CN102068695A

CN102068695A - 鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN102068695A
Application number: CN2010106123219A
Authority: CN
Inventors: 李陆梅; 宫晓; 李昌友; 左青山; 李晓林; 孙健
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2030-12-29
Also published as: CN102068695B

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒(H9亚型)YBF003株和表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

Description

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明是一种用于预防鸡的新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病四种疫病油乳剂疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)

禽流感(H9亚型)(Avain Influenza H9 subtype)是由禽流感病毒(Avain InfluenzaVirus)引起的、主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease virus，IBD)是由双RNA病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡。本病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)

国内外现在上市的商品化产品品种很多，但都是很单一的传统疫苗，多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激，还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面。所以迫使我们在以往具有不散毒、抗体滴度高、免疫保护期长、受母源抗体影响小等优点的油乳剂灭活疫苗的基础上开发出更新更好更适合预防这四种现状流行性疾病的产品。

发明内容

本发明的目的是制备鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病的四种抗原，并进行合理复配制成鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病四种疫病油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，而且保证了公众健康。

该四联苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段：

(1)选育的新毒株要经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒攻击的一株较理想的制苗用毒株。

(2)在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配，并且保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果。

(3)利用美国进口的Millipore浓缩机将抗原经过超强浓缩，抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延(浓缩机的生产厂家，美国密理博。型号为CUP50)。

(4)疫苗生产的主要步骤为：

(1)生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、M41株鸡传染性支气管炎病毒、YBF003株禽流感病毒H9亚型和E.coli BL21/pET28a-VP2株表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌；

(2)分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒、M41株鸡传染性支气管炎病毒和YBF003株禽流感病毒H9亚型，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；用加卡那霉素的LB液体培养基培养表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21/pET28a-VP2株(本发明或简称为“基因工程菌”)，经过破菌、硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

(3)将以上制备的四种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗。

本发明详细描述

1.生产用种毒的来源

(1)鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株)均购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所。

(2)鸡传染性支气管炎病毒M41株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所。

(3)表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株(中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保管，菌株保藏编号为M204038，长江大学荣俊等提供，荣俊.IBDVVP2基因重组质粒Pbv220表达条件的优化。《动物医学进展》2007年第4期；荣俊.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗免疫效力及安全性试验.《浙江农业科学》2007年第6期)；传染性法氏囊病病毒BC6-85株(CVCC AV7株)购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所。

(4)禽流感病毒(H9亚型)(本发明又统称为禽流感病毒，Avain Influenza Virus)A/Chicken/shandong/11/05(H9N2)株(简称YBF003株)，该毒株已于2010年12月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4503。

2.生产用种毒的制备：

(1)鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(2)鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2～10^-3)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液(尿囊液及羊水)，装于无菌容器内。将检验无菌、病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(3)禽流感病毒YBF003株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶256(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于安瓿中，冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

(4)表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生产用菌种制备：一级种子繁殖和鉴定将各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。置2～8℃保存，应不超过3日。

3.制苗用病毒液的制备：

(1)鸡新城疫病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。同时按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2005，本发明以下简称《中国兽药典》)规定的方法进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶2048(微量法)时停止浓缩，按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

(2)鸡传染性支气管炎病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2或10^-3)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

(3)H9亚型禽流感病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)时停止浓缩。按现行《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

(4)鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基(加卡那霉素的LB液体培养基)及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。

灭菌将收集的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)，以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2～8℃保存，不超过7日；-15℃以下保存，不超过60日。

4.灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。

油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、H9亚型禽流感病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白等量混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀；水相中传染性法氏囊病毒VP2蛋白效价(与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价)不低于1∶16。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

乳化取油相3份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

本发明与现有技术的区别在于：

1.我们所采用的A型禽流感病毒(H9亚型)毒株YBF003株，是在全国各地经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定的新毒株，它是一株HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒攻击的一株较理想的制苗用毒株。

2.表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株(生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗用的工程菌种)是用分子生物学的方法克隆的一株在我国流行的IBDV超强毒株的VP2基因，对基因序列进行适当修饰后加载到表达质粒载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21后制成的。此重组菌株可表达传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白，提取VP2蛋白制备成疫苗，免疫效果好、生产工艺操作简单、生产成本低、纯度高、使用安全，跟以往的制苗过程不一样，并且将传统全病毒灭活疫苗的基础上结合了基因工程亚单位疫苗的复配，同时保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果。

3.本发明所采用的浓缩工艺是利用美国进口的Millipore浓缩机浓缩，虽然目前国内外的一些厂家都采用此类浓缩技术，但是我们在本产品的浓缩工艺环节中加大了抗原浓缩倍数，经过超强浓缩后的抗原，制备疫苗后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

本发明的积极意义

附图说明

图1本发明工艺流程图，其中：

A1熏蒸消毒：是指消毒剂采用熏蒸的方法对培养鸡胚的孵化器进行彻底消毒。

A3NDV、IBV、AIV接种鸡胚：指鸡胚在孵化至10～11日龄时接种鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒在鸡胚内进行繁殖。

A4收毒：在培养到规定的时期，将鸡胚中繁殖的鸡胚液病毒进行收获。

A5病毒浓缩：将收获的含毒鸡胚液在2～8℃条件下采用美国Millipore超滤浓缩机进行抗原的浓缩，使其提高抗原含量，并同时对抗原做了进一步的纯化。

A6测毒价：测其抗原的血凝价。

B5破碎：指传染性法氏囊的VP2蛋白离心后收集菌体，加适量的PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎，使其菌体内的蛋白充分释放出来。

C灭活：将A组和B组的抗原液都用适量的甲醛溶液进行灭活，灭活掉抗原活性及外毒素。。

D半成品检验：是指要进行灭活检验、VP2蛋白含量检测、无菌检验、内毒素检验，使其各个指标在半成品时合格，才能进行下一步。

E抗原配比：指鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊4组的水相的抗原配比是1∶1∶1∶1。

F乳化：指将含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即成为成品的疫苗状态。

最佳实施方式

实施例1

(一)抗原制备以及半成品检验：

1.鸡新城疫病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，接种6528枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。收获的77000mL合格胚液，同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶2048(微量法)时停止浓缩，浓缩后19000mL胚液，按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.鸡传染性支气管炎病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-2或10^-3)，接种7060枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。收获的80000mL合格胚液同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，浓缩后20000mL的胚液同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

3.H9亚型禽流感病毒液的制备

(1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，接种6730枚10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

(2)孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

(3)收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1∶256(微量法)者应弃去。收获的81000mL胚液同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)时停止浓缩。浓缩后20000ml的胚液按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

(5)灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

4.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

(1)菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

(2)破菌培养结束后，离心收集7000g菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集74460mLVP2蛋白液随即进行灭活。

(3)灭菌将收集的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)，以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2～8℃保存，不超过7日；-15℃以下保存，不超过60日。

5.半成品检验

(1)鸡新城疫病毒液

1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶128(微量法)者，判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量≥10^8.7EID₅₀的胚液，方可用于制苗。

2)红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1∶2048(微量法)者，方可用于制苗。

3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

4)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(2)传染性支气管炎病毒液

1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-5、10^-6和10^-73个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日。6日后收取鸡胚，无论死胚、活胚(接种后24小时内死亡者除外)均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、卷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量≥10^6.7EID₅₀，方可用于制苗。

2)无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有鸡胚进行检验，应均不出现失水、卷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象时，认为灭活完全。

(3)H9亚型禽流感病毒液

1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶16(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.7EID₅₀时，方可用于制苗。

2)红细胞凝集价测定将浓缩后灭活前的胚液测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024(微量法)者，方可用于制苗。

3)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

4)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活浓缩胚液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(4)鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

1)VP2含量检测将制苗用VP2蛋白液对鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清(购自中国兽医药品监察所)按常规方法进行琼脂扩散试验，上清液中表达产物VP2的滴度(AGP效价)不低于1∶64者，方可用于制苗。

2)无菌检验按《中国兽药典》进行，应无菌生长。

3)内毒素检测将灭菌后的VP2蛋白液按“附注”方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者(用内毒素＜0.125EU/ml的氯化钠注射液将VP2蛋白稀释1000倍，鲎试剂盒检测为阴性)，方可用于制苗。

(二)疫苗制备：

1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

2水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、H9亚型禽流感病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白等量混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀；水相中传染性法氏囊病毒上清液中VP2蛋白的含量不低于1∶16(与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价)。取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。水相总量共计79200mL。

3乳化取油相3份(257000mL)放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。成品疫苗共计316000mL。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

4分装定量分装，加盖密封。

实施例2

成品检验

1.性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6秒以内。

2.无菌检验按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

3.安全检验用7～14日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

4.效力检验

(1)鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1)血清学方法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶16(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1∶4(微量法)。

2)免疫攻毒法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒(CVCC AV1611株)10^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。

(2)鸡传染性支气管炎部分用14～42日龄SPF鸡25只，其中20只各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)，另5只不接种作为对照。接种后21～28日，分别采血，分离血清，同时免疫鸡再分别肌肉接种四联灭活疫苗0.3ml，二免后21～28日再将免疫鸡和对照鸡分别采血，分离血清。将两次血清分别测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值应比首免血清高4倍以上，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1∶8(微量法)。

(3)H9亚型禽流感部分效力检验

1)血清学方法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶180(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1∶4(微量法)。

2)免疫攻毒法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF003株毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。

(4)鸡传染性法氏囊病部分效力检验以下方法任择其一。

1)血清学方法取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡应至少有8只琼扩效价不低于1∶8，对照鸡应全部阴性。

2)免疫攻毒法取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少8只发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。

5.甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行测定，符合“兽用生物制品通则的规定”。

附注：

凝胶法检查细菌内毒素

Pyrosate内毒素快速检测试剂盒

Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒作为世界上唯一的凝胶法内毒素快速检测试剂，主要用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素的快速检测。

【成分】样品检测管(SPL)：管内壁有鲎试剂

样品阳性检测对照管(PPC)：管内壁有内毒素

吸管

【特异性】Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒只对内毒素产生特异性，并排除了(1，3)-β-D-glucans引起的假阳性结果。

【敏感性】本试剂盒的灵敏度为1EU/ml。

【作用与用途】用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素检测。

【贮藏】室温保存，有效期为120个月。

【规格】10次/盒。

操作述式：

(1)在37℃温箱中预热所用器具。

(2)将供试品用氯化钠注射液(内毒素＜0.125EU/ml)适当稀释成不同倍数，待测。

(3)将0.5ml稀释不同倍数的供试品小心加入样品检测管(SPL)，并轻轻混匀。

(4)用无热原的吸管小心地从样品检测管中吸取0.25ml的供试品加入样品阳性检测管(PPC)，轻轻混合60秒，即可。

(5)将完全混匀后的样品检测管和样品阳性检测管放置于37℃培养30min。

(6)倒置样品检测管和样品阳性检测管，观察有无凝集。

(7)当阳性对照检测管(PPC)完全凝集判试验成立。

(8)若样品检测管有凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素的含量≥1.0EU/ml；若样品检测管中无凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素含量＜1.0EU/ml。根据稀释度计算原供试品中内毒素含量。

Claims

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型、传染性法氏囊病四联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是灭活的La Sota株鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒M41株、YBF003株禽流感病毒H9亚型和E.coli BL21/pET28a-VP2株大肠杆菌基因工程菌表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐剂，其中YBF003株禽流感病毒H9亚型毒株已于2010年12月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4503。

2.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

(1)生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、M41株鸡传染性支气管炎病毒、YBF003株禽流感病毒H9亚型和鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21/pET28a-VP2株；

(2)分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒、M41株鸡传染性支气管炎病毒和YBF003株禽流感病毒H9亚型，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；用加卡那霉素的LB液体培养基培养表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株，经过破菌、硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

3.如权利要求2所述一种鸡新城疫、禽流感H9亚型、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法，其特征在于四种灭活抗原等量混合，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀，禽流感病毒含量不低于10^7.0EID₅₀；水相中传染性法氏囊病毒VP2蛋白效价按与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计算不低于1∶16。