CN105733987A - 一种鸡滑液囊支原体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株鸡滑液囊支原体,其保藏编号为CCTCC M 2016080。本发明的鸡滑液囊支原体YBF?MS1株具有稳定的生物学特性,具有强的毒力,且具有良好的免疫原性。应用其制备的油佐剂灭活疫苗安全可靠,能够产生较高水平的抗体,持续期长,有交叉保护性,免疫后鸡滑液囊支原体的发病率明显减少,能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市,用本发明的鸡滑液囊支原体YBF?MS1株制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗是防控该病的关键,同时也能弥补市场空缺。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域,具体涉及一种鸡滑液囊支原体。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae,MS)又称鸡传染性滑膜炎,是由鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡等的一种急性或慢性传染病。传染性滑膜炎是Olson等(1964)首先报道的。本病以侵害关节滑液,腱鞘膜为主,其特征为关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级等。鸡滑液囊支原体感染已遍及全球,呈世界性分布,主要侵害商品肉鸡、蛋鸡和种鸡,本病一年四季均可发生,但以冬春季节易发。鸡滑液囊支原体感染一般多见于4~16周龄的鸡,发病率一般为5%~15%,死亡率约为1%~10%。成年鸡多为慢性或隐性感染。由于本病发展缓慢,病程长,一旦在鸡群中感染,根除很困难,因此在鸡群中长期蔓延,导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高、产蛋量下降等。鸡群如存在该病原时,易发生混合感染,加剧病情,死亡率增高,造成严重的经济损失。鸡滑液囊支原体病原为滑液囊支原体,本菌经姬姆萨染色的菌体形态为多形态的球状菌,直径约0.2μm。不同菌株的致病力有所差异,引起的症状也因病原的趋向性而不同。即发酵葡萄糖,不水解精氨酸,不利用尿素。人工培养时,MS的营养要求较高。培养基内必须加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I),另外还需加入马或猪的血清,以猪的血清尤好,最适培养温度为37℃。
资料报道鸡滑液支原体在禽支原体的血清分类中为S型,滑液囊支原体只有1个血清型,经DNA-DNA杂交试验表明,不同的菌株之间几乎没有差异。虽然鸡滑液囊支原体目前在我国还没有广泛的流行病学数据,但已有从河南、陕西、北京、广东、广西、呼和浩特和上海等地区分离到MS的报道。宁宜宝等(1986),经血清学调查结果表明,我国滑液囊支原体阳性感染率为20.7%,在国内的很多地区鸡群中普遍存在,有的地区还很严重。陈建红等(2001),对珠江三角洲部分地区鹅群的185例血清样品,应用平板凝集试验对鸡滑液囊支原体感染进行了血清学检测,阳性感染率为19.5%。血清学调查表明,国内多个地区鸡群中存在MS感染。目前临床上预防鸡滑液囊支原体感染主要是适当药物投放,对于预防本病起到一定作用,但对于已经出现了典型的临床症状的,应用药物的作用并不明显,也不能根除鸡体内的鸡滑液囊支原体,很容易产生耐药性,给该病的控制增加了难度。用鸡滑液囊支原体菌株制备疫苗进行免疫预防是防治本病的有效途径之一,目前国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株鸡滑液囊支原体,该疫苗株具有较强的毒力和很高的免疫原性。
本发明的鸡滑液囊支原体YBF-MS1(MycoplasmasynoviaeYBF-MS1),已保藏于位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2016年3月3日,保藏号为:CCTCCNO:M2016080。
上述的鸡滑液囊支原体疫苗株可用于制备疫苗;
所述的疫苗,优选为灭活疫苗。
本发明的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株具有稳定的生物学特性,具有强的毒力,且具有良好的免疫原性。应用其制备的油佐剂灭活疫苗安全可靠,能够产生较高水平的抗体,持续期长,有交叉保护性,免疫后鸡滑液囊支原体的发病率明显减少,能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市,用本发明的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗是防控该病的关键,同时也能弥补市场空缺。
具体实施方式
根据下面实施例子,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:鸡滑液囊支原体YBF-MS1株的分离纯化和鉴定。
1鸡滑液囊支原体生产用培养基
1.1改良CM液体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1%酚红溶液1ml,上述成分混合溶解后,116℃高压灭菌30分钟,基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25%酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1%辅酶I溶液30ml、1%L-半胱氨酸溶液30ml,用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6~7.8,2~8℃保存。
1.2改良CM固体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、琼脂粉15.0g去离子水加至1000ml,上述成分混合后加热溶解,定量分装,以116℃灭菌30分钟后,置2~8℃保存。使用前将100ml固体培养基加热溶解,当温度降到60℃左右时,添加灭活马血清20.0ml、25%酵母浸出液20ml、1%辅酶I溶液3.0ml、1%L-半胱氨酸溶液3.0ml、8万单位/ml青霉素1.2ml。用1mol/L的氢氧化钠溶液调培养基pH值至7.6~7.8,2~8℃保存。
2鸡滑液囊支原体分离、鉴定
2.1病原菌分离:
2015年3月份,在青岛一养鸡场,已注射了鸡滑液囊支原体疫苗的鸡群中发生了典型的传染性滑膜炎症状。从发病鸡上取肿胀跗关节、足掌及龙骨囊肿内容物,接种于改良CM液体培养基,置37℃,150r/min振荡培养24~48小时,待接种后的液体培养基的颜色由猩红变成橘黄时收获,传代,取第2代(F2代)菌液进行鉴定。
2.2病原菌鉴定
2.2.1形态观察鸡滑液囊支原体分离株(命名为:YBF-MS1株)经吉姆萨染色,菌体形态为多形态的球状菌。
2.2.2生化特性鸡滑液囊支原体分离株YBF-MS1株能发酵葡萄糖及麦芽糖,产酸不产气;不发酵乳糖,不能分解精氨酸;细菌L型鉴定均为阴性;可凝集鸡的红细胞。
2.2.3培养特性鸡滑液囊支原体分离株YBF-MS1株在含有辅酶I的改良CM液体培养基中生长良好,培养24~30小时,呈轻度浑浊生长,培养基颜色由猩红变成橘黄(培养基pH值下降0.7及以上);接种含有辅酶I的改良CM固体培养基上,置5%~10%CO2条件下,37℃培养3~5日,在低倍镜下可见圆形、隆起,表面光滑的菌落,典型菌落呈“煎蛋状”。本菌在不含有辅酶I的培养基中不生长。
2.2.4纯粹检验鸡滑液囊支原体分离株YBF-MS1株按2010年版《中国兽药典》附录进行检验,结果纯粹。
2.2.5特异性
2.2.5.1代谢抵制试验在加有鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液的改良CM液体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清,出现了特异性代谢抑制作用,培养基颜色未发生变化。
2.2.5.2生长抑制试验加有鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液的改良CM固体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清,出现了特异性代谢抑制作用,培养基未见支原体菌落生长。
2.2.5分子生物学鉴定用鸡滑液囊支原体特异性引物进行PCR扩增,结果YBF-MS1株能扩增出约595bp的特异性片段。
鸡滑液囊支原体分离YBF-MS1株通过以上各项鉴定结果表明,均符合鸡滑液囊支原体特性。
2.3鸡滑液囊支原体YBF-MS1株VlhA基因序列测定与分析
2.3.1引物设计根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因,比对后针对保守区设计引物,由大连宝生物工程有限公司合成。该引物扩增片段大小为595bp,引物序列如下所示:
FvolA:CATTGCTCCTGCTGGTATAG
RvolA:TTGGAAGTCAAGTCCTGGTT
2.3.2DNA模板的制备取YBF-MS1株培养物5.0ml,12000r/min离心15min,弃上清,沉淀用1.0ml双蒸水重悬,100℃水浴10min后,12000r/min离心15min收集上清,即为PCR模板,-20℃保存备用。
2.3.3PCR扩增及测序PCR扩增体系为:10×PCRBuffer2.5μl,dNTPs1.0μl,引物F0.5μl,引物R0.5μl,模板DNA5.0μl,Taq酶0.25μl,双蒸水15.25μl。反应条件为:95℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃终延伸5min。取10μlPCR扩增产物,用1%的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定,同时以标准株作为阳性对照,结果出现了与标准参考株WVU1853株相同的约595bp的特异性条带,说明该分离株为鸡滑液囊支原体。
2.3.4测序与分析根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因序列,针对保守区设计了一对引物,并进行扩增,经测序扩增出约为595bp大小的VlhA基因片段;序列分析表明该筛选的支原体菌株与其它不同地方的分离菌株的同源性仅为95%。
2.4毒力试验将活菌量约为106CCU/ml鸡滑液囊支体YBF-MS1株菌液,爪垫注射49日龄SPF鸡10只,0.2ml/只;另设10只作对照,爪垫注射培养基,0.2ml/只。攻毒后按常规饲养,观察14日,记录试验鸡发病情况。
攻毒结果表明,发病鸡的临床症状主要为攻毒爪不敢着地或跛行;典型症状为足掌部、趾关节肿胀;个别发病鸡出现跗关节肿胀,精神不振、羽毛粗乱;所有攻毒鸡均未出现呼吸道症状。发病鸡趾关节和足掌部剖检可见肉芽增生组织、脓性粘液或纤维素性干酪物,跗关节肿胀部位剖检可见灰白色脓性粘液或纤维素性干酪样物质,剖检所有攻毒鸡气囊、气管、肺脏等器官均未见异常。结果见表1。
表1:毒力试验结果
2.5免疫原性的测定将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株灭活检验合格的浓缩菌液(灭活前活菌量约为5×109CCU/ml),加入5%吐温-80制备水相,按照2:3比例与油相混合乳化,制备灭活疫苗。分别以0.1ml、0.25ml、0.5ml颈部皮下注射21日龄SPF鸡各10只,另设不免疫对照10只。免疫后28日,各组试验鸡均用活菌量约为106CCU/ml的YBF-MS1株菌液爪垫注射攻毒,每只0.2ml。观察14日内试验鸡发病情况。试验结果表明,以0.1ml免疫21日龄SPF鸡,免后28日试验鸡的保护率为4/10;以0.25ml和0.5ml免疫21日龄SPF鸡,免后28日试验鸡的保护率为8/10和9/10;对照鸡8/10发病。由表2结果可见,鸡滑液囊支原体YBF-MS1株的最小免疫保护剂量为0.25ml,结果见表2。
表2:免疫原性试验结果
实施例2:YBF-MS1株在鸡滑液囊支原体疫苗中的应用
1菌种制苗用菌种为鸡滑液囊支原体YBF-MS1株,该发明菌株的菌体、菌落形态、生化特异均符合鸡滑液囊支原体的生物学特性,对易感日龄鸡具有较强的毒力和良好的免疫原性。
2生产用菌种制备
2.1一级种子繁殖将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株基础冻干种子用改良CM液体培养基复原,按10%将种子液分别接种于液体培养基中,置37℃,150r/min振荡培养24~30小时(待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养),收获培养物,经纯粹检验合格后,作为一级种子。-15℃以下保存备用。
2.2二级种子和多级种子繁殖取一级种子液按10%接种液体培养基,置37℃,150r/min振荡培养24~30小时(待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养)收获培养物,经镜检合格后,作为二级种子,置2~8℃保存备用。以此方法逐步做种子扩大培养,一直到所需要的种子量。经镜检纯粹后,作为扩大培养用种子液。
2.3制苗用菌液制备
2.3.1菌液培养按10%加入鸡滑液囊支原体YBF-MS1株种子液进行培养,培养温度为37℃,150r/min振荡培养24~30小时(待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养)收获并取样,按照2010年版《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验和活菌计数。每批制备菌液均应纯粹,无杂菌生长,且活菌数均不低于109CCU/ml。
2.3.2菌液浓缩采用连续流离心的方法将菌液作5倍浓缩,浓缩后立即灭活。
2.3.3菌液灭活将浓缩菌液无菌导入灭活瓶内,按照浓缩菌液数量,计量加入甲醛溶液,使其充分混合,甲醛溶液的终浓度为0.2%,37℃振摇灭活12~16小时(以瓶内温度达到37℃开始计时),灭活菌液经灭活检验合格后,置2~8℃保存作制苗用抗原用。
2.4疫苗制备
2.4.1油相制备取注射用白油95份、硬脂酸铝1份、司本-805份,混合均匀,经115℃灭菌40分钟,冷却后备用。
2.4.2水相制备将灭活检验合格的浓缩菌液95份,加入无菌的吐温-805份,充分混匀即为水相。
2.4.3乳化取油相2份导入乳化罐内,开动电机低速搅拌,同时缓缓加入水相1份,4000r/min乳化30分钟。取样10ml,3000r/min离心15分钟,管底析出的水相应不多于0.5ml。
2.4.4分装定量分装,加盖密封,2~8℃保存。
2.5疫苗成品检验
2.5.1性状
2.5.1.1外观鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)外观为乳白色乳剂。
2.5.1.2剂型油包水型。取一清洁吸管,吸取少量疫苗滴入冷水表面,除第1滴外,均不扩散,说明剂型稳定。
2.5.1.3稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中,3000r/min离心15分钟,管底析出的水相不多于0.5ml。
2.5.1.4黏度按2010年版《中国兽药典》附录进行检验,符合规定。
2.5.2装量检查按2010年版《中国兽药典》附录进行检验,符合规定。
2.5.3无菌检验按2010年版《中国兽药典》附录进行检验,疫苗无菌生长。
2.5.4安全检验用22日龄SPF鸡10只,每只颈部皮下注射疫苗1.0ml(2羽份),观察14日,所有试验鸡精神、采食及饮水均未见明显异常,注射部位和全身均无不良反应。
2.5.5甲醛残留量测定疫苗按2010年版《中国兽药典》进行检验,结果表明,疫苗中甲醛残留量为0.07,符合兽用生物制品通则的规定。
2.5.6效力检验用21日龄SPF鸡20只,随机分成2组,每组10只。其中1组颈部皮下注射鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株),每只0.5ml;另1组不免疫作对照。免疫后28日,将所有试验鸡采血,检测平板凝集抗体;同时将所有试验鸡均用活菌量约为106CCU/ml的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液爪垫注射进行攻毒,每只0.2ml。结果表明,免疫后28日,免疫鸡9/10凝集抗体效价不低于1:16;对照鸡10/10凝集抗体效价均为阴性;免疫鸡攻毒后9/10保护;对照鸡攻毒后9/10发病。疫苗效力试验合格,说明鸡滑液囊支原体YBF-MS1株所制备的灭活疫苗具有非常好的免疫保护力。
对比实验表明,用目前市场上出售的鸡滑液囊支原体疫苗进行免疫,再用本发明筛选的YBF-MS1株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明YBF-MS1株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于YBF-MS1株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
Claims (4)
1.一种鸡滑液囊支原体,其特征在于,所述的鸡滑液囊支原体的保藏编号为CCTCCM2016080。
2.如权利要求1所述的鸡滑液囊支原体,其特征在于,所述的鸡滑液囊支原体的菌株号为YBF-MS1株。
3.权利要求1所述的鸡滑液囊支原体在制备疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的疫苗为灭活疫苗。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |