CN115786276B - 牦牛轮状病毒分离株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株牦牛轮状病毒分离株及其应用，属于生物技术和病毒学技术领域，所述牦牛轮状病毒分离株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:V202244，保藏日期为2022年5月25日。本发明还公开了一种防治牦牛轮状病毒病的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的灭活的所述轮状病毒分离株和药学上可接受的佐剂。本发明牦牛轮状病毒分离株作为疫苗株具有很好的免疫原性，免疫动物后能产生较高水平的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和病毒学领域，特别涉及牦牛轮状病毒分离株及其应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)又称犊牛腹泻病毒(Calf diarrbealvirus)，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。轮状病毒感染多发生在15～45日龄的犊牛，其临床症状表现为精神沉郁、食欲废绝、水样腹泻、严重脱水和酸中毒。
根据我国BRVA的分子流行病学调查资料显示，BRVA在我国呈普遍感染态势，且G6、G8、G10型和P[1]、P[5]、P[11]型是我国最广泛流行的BRVA基因型。G型和P型的组合中，G6P[11]型、G8P[1]型和G10P[11]型是主要的流行型，显示我国流行血清型多样，给BRV的防控带来困难。其中，G10P[11]型只在奶牛中被发现并分离出来，由于牦牛源BRVA的分子特征和基因组研究资料严重匮乏，制约了该病的防控，迄今为止，尚未见有公开牦牛中也存在G10P[11]型病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牦牛源A群轮状病毒纯化毒株(本发明说明书中的HB-3毒株)，其基因型为G10P[11]型，该毒株在MA104细胞上能产生稳定病变，且复制能力较强，可用于A群轮状病毒疫苗研发的生产毒种；并提供上述毒株的分离培养及鉴定方法。
本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供牦牛轮状病毒分离株，所述病毒分离株保藏编号为CCTCCNO:V202244。
第二方面，本发明提供前述牦牛轮状病毒分离株在制备牦牛轮状病毒诊断试剂中的用途；所述用途为制备牦牛轮状病毒株与致病性病原体、抗原、抗体以及核酸检测相关的试剂。
所述诊断试剂包括抗原检测试剂盒、抗体检测试剂盒、核酸检测试剂盒。
所述抗原检测试剂盒中的抗原选自病毒分离株、病毒分离株的基因工程蛋白或病毒分离株的多肽；所述抗体检测试剂盒中的抗体选自所述病毒分离株、病毒分离株的基因工程蛋白或病毒分离株的多肽制备的单抗或多抗。
第三方面，本发明提供前述的牦牛轮状病毒分离株在制备预防和/或治疗牦牛轮状病毒感染的疫苗中的用途。
进一步地，所述疫苗选自灭活疫苗、弱毒疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗中的一种或几种。
第四方面，本发明提供一种疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的灭活的前述的牦牛轮状病毒分离株和/或药学上可接受的载体或辅料。
进一步地，所述疫苗组合物在预防和/或治疗由牦牛轮状病毒所致疾病中的应用。
所述有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明所用的术语“药学上可接受的载体或辅料”，意指一种当被施用时不会在被施用个体内造成过敏性反应或其它非所需的效用的载体或辅料。依据本发明，所述药学上可接受的载体或辅料包括但不限于下列试剂：溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂以及类似物。
本发明中，所述疫苗组合物包括但不限于水包油乳液、油包水乳液或双重乳液；所述双重乳液表现为水包油包水乳液。
本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗包括但不限于全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗，裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
第四方面，本发明提供所述的疫苗组合物的制备方法，为：将灭活后的病毒液和佐剂制备成灭活疫苗。
进一步地，采用β-丙内酯灭活病毒液。
进一步地，灭活的病毒液：佐剂＝1：1。
所述佐剂包括油佐剂，其包括但不限于动物油、植物油或矿物油、白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。在本发明的具体实施方式中，所述佐剂为201佐剂。
第五方面，本发明提供一种制品，其包含在无菌小瓶、安瓿或注射器中的前述病毒毒株或前述的疫苗组合物。
本发明术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制牦牛轮状病毒所致疾病发作的所有行为。
术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使牦牛轮状病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。
有益效果：
本发明从牦牛种分离到了一株致病性的牦牛轮状病毒G10P[11]型分离株，将该疫苗免疫动物后，具有很好的免疫原性，仅经过二次免疫就能刺激机体产生较高的抗体水平，将其应用到牦牛轮状病毒的预防和/或治疗中，可以有效防控牦牛轮状病毒病毒的流行。
附图说明
图1 HB-3毒株电子显微镜下的轮状病毒形态；
图2 HB-3毒株纯化后1-6代RT-PCR电泳图，P：检出过BRVA的阳性对照，N：染料+dd水的阴性对照(空白对照)；
图3正常MA104细胞及分离毒株HB-3在细胞上的病变情况，图中A：HB-3毒株在MA104细胞上的病变；B：正常MA104细胞；
图4 HB-3毒株的间接免疫荧光鉴定结果，A.病毒感染后24h的细胞；B.阴性对照细胞；
图5 HB-3毒株传代RT-PCR扩增轮状病毒特异性VP4、VP7基因电泳图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所应用的方法可以采用病毒研究领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1、HB-3毒株的分离方法：
(1)获取病毒样本
采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县的犊牛腹泻粪便样本，用PBS稀释后，于8000rpm/min、4℃离心10min，并使用0.22的滤器过滤除菌，-80℃保存待用。通过轮状病毒特异性引物进行RT-PCR检测，引物信息见表1。
表1特异性检测BRVA引物信息
(2)HB-3毒株病毒在MA104细胞上的适应
将病料上清加入终浓度为10μg/ml的胰蛋白酶来激活病毒，置于37℃的CO2细胞培养箱激活1h，接种到细胞生长至80-90％的T25细胞瓶中，置于37℃的CO2细胞培养箱孵育1h后弃掉上清，加入4ml的胰蛋白酶终浓度为1μg/ml的维持液，放入37℃的CO2细胞培养箱并定时观察病变，72～96h后进行收毒。收细胞毒时将T25细胞瓶反复冻融3次，8000转离心10min，取上清，后按照上述方法继续进行接毒。在本发明的轮状病毒分离方法中，通过优化激活胰酶的使用浓度，提高了轮状病毒的分离效率。
(3)HB-3毒株的纯化
待分离株病变时间稳定时进行蚀斑纯化，将病毒用TPCK胰酶激活后，将其用DMEM按照10-x次方进行稀释，在稀释后将其置于铺满单层的MA-104细胞，在37℃的CO2培养箱中孵育1h，后弃去病毒液，每孔加入适量甲基纤维素混合液后放置培养箱，每3h观察细胞病情况，后挑取单个噬斑作病毒的下一次纯化，按此方法纯化1～6代，HB-3毒株纯化后1-6代RT-PCR电泳图如图2。
2、HB-3毒种(纯化三代)的鉴定方法：
(1)HB-3毒株病毒滴度测定
将细胞毒用终浓度为10ug/ml的胰蛋白酶37℃激活1h后，吸取100μl病毒液加入900μl的DMEM营养液后进行10倍梯度稀释，从10-1稀释到10-10，在铺好单层细胞的96孔板中每孔依次加入100μl稀释好的病毒液，37℃孵育1h后弃掉上清，每孔加入100μl胰蛋白酶终浓度为1μg/ml的维持液，并设立阴性对照孔。置于37℃CO2培养箱后逐天观察病变，做好记录，根据Reed-Muech氏法计算病毒的TCID50。
生物保藏信息
将所分离的牦牛轮状病毒株提交到中国典型培养物保藏中心进行保藏，其微生物保藏号是：CCTCC NO:V202244；分类命名是：牦牛A群轮状病毒RVA/Yak-tc/CHN/HB-3/2021/G10P[11]，病毒的TCID50为10-4.125/0.1mL。为保藏时间：2022年5月25日，保藏地址：中国武汉大学。
(2)间接免疫荧光鉴定
将MA104细胞铺到6孔板中，待细胞长成单层时进行接毒，设置阴性对照孔，并在接毒后24h用PBS(PH为7.4)洗涤3次，每次2min，每孔加入80％的丙酮在4℃条件下固定10min，弃掉丙酮后用PBS洗涤3次，每次2min；每孔加入3％BSA室温静置30min，弃掉BSA后用PBS洗涤3次，每次2min；每孔加入1：300稀释的一抗1ml，37℃孵育45min，一抗孵育结束后用PBS洗涤3次，每次2min；每孔加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗，用PBS 1:1000进行稀释，37℃避光孵育45min，二抗孵育结束后用PBS洗涤5次以上，每次2min；滴加含有DAPI的封片液，静置10min后用吸水纸吸去残存液体；用倒置显微镜观察结果(图1)。
(3)病毒的电镜观察
将已纯化的细胞毒在室温下用2％磷钨酸染色1-2min，JEM-1400FLASH透射电镜观察(图1)。
(4)HB-3毒株病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建
RNA的提取按照Trizol试剂盒(RNAiso Plus)说明书进行，并利用PrimeScriptTMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA，置于-20℃待用。分析GenBank中已发表的所有BRVAP[11]型的VP4的完整基因序列与G10型VP7的完整基因序列，用Primer 5.0引物设计软件设计了22对引物，对分离株完整基因进行扩增(图5)。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行检测，目的条带用胶回收试剂盒回收，连接pMD19-T载体后，转化到DH5α感受态细胞中，筛选重组质粒，后进行测序。
轮状病毒为分节段病毒，其全基因结构为6个结构蛋白和5个非结构蛋白。本试验对其全基因序列进行扩增，成功扩增到该病毒的全基因序列，GenBank号为：ON711384-ON711394，不仅对了解其分子特征和遗传进化提供了参考，而且对亚单位疫苗的研制奠定了基础。扩增引物见表2。
表2 BRVA全基因扩增引物信息
3、RVA灭活疫苗的制备
为了解轮状病毒疫苗样品的免疫原性情况，选取纯化后第4代病毒液，经β-丙内酯灭活处理6h，制备为免疫用疫苗样品。随机取3份灭活后的样品接种在MA-104细胞上，并设立阳性对照和阴性对照，放37℃CO2培养箱中观察96h。结果显示接种后的阳性对照出现明显的细胞病变，而阴性对照及灭活后的样品则无病变(图3)，表明灭活的病毒液已完全灭活。
将经β-丙内酯灭活的BRV疫苗与201佐剂等量混匀后，使其充分乳化后制成灭活疫苗，观察疫苗为颜色均一的乳白色悬液，将灭活疫苗离心5000r/min 5min后未见分层，表明疫苗可用于后续试验。
6只BALB/c小鼠(体重约16g，3月龄雌鼠)皮下注射150ul的灭活疫苗(RVA/Yak-tc/CHN/HB-3/2021/G10P[11])，2只阴性对照皮下注射150ul的PBS，免疫2次。免疫后每7d采集小鼠血并分离血清。
轮状病毒疫苗样品免疫效力分析
为了解轮状病毒疫苗样品的免疫原性情况，用微量中和试验对小鼠高免血清进行中和抗体效价测定。将56℃30min灭活的待检血清用DMEM按2倍倍比稀释后加入96孔细胞培养板中，每孔加入25ul；将激活后的轮状病毒原液用DMEM稀释至200TCID50，后每孔加入25ul，充分混匀后放入37℃培养箱1h；按常规方法处理、消化，制备细胞悬液，后在96孔板中每孔加入25ul的细胞悬液。混合后于37℃温箱培养观察，并设置阴、阳性对照；后用Reed-Muech法计算血清中和效价(详见表3)。
表3 BRVA分离株中和效价
通过中和试验结果可知，小鼠在二免7d后就能产生对RVA/Yak-tc/CHN/HB-3/2021/G10P[11]分离株的抗体，其中和抗体效价可达1:1250，而阴性对照无抗体产生，表明该毒株可作为BRV疫苗的候选毒株。
上述说明并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.牦牛轮状病毒(Bovine Rotavirus)分离株，其特征在于，所述病毒分离株保藏编号为CCTCC NO:V202244。
2.权利要求1所述的牦牛轮状病毒分离株在制备牦牛轮状病毒诊断试剂中的用途。
3.权利要求1所述的牛轮状病毒分离株在制备预防牛轮状病毒感染的疫苗中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疫苗选自灭活疫苗、弱毒疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗中的一种或几种。
5.一种疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1所述的牦牛轮状病毒分离株和药学上可接受的载体或辅料。
6.权利要求5所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，将灭活后的病毒液和佐剂制备成灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用β-丙内酯灭活病毒液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，灭活的病毒液：佐剂＝1：1。
9.一种制品，其包含在无菌小瓶、安瓿或注射器中的权利要求1所述病毒分离株或权利要求5所述的疫苗组合物。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988170A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-05-04 | 吉林正业生物制品股份有限公司 | 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用 |
| CN108690126A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-23 | 西南民族大学 | 一种牦牛源轮状病毒重组vp6蛋白抗原与应用 |
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| KR20210038171A (ko) * | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011056175A1 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Intervet International B.V. | Methods of immunizing pregnant heifers at three months of gestation |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN108690126A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-23 | 西南民族大学 | 一种牦牛源轮状病毒重组vp6蛋白抗原与应用 |
| KR20210038170A (ko) * | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물 |
| KR20210038171A (ko) * | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Comparison of antigenicity between recently isolated bovine rotaviruses A and vaccine strains by cross-neutralizing antibody tests and their significance for immunization;Md Amirul HASAN等;《Journal of Veterinary Medical Science》;20230103;第85卷(第31期);第318-325页 * |
| High prevalence and genomic characteristics of G6P[1] Bovine Rotavirus A in yak in China;Nan Yan等;《J Gen Virol》;20200731;第101卷(第7期);第701-711页 * |
| Whole genome characterization of reassortant G10P[11] strain (N155) from a neonate with symptomatic rotavirus infection: Identification of genes of human and animal rotavirus origin;Ramani S等;《Journal or Clinical Virology》;20090731;第45卷(第3期);第237-244页 * |
| 奶牛源G10P[11]型A群轮状病毒的分离鉴定;卜娴等;《四川畜牧兽医》;20220615;第49卷(第6期);第35-37页 * |
| 抗轮状病毒牛初乳治疗轮状病毒性肠炎的初步研究;郁凯明, 刘在勇, 沈晓明, 陈俊仪, 蒋明华, 黄心蕊, 钱龙华;中华儿科杂志;19970716(第07期);第353-355页 * |
| 牦牛源G6P[5]型A群轮状病毒的分离鉴定及其基因组特征研究;熊攀芝;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》;20230315(第3期);第1-65页 * |
| 牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用;周芳;岳华;张斌;李凡;陈曦;汤承;;畜牧兽医学报;20160719(第07期);第1465-1473页 * |
| 犊牛病原性腹泻及疫苗研究进展;郭沈涛等;中国畜牧兽医;20171220(第12期);全文 * |
| 猪A群轮状病毒RVA/Pig-tc/CHN/SWU-1C/2018/G9P[13]株的分离与鉴定;李玉;穷达;张敏;阚蕊慈;汤承;岳华;张斌;;中国预防兽医学报;20191115(第11期);第90-93页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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