CN111494614A

CN111494614A - 一种三联灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111494614A
Application number: CN202010269614.5A
Authority: CN
Inventors: 杨振; 钱钟; 王建国; 李琛; 马玉峰; 董昌海; 杨玉倩; 江媛; 徐萍; 李甜甜; 范娟; 潘杰
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明提供一种变异株法氏囊病毒FJ19株，用该毒株的VP2蛋白制备三联灭活疫苗的方法及相应疫苗。疫苗包括来源于变异株FJ19株(保藏编号为CGMCC NO：19381)的VP2蛋白、鸡新城疫La Sota病毒株和H9亚型禽流感TL18株(保藏编号号为：CGMCC NO：19382)。本发明三联疫苗可一针防治三病，免疫原性好，持续期长，安全性能好；特别地，疫苗中VP2蛋白含量高，甲醛和内毒素含量低，对当前流行的FJ19变异株法氏囊病毒具有较好的保护效果，免疫剂量小，免疫效果好，能够有效提高鸡群保护率。

Description

一种三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物兽药技术领域，具体涉及一种新型鸡新城疫、传染性法氏囊、禽流感三联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害全球养禽业最为严重的烈性传染病之一。OIE将其列为A类疫病，是我国《国家中长期动物疫病防治规划》中规定优先防治和重点防范的5种一类动物疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病。Lasota为常见的新城疫毒株。

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染禽类引起的一类传染病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。禽流感H9亚型数与低致病性禽流感，在养殖场的发病率比较高，发病症状不太明显，但对鸡肠道和输卵管等影响非常大。

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种危害青年鸡的烈性、高度接触性、病毒性传染病，主要侵害鸡法氏囊。传染性法氏囊(IBD)是最为重要的免疫抑制性疾病之一，导致感染鸡较高的发病率和病死率。在过去的几十年中，我国临床流行的法氏囊以超强毒(vvIBDV)和中等毒力的法氏囊病毒为主，传染性法氏囊病毒(IBDV)变异株却从未引起大家的重视。目前使用的IBD 疫苗包括中等毒力的弱毒苗、全病毒灭活疫苗以及基因工程疫苗，但在有的地区免疫过IBD疫苗的鸡群中仍然有IBD的发生，提示IBDV 的感染和传播对我国IBD的防控仍然构成威胁。最近，我国多个地区养殖场发生疑似IBD的亚临床感染症状，从发病鸡分离到IBDV，经研究确定分离株为IBDV的变异株。该病多发生在白羽肉鸡、817肉鸡；一年四季均可发生，以4-7月份多发；3-7周龄易感，最小可见 16天鸡发病，感染途径包括消化道、呼吸道、眼结膜等，也可接触传播，其他可通过如饮水器具、食槽、尘土、人员、昆虫、运输车辆间接传播，带毒和发病鸡为主要传染源。

目前还没有针对新型IBDV变异株和AI变异株的疫苗，而传统的疫苗不能对流行的变异株病毒提供保护。因此，研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的变异株IA和IBDV亚单位灭活疫苗对目前临床防控IBD具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的是针对上述现有技术的不足，提供一种三联灭活疫苗及其制备方法，抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感TL18株和灭活的变异株法氏囊病毒FJ19株VP2蛋白。TL18 株，分类命名为A型禽流感病毒H9亚型，菌种保藏编号为CGMCCNO： 19382于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。变异株法氏囊病毒FJ19株从发病白羽肉鸡群的法氏囊组织样品中分离得到，为国内新分离的病毒，所述毒株引起鸡的症状不同于目前的超强毒和经典株传染性法氏囊病毒，FJ19株，分类命名为禽双股RNA 病毒，菌种保藏编号为CGMCC No.19381，于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选地，变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更优选地，所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥ 10^8.5EID₅₀/0.1mL；所述H9亚型禽流感TL18株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；所述变异株法氏囊病毒VP2蛋白含量的琼扩效价≥1:128。

本发明还提供了灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感TL18株和灭活的变异株法氏囊病毒FJ19株VP2蛋白三联灭活疫苗的制备方法，包括了VP2蛋白的制备、油相制备、水相制备和乳化步骤，具体为：

S1、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备：

S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备

扩增获得IBDV FJ19株的VP2蛋白，与pMD相连，获得pMD-IBDV-VP2；

S102、pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒的制备：

将pFastBac I质粒和S101中得到的pMD-IBDV-VP2重组质粒分别进行双酶切后连接获得pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒；

S103、重组杆粒rBac-IBDV-VP2的构建：

将S102中得到的pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒转入大肠杆菌 DH10Bac中获得重组杆粒rBac-IBDV-VP2；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

将S103中得到的重组杆粒rBac-IBDV-VP2转染昆虫细胞sf9，培养获得重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代；

S105、重组杆状病毒的扩增：

将S104中得到的重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞 sf9，培养得到F1代重组杆状病毒；

S106、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的获得：

将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，培养，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到变异株法氏囊病毒VP2蛋白。

S2、油相制备：

取注射用白油、硬脂酸铝混合加热后，加入司本80，继续加热，自然冷却至室温后，得到油相；

S3、水相制备：

将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；

S4、乳化：

将S2中得到的油相放入乳化罐内，边搅拌边加入S3中得到的水相，得到乳化液，剪切，得到三联灭活疫苗。

更优选地，变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备步骤为：

S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备：

设计适于杆状病毒表达系统表达VP2蛋白核酸序列的引物对，分别命名为VP2-P1和VP2-P2，所述VP2-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；所述VP2-P2的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；以提取的变异株IBDV FJ19株总RNA的反转录产物cDNA为模板，以VP2-P1和VP2-P2为引物，进行PCR扩增，得到VP2目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收VP2目的片段，并用T4 DNA连接酶连接到pMD载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒 a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-IBDV-VP2重组质粒；所述VP2目的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

S102、pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒的制备：

用Sal II限制性内切酶和Not I限制性内切酶将pFastBac I质粒和S101中得到的pMD-IBDV-VP2重组质粒分别进行双酶切，得到 pFastBac I酶切片段和pMD-IBDV-VP2酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBac I酶切片段和pMD-IBDV-VP2酶切片段，然后用T4 DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养 12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

S103、重组杆粒rBac-IBDV-VP2的构建：

将S102中得到的pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒转入大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养 12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒rBac-IBDV-VP2；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒rBac-IBDV-VP2 转染昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株 F0代；

S105、重组杆状病毒的扩增：

将S104中得到的重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到F1代重组杆状病毒；

S106、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的获得：

将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到变异株法氏囊病毒VP2蛋白；

更优选地，油相制备步骤为：

取注射用白油、硬脂酸铝，置于油相制备罐中加热到80℃时，再加入司本80，至温度达到116℃时维持30min，自然冷却至室温后，得到油相；注射用白油、硬脂酸铝和司本80的质量比为94:1:6；

更优选地，水相制备步骤为：

将鸡新城疫La Sota病毒株培养得到鸡新城疫病毒液，将H9亚型禽流感TL18株培养得到禽流感病毒液，将得到的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别经过滤、浓缩、用甲醛灭活，分别得到灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液，将S106中得到的变异株法氏囊病毒VP2蛋白用二乙烯亚胺灭活，得到灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白；将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白等质量混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；所述水相中混合抗原液和吐温80的质量比为96:4；

更优选地，乳化步骤为：

将S2中得到的油相放入乳化罐内，以150r/min的搅拌速率，边搅拌边加入S3中得到的水相，待水相加入完后，继续搅拌30min，得到乳化液，然后在温度为20℃～25℃的条件下，将所述乳化液在剪切速率为4000r/min的条件下剪切2次后，得到三联灭活疫苗。

更优选地，S104、S105和S106中离心的转速均为4000rpm～ 10000rpm，离心的时间均为30min～60min。

更优选地，S105中所述重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；S106中所述F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0。

更优选地，S3中所述鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液的浓缩的倍数均为3～4倍。

更优选地，S4中所述三联灭活疫苗的保存条件为温度为2℃～8℃的条件下密封保存。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明首次提供了针对传染性法氏囊病毒变异株FJ19的疫苗。采用灭活的变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白作为抗原，再与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合后得到混合抗原液经乳化后得到三联灭活疫苗，得到的疫苗中VP2蛋白含量高，免疫原性强，甲醛含量和内毒素含量低，对当前流行的传染性法氏囊病毒变异株FJ19具有较好的保护效果，且对鸡群无注射应激。本发明将传统疫苗生产工艺和基因工程相结合，为疫苗工艺的提升和质量的保证打下基础。

2、本发明制备的三联灭活疫苗安全性能好，免疫实验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，效力试验和免疫持续期试验的分析，免疫效果确实，持续期长，能够有效提高鸡群保护率。同时，本发明制备的疫苗能提供效价和整齐度高的传染性法氏囊抗体水平，具有高效、安全性好、生产便捷的优点。可以作为预防鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病毒变异株的优秀选择。

附图说明

图1 FJ19株与参考毒株序列的遗传进化树

图2 FJ19株VP2完整开放阅读框序列的PCR扩增，其中，M： DL2000 DNA Marker；1：PCR产物。

图3 转移载体构建PCR鉴定，其中，M：DL5000 DNA Marker； 1～8:8个不同菌落PCR。

图4 重组杆粒PCR鉴定，其中，M：DL5000 DNA Marker；1～ 4:4个不同菌落PCR。

图5 SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物，其中，M：预染蛋白质Marker；1：重组杆状病毒；2-6:感染空杆状病毒的Sf9细胞。

图6 Western Blot鉴定重组杆状病毒表达产物，其中，M：预染蛋白质Marker；1：重组杆状病毒；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞。

图7 变异株IBDV攻毒症状

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1三联灭活疫苗的抗原组成

三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的 H9亚型禽流感TL18株和灭活的变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白；所述变异株法氏囊病毒VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述变异株法氏囊病毒VP2蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.2所示；所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；所述H9亚型禽流感TL18株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；所述变异株法氏囊病毒VP2 蛋白含量的琼扩效价≥1:128；

所述鸡新城疫La Sota病毒株来源于中国兽医药品监察所；

所述H9亚型禽流感TL18株，属于流感病毒，所述TL18株于2020 年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC NO：19382；所述H9亚型禽流感TL18株的血凝价为211，毒价为10^7.0EID₅₀/0.1mL，适于疫苗的生产，在同源性上，与近些年临床分离株交叉血凝高，且氨基酸同源性与近些年临床分离的流行株的同源性为97.3％～98.0％；与目前使用的疫苗株的同源性为90.7～91.5％，表明H9亚型禽流感TL18株与流行株匹配，对临床的H9亚型禽流感具有良好保护作用。

所述传染性法氏囊病毒变异株FJ19株，是从发病白羽肉鸡群的法氏囊组织样品中分离得到的，该病毒为国内新分离的病毒，不同于目前的超强毒和经典株传染性法氏囊病毒，所述毒株对鸡红细胞没有凝集特性，于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.19381。在同源性上，与国外的变异株(Var E)核苷酸同源性为96.1％，氨基酸同源性为 97.8％；与目前的超强毒核苷酸同源性为93.4％-94.2％，氨基酸同源性为95.8％；与中等强毒核苷酸同源性为94.0％-94.4％，氨基酸同源性为95.4％-96.2％。图1显示了FJ19株与参考毒株序列的遗传进化树。

实施例2法氏囊病毒变异株FJ19株总cDNA的制备

采集病鸡法氏囊组织研磨后加入含双抗的PBS稀释成悬浊液，在悬浊液中加入等体积的氯仿，放置在低温环境中20rpm处理24小时， 3000转离心后取上清分装在安剖瓶备用。将处理好样本绒尿膜途径 (CAM)接种10日龄鸡胚，置37℃孵育。弃去24h内死亡的鸡胚，将24h以后死亡的鸡胚置4℃，收集尿囊液进行血凝试验，同时收取胚体和绒尿膜，无菌研磨后分装在安剖瓶备用。使用AXYGEN试剂盒提取培养物总RNA，用M-MLV反转录酶将RNA反转录为cDNA。

实施例3变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备：

S201、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备：

设计适于杆状病毒表达系统表达VP2蛋白核酸序列的引物对，分别命名为VP2-P1和VP2-P2，所述VP2-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；所述VP2-P2的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；以提取的变异株IBDV FJ19株总RNA的反转录产物cDNA为模板，以VP2-P1和VP2-P2为引物，进行PCR扩增，得到VP2目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收VP2目的片段，结果如图2所示，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：PCR产物，从图中可以看出回收片段大小为1356bp，并用T4 DNA连接酶连接到pMD载体上，然后在无菌条件下转化DH5 α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-IBDV-VP2重组质粒；所述 VP2目的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸如SEQ ID NO.1 所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCR扩增的反应体系为：变异株法氏囊病毒cDNA 1.0μL、VP2-P1和VP2-P2各2.0μL、5U/ μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、dNTPs 5μL、缓冲液5μL、无菌重蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min； 94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。所述菌落PCR鉴定的反应体系为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2 ×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。

S202、pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒的制备：

用Sal II限制性内切酶和Not I限制性内切酶将pFastBac I质粒和 S101中得到的pMD-IBDV-VP2重组质粒分别进行双酶切，得到pFastBac I酶切片段和pMD-IBDV-VP2酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBac I酶切片段和pMD-IBDV-VP2酶切片段，然后用T4 DNA 连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化 DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用 M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证 (PCR鉴定结果如图3所示，其中M表示DL5000 DNA Marker；泳道1～8 表示8个不同菌落PCR鉴定结果，从图中可以看出，泳道2，3，6，7 为阳性菌落)，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBac I-IBDV-VP2 中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述 M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述菌落PCR鉴定的反应体系为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

S203、重组杆粒rBac-IBDV-VP2的构建：

将S102中得到的pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒转入大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养 12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定(PCR鉴定结果如图4所示，其中M表示DL5000 DNA Marker；泳道1～4表示4个不同菌落PCR鉴定结果，从图中可以看出，泳道 1和2为阳性菌落)，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒rBac-IBDV-VP2；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述菌落PCR鉴定的反应体系为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L 的M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA 聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

S204、重组杆粒转染sf9细胞：

S205、重组杆状病毒的扩增：

将S204中得到的重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到F1代重组杆状病毒；所述重组杆状病毒 rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；

S206、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的获得：

将S205中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到变异株法氏囊病毒VP2蛋白；所述F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；

(1)对S206中得到的变异株法氏囊病毒VP2蛋白进行表达蛋白的鉴定：

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定：将S206 中得到的变异株法氏囊病毒VP2蛋白进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在48kDa的位置，其分子量与理论大小相符，说明变异株法氏囊病毒VP2蛋白表达成功(SDS-PAGE鉴定结果如图5，其中M：预染蛋白质Marker；1：重组杆状病毒；2-6:感染空杆状病毒的Sf9细胞，从图中可以看出泳道1的样本中VP2成功表达)；

Western Blot(蛋白质印迹法)鉴定：取所述SDS-PAGE电泳后的凝胶，直接用型号为BIO-LAB转印装置将其转印到NC膜(硝酸纤维素膜)上，转印结束后，按常规方法进行Western blot鉴定，用鸡源抗变异株传染性法氏囊病毒多抗阳性血清参考品IgG(1:200)作为一抗(扬州优邦生物药品有限公司制备)；用辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗IgG(购自北京百奥莱博科技有限公司)(1:2000) 作为酶标二抗；最后用TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色(购于碧云天生物技术研究所)，一抗与变异株法氏囊病毒VP2蛋白结合后加入酶标过的二抗，二抗与一抗识别并结合，结果表明，变异株法氏囊病毒VP2蛋白在48kDa左右处出现1条明显的特异性条带，而空白的细胞培养物阴性对照则在48kDa左右处无此特异性反应，说明变异株法氏囊病毒VP2蛋白可被变异株传染性法氏囊病毒多抗阳性血清中的抗体识别，具有良好的特异性和反应原性(Western Blot鉴定结果如图6所示，其中M：预染蛋白质Marker；1：重组杆状病毒；2：感染空杆状病毒的Sf9细胞，从图中可以看出泳道1的样本中VP2成功表达)。

(2)对S206中得到的变异株法氏囊病毒VP2蛋白的含量鉴定：

使用琼扩法对表达的变异株法氏囊病毒VP2蛋白进行含量的检测，阳性血清为变异株传染性法氏囊病毒多抗血清(扬州优邦生物药品有限公司制备)，阴性对照为生理盐水。变异株传染性法氏囊病毒多抗血清中含有针对变异株法氏囊病毒的抗体，在琼扩检测板上，变异株法氏囊病毒多抗血清孔与变异株法氏囊病毒VP2蛋白孔之间进行抗原抗体反应而出现沉淀线，判为阳性，以出现清晰沉淀线的样品最高稀释倍数为被测抗原琼扩琼扩效价。阳性血清孔与生理盐水孔之间不发生抗原抗体反应，不会出现沉淀线，为阴性。对变异株法氏囊病毒VP2蛋白预先进行2倍系列的梯度稀释，阳性血清与不同浓度的蛋白进行抗原抗体反应，当VP2蛋白稀释到128倍以后仍能被阳性血清反应，继续稀释后不能被阳性血清识别，表明变异株法氏囊病毒 VP2蛋白的琼扩效价为1:128。

实施例4制备油相：

实施例5制备水相：

将鸡新城疫La Sota病毒株培养得到鸡新城疫病毒液，将H9亚型禽流感TL18株培养得到禽流感病毒液，将得到的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别过滤去除颗粒杂质，得到透明或半透明的溶液，然后用超滤浓缩系统进行浓缩，浓缩3～4倍，用甲醛灭活，分别得到灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液，将S206 中得到的变异株法氏囊病毒VP2蛋白用二乙烯亚胺灭活，得到灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白；将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白等质量混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；所述水相中混合抗原液和吐温80的质量比为96:4；

S4中所述鸡新城疫病毒液的培养方法为：取生产用的鸡新城疫病La Sota株毒种，用灭菌生理盐水稀释10⁴或10⁵倍，接种10～11 日龄健康易感鸡胚，每胚经尿囊腔内接种0.1～0.2mL，密封针孔，置 36℃～37℃继续孵育，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每日照蛋2～3次至96小时，将死亡的鸡胚随时取出，96小时后取出全部未死亡鸡胚，气室向上直立，置2℃～8℃冷却4～24小时；将冷却的鸡胚取出，活胚与死胚分开，无菌收获鸡胚液；每若干枚鸡胚混为一组，吸取尿囊液放于同一灭菌容器内，每组抽样进行无菌及1％红细胞凝集检验，血凝价低于1∶512(微量法)者弃去，收获得到鸡新城疫病毒液，置-20℃以下保存，应不超过6个月；

S4中所述禽流感病毒液的培养方法为：取生产用H9亚型禽流感 TL18株毒种，用灭菌生理盐水稀释10⁴或10⁵倍，接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚经尿囊腔内接种0.1～0.2mL，密封针孔，置36℃～ 37℃继续孵育，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每日照蛋2～3 次至96小时，将死亡的鸡胚随时取出，96小时后取出全部未死亡鸡胚，气室向上直立，置2℃～8℃冷却4～24小时；将冷却的鸡胚取出，活胚与死胚分开，无菌收获鸡胚液；每若干枚鸡胚混为一组，吸取尿囊液放于同一灭菌容器内，每组抽样进行无菌及1％红细胞凝集检验，血凝价低于1：256(微量法)者弃去，收获得到禽流感病毒液，置 -20℃以下保存，应不超过6个月；

对S4中未经过过滤、浓缩和灭活的鸡新城疫病毒液中的鸡新城疫病La Sota株的含量测定，得到鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥ 10^7.0EID₅₀/0.1mL；对S4中所述禽流感病毒液中的H9亚型禽流感TL18 株的含量测定，得到H9亚型禽流感TL18株的含量≥10^8.0EID₅₀/0.1mL；

S4中经过过滤、浓缩后的鸡新城疫病毒液和经过过滤、浓缩后的禽流感病毒液的灭菌方法为：将经过过滤、浓缩后的鸡新城疫病毒液和经过过滤、浓缩后的禽流感病毒液，分别放入灭活罐中，然后分别边搅拌边加入10％甲醛溶液至甲醛溶液的终浓度为0.1％，加完后，再搅拌混合5min，然后升温至37℃灭活24小时(以罐内鸡新城疫病毒液或禽流感病毒液的温度达到37℃开始计时)，灭活结束后分别取样进行灭活检验和无菌检验，得到的灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液在2℃～8℃保存，应不超过1个月；

所述灭活的鸡新城疫病毒浓缩液或灭活的禽流感病毒浓缩液检验灭活完全的方法为：取灭活的鸡新城疫病毒浓缩液或灭活的禽流感病毒浓缩液经尿囊腔内接种10日龄SPF(无特定病原)鸡胚10枚，每胚0.2mL，37℃孵育至120小时，剔除24小时内死亡鸡胚，非特异性死亡鸡胚均应不超过1个，逐胚测定血凝价，均应不出现血凝。将鸡胚液等量混合后按上述方法盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完全；

S4中的变异株法氏囊病毒VP2蛋白的灭活方法为：

(1)2－溴乙胺氢溴酸盐的环化：将浓度2mol/L的2－溴乙胺氢溴酸盐和浓度为2mol/L的NaOH溶液等体积混合，然后放置在温度为37℃的水浴中，每隔10分钟振摇1次，1小时后终止环化，得到浓度为1mol/L的二乙烯亚胺溶液；

(2)灭活和阻断：将变异株法氏囊病毒VP2蛋白导入灭活罐中，边搅拌边加入浓度为1mol/L的二乙烯亚胺溶液，至二乙烯亚胺溶液的终浓度为0.005mol/L，加完后，再搅拌混合10min，然后升温至 32℃时灭活20小时(以变异株法氏囊病毒VP2蛋白的温度达到32℃开始计时)，立即在变异株法氏囊病毒VP2蛋白中加入过滤除菌的 2mol/L的Na₂S₂O₃溶液至Na₂S₂O₃溶液的终浓度为0.005mol/L进行灭活阻断，搅拌混合均匀，停止灭活后，灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白在2℃～8℃保存，应不超过3个月；

所述灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白检验灭活完全的方法为：取灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白，按培养基总质量的5％接种于已形成良好单层的Sf9细胞，置27℃培养观察3日后再盲传1代，继续培养3日后吸取培养基中的培养液，接种于Sf9细胞的灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白作为样品接种在6孔板中的4个孔中，同时设阴性对照、阳性对照各1孔，1mL/孔，所述阴性对照为正常的Sf9 细胞，所述阳性对照为表达变异株法氏囊病毒VP2蛋白的杆状病毒，进行空斑实验，培养7～10天，阴性对照孔出现蚀斑，样品孔及阳性对照孔均无蚀斑出现，判为灭活完全；

对S4中灭活的鸡新城疫病毒浓缩液的鸡新城疫病La Sota株的含量测定，得到鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；对S4中所述灭活的禽流感病毒浓缩液中的H9亚型禽流感TL18株的含量测定，得到H9亚型禽流感TL18株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；对S4中所述灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白进行蛋白含量的测定，琼扩效价≥1:128；

实施例6乳化：

将S3中得到的油相放入乳化罐内，以150r/min的搅拌速率，边搅拌边加入S4中得到的水相，待水相加入完后，继续搅拌30min，得到乳化液，然后在温度为20℃～25℃的条件下，将所述乳化液在剪切速率为4000r/min的条件下剪切2次后，得到三联灭活疫苗；所述三联灭活疫苗的保存条件为温度为2℃～8℃的条件下密封保存。

实施例7三联灭活疫苗的安全试验

按照实施例1的三联灭活疫苗的制备方法制备得到二批次的三联灭活疫苗，批号分别为NAIBs01和NAIBs02，分别进行安全试验：

使用制备的三联灭活疫苗NAIBs01和NAIBs02进行疫苗注射安全试验。取14日龄SPF鸡30只，分别注射上述二批次疫苗0.3mL/只，各10只，10只阴性对照每只鸡颈部注射生理盐水0.3mL；取7日龄商品白羽肉鸡30只，分别注射上述二批次疫苗0.3mL/只，各10只， 10只阴性对照每只鸡颈部注射生理盐水0.3mL；连续观察21日。每天观察各组鸡的饮食饮水、全身、局部反应及其它临床症状，并于接种后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鸡注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应，免疫后21天，剖杀所有鸡，重点检查注射部位的变化，包括注射部位组织病变。结果，二批次疫苗对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免后21日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径对靶动物是安全的，见表1。

表1 二批次疫苗接种安全性实验

实施例8三联灭活疫苗的免疫效力试验

用实施例2中的批号分别为NAIBs01和NAIBs02二批次的三联灭活疫苗，分别进行免疫效力试验：

(一)鸡新城疫病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行鸡新城疫病毒效力实验；

(1)血清学方法：取21日龄SPF鸡，所述三联灭活疫苗的皮下接种的免疫剂量为0.2mL/只，10只/组，共二组，所述二组均为免疫组，第一组的21日龄SPF鸡皮下接种批号为NAIBs01的三联灭活疫苗，第二组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAIBs02的三联灭活疫苗，同时设5只未注射三联灭活疫苗的21日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的21日龄SPF鸡皮下接种等剂量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)；隔离器内饲养。免疫后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI (血凝抑制)抗体效价测定，结果如表2所示，免疫后21日血清HI 抗体平均几何效价均高于1:16，符合疫苗规程要求。

(2)免疫攻毒法：将经过上述血清学方法免疫后21天的二组免疫组和阴性对照组的鸡采血后，将二组免疫组与阴性对照组同时用鸡新城疫强毒株北京株F3代湿毒攻毒，肌肉注射0.2mL/只(0.2mL鸡新城疫强毒株北京株F3代的攻毒剂量为10^5.0EID₅₀)，观察14日，结果如表2所示，结果表明二批次的疫苗免疫后21日血清HI抗体平均几何效价均高于4log2；如表3所示，二组免疫组攻毒后14天鸡均健活，对攻毒鸡新城疫病毒的攻毒保护率均达到100％，阴性对照组攻毒后5日内5只全部死亡，死亡率为100％。

鸡新城疫病毒效力实验表明，疫苗组攻毒后14天鸡均健活，而对照组5只全部死亡。说明疫苗对鸡群的保护率均达到100％，在临床使用疫苗可以对鸡群新城疫提供完全保护。

表2 二批次的疫苗的鸡新城疫病毒抗体检测

表3 二批次的疫苗的鸡新城病毒疫免疫攻毒保护结果

(二)H9亚型禽流感病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行H9亚型禽流感病毒效力实验；

(1)血清学方法：取21日龄SPF鸡25只，所述三联灭活疫苗的皮下接种的免疫剂量为0.3mL/只，10只/组，共二组，第一组的 21日龄SPF鸡皮下接种批号为NAIBs01的三联灭活疫苗，第二组的 21日SPF鸡皮下接种批号为NAIBs02的三联灭活疫苗，同时设5只未注射三联灭活疫苗的21日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的21日龄SPF鸡皮下接种等剂量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)；隔离器内饲养。免疫后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定，结果如表4所示，免疫后21日血清中禽流感(H9亚型)HI抗体几何平均值均高于6log2，对照组HI抗体效价几何平均值均不高于2log2，实验结果符合规程规定要求。

(2)免疫攻毒法：将经过上述血清学方法免疫后21天的二组免疫组和阴性对照组的鸡采血后，将二组免疫组与阴性对照组同时用 H9亚型禽流感TL18株F3代湿毒进行静脉注射攻毒，0.2mL/只，攻毒后5日，分别采集每只鸡泄殖腔棉拭子样品，将每只鸡采集的泄殖腔棉拭子样品经尿囊腔分别接种5枚10日龄SPF胚，每个SPF胚接种的泄殖腔棉拭子的剂量为0.2mL，孵育观察5日，测定所有鸡胚液 HA(血凝)效价，每个棉拭子样品接种的5枚10日龄SPF胚中只要有1个SPF胚的尿囊液HA效价≥1:16，即可判定为H9亚型鸡禽流感病毒分离阳性，对H9亚型鸡禽流感病毒分离阴性的样品，盲传1代后再进行判定，表5所示，结果表明2组免疫组对H9亚型禽流感病毒免疫保护率为100％，阴性对照组的攻毒感染的排毒率为100％，达到疫苗效力标准。

表4 二批次疫苗的H9亚型禽流感病毒抗体检测

表5 ER批次的疫苗的H9亚型禽流感病毒攻毒结果

(三)变异株传染性法氏囊病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行变异株传染性法氏囊病毒效力实验；

(1)血清学方法取21日龄SPF鸡30只，其中二组分别颈部皮下免疫上述二批次灭活疫苗，0.2mL/只，10只/组；对照10只皮下接种等量PBS作为对照组，隔离器内饲养。免疫后21天后，每只鸡分别采血，分离血清，进行IBDV的ELISA(爱德士)和琼扩抗体效价测定。免疫组鸡10只的血清琼扩效价均不低于3log2，ELISA抗体效价不低于1000(根据试剂盒参考公式计算)，对照鸡血清琼扩效价均应为阴性，见表6。

注：试剂盒参考值ELISA抗体值≥396为阳性

(1)免疫攻毒法上述方法免疫后21天采血后，免疫组与对照组同时用分离的IBDV变异株攻毒，滴眼总计0.2mL/只(含100BID)，观察96小时，96小时后剖杀全部鸡，观察法氏囊症状。如表7所示，疫苗组攻毒后96小时鸡均健活，法氏囊与非免疫非攻毒组一致，无发病症状(法氏囊明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种病变)，保护率均达到100％，对照组攻毒后5日内10/10发病，发病率为100％。

表7 21日SPF鸡被动免疫攻毒(变异株传染性法氏囊FJ19株)

注：法氏囊病变标准为明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种症状。

另选1日龄白羽肉鸡40只，随机均分为4组，其中2组分别颈部皮下免疫上述2批次灭活疫苗，0.15mL/只；10只皮下接种等量PBS 作为对照组，10只做正常对照，不做任何免疫，隔离器内饲养。免疫后28天后，免疫组与对照组同时用分离的IBDV变异株攻毒，滴眼0.2mL/只(含100BID)，观察96小时，96小时后剖杀全部鸡，观察法氏囊症状。如表8所示，疫苗组攻毒后96小时鸡均健活，法氏囊与非免疫非攻毒组一致，无发病症状(法氏囊明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种病变)保护率均达到90％以上，对照组攻毒后5日内10/10发病，发病率为100％。

表8 28日龄雏鸡被动免疫攻毒(变异株传染性法氏囊FJ19株)

上述实验结果表明，三联灭活疫苗效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及变异株传染性法氏囊病毒对临床鸡群的感染。

最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 一种三联灭活疫苗及其制备方法

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> Infectious bursal disease virus

<400> 1

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc catcccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggcttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacatac tgcagagcga tgggagctac 240

aagttcgatc agatgctcct gacggcccag aacctacctg ccagctacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtaaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcgcta 360

aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa gggagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaacgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgata aaattgggaa cgtcctagta 480

ggggaagggg taaccgttct cagcttaccc acatcatatg atctcgggta tgtgaggctt 540

ggtgacccca tacctgctgt agggctcgac ccaaagatgg tagcaacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgacaatt accaattctc atcacagtac 660

aagacaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cactagtctc 720

agcgttgggg gggagcttgt gttcaaaacc agcatccaaa accttgtact gggcgccaca 780

atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc tgcaaacaat 840

gggctgacgg ccggcatcga caacctcatg ccattcaacc ttgtgattcc gaccagcgag 900

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gcaggggaac agatgtcgtg gtcggcaagt gggagtctag cagtgacgat ccatggtggc 1020

aactatccag gagccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaacgagt ggcaaaagga 1080

tccgttgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg tcacagaata cggccgattc gacccaggag ccatgaacta cacgaaactg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatt aagaccgtct ggccaacaag ggagtacacc 1260

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<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> Infectious bursal disease virus

<400> 2

Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg

1 5 10 15

Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr

20 25 30

Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro

50 55 60

Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Ile Leu Gln Ser Asp Gly Ser Tyr

65 70 75 80

Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr

85 90 95

Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr

100 105 110

Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr

115 120 125

Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu

130 135 140

Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val

145 150 155 160

Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly

165 170 175

Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Val Gly Leu Asp Pro Lys

180 185 190

Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile

195 200 205

Thr Ala Ala Asp Asn Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Lys Thr Gly Gly

210 215 220

Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

225 230 235 240

Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Lys Thr Ser Ile Gln Asn Leu Val

245 250 255

Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile

260 265 270

Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala Gly Ile Asp Asn

275 280 285

Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro

290 295 300

Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Asp Gly Gln

305 310 315 320

Ala Gly Glu Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr

325 330 335

Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val

340 345 350

Ala Tyr Glu Arg Val Ala Lys Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val

355 360 365

Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val

370 375 380

Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu

385 390 395 400

Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr

405 410 415

Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu

420 425 430

Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Ile Arg

450

Claims

1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗抗原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒和变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白，其中所述变异株法氏囊病毒FJ19于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.19381。

2.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述鸡新城疫病毒的毒株为LaSota，禽流感病毒的毒株为H9亚型的TL18株，所述TL18株于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC NO：19382。

3.根据权利要求2所述的三联灭活疫苗，其特征在于，其中La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL，TL18株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL，变异株法氏囊病毒VP2蛋白含量的琼扩效价≥1:128。

4.根据权利要求1-3任一项所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述VP2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

5.权利要求1-4任一项所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

S1、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备；

S2、油相制备；

S3、水相制备：

S4、乳化。

6.根据权利要求5所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：

S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备：

扩增获得IBDV FJ19株的VP2蛋白，与pMD相连，获得pMD-IBDV-VP2；

S102、pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒的制备：

S103、重组杆粒rBac-IBDV-VP2的构建：

将S102中得到的pFastBac I-IBDV-VP2中转质粒转入大肠杆菌DH10Bac中获得重组杆粒rBac-IBDV-VP2；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

S105、重组杆状病毒的扩增：

将S104中得到的重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9，培养得到F1代重组杆状病毒；

S106、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的获得：

7.根据权利要求5所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2油相制备包括：

取注射用白油、硬脂酸铝混合加热后，加入司本80，继续加热，自然冷却至室温后，得到油相。

8.根据权利要求5或6所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，S3水相制备步骤包括：

将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相。

9.根据权利要求5-7任一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，

步骤S4包括：将S2中得到的油相放入乳化罐内，边搅拌边加入S3中得到的水相，得到乳化液，剪切，得到三联灭活疫苗。