P13代。分别对各代毒种进行无菌检验，毒价(EID₅₀)测定。各项检测结果表明，传染性支气管炎病毒毒价保持稳定，均在10^6.0EID₅₀/0.2ml以上。

1.7病毒的靶动物回归试验

取1～7日龄SPF鸡10只，饲养在动物房的负压区隔离器中，温度保持18～26℃，湿度保持30～40％，保证水和饲料充足。用10倍稀释的毒种滴鼻，每只1～2滴，分2次攻毒，时间间隔不超过48h，观察14日。记录出现鸡传染性支气管炎典型症状或者死于传染性支气管炎的鸡只。剖检死亡鸡出现传染性支气管炎感染的典型症状，并且采集病死鸡的气管、肺脏和肾脏分离病毒，利用RT-PCR检测传染性支气管炎cb2株病毒。结果显示，利用第4代病毒接种SPF鸡，10只鸡有9只出现发病，在接种后48h出现气喘，甩头呼吸等呼吸系统症状。其中发病鸡中有3只分别在第3d和第5d死亡，剖检死亡鸡，可见气管中有大量粘液，并且出现典型的花斑肾。采集气管、肺脏和肾脏，按照病毒的分离步骤，进行分离RT-PCR鉴定，结果显示出现1610bp的S1基因目的条带。

实施例2传染性支气管炎病毒S1基因RT-PCR、测序和进化分析比对

按照TRIzol的说明方法从cb2株第4代鸡胚尿囊液提取病毒RNA。应用RT-PCR的方法扩增病毒S1基因。将回收后的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。分析病毒S1基因序列，并与GenBank中的参考毒株进行序列比对，见附图1：疫苗株cb2株其病毒纤突蛋白S1亚基的基因序列进化关系。

新分离得到的传染性支气管炎cb2株与国内大部分的分离株(比如QX株和类QX株)亲缘关系较近，那么可能对现行的流行株形成交叉保护。新分离株传染性支气管炎cb2与当前使用的疫苗株S1基因的亲缘关系较远。

实施例3本发明鸡传染性支气管炎灭活疫苗cb2株安全性和效力试验

3.1制苗用抗原的制备与检验

取生产用毒种，用灭菌生理盐水作1000倍稀释，接种11日龄非免疫鸡胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。接种后，每天照蛋2次，弃去30小时内死亡鸡胚。将30～48小时内死亡的鸡胚随时取出，培养至48小时后无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却24小时。将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液，每若干枚鸡胚的胚液混合为一组，置灭菌容器中，分别取样进行检验，-20℃以下保存备用。

收获的病毒液，应逐瓶做红细胞凝集试验，并抽样一份测定病毒含量，对1％鸡红细胞悬液凝集试验应为阴性，每0.2ml病毒含量应≥10^7.0EID₅₀。将检验合格的传染性支气管炎病毒加入10％的甲醛溶液，使甲醛溶液的最终浓度为0.2％，边加边搅拌，使其充分混合，37℃条件下灭活24小时。灭活完毕后，进行灭活检验和无菌检验。结果显示，灭活前传染性支气管炎抗原的病毒含量为10^7.2EID₅₀/0.2ml，灭活完成后灭活检验和无菌检验均合格。

3.2疫苗的制备

3.2.1白油佐剂疫苗制备

与商品疫苗制备方法相同。取注射用白油94份，加入司班-806份，充分混合后高压灭菌备用。将灭活的IBV病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。将3份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓慢加入1份水相，加完后中速混合，然后高速乳化。乳化后取10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。疫苗无菌分装，注明批号、制备日期，2～8℃保存。

3.2.2 605佐剂疫苗制备

将灭活的传染性支气管炎病毒液与佐剂按照体积比1:1的比例混合，以100～500r/min的速度搅拌，时间不少于30分钟。疫苗无菌分装，表明批号、制备日期，2～8℃保存。

3.2.3检验

按照现行《中国兽药典》三部相关要求进行各项检验。结果显示，稳定性检测、黏度检测、无菌检验、甲醛残留测定等检验结果均合格。

3.3商品苗对照

商品苗1和商品苗2均采用已被公开的市售的商品疫苗，鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎三联灭活疫苗，其中佐剂均为白油佐剂，传支抗原均为M41株抗原。

3.4疫苗的安全性评价试验

3.4.1单剂量和单剂量重复接种试验

每批疫苗颈部皮下接种途径接种7日龄SPF鸡，每只0.3ml，各组10只。接种后观察14天，14天后再以相同方式和剂量接种一次，继续观察14天，记录鸡群的临床症状以及其它不良反应。试验同时设同类商品疫苗作为对照。具体结果见表1。

表1疫苗单剂量和单剂量重复接种安全性试验

3.4.2超剂量接种试验

每批疫苗采用颈部皮下接种途径接种7日龄SPF鸡，每只0.6ml，各组10只。接种后观察14天，记录鸡群的临床症状以及其它不良反应。并在接种后21日观察注射部位的损伤和疫苗吸收情况。结果见表2。

表2疫苗超剂量接种安全性试验

3.4.3商品肉鸡安全性检验

每批疫苗颈部皮下接种7日龄商品肉仔鸡30只，每只0.3ml，饲养观察14天，记录鸡群的临床症状以及其它不良反应。结果见表3。

表3本专利疫苗接种商品肉鸡安全性试验

3.5本发明疫苗效力评价试验

用21日龄SPF鸡100只，每只颈部皮下注射疫苗0.3ml，每批疫苗接种20只。另取20只作为空白对照。接种后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定(待检血清经高岭土悬液吸附处理)。采血后，各试验组鸡分别滴鼻接种10^6.0EID₅₀/0.2ml的IBVcb2株和M41株毒液100μl，攻毒后观察14d，详细记录试验动物的精神状态、饮食状况、临床表现和发病死亡情况。如出现死亡的鸡只，随时剖检，记录剖检病变。

结果显示，鸡传染性支气管炎灭活疫苗常规剂量免疫21日龄SPF鸡，免疫后21日，白油佐剂疫苗201501批传染性支气管炎HI抗体几何平均值为6.8log2；605佐剂疫苗201502批传染性支气管炎HI抗体几何平均值为7.1log2；商品苗1传染性支气管炎HI抗体几何平均值为5.5log2；商品苗2传染性支气管炎HI抗体几何平均值为5.2log2。

利用传染性支气管炎病毒cb2株和M41株分别以滴鼻途径进行攻毒，结果显示，cb2株空白组(未做免疫)10只鸡，9只出现精神沉郁、气管啰音、拉白色粥状稀便等临床症状，3只鸡死亡，剖检显示，出现明显的“花斑肾”症状。M41株空白组(未做免疫)10只鸡，9只出现精神沉郁、呼吸促迫、咳嗽、气管啰音等明显的呼吸症状。白油佐剂疫苗组201501批和605佐剂组201502批对cb2株和M41株的攻毒保护率均达到9/10以上保护。而商品苗对cb2株的攻毒保护仅达到4/10和3/10，对M41株的攻毒保护仅达到6/10和5/10。结果见表4。

表4疫苗商品效力评价试验

上述研究结果表明，本发明鸡传染性支气管炎病毒cb2株用于灭活疫苗的制备，不仅安全可靠，而且可有效预防鸡群因呼吸型和肾型传支病毒引起的感染，与已公开的商品苗相比较可同时预防鸡群呼吸型传染性支气管炎和肾型传染性支气管炎的发生，而且在安全性和效力方面比商品苗和已公开的专利疫苗具有更显著优势。

序列表

<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司

<120> 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 545

<212> PRT

<213> 鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

Ser Ala Phe Arg Pro Pro Asn Gly Trp His Leu Gln Gly Gly Ala Tyr

35 40 45

Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Tyr Thr Asn Asn Ala Gly Ser Ala Ser

50 55 60

Gly Cys Thr Val Gly Val Ile Lys Asp Val Tyr Asn Gln Ser Ala Ala

65 70 75 80

Ser Ile Ala Met Thr Ala Pro Pro Gln Gly Met Ala Trp Ser Lys Ser

85 90 95

Gln Phe Cys Ser Ala His Cys Asn Phe Ser Glu Ile Thr Val Phe Val

100 105 110

Thr His Cys Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Ser Cys Pro Ile Thr Gly Met

115 120 125

Ile Ala Arg Asp His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Asn Gly Thr Leu

130 135 140

Phe Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Asn Phe Lys Ser

145 150 155 160

Phe Gln Cys Val Asn Asn Phe Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu

165 170 175

Val Phe Ile Ser Asn Lys Thr Thr Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr

180 185 190

Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Ser Val Met Lys Glu Phe Lys

195 200 205

Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys

210 215 220

Asp Lys Ser Pro Lys Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn

225 230 235 240

Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Thr Thr Leu Val Arg Glu

245 250 255

Lys Phe Thr Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Asn Thr Leu Ala Leu

260 265 270

Thr Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Gln Pro Asn Ser Gly

275 280 285

Gly Val Asn Thr Phe His Leu Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly

290 295 300

Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Gln Phe Val Tyr Lys Ala

305 310 315 320

Ser Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Arg Cys Ser Phe Arg Pro

325 330 335

Glu Thr Ile Asn Ser Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu

340 345 350

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355 360 365

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Leu Ile Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Thr

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420 425 430

Lys Cys Val Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile

435 440 445

Thr Asn Val Thr Asp Ser Ala Ala Asn Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Gly

450 455 460

Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Val Phe Val Val

465 470 475 480

Gln Gly Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp

485 490 495

Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Ile Val Gly Ile Leu

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Val Lys Leu Thr Asn Ser Ser His Arg Arg Arg Arg Leu Cys Gln Lys

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Thr

545

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<212> DNA

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<400> 2

atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg acctatgtag tgcaaatttg 60

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agtggtttat ggtttaattc tttgtcagtt tctcttactt atggacccct acagggaggg 1080

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gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgtaggcgt 1620

ctatgccaaa agacctc 1637

Claims

1.一株鸡传染性支气管炎病毒分离株，其特征在于微生物保藏号为CGMCC No. 12657。

2.如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒分离株，其特征还在于病毒的纤突蛋白S1亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，根据序列测定和遗传基因进化分析比对，所述病毒分离株与QX型毒株遗传关系较近。

3.如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒分离株，其特征还在于可同时引起鸡群的呼吸系统疾病和泌尿生殖系统疾病。

4.一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包括权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒分离株的灭活抗原和疫苗佐剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于抗原为每0.2ml不低于10^6.5EID₅₀含量的抗原；所述佐剂包括注射用白油佐剂和605佐剂。

6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，按照0.3ml/羽份的常规剂量免疫接种21~28日龄SPF鸡10只，免疫后21日采血检测血清中HI抗体效价，并进行攻毒保护试验，其抗体几何平均值不低于6.5log2，效检攻毒可获得9/10以上保护。