CN100360662C

CN100360662C - 一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用

Info

Publication number: CN100360662C
Application number: CNB2004100800658A
Authority: CN
Inventors: 荣俊; 程太平; 刘晓娜; 杨待建
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2004-09-27
Filing date: 2004-09-27
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2024-09-27
Also published as: CN1754959A

Abstract

本发明涉及一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗生产的菌种，其特征是：Escherichia coli BL21/pET-28a-VP2，CCTCC NO：M204038。该菌种的构建过程是先在表达质粒pET-28a上插入传染性法氏囊病毒的VP2蛋白基因构建成原核表达质粒；然后用该表达质粒转化大肠杆菌BL21，IBDV的VP2蛋白基因是从湖北荆州分离的超强IBDV野毒株中克隆出来的。使用乳糖作为诱导剂，诱导Escherichia coli BL21/pET-28a-VP2表达VP2蛋白，经过适度纯化后可加入油乳剂制成油乳剂疫苗。此疫苗可用于肉用仔鸡、蛋鸡、种鸡等预防传染性法氏囊病。

Description

一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病的基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用，属基因工程领域。

背景技术

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是急性、高度接触传染性的病毒病。它是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的鸡的免疫抑制性传染病。传染性法氏囊病的传染性极强，能在一个鸡群中迅速传播。

该病的病原体IBDV有很强的抗失活能力。因此，在高传染压力的情况下除了采用严格的卫生学措施外疫苗的使用是必须的，也是一个强制的措施。这样做的主要目的是保护雏鸡在孵出后的数周内免受IBDV的感染。要达到这一目的有两个重要措施，首先要在产蛋种鸡的整个产蛋期间通过灭活油乳剂疫苗诱导出高滴度的母源抗体。另外，在雏鸡孵出后适时接种减毒活疫苗。活疫苗接种的时间非常关键。因为，在小鸡体内存在的母源抗体能中和活疫苗。然而，1986年超强毒株(vvIBDV)的出现使得预防免疫的形势发生了很大的变化。由于vvIBDV的毒力更强和抗原特性的变化，使它能突破母源抗体的保护和弱毒活苗接种后的保护。因此，传统的疫苗对vvIBDV失去了作用。开发新疫苗成为必然。新疫苗是未完全减毒的中等毒力活疫苗，其主要目的是提供足够强的免疫刺激以产生对超强毒株的保护作用。然而，这些中等毒力活疫苗本身可能会造成免疫抑制并干扰其它疫苗的免疫作用，如新城疫疫苗和马立克病疫苗。而且，中等毒力活疫苗免疫后感染超强毒株的病例仍然不断出现。另外一种对抗vvIBDV的有效方法是灭活疫苗，但这种灭活疫苗必需具有相当高的病毒抗原滴度才有作用。在高感染区一个最有效的灭活疫苗是用感染的法氏囊制备抗原。这种抗原的制备必需用vvIBDV感染鸡，然后宰杀感染鸡从法氏囊中提取所需抗原。这一过程需要屠宰大量鸡因而生产成本很高。针对现用IBDV疫苗的缺陷迫使人们探索新的改进疫苗和开发新疫苗，以控制IBDV感染减少经济损失。

近年来由于基因克隆和重组技术的日益完善和实用化，许多科学家研究开发了许多实验性重组IBD疫苗。这些疫苗多是以病毒为活载体的疫苗。主要载体病毒有：fowl poxvirus，herpevirus of turkey，fowl adenovirus，Marek’sdisease virus，和Semlidk Forest virus。此外，体外表达VP2和产生IBDV类病毒颗粒也已被证实有免疫原性。以细菌为表达载体的活载体疫苗和亚单位疫苗也已研究多年。最近，有报道用酵母表达系统生产IBDV亚单位疫苗，在实验室研究和田间实验中取得较好的效果。用大肠杆菌表达系统研究开发亚单位疫苗和活菌载体疫苗的研究也进行了多年，但已知的研究结果是，大肠杆菌表达IBDV VP2蛋白无免疫原性或形成不溶性包含体无法用作疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种E.coli.BL21/pET-28a-VP2菌种和用该菌种生产IBD基因工程亚单位疫苗和生产IBD基因工程活菌载体疫苗的方法及应用。

本发明的技术方案是：

1、总RNA的提取

总RNA使用生工UNIQ-10 Trizol RNA提取试剂盒进行。简要过程如下：法氏囊取自IBD病死鸡，研磨和匀浆。将细胞冻融3次。取50毫克组织匀浆置于一只聚乙烯离心管中，室温下加入0.5毫升Trizol试剂。加盖密封并剧烈振荡15秒。加氯仿/异戊醇100微升，剧烈振荡30秒。置4℃条件下12,000rpm离心15分钟。将上层水相的无色水溶液转入另外一只无RNA酶的离心管中，每450微升液体加无水乙醇150微升温和振摇。将整个溶液转入UNIQ-10柱和收集管中。室温放置2分钟。室温下12,000rpm离心1分钟。将柱从收集管中取出，弃去收集管中废液。将柱重新放入同一收集管中。加入450微升RW液于UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。室温12,000rpm离心1分钟。从收集管中取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放入同一个收集管中。重复前一步骤一次。将柱在12,000rpm下离心1分钟。将柱转入无RNA酶的离心管中。加50微升DEPC处理过的无RNA酶的水于柱中央的膜上，70℃保温2分钟。将管置12000rpm下离心1分钟。离心管中的溶液就是法氏囊和IBDV的总RNA。

2、VP2基因克隆

根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA。取总RNA液8微升，加1微升40μmol/L反向引物70～80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟。随后依次加入4μl M-MLV5×RT buffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入步骤1的标本管中，每管11微升，使总体积达20μl，离心数秒钟后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活RT酶。

cDNA的PCR扩增：10μl cDNA液，5μl 10×Ex Taq缓冲液，4单位TaKaRaEX Taq(一种高保真DNA聚合酶，同时能在扩产物未端给出一个额外A用于T载体连接)，两种40μmol引物各0.5μl。4μl dNTP混合液(每管2.5mM)，总体积为50μl。PCR温度循环程序为：94℃，5分钟；(94℃60秒，64℃120秒，72℃120秒)循环35次；72℃，10分。用1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，相应的核酸带被切下，并用小量胶提取试剂盒进行纯化。分离的VP2片段被连接到pMD18-T载体上。连接的DNA质粒转化E.coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LBG板上的白色菌株被分离出来。提取质粒DNA，用限制性内切酶和PCR法分析VP2的存在和连接方向。

3、表达载体的构建

将含有正确方向和序列的VP2基因片段用限制性内切酶切下，VP2基因片段用与上述相同的琼脂糖凝胶电泳后回收的方法进行回收。然后亚克隆到线性化的pET-28a载体上，线性化的过程使用相同的限制性内切酶。新质粒命名为pET-28a-VP2。将它用来转化E.coli.BL21。转化菌用PCR和限制内切酶进行鉴定。分离含有VP2的cDNA克隆并测序。

表达序列测序结果：

atg aca aac ctg caa gat caa acc caa cag att gtt ccg ttc ata cgg 48

Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg

1 5 10 15

agc ctt ctg atg cca aca acc gga ccg gcg tcc att ccg gac gac acc 96

Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr

20 25 30

cta gag aag cac act ctc agg tca gag acc tcg acc tac aat ttg act 144

Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

gtg ggg gac aca ggg tca ggg cta att gtc ttt ttc cct ggt ttc cct 192

Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro

50 55 60

ggc tca att gtg ggc gct cac tac aca ctg cag agc aat ggg aac tac 240

Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr

65 70 75 80

aag ttc gat cag atg ctc ctg act gcc cag aac cta ccg gcc agc tac 288

Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr

85 90 95

aac tac tgc agg cta gtg agt cgg agt ctc aca gtg agg tca agc aca 336

Asn Tyr Gys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr

100 105 110

ctc cct ggt ggc gtt tat gca cta aat ggc acc ata aac gcc gtg acc 384

Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr

115 120 125

ttc caa gga agc ctg agt gaa ctg aca gat gtt agc tac aat ggg ttg 432

Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu

130 135 140

atg tct gca aca gcc aac atc a ac gac aaa att ggg aac gtc cta gta 480

Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val

145 150 155 160

ggg gag ggg gta acc gtc ctc agc tta ccc aca tca tat gat ctt ggg 528

Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly

165 170 175

tat gtg aga ctc ggt gac ccc att ccc gct ata ggg ctc gac cca aaa 576

Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys

180 185 190

atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga gtc tac act ata 624

Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile

195 200 205

act gca gcc gat gat tac caa ttc tca tca cag tac caa gca ggt ggg 672

Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly

210 215 220

gta aca atc aca ctg ttc tca gct aat atc gat gcc atc aca agc ctc 720

Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

225 230 235 240

agc atc ggg gga gaa ctt gtg ttt caa aca agc gtc caa ggc ctt ata 768

Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile

245 250 255

ctg ggt gct acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg act gcg gta atc 816

Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile

260 265 270

acc aga gct gtg gcc gcg gac aat ggg cta acg gcc ggc act gac aac 864

Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Ash Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Ash

275 280 285

ctt atg cca ttc aat att gtg att cca acc agc gag ata acc cag cca 912

Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro

290 295 300

atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa agt ggt ggt cag 960

Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln

305 310 315 320

gcg ggg gat cag atg tca tgg tca gca agt ggg agc cta gca gtg acg 1008

Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr

325 330 335

atc cac ggt ggc aac tat cca ggg gcc ctc cgt ccc gtc aca cta gta 1056

Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val

340 345 350

gcc tac gaa aga gtg gca aca ggg tct gtc gtt acg gtc gcc ggg gtg 1104

Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val

355 360 365

agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca aag aac ctg gtc 1152

Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val

370 375 380

aca gaa tac ggc cga ttt gac cca ggg gcc atg aac tac aca aaa ttg 1200

Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu

385 390 395 400

ata ctg agt gag agg gac cgt ctt ggc atc aag acc gta tgg cca aca 1248

Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr

405 410 415

agg gag tac act gac ttt cgc gag tac ttc atg gag gtg gcc gac ctc 1296

Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu

420 425 430

aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc aaa gac ata atc 1344

Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile

435 440 445

cgg gcc ata agg aaa gct tgc ggc cgc act cga gca cca cca cca cca 1392

Arg Ala Ile Arg Lys Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro

450 455 460

cca ctg aga tcc ggc tgc taa 1413

Pro Leu Arg Ser Gly Cys End

465 470

4、大肠杆菌中的表达过程

挑取大肠杆菌BL21/pET-28a-VP2单菌落，接种于10ml的LB+Kan培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0，加入IPTG使终浓度为lmmol/L或加入α-乳糖至终浓度20mmol/L，37℃再培养5小时。取出后5000rpm×10min。将菌体沉淀重悬于1/10体积(1ml)的PBS液中。加溶菌酶至100μg/ml，同时加入1/10体积的TritonX-100，PMSF 3μl，37℃保温1小时。反复冻融3次，用超声波细胞破碎器处理剪切DNA至溶液不再粘稠。12,000g离心15分钟，分离可溶部分和不溶部分。对可溶部分进行抗原活性检查。

5、疫苗的制备

IBD亚单位油乳剂疫苗的制备：将上述溶菌液的上清用20-45％饱和度的硫酸铵沉淀。收集沉淀重溶于适量的PBS液中，转入透析袋中对PBS进行透析。将溶液稀释至VP2的AGP抗原滴度为1/16。按1份VP2蛋白溶液加2份油乳剂，并进行分散制成油乳剂疫苗(油乳剂的制备：矿物油∶司本-80＝9∶1，充分混匀后加入4％吐温-80，2％硬脂酸铝，充分混合，高压蒸汽灭菌后备用)。

大肠杆菌BL21/pET-28a-VP2 IBD活菌载体疫苗制备：其过程与前述的“表达载体的构建”过程相同，但不作溶菌处理。收集菌体加入适量的稳定剂冻干处理后备用。

IBD中等毒力活疫苗B87的准备：IBD活疫苗系中国杭州荐量兽用生物制品有限公司生产，按说明书要求用灭菌生理盐水稀释后备用。

6、免疫实验

(1)试验鸡从荆州康尔美种鸡场购买200只1日龄艾维因商品肉仔鸡。第18(12)日龄时，对每只鸡采血，以琼脂凝胶免疫扩散试验(AGP)检测母源抗体。剔除母源抗体阳性鸡，将母源抗体阴性鸡随机分成5组，分别为A、B、C、D、E、组。

(2)接种方法均为肌肉注射。

(3)分组及免疫接种

表1 鸡免疫实验分组及免疫接种

组别	接种疫苗类型	第一次接种		第二次接种
		第一次接种		第二次接种		只数	剂量(ml)	只数	剂量(ml)
		A	阴性空白组	6	-	只数	剂量(ml)	只数	剂量(ml)	6	-
B	阳性空白组	A	阴性空白组	6	-	17	-	17	-	6	-
B	阳性空白组	C	E.coli.BL21/pET-VP2	14	0.1	17	-	17	-	14	0.1
D	VP2亚单位油乳剂苗	C	E.coli.BL21/pET-VP2	14	0.1	14	0.3	14	-	14	0.1
D	VP2亚单位油乳剂苗	E	IBD中等毒力活疫苗	6	0.1	14	0.3	14	-	6	0.1

(4)攻毒试验

IBDV强毒株BC 6/85，购自中国兽药监察所，用2×10⁴鸡胚半数感染量(EID₅₀)/ml攻毒时，每只鸡肌肉注射0.1ml。第二次免疫接种后10天攻毒。

(5)免疫效果确定依据

攻毒后第10天剖杀试验鸡。检查法氏囊，并观察其外观色泽。取一部分法氏囊作组织切片，以观察组织学病理变化。

法氏囊组织学异常变化分析依据，见表2。

表2 IBDV感染后法氏囊损伤组织学评分系统

损伤评分	组织学特性
损伤评分	组织学特性	012345	法氏囊的任何淋巴滤泡均无损伤，髓质和皮质界限清楚。偶见淋巴滤泡轻微坏死，法氏囊整体结构维持正常。＜50％的淋巴滤泡有严重的淋巴细胞损耗＞50％的淋巴滤泡有严重的淋巴细胞损耗仅有淋巴滤泡的轮廓存在，结缔组织增生，囊腔化。整个淋巴滤泡结构丧失，纤维化。

(7)免疫接种后鸡体内抗IBDV抗体产生情况：见表3。

表3 实验鸡体内抗IBDV抗体AGP检测结果出率

组别	接种疫苗类型	鸡只数(只)	抗体阳性数(只)	抗体阳性率(％)
组别	接种疫苗类型	鸡只数(只)	抗体阳性数(只)	抗体阳性率(％)	A	阴性空白组	6	0	0
B	阳性空白组	17	0	0	A	阴性空白组	6	0	0
B	阳性空白组	17	0	0	C	E.coli.BL21/pET28a-VP2	14	14	100.0
D	VP2亚单位油剂苗	14	14	100.0	C	E.coli.BL21/pET28a-VP2	14	14	100.0
D	VP2亚单位油剂苗	14	14	100.0	E	IBD中等毒力活疫苗	6	2	33.3

由表3可见，C组(E.coli.BL21/pET28a-VP2活菌苗组)和D组(VP2亚单位油剂苗组)的抗体阳性均达100％。而E组商品疫苗抗体阳性检出率为33.3％。

(8)攻毒后第10天实验验鸡的法氏囊组织学检查结果表4

表4 组织学检查法氏囊损伤评分结果

组别	疫苗	数量	实验鸡法氏囊损伤评分数						保护率(％)
			实验鸡法氏囊损伤评分数							0	1	2	3	4	5
			A	阴件空白	6	6	0	0		0	1	2	3	4	5	0	0	0	-
B	阳性空白	17	A	阴件空白	6	6	0	0	0	0	0	0	8	9	0/17(0.0)	0	0	0	-
B	阳性空白	17	C	E.coli.BL21/pET28a-VP2活菌苗	14	12	0	1	0	0	0	0	8	9	0/17(0.0)	0	1	0	12/14(85.7)
D	VP2亚单位油剂苗	14	C	E.coli.BL21/pET28a-VP2活菌苗	14	12	0	1	8	5	1	0	0	0	13/14(92.8)	0	1	0	12/14(85.7)
D	VP2亚单位油剂苗	14	E	IBD中等毒力活疫苗	6	0	2	2	8	5	1	0	0	0	13/14(92.8)	0	2	0	2/6(33.3)

本发明具有以下优点和积极效果：

(1)本菌种能稳定可靠的表达IBDV VP2蛋白。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP2蛋白的抗原活性，生产成本较低。

(2)该菌种可用来生产基因工程亚单位疫苗和基因工程活菌载体疫苗，用于IBD的预防。

(3)将表达的VP2蛋白纯化后可作为基因工程抗原用于ELISA的标准抗原制备，或AGP等其它标准抗原的制备。

中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)：

分类命名 Escherichia coli BL21/pET-28a-VP2

保藏日期 2004年5月24日

保藏单位中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉武汉大学

保藏编号 CCTCC NO：M204038

具体实施方式

将编码IBDV超强毒株的VP2基因连接到pET-28a质粒上构成表达质粒pET-28a-VP2，转化Escherichia coli BL21，得到基因工程菌种Escherichia coliBL21/pET-28-VP2。该菌种可用于基因工程亚单位疫苗的生产，为IBD的预防提供一个新方法。该菌种也可用于VP2基因工程抗原的生产，用于鸡血清抗IBD抗体的检测。

Organization Applicant

------------------------

City：湖北荆州

Country：中国

PostalCode：434025

PhoneNumber：07168496979

EmailAddress：rongjunl@public.js.hb.cn

<110>OrganizationName：长江大学

<120>Title：一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用

<130>AppFileReference：一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用

<140>CurrentAppNumber：cn

<141>CurrentFilingDate：2004-08-28

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>Length：1413

SequenceName：IBDV subunit vaccine VP2 gene sequence

<212>Type：DNA

<213>OrganismName：Infectious bursal disease virus

Feature

<221>FeatureKey：CDS

<222>LocationFrom：1

<222>LocationTo：1413

<400> PreSequenceString：1

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggtttcc ctggctcaat tgtgggcgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360

aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480

ggggaggggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540

ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac tataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660

caagcaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720

agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780

atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcggacaat 840

gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960

gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg 1080

tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260

gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggaaag cttgcggccg cactcgagca 1380

ccaccaccac caccactgag atccggctgc taa 1413

Sequence

<210>2

<211>Length：470

<212>Type：PRT

<213>OrganismName：Infectious bursal desease virus

<221>FeatureKey：VP2

<222>LocationFrom：1

<222>LocationTo：470

<400>PreSequenceString：2

MTNLQDQTQQ IVPFIRSLLM PTTGPASIPD DTLEKHTLRS ETSTYNLTVG DTGSGLIVFF 60

PGFPGSIVGA HYTLQSNGNY KFDQMLLTAQ NLPASYNYCR LVSRSLTVRS STLPGGVYAL 120

NGTINAVTFQ GSLSELTDVS YNGLMSATAN INDKIGNVLV GEGVTVLSLP TSYDLGYVRL 180

GDPIPAIGLD PKMVATCDSS DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QAGGVTITLF SANIDAITSL 240

SIGGELVFQT SVQGLILGAT IYLIGFDGTA VITRAVAADN GLTAGTDNLM PFNIVIPTSE 300

ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAS GSLAVTIHGG NYPGALRPVT LVAYERVATG 360

SVVTVAGVSN FELIPNPELA KNLVTEYGRF DPGAMNYTKL ILSERDRLGI KTVWPTREYT 420

DFREYFMEVA DLNSPLKIAG AFGFKDIIRA IRKACGRTRA PPPPPLRSGC 470

Claims

1、一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位油乳剂疫苗生产的菌种，其特征在于：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-VP2，CCTCC NO：M204038。