CN104274829B - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，其中，该疫苗组合物包括免疫量的鸡新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、H9亚型禽流感病毒抗原以及传染性法氏囊病毒抗原。同时还提供了该疫苗组合物的制备方法和应用。本发明的疫苗组合物可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感和传染性法氏囊病的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，保证公众食品安全。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种疫苗组合物，以及其制备方法和应用。

背景技术

鸡新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给养禽业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。

禽流感(H9亚型)(Avian Infectious H9subtype)是由禽流感病毒(AvianInfectious Virus)引起的、主要流行于动物和人类中一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。

鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBD)是由双RNA病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡。该病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。

国内外现在上市的商品化产品品种很多，但都是很单一的传统疫苗，多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的应激反应，还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来H9亚型禽流感毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面。

同时，近几年的H9亚型禽流感毒株已发生变异，以前分离的毒株对新流行毒株的保护力有限。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种新的鸡新城疫、禽流感、传染性支气管炎、法氏囊疫苗组合物，对现在流行的4种疫病达到较好的保护效果。

本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的鸡新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、H9亚型禽流感病毒抗原以及传染性法氏囊病毒抗原。

优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的传染性支气管炎病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的H9亚型禽流感病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；以及所述的传染性法氏囊病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原。

优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为灭活的La Sota株全病毒抗原，所述的传染性支气管炎病毒抗原为灭活的M41株全病毒抗原，所述的H9亚型禽流感病毒抗原为灭活的SZ株全病毒抗原，以及所述的传染性法氏囊病毒抗原为传染性法氏囊病毒成都株VP2蛋白。

禽流感病毒(H9亚型)SZ株(Avian influenza virus(H9subtype)strain SZ)生物保藏号是：CCTCC NO：V201240，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期：2012年9月16日。

La Sota株、M41株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所。

优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为≥10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原含量为≥10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述的H9亚型禽流感病毒抗原含量为≥10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述的传染性法氏囊病毒抗原含量为琼脂扩散效价≥1:16。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的H9亚型禽流感病毒SZ株抗原，所述的H9亚型禽流感病毒SZ株抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述H9亚型禽流感病毒SZ株生物保藏号是：CCTCC NO：V201240。

优选地，所述H9亚型禽流感病毒SZ株抗原为灭活的全病毒抗原；所述H9亚型禽流感病毒SZ株灭活的全病毒抗原含量为10^6.5EID₅₀/0.1ml～10^8.5EID₅₀/0.1ml。

优选地，所述H9亚型禽流感病毒SZ株疫苗组合物进一步包括佐剂，所述佐剂包括油佐剂。

本发明的再一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：(1)分别培养增殖所述鸡新城疫病毒、所述的传染性支气管炎病毒、所述的H9亚型禽流感病毒，表达所述的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；(2)分别灭活所述培养增殖的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒，收集所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；以及(3)将灭活的所述鸡新城疫病毒全病毒抗原、传染性支气管炎病毒全病毒抗原、H9亚型禽流感病毒全病毒抗原和所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白混合，加入佐剂。

优选地，所述步骤(3)中各抗原量之间比例为1:1:1:1～1:1:1.2:1.2；所述佐剂包括硬脂酸铝油佐剂。

本发明的还一目的在于提供一种疫苗组合物在制备预防和治疗鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒以及传染性法氏囊病毒感染的疾病的药物中的应用。

本发明通过制备鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病的四种抗原，并进行合理复配制成鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病四种疫病油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，保证公众食品安全。

本发明的四联苗技术的具有以下特点和优点：

(1)选育的新毒株经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出了一株较理想的制苗用毒株，该毒株HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒株攻击。

(2)在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配，用于表达传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白的重组菌株是用分子生物学的方法克隆的一株在我国流行的IBDV超强毒株成都株的VP2基因，可表达传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白，提取VP2蛋白制备成疫苗，免疫效果好、生产工艺操作简单、生产成本低、纯度高、使用安全，跟以往的制苗过程不一样，并且将传统全病毒灭活疫苗的基础上结合了基因工程亚单位疫苗的复配，同时保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样效果。

(3)本发明对H9亚型禽流感病毒的繁殖工艺进行了摸索，确定了病毒的最适繁殖工艺，缩短了病毒繁殖时间，同时提高了病毒滴度。在疫苗制备过程中，大大缩短了病毒液生产时间，同时，较高的病毒滴度降低了生产成本，利用美国进口的Millipore浓缩机将抗原经过超强浓缩，抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延。

序列表中：

序列1为禽流感病毒H9亚型SZ株HA1基因序列；

序列2为IBD成都株VP2基因序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 H9亚型禽流感病毒SZ株对现有流行株的交叉保护试验

1.方法

从2012～2013年分离株中选取4株病毒，对SZ株灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒株具体信息见下表1。

表1 4株禽流感分离株的详细信息

毒株名称	分离时间	分离地点
			A019	2012	江苏
A055	2012	山东
			A089	2013	山东
A119	2013	安徽

(1)禽流感病毒SZ株制苗毒的制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3或10^-4)，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种24～48小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶256(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(2)禽流感病毒SZ株抗原的制备及检验：

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:2048(微量法)时停止浓缩，浓缩后的胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加入甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

(3)禽流感病毒SZ株灭活疫苗的制备：

(3.1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔接种10～11日龄的SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.7EID₅₀胚液，方可用于制苗。

(3.2)红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1:2048(微量法)者，方可用于制苗。

(3.3)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(3.4)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(3.5)油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

(3.6)水相制备取灭菌后的吐温-804份，加入H9亚型禽流感抗原96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

(3.7)乳化取油相3份放入灭菌容器中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以15000r/min搅拌5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，使成品中H9亚型禽流感病毒含量为10^6.5EID₅₀/0.1ml～10^8.5EID₅₀/0.1ml，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

(4)禽流感病毒SZ株对2012～2013年分离株的保护力试验：

取上述制备的灭活苗，以0.2ml/只的剂量经皮下途径免疫21日龄SPF鸡。免疫后21日，将免疫鸡连同对照鸡，分别以静脉注射0.2ml的方法各感染H9亚型禽流感病毒A019、A055、A089株和A119株病毒液(使用无菌生理盐水将4株病毒液的病毒含量均稀释至5×10^6.0EID₅₀/0.1ml)，每株病毒攻毒免疫鸡10只，空白鸡5只。攻毒后第5日，采集喉头和泄殖腔棉拭子，将同一只鸡的两种棉拭子液混合作为一份样品，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。对病毒分离阴性的样品应盲传1代，再进行判定。

2.结果

使用2012～2013年的4株分离株对SZ株灭活苗免疫后21日的SPF鸡进行攻毒，攻毒后第5日采集棉拭进行病毒分离，结果见表2。结果显示，SZ株灭活苗对4株分离株的攻击均可提供良好的攻毒保护，攻毒后病毒分离率均为0/10，而空白鸡至少4/5出现排毒。

表2SZ株灭活苗对2012～2013年分离株的攻毒保护结果

上述结果表明，SZ株对现有流行毒株有良好的免疫保护效果。

实施例2 E.coli BL21(DE3)/pColdⅢ-VP2大肠杆菌基因工程菌的构建

1、实验材料

质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab；EcoR1、Sal1限制性内切酶、pColdⅢ_DH5α菌株购自TaKaRa；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天泽生物,其他试剂均为分析纯。

2、实验步骤

2.1VP2cDNA制备

2.1.1总RNA的提取

总RNA提取简要过程如下：将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200μL病料补加TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)至500μL，加入5μL蛋白酶K和10％(W/V)十二烷基磺酸钠(SDS)50μL，56℃水浴3小时。加入等体积苯酚/氯仿(1:1，V/V)抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5mL离心管，加入1/10体积的NaAc(3M,pH5.2)、等体积异丙醇，-20℃沉淀2小时。4℃、10000转/分离心15分钟，用75％乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水0.5ml重新溶解。

2.1.2VP2cDNA制备

根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下：

VP2-EcoR1-f：CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC

VP2-Sal1-r：ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT

2.2含酶切位点的VP2片段扩增

对上述制备的VP2cDNA进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

2.3pColdⅢ质粒EcoR1、Sal1双酶切

利用EcoR1、Sal1对pColdⅢ质粒进行双酶切，形成具有粘性末端的连接片段，反应体系如下：

37℃水浴2h后，琼脂糖电泳回收1.7kb大小的目的片段。

2.4目的基因片段的琼脂糖凝胶回收

1.从琼脂糖凝胶中切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5ml离心管中，称重。

2.每100mg琼脂糖凝胶加入300μl溶胶溶液。

3.55℃温浴10min，至凝胶完全融化。

4.取700μl融化的凝胶溶液转移至纯化柱中，10000g室温离心1min。

5.将纯化柱放回收集管中，加入500μl洗涤缓冲液，10000g室温离心1min。

6.弃去滤过液，纯化柱放回收集管，再次离心1min，再次离心1min，以除去残留的Washing Buffer。

7.将纯化柱转移至1.5ml新的微量离心管中，在柱子中央加入30～50μl洗脱缓冲液，10000g室温离心1min。离心管中洗脱液即为回收的DNA。

2.5酶连反应

1、取约10μl经过酶切和纯化的pColdⅢ载体，加入30μl的待插入片段。

2、加入1μl T4DNA连接酶，漩涡混匀，室温离心数秒。

反应体系如下：

3、20-25℃孵育连接2小时后可以取20μl直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为阳性克隆，命名为pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。挑取单克隆在含有100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后，送Invitrogen公司测序分析，分析测序结果，与Genebank中登录号为KF021490.1VP2基因序列一致。

实施例3本发明生产用种毒的制备

(1)鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-4或10^-5)，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶256(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(2)鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-2或10^-3)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液(尿囊液及羊水)，装于无菌容器内。将检验无菌、病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(3)禽流感病毒SZ株毒种制备：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3或10^-4)，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种24～48小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1∶512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

(4)表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白生产用菌种制备：一级种子繁殖和鉴定：将各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。置2～8℃保存，应不超过3日。

实施例4抗原制备及半成品检验

1.鸡新城疫病毒液的制备：取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-4或10^-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，若干鸡胚混为一组，血凝价低于1:128者弃去，所收获的合格胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:1024(微量法)时停止浓缩，浓缩后的胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加入甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.鸡传染性支气管炎病毒液的制备：取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-2或10^-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，若干鸡胚混为一组，抽样检测病毒含量，应≥10^6.0EID₅₀/0.1ml。所收获的合格胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，浓缩后的胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将鸡传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加入甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

3.H9亚型禽流感病毒液的制备：取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3或10^-4)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，若干鸡胚混为一组，血凝价低于1:512者弃去，所收获的合格胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。收获胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:2048(微量法)时停止浓缩，浓缩后的胚液按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加入甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

4.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

(1)菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

(2)破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。

(3)灭菌将上级的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)，以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2～8℃保存，不超过7日；-15℃以下保存，不超过60日。

5.半成品检验

(1)鸡新城疫病毒液

(1.1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液用灭菌生理盐水4倍还原后，进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔接种10～11日龄的SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.7EID₅₀胚液，方可用于制苗。

(1.2)红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1:2048(微量法)者，方可用于制苗。

(1.3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(1.4)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(2)鸡传染性支气管炎病毒液

(2.1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液用灭菌生理盐水4倍还原后，进行10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF胚5个，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日。6日后收取鸡胚，无论死胚、活胚(接种24小时内死亡者除外)均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、蜷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特征性病痕者，判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量≥10^6.7EID₅₀，方可用于制苗。

(2.2)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(2.3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有鸡胚进行检验，应均不出现失水、蜷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象时，认为灭活完全。

(3)H9亚型禽流感病毒液

(3.1)病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液用灭菌生理盐水4倍还原后，进行10倍系列稀释，取10^-8、10^-9、10^-103个稀释度，各尿囊腔接种10～11日龄的SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^8.7EID₅₀胚液，方可用于制苗。

(3.2)红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1:2048(微量法)者，方可用于制苗。

(3.3)无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(3.4)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

(4)鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

(4.1)VP2含量测定将制苗用VP2蛋白液对鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清(购自中国兽医药品监察所)按常规方法进行琼脂扩散试验，上清液中表达产物VP2的滴度(AGP效价)不低于1:64者，方可用于制苗。

(4.2)无菌检验按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

(4.3)内毒素检测将灭菌后的VP2蛋白液按“附注”方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者(用内毒素＜0.125EU/ml的氯化钠注射液将VP2蛋白稀释1000倍，鲎试剂盒检测为阴性)，方可用于制苗。

实施例5疫苗制备

1.油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

2.水相制备将检验合格的鸡新城疫抗原、传染性支气管炎抗原、H9亚型禽流感抗原、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白以1:1:1.2:1.2比例混合。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

3.乳化取油相3份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，使0.1ml成品中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，鸡传染性支气管炎病毒含量不低于10^6.0EID₅₀，H9亚型禽流感病毒含量不低于10^8.0EID₅₀；水相中传染性法氏囊病毒VP2蛋白的含量不低于1:16(与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价)，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

4.分装定量分装，加盖密封。批号为20130102(以下简称“SZ四联苗20130102”)。

实施例6成品检验

1.性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

黏度用运动黏度仪测定，应不超过200cP。

2.无菌检验按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

3.安全检验用7～14日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

4.效力检验

(1)鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1)血清学方法用30～60日龄SPF鸡15只，10只皮下注射或肌肉注射疫苗20ul，另5只不免疫作为对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:16(微量法)，

为免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)。

2)免疫攻毒法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20ul，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒(CVCCAV1611株)购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所)10^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。

(2)鸡传染性支气管炎部分用14～42日龄SPF鸡25只，其中20只各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)，另5只不接种作为对照。接种后21～28日，分别采血，分离血清，同时免疫鸡再分别肌肉接种四联灭活疫苗0.3ml，二免后21～28日再将免疫鸡和对照鸡分别采血，分离血清。将两次血清分别测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值应比首免血清高3倍以上，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:8(微量法)。

(3)H9亚型禽流感部分效力检验

1)血清学方法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作为对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:256(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)。

2)免疫攻毒法用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作为对照。接种后21～28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的SZ株病毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。

(4)鸡传染性法氏囊病毒部分效力检验以下方法任择其一。

1)血清学方法取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡应至少有8只琼扩效价不低于1:8，对照鸡应全部阴性。

2)免疫攻毒法取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只肌肉或皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少8只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。

5.甲醛、汞类防腐剂残留量测定

按现行《中国兽药典》进行测定，符合“兽用生物制品通则的规定”。

附注：

凝胶法检查细菌内毒素

Pyrosate内毒素快速检测试剂盒

Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒作为世界上唯一的凝胶法内毒素快速检

测试剂，主要用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素的快速检测。

【成分】样品检测管(SPL)：管内壁有鲎试剂

样品阳性检测对照管(PPC)：管内壁有内毒素

【特异性】Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒只对内毒素产生特异性，并排除了(1，3)-β-D-glucans引起的假阳性结果。

【敏感性】本试剂盒的灵敏度为1EU/ml。

【作用与用途】用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素检测。

【贮藏】室温保存，有效期为120个月。

【规格】10次/盒。

操作述式：

(1)在37℃温箱中预热所用器具。

(2)将供试品用氯化钠注射液(内毒素＜0.125EU/ml)适当稀释成不同倍数，待测。

(3)将0.5ml稀释不同倍数的供试品小心加入样品检测管(SPL)，并轻轻混匀。

(4)用无热原的吸管小心地从样品检测管中吸取0.25ml的供试品加入样品阳性检测管(PPC)，轻轻混合60秒，即可。

(5)将完全混匀后的样品检测管和样品阳性检测管放置于37℃培养30min。

(6)倒置样品检测管和样品阳性检测管，观察有无凝集。

(7)当阳性对照检测管(PPC)完全凝集判试验成立。

(8)若样品检测管有凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素的含量≥1.0EU/ml；若样品检测管中无凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素含量＜1.0EU/ml。根据稀释度计算原供试品中内毒素含量。

实施例7与同类产品的免疫效力比较

用“实施例4”同批的抗原，按“实施例5”的制苗方法，改变配苗比例，即将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、H9亚型禽流感病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白以1:1:1:1比例混合，制备四联苗，批号为20130108(以下简称“SZ四联苗20130108”)。

取“实施例5”制备的SZ四联苗20130102、SZ四联苗20130108及国内市场上的新支流法(VP2)四联苗(批号2013001，以下简称“四联苗2013001”)进行免疫效力比较。

10日龄SPF鸡40只，10只/组，其中三组免疫SZ四联苗20130102、SZ四联苗20130108和四联苗号2013001，0.3ml/羽，第4组为对照组，注射等量的灭菌生理盐水，四联苗免疫后21天，分别测定禽流感(H9)、鸡传染性支气管炎、鸡新城疫的HI抗体及鸡传染性法氏囊琼扩抗体效价，比较三种苗免疫后HI抗体水平。具体结果见表3。

表3SZ四联苗与市场同类产品的免疫效力比较结果

注：ND为鸡城疫的缩写，IB为传染性支气管炎的缩写，AI为流感的缩写，IBD为传染性法氏囊的缩写。

由上表可以看出，在免疫后21日，SZ四联苗20130108和市场四联苗2013001的ND、IB、IBD部分的HI抗体水平较为一致，而我们对配苗比例适当调整后，四联苗20130102AI部分和IBD的HI抗体则远高于四联苗2013001免疫组。说明本发明制备的SZ四联苗在AI部分和IBD部分的免疫效果要优于市场四联苗。

另外，由于H9亚型禽流感病毒SZ株抗原的存在，使得本发明SZ四联苗对近年来不断变异的H9亚型禽流感毒株，具有良好的保护力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的鸡新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、H9亚型禽流感病毒抗原以及传染性法氏囊病毒抗原，所述的鸡新城疫病毒抗原为灭活的La Sota株全病毒抗原，所述的传染性支气管炎病毒抗原为灭活的M41株全病毒抗原，所述的H9亚型禽流感病毒抗原为灭活的SZ株全病毒抗原，以及所述的传染性法氏囊病毒抗原为传染性法氏囊病毒成都株VP2蛋白；所述SZ株生物保藏号为CCTCC NO：V201240。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为≥10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述的传染性支气管炎病毒抗原含量为≥10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述的H9亚型禽流感病毒抗原含量为≥10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述的传染性法氏囊病毒抗原含量为琼脂扩散效价≥1:16。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括佐剂。

4.一种权利要求1～3任一项的疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：

(1)分别培养增殖所述鸡新城疫病毒、所述的传染性支气管炎病毒、所述的H9亚型禽流感病毒，表达所述的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

(2)分别灭活所述培养增殖的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒；收集所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；以及

(3)将灭活的所述鸡新城疫病毒全病毒抗原、传染性支气管炎病毒全病毒抗原、H9亚型禽流感病毒全病毒抗原和所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白混合，加入佐剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中各抗原量之间比例为1:1:1:1～1:1:1.2:1.2；所述佐剂包括硬脂酸铝白油。

6.权利要求1～3任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒以及传染性法氏囊病毒感染的疾病的药物中的应用。