CN1847392A - 一种用大肠杆菌生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗生产的菌种和用该菌种生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法，该菌种的特征是：Escherichia coli BL21/pBV220－VP2，CCTCC NO：M204037；该菌种的构建过程是从分离的传染性法氏囊病超强毒株中克隆出VP2基因，将它插入pBV220质粒上构建成原核表达质粒，用该表达质粒转化大肠杆菌BL21菌种；通过热诱导的方法使Escherichia coli BL21/pBV220－VP2菌种表达VP2蛋白后，经过适度纯化后可加入油乳剂制成油乳剂疫苗。此疫苗可用于肉用仔鸡、蛋鸡、种鸡预防传染性法氏囊病。该疫苗不造成对鸡法氏囊的损伤，不影响其它疫苗的免疫效果，也没有引起病源扩散的危险。

Description

一种用大肠杆菌生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法

技术领域：

本发明涉及一种用大肠杆菌生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法，属基因工程领域。

背景技术：

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的鸡的免疫抑制性传染病，它的传染性极强，能在一个鸡群中迅速传播。

目前预防这种疾病有两种主要方法：一是应用未完全减毒的中等毒力活疫苗，其主要目的是提供足够强的免疫刺激以使免疫鸡产生对强毒和超强毒株的保护作用。然而，这些中等毒力活疫苗本身也可能会造成免疫抑制并干扰其它疫苗的免疫作用。另一种有效方法是采用灭活疫苗，但这种灭活疫苗必需具有相当高的病毒抗原滴度才有作用。在高感染区一个最有效的灭活疫苗是用感染的法氏囊制备抗原，这种抗原的制备必需用超强IBDV毒株感染鸡，然后宰杀感染鸡从法氏囊中提取所需抗原。这一过程需要屠宰大量鸡因而生产成本很高。

近年来由于基因克隆和重组技术的日益完善和实用化，许多科学家研究开发了许多不同的实验性重组IBD疫苗。这些疫苗多是以病毒为活载体的疫苗。主要载体病毒有：fowl poxvirus，herpevirus of turkey，fowl adenovirus，Marek’s disease virus，和Semlidk Forest virus。此外，还有编码VP2基因的DNA疫苗的报道，以及用酵母表达系统生产IBD亚单位疫苗的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种Escherichia coli BL21/pBV220-VP2菌种和用该菌种生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法。

本发明的技术方案是：

1、总RNA的提取：

总RNA使用上海生工UNIQ-10 Trizol RNA提取试剂盒进行。简要过程如下：法氏囊取自IBD病死鸡，研磨和匀浆。将细胞冻融3次。取50毫克组织匀浆置于一只聚乙烯离心管中，室温下加入0.5毫升Trizol试剂。加盖密封并剧烈振荡15秒。加氯仿/异戊醇100微升，剧烈振荡30秒。置4℃条件下12,000rpm离心15分钟。将上层水相的无色水溶液转入另外一只无RNA酶的离心管中，每450微升液体加无水乙醇150微升温和振摇。将整个溶液转入UNIQ-10柱和收集管中。室温放置2分钟。室温下12,000rpm离心1分钟。将柱从收集管中取出，弃去收集管中废液。将柱重新放入同一收集管中。加入450微升RW液于UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。室温12,000rpm离心1分钟。从收集管中取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放入同一个收集管中。重复前一步骤一次。将柱在12,000rpm下离心1分钟。将柱转入无RNA酶的离心管中。加50微升DEPC处理过的无RNA酶的水于柱中央的膜上，70℃保温2分钟。将管置12000rpm下离心1分钟。离心管中的溶液就是法氏囊和IBDV的总RNA。

2、VP2基因克隆：

根据VP2基因5′和3′末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5′端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA。取总RNA液8微升，加1微升40μmol/L反向引物70--80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟。随后依次加入4μl M-MLV 5×RT buffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入到RNA标本管中，每管11微升，使总体积达20μl，离心数秒钟后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活反转录酶。

cDNA的PCR扩增：10μl cDNA液，5μl 10×Ex Taq缓冲液，4单位TaKaRaEX Taq(一种高保真DNA聚合酶，同时能在扩产物未端给出一个额外A用于T载体连接)，两种40μmol引物各0.5μl。4μl dNTP混合液(每管2.5mM)，总体积为50μl。PCR温度循环程序为：94℃，5分钟；(94℃60秒，64℃120秒，72℃120秒)循环35次；72℃，10分。用1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，相应的核酸带被切下，并用小量胶提取试剂盒进行纯化。分离的VP2片段被连接到pMD18-T载体上构建成pMD-VP2质粒。用该质粒转化Escherichia coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LBG板上的白色菌株被分离出来。提取质粒DNA，用限制性内切酶和PCR法分析VP2的存在和连接方向。

3、表达载体的构建：

将pMD-VP2质粒中的VP2基因片段用限制性内切酶切下，用琼脂糖凝胶电泳后胶回收的方法进行回收。然后亚克隆到线性化的pBV220载体上，线性化的过程使用相同的限制性内切酶。新质粒命名为pBV220-VP2。将它用来转化Escherichia coli BL21。转化菌通过测序进行鉴定。

4、大肠杆菌中的表达过程：

挑取大肠杆菌BL21/pBV220-VP2菌单菌落，接种于10ml的LB+AMP培养液中，29℃发酵罐中培养至OD₆₀₀＝0.8--0.9。将温度升至42℃再诱导培养3小时。取出后5000rpm离心10分钟。将菌体沉淀重悬于1/10体积(1ml)的细菌裂解液中。加溶菌酶至100μg/ml，同时加入1/10体积的TritonX-100，37℃保温1小时。反复冻融3次，用超声波细胞破碎器处理剪切DNA至溶液不再粘稠。4℃，12,000g离心15分钟，分离可溶部分和不溶部分。对可溶部分中的VP2表达蛋白进行抗原活性和蛋白电泳检查，表明这种表达蛋白是可溶性具有抗原活性的非融合蛋白。

5、疫苗的制备：

IBD基因工程亚单位油乳剂疫苗制备：将含有VP2表达蛋白的溶菌液上清用20-45％饱和度的硫酸铵进行沉淀。收集沉淀重溶于适量的PBS液中，转入透析袋中对PBS进行透析。将溶液稀释至VP2的AGP抗原滴度为1/32。按1份VP2蛋白液加2份油乳剂，进行分散处理制成油乳剂疫苗。

IBD亚单位油乳剂的制备：矿物油∶司本-80＝9∶1，充分混匀后加入4％吐温-80，2％硬脂酸铝，充分混合，高压蒸汽灭菌后备用。

鸡传染性法氏囊病(IBD)基因工程活菌载体疫苗制备：大肠杆菌BL21/pBV220-VP2经过步骤4诱导后，不进行细胞破碎，将菌体沉淀重悬于适量疫苗稳定剂中，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，-20℃保存备用。

IBD中等毒力活疫苗B87的准备：IBD活疫苗系中国杭州荐量兽用生物制品有限公司生产，按说明书要求用灭菌生理盐水稀释后备用。

6、免疫实验：

(1)试验鸡  从荆州康尔美种鸡场购买100只1日龄艾维因商品肉仔鸡。第18日龄时，对每只鸡采血，以琼脂凝胶免疫扩散试验(AGP)检测母源抗体。剔除母源抗体阳性鸡，将母源抗体阴性鸡随机分成5组，分别为A、B、C、D、E组。

(2)接种方法  均为肌肉注射。

(3)分组及免疫接种

表1  鸡免疫实验分组及免疫接种

组别	接种疫苗类型	第一次接种		第二次接种
						只数	剂量(ml)	只数	剂量(ml)
		A	阴性空白组	6	-					6	-
B	阳性空白组					17	-	17	-
		C	IBD基因工程活菌载体疫苗	13	0.1					13	0.1
D	IBD基因工程亚单位油乳剂疫苗					11	0.3	11	-
		E	IBD中等毒力活疫苗	6	0.1					6	0.1

(4)攻毒试验

IBDV强毒株BC 6/85，购自中国兽药监察所，用2×10⁴鸡胚半数感染量(EID₅₀)/ml攻毒时，每只鸡肌肉注射0.1ml，第二次免疫接种10天后攻毒。

(5)免疫效果确定依据

攻毒后第10天剖杀试验鸡。检查法氏囊，并观察其外观色泽。取一部分法氏囊作组织切片，以观察组织学病理变化。法氏囊组织学异常变化分析依据，见表2。

表2  IBDV感染后法氏囊损伤组织学评分系统

损伤评分	组织学特性
		0	法氏囊的任何淋巴滤泡均无损伤，髓质和皮质界限清楚。

1	偶见淋巴滤泡轻微坏死，法氏囊整体结构维持正常。
		2	＜50％的淋巴滤泡有严重的淋巴细胞损耗
3	＞50％的淋巴滤泡有严重的淋巴细胞损耗
		4	仅有淋巴滤泡的轮廓存在，结缔组织增生，囊腔化。
5	整个淋巴滤泡结构丧失，纤维化。

(6)免疫接种后鸡体内抗IBDV抗体产生情况：见表3。

表3  实验鸡体内抗IBDV抗体AGP检测结果

组别	接种疫苗类型	鸡只数(只)	抗体阳性数(只)	抗体阳性率(％)
					A	阴性空白组	6	0	0
B	阳性空白组	17	0	0
					C	IBD基因工程活菌载体疫苗	13	11	84.6
D	IBD基因工程亚单位油乳剂疫苗	11	11	100.0
					E	IBD中等毒力活疫苗	6	2	33.3

(7)攻毒后第10天实验鸡的法氏囊组织学检查结果表4

表4  组织学检查法氏囊损伤评分结果

组别	疫苗	数量	实验鸡法氏囊损伤评分数						保护率(％)
										0	1	2	3	4	5
			A	阴性空白	6	6	0	0								0	0	0	-
B	阳性空白	17							0	0	0	0	8	9	0/17(0.0)

C	IBD基因工程活菌载体疫苗	13	4	9	0	0	1	0	13/13(100.0)
										D	IBD基因工程亚单位油乳剂疫苗	11	6	4	1	0	0	0	10/11(90.9)
E	IBD中等毒力活疫苗	6	0	2	2	0	2	0	2/6(33.3)

0、1分代表被保护，2、3、4、5分代表法氏囊受到不同程度损伤，损伤程度随分增加而加重，均代表未受有效保护。详见表2。

此次免疫保护实验结果：IBD基因工程活菌载体疫苗保护率为100％；IBD基因工程亚单位油乳剂疫苗保护率90.9％，商品疫苗33.3％。

7、IBD基因工程检测用抗原制备：大肠杆菌BL21/pBV220-VP2，经前述方法诱导表达后，进行细胞破碎，收集溶菌液上清，在20-45％饱和度下进行硫酸铵沉淀，然后通过sephadex G100分子筛层析，DEAE纤维素离子交换层析，羟基磷灰石吸附层析后得到纯化VP2蛋白。该蛋白作为基因工程抗原可直接用于AGP和ELISA检测IBD抗体。商品化可加稳定液后冷冻保存，或将纯蛋白液在冷冻干燥机中冻干冷藏。

本发明具有以下优点和积极效果：

(1)本菌种能稳定可靠的表达IBDV VP2蛋白。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP2蛋白的抗原活性，生产成本较低。

(2)该菌种可用来生产基因工程亚单位疫苗和基因工程活菌载体疫苗，用于IBD的预防。

(3)将表达的VP2蛋白纯化后可作为基因工程抗原用于ELISA的标准抗原制备，或AGP等其它标准抗原的制备。

中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)：分类命名Escherichia coli BL21/pBV220-VP2

保藏日期  2004年5月24日

保藏单位  中国  武汉  武汉大学  邮编  430072

保藏编号  CCTCC NO：M204037

具体实施方式：

将编码IBDV超强毒株的VP2基因连接到pBV220质粒上构成表达质粒pBV220-VP2，转化Escherichia coli BL21，得到基因工程菌种Escherichia coliBL21/pBV220-VP2。该菌种可用于基因工程亚单位疫苗的生产，为IBD的预防提供一个新方法。该菌种还可用来生产VP2基因工程抗原，该抗原可用于检测鸡血清中抗IBD抗体。

Claims (4)

1、一种用于鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗生产的菌种，其特征在于：Escherichia coli BL21/pBV220-VP2，CCTCC NO：M204037。

2、一种用权利要求1所述的菌种生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法，其特征在于该菌种经热诱导能表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白，这种蛋白是可溶性具有抗原活性的非融合蛋白，可用于制备鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗。

3、根据权利要求2所述的生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法，其特征在于该菌种经诱导表达、冷冻干燥后，可直接用作活菌载体疫苗，预防鸡传染性法氏囊病。

4、根据权利要求2所述的生产鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的方法，其特征在于该菌种诱导表达出来的VP2蛋白，经过纯化后可作为基因工程抗原，用于传染性法氏囊病的抗体检测。