CN114561366B - 一种山羊库布病毒分离株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒领域，具体涉及了一种山羊库布病毒分离株，所述分离株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCCNO:V202205，保藏日期为2022年1月25日，分类命名为山羊库布病毒SWUN/F5/2021(Aichivirus C)。本发明还涉及该山羊库布病毒分离株的应用；该山羊库布病毒具有较高的毒价，而且该病毒株免疫原性良好，制备成灭活疫苗后能产生较高的抗体，可作为一株良好的山羊库布病毒疫苗候选毒株，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种山羊库布病毒分离株及其应用

技术领域

本发明属于涉及病毒领域，具体涉及了一种山羊库布病毒分离株及其应用。

背景技术

库布病毒(Kobuvirus,KoV)是小RNA病毒科一个新的属，动物库布病毒均被归为此属。2003年，首次在胎牛血清以及牛的粪便样品中发现动物库布病毒。2020年最新国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)根据Polyprotein、P1、2C和3CD区氨基酸相似性进一步将KoV划分为Aichivirus A-F 6个种以及未分类的挪威鼠库布病毒、灰松鼠库布病毒和蝙蝠嵴病毒3个种。其中，Aichivirus A成员的人爱知病毒(Aichivirus A1，AiV-A1)，Aichivirus B成员的山羊库布病毒(Bovinekobuvirus,BKoV)和Aichivirus C成员的猪库布病毒(Porcine kobuvirus,PKoV)为腹泻相关病原。

KoV基因组主要由5′端非编码区(5′UTR)、1个大的开放阅读框(ORF)以及3′端非编码区(3′UTR)构成，其中ORF包括氨基端的非结构L蛋白，3种结构蛋白P1(VP0、VP3和VP1)、7种非结构蛋白P2(2A-2C)和P3(3A-3D)。

目前，在羊中发现了两种不同种的KoVs：绵羊库布病毒(Ovine kobuvirus,OKoV)和山羊库布病毒(Caprine kobuvirus,CKoV)，OKoV是Aichivirus B的成员，而CKoV是Aichivirus C的成员。

2012年，韩国研究者根据牛库布病毒U-1和人爱知病毒AiV-1最保守的3D基因设计的引物在韩国黑山羊腹泻粪便样本中首次检测到KoV；2014年该团队用电子显微镜在韩国一只腹泻的羔羊粪便样本中观察到小RNA病毒样颗粒，并运用序列非依赖的单引物扩增方法获得了该毒株完整的基因组，表现出典型的小RNA病毒基因组结构，为一种新的KoV种，命名为CKoV，其基因组与Aichivirus C成员的猪库布病毒基因组序列遗传关系最近。2016年在意大利山羊粪便样本中都检测到CKoV，2020年在明尼苏达州腹泻山羊的粪便样本中发现了CKoV(Sobhy et al.,2020)。此外，在2012-2014年从意大利捕获鹿的粪便中也检测到CKoV，表明CKoV可能具有跨种间传播的能力。最新国际病毒分离委员会将CKoV确定为Aichivirus C成员。

然而，到目前为止，国内外CKoV流行病学资料仍然匮乏，库布病毒对山羊的致病性仍不清楚。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明对山羊库布病毒株进行分离培养，通过电镜观察、分子生物学和免疫学方法对分离毒株进行了鉴定，并研究其致病性，以该病毒分离株制得的疫苗组合物免疫羔羊后能够产生高水平的抗体。

本发明的第一发明目的在于提供一种山羊库布病毒分离株SWUN/F5/2021，所述分离株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，保藏编号为CCTCC NO:V202205，保藏日期为2022年1月25日，分类命名为山羊库布病毒SWUN/F5/2021(Aichivirus C)。

本发明所述病毒分离株的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明的第二发明目的在于提供一种山羊病毒分离株在制备用于预防和/或治疗羊库布病毒产品中的应用。

进一步地，所述产品为疫苗；

进一步地，所述疫苗包括但不限于灭活疫苗、弱毒疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗。

本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗包括但不限于全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗，裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。

本发明第三发明目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括以上所述的山羊库布病毒分离株和/或药学上可接受的载体或稀释剂。

本文中所用的术语“药学上可接受的载体”，意指一种当被施用时不会在被施用个体内造成过敏性反应或其它非所需的效用的载体。依据本发明，所述药学上可接受的载体包括但不限于下列试剂：溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂以及类似物。

本发明第四发明目的在于提供一种上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗羊库布病毒产品中的应用。

本发明术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制羊腹泻或推迟疾病发作的所有行为。

术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使羊腹泻病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。

本发明第五发明目的在于提供一种制备上述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)培养增殖山羊库布病毒分离株；

(2)灭活(1)所述增殖的山羊库布病毒分离株；

(3)加入佐剂。

所述佐剂包括油佐剂，其包括但不限于动物油、植物油或矿物油、白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。

本发明中，所述疫苗组合物包括但不限于水包油乳液、油包水乳液或双重乳液；所述双重乳液表现为水包油包水乳液。

本发明第六发明目的在于提供一种制品，其包含在无菌小瓶、安瓿或注射器中的上述病毒分离株或药物组合物。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明第七发明目的在于提供一种上述的山羊库布病毒分离株在制备预防和/或治疗羊库布病毒诊断试剂中的应用；

进一步地，所述诊断试剂包括抗原检测试剂盒、抗体检测试剂盒、核酸检测试剂盒。

进一步地，所述抗原检测试剂盒中的抗原选自病毒分离株、病毒分离株的基因工程蛋白或病毒分离株的多肽；所述抗体检测试剂盒中的抗体选自所述病毒分离株、病毒分离株的基因工程蛋白或病毒分离株的多肽制备的单抗或多抗。

有益效果：

(1)本发明在腹泻山羊粪便样本中检出山羊库布病毒并获得一个近似完整的基因组，首次证实山羊库布病毒在国内的存在，使羊库布病毒的防控更具有针对性和有效性，在羊库布病毒灭活疫苗、弱毒疫苗的应用研究方面具有重要的价值。

(2)本发明使用山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株制备用于预防羊羔腹泻的疫苗，将该疫苗免疫动物后，具有很好的免疫原性，能刺激机体产生高效价的特异性血清中和抗体。

保藏信息：

关于保藏编号为CCTCC NO:V202205的山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株：该病毒的分类命名为山羊库布病毒SWUN/F5/2021(Aichivirus C)，拉丁文学名为Caprinekobuvirus，是于2022年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)。

附图说明

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可借由参照下文的描述、所附的权利要求书和附图而变得更为明显，附图中：

图1是本发明山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株致vero细胞病变图，其中，A：正常vero细胞，B：蚀斑纯化产生病变的vero细胞；C：间接免疫荧光鉴定；D：透射电镜图；

图2是本发明山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株的PCR检测，其中，凝胶电泳加样顺序依次为：泳道1：阴性对照；泳道2：阳性对照；泳道3：SWUN/F5/2021；M：MarkerⅡ，由上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图3是本发明山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株特异性、纯净性检测，其中，泳道1：CKoV阳性对照；泳道2：CKoV阴性对照；泳道3：SWUN/F5/2021检测；泳道4：RVA阳性对照；泳道5：RVA阴性对照；泳道6：SWUN/F5/2021RVA检测；泳道7：CEoV阳性对照；泳道8：CEoV阴性对照；泳道9：SWUN/F5/2021CEoV检测；泳道10：CAoV阳性对照；泳道11：CAoV阴性对照；泳道12：SWUN/F5/2021CAoV检测；泳道13：BVDV阳性对照；泳道14：BVDV阴性对照；泳道15：SWUN/F5/2021BVDV检测；泳道16：BCoV阳性对照；泳道17：BCoV阴性对照；泳道18：SWUN/F5/2021BCoV检测；M：Mark LD2000，由上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图4是本发明山羊库布病毒SWUN/F5/2021分离株制备的灭活疫苗免疫羔羊后中和抗体水平的测定。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明所应用的方法可以采用病毒研究领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中所用试剂和材料如下：

恒温培养箱和恒温振荡培养箱购自Thermoforma公司；高速离心机5804购自Eppendorf公司；凝胶成像系统VersaDoc2000、普通PCR仪、核酸蛋白电泳仪powerpacuniversal^TM购自Bio-Rad公司；Quick Taq HS DyeMix购自TOYOBO东洋纺生物科技有限公司；DNA MarkerⅡ、Prime Script^TMRT试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Tirzol试剂盒(RNAiso Plus)购于Takara公司；VERO(Madin-Darby bovine kidney，VERO)细胞购自博士德生物有限公司；DMEM培养基和0.25％Trypsin-EDTA(1×)胰酶购自Gibco公司；胎牛血清购自BI公司；商品化灭活疫苗(CKOV&IBRV二联苗)购自扬州优邦生物药品有限公司；MONTANIDE ISA201VG佐剂购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司。

实施例1山羊库布病毒的分离鉴定

1.1山羊库布病毒的分离

首先观察羊群发病情况，发明人采集初步诊断为腹泻的的羔羊粪便样本。将粪便样本用PBS(100U/mL青霉素，100g/mL链霉素)1：5稀释。5000r/min离心10min，得到上清液经0.45μm滤膜过滤除菌后得到病料处理液。

将上述病料处理液接种于6孔培养板上生长旺盛的单层vero细胞，每孔接种0.5mL，同时设立阴性对照孔，37℃含5％CO2培养箱内感作1h，弃去感作液，加入2mL维持液(1％胎牛血清的DMEM)，于37℃含5％CO2培养箱内培养，每隔12h观察细胞病变，培养72h后收毒，细胞毒反复冻融3次之后再次接种vero细胞，如此传代，直至出现典型的细胞病变。

病料处理液接种vero单层细胞后，前两代未出现细胞病变，病毒盲传至第6代，腹泻粪便样本SWUN/F5/2021开始出现局部细胞病变，收获细胞培养物，再次接种vero细胞48h后产生典型的细胞病变现象，主要表现为感染细胞聚集成堆，细胞圆缩、脱落等(见图1)，完全病变后则表现为大部分细胞融合，其他未出现细胞病变，对照组细胞生长良好。

1.2山羊库布病毒的RT-PCR鉴定

1.2.1病毒PCR检测

参照文献中已发表的CKOV检测引物，并送至上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下。

表1 CKoV检测引物

取400μL上述分离毒株的vero细胞培养物作为病毒RNA的提取样品，参照上海英俊生物科技有限公司Trizol试剂盒(RNAisoPlus)说明书提取粪便的RNA，取400μL上清液加入700μL的Trizol，室温静置10min；加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，取上清液；加入等体积的异丙醇充分颠倒混匀，室温静置10min；4℃、12000r/min离心15min，弃上清液，加入1mL750mL/L(经DEPC处理过的灭菌水配置)乙醇；4℃、12000r/min离心5min，弃上清液，用15μL经过DEPC处理过的无菌水溶解沉淀，置-80℃冰箱备用。

利用Prime Script TMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，所述RT-PCR扩增的反应体系如下：模板cDNA 2μL，Quick Taq HS DyeMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1.0μL，余下的由ddH2O补足，总量为25μL。

反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示分离株得到一条大小约为484bp的特异性条带(见图2)，并将PCR产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序分析，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，测定结果与NCBI已发表的CKOV序列进行基因进化树分型分析，结果显示分离株SWUN/F5/2021属于Aichivirus C。

1.2.2纯净性检测

取400μLvero细胞病毒液作为RNA提取样品，参照上海英俊生物科技有限公司Trizol试剂盒(RNAisoPlus)说明书提取粪便的RNA，并利用Prime Script TMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA。以合成的cDNA为模板，应用本实验室建立的RT-PCR检测方法，对羊轮状病毒(Ovine rotavirus，ORoV)、羊肠道病毒(Caprine enterovirus,CEoV)、羊星状病毒(Caprine astrovirus，CAoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)进行外源病毒检测。

所述RT-PCR扩增的反应体系如下：

模板cDNA 2μL，Quick Taq HS DyeMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(引物序列见表2)，余下的由ddH2O补足，总量为20μL。

反应程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。

经RT-PCR检测，CKOV分离株经外源病毒检测RVA、OEoV、CapAstV、BVDV和BCoV均为阴性。

表2外源病毒检测引物序列

1.3病毒蚀斑纯化

将病毒液做10倍系列稀释到10^-6，将其接种到生长良好的单层vero细胞6孔培养板中，每孔接种100μL病毒稀释液，每个稀释度接种2孔，同时设立空白对照孔，置细胞培养箱中吸附1h，每隔20min摇晃一次使病毒均匀分布。吸附后弃去6孔板中的病毒液，然后每孔加入含4％FBS的2％甲基纤维素培养基2mL，使其平铺在细胞表面，室温凝固后置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。待适当稀释度度出现单个蚀斑后，用无菌枪头挑选典型的蚀斑重复性克隆，接种单层vero细胞继续培养增殖，按照上述步骤重复3次。纯化3次之后大批量扩繁病毒液作为种毒。

1.4病毒滴度的测定

将生长状态良好的vero细胞悬浮液铺满96孔板，然后对细胞病毒培养液做连续10倍系列稀释后，加入96孔细胞板内，每一个稀释度8个孔，每孔100μL，置于37℃含5％CO细胞培养箱内感作1h，弃去病毒液，每孔加入含1％的胎牛血清DMEM培养液，37℃含5％CO₂细胞培养箱培养，2～3日观察细胞的病变情况，按照Reed-Muench计算法对分离株进行TCID50测定，结果为SWUN/F5/2021＝10^-6.7/0.1mL。

实施例2 CKoV灭活疫苗的研制

2.1病毒的繁殖

取生长状态良好的vero单层细胞，用Hanks清洗2遍，将上述免疫原性良好的疫苗候选毒株SWUN/F5/2021细胞培养液接种到vero细胞，加入含1％胎牛血清的DMEM细胞维持液，置于37℃含5％CO₂的培养箱内培养，待细胞病变为80％左右时，收获病毒培养液，反复冻融3次，4℃高速离心，获得病毒上清液作为疫苗用病毒。

2.2病毒灭活疫苗的制备

将上述免疫原性良好的疫苗候选株SWUN/F5/2021细胞培养上清液，利用终浓度为0.5％的β-丙内酯对CKoV病毒液进行充分混匀，在37℃摇床内，灭活处理6h。取两份灭活之后的病毒液分别接种到vero细胞进行灭活检验并经vero细胞盲传两代，每代培养48～72h，观察细胞病变情况，同时设立阳性病毒对照和空白对照。

接种灭活病毒液的检测组和阴性对照组细胞无CPE，而阳性对照组出现典型的CKoV细胞病变，对检测组进行2代盲传，仍未见CPE，表明所检测灭活病毒液灭活完全。

最后将灭活的CKoV与201佐剂等体积混合，搅拌后充分混匀，在乳化机内乳化5min，制成水包油包水的灭活疫苗，分装于透明玻璃瓶内，观察疫苗为乳白色均匀混悬液，用注射器吸一滴灭活疫苗于盛水的烧杯中，疫苗均匀的分散在整个烧杯内，并将灭活疫苗在3000r/min离心5min，未见分层现象，疫苗检验合格，可用于后续实验。

表3

选取1～3月龄CKoV抗原、抗体阴性健康羔羊6头。随机分为实验组5头，对照组1头，每日观察有无临床异常，所有动物采血，用于病毒抗体水平检测。首次免疫通过颈部肌肉接种灭活疫苗(SWUN/F5/2021)；空白对照组接种相同剂量不含病毒的细胞液。疫苗接种后21日进行二免，接种方式和剂量同前所述。安全性试验结果表明，本发明SWUN/F5/2021病毒株对羔羊安全，无副作用。疫苗接种后不同时间采血，利用抗体中和试验测定羔羊免疫后的中和抗体水平(图4)。

不同动物的免疫试验结果表明，SWUN/F5/2021毒株在免疫7天后就可诱导产生高水平的抗体，SNT效价达到1500U/ml，可以作为疫苗研制的候选毒株。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西南民族大学

<120> 一种山羊库布病毒分离株及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8106

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

cccccttttc cctaacccca accgccgtat ctggtggcgg caagacacac gggtctttcc 60

ctctaaagca caaatgtgtg tgtgtcccag gtcctcctgc gctcggtgcg ggagtgctcc 120

cacccaactg ttgtaagcct gtccaacgtg tcgtcctggc aagactatga cgtcgcatgt 180

tccgctgcgg atgccgaccg ggtaaccggt tccccagtgt gtgtagtgcg atcttccagg 240

ttcccctggt tggcgttgtc cagaaactgc ttcaggtaag tggggtgtgc ccaatccctg 300

caaaggttga ttctctcacc accttaggaa tgctccggag gtaccccagc aacagctggg 360

atctgaccgg aggctaattg tctacgggtg gtgtttcctt tttctttttc cacaacttca 420

ttgctgacaa ctcactgact acccatttgc tctcttgtgc ctttctgctc tggttcaagc 480

tccttgattg tttttgattg ctttctattg ctttcttcca ctcaaccctt gctcagttca 540

aagtcatgga gtccaaactt cttgtctctg agtccacctt tgtccctgct cttacccaca 600

agctttcccg ccgcatcagg cgacaccctc tcgcctggaa cgcgcgggac aacccccgcc 660

tttcctacat cactgccatg gaggagttgg atgctgcgta catccaagac cagcaccggc 720

tcttccctct cccccgcccc tcccactggt acaactgtct tttttgtcag aacccctcgc 780

gggacggcga cgaccttatg tcgctggcct gcgagtatgg tgatgactgc ccccaccatt 840

cctcccacct tgatcccaaa cccgtccgcc aagcgaagaa ccccgaggac atcctcgagg 900

actccgaatg gccggacaac attctcacct ctgatcctcc ttctttcacc actgatgccg 960

agcaaaactg gctggaccag ctcgccctgg ctacccttcc cggaccccat caggtccgcc 1020

ccctttccaa gttcttttct gaacatccac cccctccttc tcttgcttct aaagtcccca 1080

ttccgggctg ctgctatggc ctggaatgtc ccacttgtga tccccacctt cccacgtctg 1140

cccaggtcgt gcgccaaggg gcgtctacca ccaacatcta cggcaatggc aacaatgtga 1200

ccactgacgt tggtgcgaat ggttggaccc ctacggtcaa cactggcctc ggtgatggtc 1260

ccgtttcctc ctctgctgac gaggttcccg gccgtgccgg tggttcttct acagctaaga 1320

aggattcctc ccctgcctcc actgttaagg tgcacaactt taacaagtgg tgggaacccg 1380

ctgctgccaa agctctcagc cgtggcgtcg acaaggcgct agacggcata gagggtgctg 1440

gcaagcttgc ctccgacgcc atcaagagca agctgtctgg cgggcgtccc ggcccatccc 1500

ccaaccttat tgccctcaac ccctctgcta cccagtccgg taatgccatg attacgacgg 1560

gctctaccgc cccgactgtt gtggcttacc ctcccactcc ctcagttccc cttcctaatc 1620

ctgatgcacc ctcccaacct ggtccttccg gcgaccgcac atggttgctg gatacactta 1680

cctggacccc tgacatgacc gctggatacc atatggctgg ccccaatggt atgcagtgga 1740

ctgccctcca acaacctgtc tttccactct ctacttctgc ttcatggggg acacagaaca 1800

atatggcccc cactgcttat cccctccctg ccgcctttgt gcgagcctac cctgactgtc 1860

cctggtctgc catgcacgac acccactcga tgtggaattg tggctggcgg atccaggtgg 1920

tggtcaatgg tagtcagttc cactctggca ctcttgttct tcttatggtt cctgagggga 1980

gtgacatttt ctccaccggg aacccccgga cggaggcgat gttcgtcttc ccttatgctc 2040

tcctcaacct ctaccagtcc aacacagcct cccttgaggt cccttacatt ggtcccacac 2100

ccaacacctc ctctggtctt cgctgtcctt ggaccttcta tcttactgtc ctcacccccc 2160

tttctgtccc aacaggtgct acccagtctc tttctgtttc catttacgtt actcccatta 2220

attccacctt ccatggcctg cgccaagttc agaaacagca catcaagatg cgttcgctcc 2280

ccggggcgaa tgcgtttggt tctgttgtgg ctggacaaga aatccctgtg tatgccatgg 2340

aaacctatcg cccgcctgtg gactacctgc ctgctgaggt gcatgattgg ctagaatttg 2400

cccaccggcc tggtctgttc gacaccatcg catggactat ggccgaggac gccggacaca 2460

aattggcaga agtgtccgtc gatccgagtg ttctggtaaa caccaacact ccactctcat 2520

tcgtggtcaa catgtacact cagtggcgcg gggaaatcca gctttccctt cttttcactg 2580

gctctgcaca gcactacggc cgccttgccg tgtgcttcac cccccctgct gctacctcac 2640

ccgcaactct tcaggatgcc ctgcgcggta cctacaccgt gtgggacgtc aactcttctt 2700

ccacccttga cttcacggtg cccttcatct ctcaaaccta ttggaaggtc accaactaca 2760

ccctccccac ttctcttctt gccaaacttg gcactgtctc tgtttgggtc atgaatcctc 2820

tttcaggacc ctctgctgcc cccccctctg cccttgtaca attctttgtt tctgctgggg 2880

agtcgtttaa cgtccgtgga ctgcagtctc ccatctgtat tctgcaggcg gctgacgacg 2940

actcggcacc ccaccccatt tccaacttgg agtctggcga agtggtctcg gttcccgagc 3000

cgcgcaccac tttcgcttac tccgacaacc ccactcctcc agacactaac ctggcaaact 3060

ttttctccat ttaccggcgt gcgccgatgg actccaacgg cgactgggag aagtctttca 3120

accaaggctt cgaaaccatc acctatgatc tcgctgcgtg gatccagaat gcaaacgccg 3180

gggatgacct tcccctcttt ctctcttgtt tcacctacat ggccgccgat gttcgtgtgg 3240

ccttttccat ctccaaccct gctgcttttt ctgcacatgt ttccttctat tatcttcctc 3300

ccggggcaac tcctctctgg gaactgacag ataacaacgt ggtggccctt tccaactact 3360

accatgttga tgctgttgtt cccccaacct ccacccaggt tgtcccgctc tcatttccct 3420

acgcctctcc tctttgtgcc cttccccttt cctactgggg cttctcgtca tacgatggcg 3480

agaccgatgt tgccaaccgc aacttgggat ccgtcgtcat ttacgtgagc ttccagtctg 3540

atgctgtgcc caccacccag aatattacca tctcccagaa gattgccttc ggcaacttcc 3600

gggcttgggt tccccgccct ccaccacccc tgggcgctcc tccctccgct tctgctactt 3660

ctgctgtggc cctccccgca cacagacccc tttcctccaa atcaaagatc gtgcgccagt 3720

gtgctgcgcc tgatggatgc actcttcccc tcacctgcga ggatgtgcgt gtgttcatcg 3780

tcaaggtgca gcgcccaacg tacgttcatt gggcattgcg tgccgttcac ccgagcggtg 3840

tgcaacaaat ttccctctcc cgctggcgtc tctccgctgt cgtcgcttac gaggacccgg 3900

ctggcgtggt ctaccaagag gttgaaccat gccactgggc gatcgctgag gcgatggttg 3960

gggaacgctg gaactattct gctgacaaca actgcaccca ctttgtttcc aacattactg 4020

gtgtgtccct ccccaacaca ggcttttctc tctgtcttgg tcttggcgct cttgccgtcc 4080

tgactggctt tgccgccgtt caagcggcca aaggcggtat tgtccgtcag ggtcttcttt 4140

cccttgaggc ccctccagag gttgttcagg ctgccaaccg cgttgctgat tcaattgaat 4200

ccacagcatc tgctgtgcgc gaggctgatc ttgtgcactc cacccgcaac atcaccctcg 4260

ccgcctccga catccgcgag gccgcaacgc aggtttccag tagtctggat ggcttcaccc 4320

atatgcttca gaatttttcc tccaccttta cccagggggt caacaaagcc ctcggtgatg 4380

gactttccac cttcctcacc tgggttgcca aggtctttgg ctacctcctg gttctttttg 4440

gctctcccac tccgatgtcc atagccggtc tattggtcat catctgtgct gatcttgctc 4500

cttctgcctc tgaatacttt acctcccgca attcagttct tggatctctt ttctactgga 4560

ttgcctctaa gcttggcctt tcctgttcac cagaggaggc ggacgcagca gccgtggaac 4620

cgcaaggtgt ccgcgactac aatgatgcag tcaatgcggt gaagaacacc gagtacttgg 4680

ctgagacctg ctggcgctgg gccgagcgtg tcctcaattg gattcgtggt aaggccaaga 4740

cggacccaca agccctcttg gctgatgccc atgatgaaat cttgaggcac tactcagagt 4800

ccatcgctgc tctctcttcc gagcgcactc cggtgaatgc catcaccgac gccatctccc 4860

ggtgtcgtga actcaccaaa attgctgctg atgctaaatc tgcccctcac tcctctttcc 4920

tctctcaggc cttgcgcaac tatcagcttg ctctcaattc cgcgcgcatg gcccagtctg 4980

gtcctcgccc tgaacccgtt gtgatctacc tctatggtcc accggggacg ggcaagtctc 5040

ttcttgctgc tctcctctcc cgtgtccttg cacaaaagtt gtccggcaac ccggatgatg 5100

tctactcccc ttcttctgcc agttgcgaat tctttgacgg atacactggc caggttgtcc 5160

acttcatcga cgacctgggt caggatcctg agggtcgtga ctgggcaaat tttcctaatc 5220

ttgtttcttc tgcccctttt attgtcccca tggcaaatct ggaggccaag ggcacccact 5280

acacctccaa ggtaatagtg gtcacttcca acttcgctgg gccgaacgag cgagctgctc 5340

gttccattgg tgcactgcgc aggcgcatgc acctgcggat caacattgac cgcaaagaag 5400

gcgagccctt cgacccggtg gaagccctca ggcctctgga cctcccctcc aagtacctta 5460

cctcccagac taaactctcc ctctttcatt ctttcaagct gtccattgat gttgactcgc 5520

tctggacacc gaagttcacg gacttcgact cgctggtcga ctccatcgtc tcacgactgg 5580

accgcgccac aggggtctcc gacctcctgg acggcctggt taaaaggcag ggactgacca 5640

tcgagactga ccccactgaa ctttcgtacc aggacgttct tgaaattgat tctcactcta 5700

aacctgtccc aacctccctt tcttttgagc gtgccatcgc tcagaatgcc cctttgtcgg 5760

tgatagatac catctggcag tatcgccgac ctctctttgc ctgcaccact ttcctcacca 5820

tcattggctt cctcatcacc atcatcgctc ttgcgcgaac gctgtggaag gccaaggatg 5880

acacccctga ccaaccccag ggtgcatatt ctggcctccc gcggctgaag cgccaggaga 5940

aggtgaagcc aaaccaccct cccccccctc cgcctgccca atcgcgttcc attgttcggc 6000

agtctctttc tcctgcttta ccaaagattg ctgacaatgt gtacccgatt actacccatt 6060

ccccctccat tggcaagtct tctagctgtg gtttctttct gttttcccgc tttttccttg 6120

cccccaccca cattgttccg gacgacacca ctcggatcat gcttggtccg gatggttatg 6180

actggaacac tcttccccac cttcgtctcg gaaacgagat gactctcatc tattttccca 6240

ctgcacgcca acatcgcgac ctgcgtcgct ttattggctc tttcccctat ccaactggcc 6300

accttatttc tactctttct ggccctcctg tctaccttcg cttctccaag aaccgccttg 6360

ttcatcttga cattccagac gtcgtcagtg aaccggaggc ctacggctac aaggctccca 6420

catttcgcgg tctctgtggt gcccccctca tcacggatga cccagcgggc gtcaagttgc 6480

tcggcctcca tgtagctggc gttgtcggct cttctggctt ctctgttccc atccacaaat 6540

acctgcccca gatcgaggaa tttgcgcttg gctaccaatc catcatcatt ccgggaccac 6600

ccgtggatcc cggggtgaat gtcaaccgca aatccaaact cggtcgttcc ccggcttttg 6660

gtgcctttcc tgtcaagaaa cagccagctc ctctttcaca gaaagacggg cgtctcgagg 6720

acgggatcac cttggatgac caactcttcc ttaaacacaa caagggagac atgggtcagc 6780

catggcccgg tctcgaggcg gccgccgatc tttacttctc caaatttccc actgtcattc 6840

gaaccctcac tcttgaggag gcaatcaatg ggacgccaaa cctggaaggc atcgacatga 6900

atcaggctgc cgggtatcca tggaacacca tgggacgctc gcgccgctct ctctttgtcg 6960

aacaggcccc tggcttctat atgccgactc cggagctgca ggaggagatt gacaaaaccc 7020

tatccaaccc agattacttt tactccacct ttctcaaaga cgagctccgc ccgatcccca 7080

aagtgacggc gggactcacc agagtggtcg aggctgctcc catacatgct atcgtggccg 7140

gccgcatgct gctcggtgga ctcatcgagt acatgcaggc acaccctggc cggcacggta 7200

gcgccgtggg ttgcaaccca gacctccatt ggacaaaatt cttttataaa ttctgtgtct 7260

atcctcaagt ctttgatctg gactacaagt gttttgatgc aacccttccc tcctgtgctt 7320

ttcgcatagt cgaggagcat ctcctcaaac taactggaga tgaaagggtc ccccgctata 7380

tcgaatccat acgccactcc cgtcacattt acgggagcaa cacgtatgag atgattggcg 7440

gtaacccttc aggctgtgtt ggtacttcca tcatcaacac catcatcaac aacatttgtg 7500

tcctctctgc tctgatccaa catccagact tttctcatga ctcctaccgg atcctggcct 7560

acggtgatga tgtgatctac gggtgcgatc cacccatcca tccgtcttac atcaaagagt 7620

tctatgataa gcacactccg cttgtcgtga ctcccgccaa caagggttcc accttccctg 7680

agagctccac aatctacgac gtcacgtttc tgaaacgctg gtttgtgcct gatgatgtcc 7740

gtccgtttta catccacccc gtgatggacc cagacactta cgagcagtcg gtgatgtggc 7800

tgagagatgg agacttccag gatctggtca cctctctttg ttttctggct ttccacagtg 7860

gcccgcgtac ttacgcccgc tggtgcgacc gcgtccgcga gcgggtcatg cagaccactg 7920

gttttcctcc taccttcctt ccctatacct accttcagac ccgctggctg aatttgctgg 7980

cagcgtgaga caccagaatc acccccgctc tgattcgcct ctgtgtagaa tagactcatg 8040

cttccctaag acctggatct cttcccaggc gtttcacccg ccctgccctg ctccttcacc 8100

ggactg 8106

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gccgacgcaa gcgaaacaat 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

tagacgcatc cttacttaca gagt 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

tccccactga gccgctgtcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

tccccactga gccgctgtcc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

tgcgtcaact tattcgctct tccg 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

cgatgcgggc ggactttgg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

gccatgccct tagtaggact 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 9

<400> 9

caccctatca ggctgtrtyc 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 10

<400> 10

cgagttgaac acccagat 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 11

<400> 11

gagacgggca tctacact 18

Claims (8)

1.一种山羊库布病毒(Caprine kobuvirus )分离株，其特征在于，所述分离株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:V202205，保藏日期为2022年1月25日，分类命名为山羊库布病毒SWUN/F5/2021 Aichivirus C。

2.权利要求1所述的山羊病毒分离株在制备用于预防羊库布病毒产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗选自灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗中的一种或几种。

5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括权利要求1所述的山羊库布病毒分离株和/或药学上可接受的载体或稀释剂。

6.权利要求5所述的疫苗组合物在制备预防羊库布病毒产品中的应用。

7.一种制备权利要求5所述的疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）培养增殖山羊库布病毒分离株；

（2）灭活（1）所述增殖的山羊库布病毒分离株；

（3）加入佐剂。

8.一种制品，其包含在无菌小瓶、安瓿或注射器中的权利要求1所述病毒分离株或权利要求5的疫苗组合物。

Images