KR102239927B1 - 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물 - Google Patents

불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 소 로타바이러스 백신주, 더욱 상세하게는 G6P[5]형의 소 로타바이러스 백신주 및 이의 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물{Vaccine Composition Containing Inactivated Bovine Rotavirus}
본 발명은 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 G6P[5]형의 소 로타바이러스 백신주, 및 이의 불활화된 바이러스를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.
소 로타바이러스는 송아지 바이러스성 설사병의 주요 원인체 중 하나이며, 임상 증상으로는 수양성설사, 우울감, 식욕부진과 탈수증세가 나타난다. 전세계적으로 로타바이러스는 사람뿐만 아니라 소, 돼지 등의 다양한 동물에서 심각한 신생축의 설사병을 유발하는 바이러스이며 종간 전파가 용이하여 다양한 혈청형을 가지고 있다.
소 로타바이러스는 레오바이러스과(Reoviridae Family)에 속하고 여섯 개의 바이러스 구조 단백질(Structural Protein, VP1-4, VP6-7)과 다섯 개의 비구조 단백질(NSP1-5)을 발현하는 11개의 분절을 가진 이중나선 RNA(dsRNA)로 구성되어있다. 이 중 두 개의 바깥쪽 켑시드(Capsid) 단백질인 VP4와 VP7은 숙주 동물에게 있어서 소 로타바이러스 감염을 방어하는데 필수적인 중화항체를 일으키는데 중요한 역할을 하며 각각 P 와 G 유전형(Genotype)으로 분류된다. 이러한 유전형은 백신 후보주 선발시 적합성 부분을 결정하는 주요한 요인이 된다. 일반적으로 소 로타바이러스에서 다발하는 G 유전형은 G6, G8 및 G10이며, P 유전형은 P[1], P[5] 및 P[11]으로 보고되어 있다.
소 로타바이러스의 주요 전파경로는 분변에서 경구감염으로 이루어지며 1주령 미만의 어린 송아지에서 주로 감염되며 대부분 2~3일간의 심한 유백색 설사와 급격한 탈수 증상을 보이며 예후가 좋지 않다. 반면에 1개월 이상 된 송아지에서는 감염되어도 증상이 심하지 않으며 대증요법 치료에 의해서 쉽게 호전된다. 병변은 소장에 한정되며, 병리조직학적으로 관찰해 보면 장융모 상피세포의 팽대, 변성 및 탈락 등이 보이며 계절적으로 늦겨울부터 초봄까지 심하게 나타나는 경향이 있다.
종래 기술에 따르면, 소의 분변 시료로부터 분리한 해외 유행주 소 로타바이러스의 유전형을 규명한 바 있고(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2), 소 로타바이러스로부터 유래되는 특정 (폴리-)펩티드를 유효성분으로 함유하는 백신을 이용하여 숙주 동물에서의 면역력을 향상시킨 내용이 개시되어 있기는 하나(특허문헌 1), 백신 제조에 사용되는 불활성화제의 종류에 따라 숙주 동물에서의 백신 면역형성능이 상이하다고 개시되어 있고(비특허문헌 3), 로타바이러스는 숙주 동물 및 각 혈청형에 따라 서로 교차방어가 되지 않는 특징으로 인하여 현재까지 규명된 모든 혈청형에 대한 감염을 효과적으로 방어하기 위한 백신 개발은 매우 어려운 실정이다(비특허문헌 4).
우리나라에서는 소 로타바이러스 예방을 위해서 이미 2000년 이전에 P44 (G6P[1])주와, 678(G10(8)P[11])주를 이용한 백신이 개발되어 축산계에서 적용되고 있으나 최근 전문가들 및 일선 농가에서는 이러한 백신주들의 효능이 저조한 것으로 나타나 여러 차례 백신 효능에 대한 의문을 제기해 왔다. 다시 말하면 소 로타바이러스 백신은 백신 개발 당시의 유행주에 맞추어 개발되어있기 때문에 시간이 지날수록 해당 백신에 의해 방어되지 않은 다른 유전형의 소 로타바이러스 종들이 점점 증가하여 우세해지는 경우가 있기 때문이다.
2017~2018년까지 전국적으로 실시한 소 설사분변에서의 소 로타바이러스 유전형 모니터링 사업을 진행한 결과 소 로타바이러스 G6P[5]형이 80% 이상으로 검출되어 우리나라에 만연해 있는 소 로타바이러스 유전형이 기존의 백신주와 상이하여 기존 백신주의 방어능이 저조한 것을 확인하였다. 이에 국내에 널리 분포되어 있는 소 로타바이러스들의 효과적인 방어 및 예방을 위해서 현재 유행하는 타입의 바이러스들의 특성을 분석하여 새로운 백신을 개발하여야 하는 필요성이 대두되었다.
한국 공개특허 제10-2014-0041067호(2014년 4월 4일)
da Silva Medeiros et al., Arch Virol., 160(2):447-451, 2015 Otto PH et al., Veterinary Microbiology, 179(3-4):168-176, 2015 Zissis G et al., J. Infect Dis., 148(6):1061-1068, 1983 Glass RI et al, J Infect Dis., 192 Suppl 1:S160-166, 2005
본 발명의 주된 목적은 현재 우리나라 전역에서 유행하나 기존의 백신주로는 효과적인 방어가 어려운 소 로타바이러스 유전형, 보다 구체적으로 G6P[5]형의 소 로타바이러스에 대한 효과적인 신규 소 로타바이러스 백신주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 신규 소 로타바이러스 백신주를 이용한 소 로타바이러스 예방용 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 한우농가 및 젖소농가에서 소 로타바이러스 감염의 의해 계속하여 발생되는 감염우의 발생을 줄이는 해결방안을 모색하기 위하여 최근 국내 소 로타바이러스 유행주들의 유전형들의 분포와 교차 방어능에 대해 조사한 다음, 소 로타바이러스에 대한 효과적인 방어 항체의 생성을 위해 국내 유행주인 G6P[5]형 소 로타바이러스주에 대한 방어력이 높은 예방 백신을 개발하고자 예의 노력해 왔다. 그 결과, 본 명세서의 실시예 1를 통해 최종 선별된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 수탁번호 KCTC18739P로 수탁기관에 수탁(기탁)할 수 있었고, 상기 수탁된 백신주를 본 명세서의 실시예 2를 통해 불활화한 다음, 어쥬번트와 혼합하여 제조한 소 로타바이러스 백신을 소/송아지의 대체 동물인 소형 동물에 접종 시 접종된 소형 동물의 혈청/혈액 내 중화항체 역가가 현저하게 상승하고 장기간 동안 유지(생쥐: 백신 접종 후 5주 이상)되어 소 로타바이러스에 대한 방어 효과가 탁월함을 확인하였다.
본 발명은 신규 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 제공한다. 상기 백신주는 RNA 세그먼트 4(RNA Segment 4)에 위치하는 VP4 유전자가 P[5]형이고, RNA 세그먼트 9(RNA Segment 9)에 위치하는 VP7 유전자가 G6형인 G6P[5] 유전형을 갖는 것을 특징으로 한다.
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본 발명은 또한, 상기 백신주를 유효성분으로 함유하는 소 로타바이러스의 감염 예방 또는 소 로타바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 G6P[5]형의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(KCTC18739P) 백신주, 및 이의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물은 기존 백신 조성물로 해결하지 못했던 국내에서 유행하는 G6P[5] 유전형의 소 로타바이러스에 대한 목적 동물(숙주 동물)의 방어력을 증진시켜, 소 로타바이러스 감염과 관련 질병의 발생을 예방하거나 저지하여 농가의 생산성을 크기 증대시킬 수 있다. 아울러, 본 백신주는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에서 우수한 증식력을 나타내기 때문에, 백신을 용이하게 또 고효율로 대량생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 TF-104 세포에 접종 후 3일째 되는 날에 세포변성 여부를 광학 현미경 하에서 100X 배율로 촬영한 사진을 나타낸 것이다([A] 소 로타바이러스 백신주 17KBR412로 접종된 TF-104 세포; [B] 미접종된 TF-104 세포).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 VP7 유전자의 계통수 분석도(Phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 VP4 유전자의 계통수 분석도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 접종량에 따른 시간대별 증식 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 함유 백신 조성물의 생쥐 접종 시험 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 불활화된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 함유 백신 조성물에 포함된 어쥬번트 종류에 따른 항체가를 그래프로 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
일 관점에서, 본 발명은 신규한 G6P[5]형 소 로타바이러스 백신주, 더 구체적으로 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412에 관한 것이다.
본 발명의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 RNA 세그먼트 4(RNA Segment 4)에 위치하는 VP4 유전자가 P[5]형이고, RNA 세그먼트 9(RNA Segment 9)에 위치하는 VP7 유전자가 G6형인 G6P[5] 유전형을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 VP7 유전자 염기서열은 서열번호 7로 표기되고, 상기 소 로타바이러스 백신주 17KBR412의 VP4 유전자 염기서열은 서열번호 8로 표기되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18739P로 2018년 11월 7일에 수탁되었다.
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다른 관점에서, 본 발명은 불활화(불활성화)된 본 발명의 소 로타바이러스 백신주를 유효성분으로 함유하는 소 로타바이러스의 감염 예방 또는 소 로타바이러스 감염증의 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 신규 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.
공지의 불활화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화(불활성화)될 수 있다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는 불활화 처리를 거친 후, 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포, 가장 바람직하게는 TF-104 세포에 접종하여 3일 이상 계대 배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 백신주는,
(a) 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시켜 수득한 배양물에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법을 통해 제조될 수 있다.
본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 5대 이상의 계대수(Passage Number), 바람직하게는 7~9대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0~1x108.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지는 소 로타바이러스일 수 있다.
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본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 로타바이러스 백신주 배양물의 상층액일 수 있다.
본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 33시간 동안 이루어질 수 있다.
본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 사용할 수 있다.
본 불활화된 소 로타바이러스 백신주 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, Vero 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등을 사용할 수 있고, 소 신장세포로는 MDBK 세포, GBK 세포, FBK 세포 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 MA-104 세포 또는 TF-104 세포를 사용한다.
상기 백신 조성물은 불활성화된 소 로타바이러스 백신주 이외에도, 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트, 항생제, 면역조절제 등을 더 포함할 수 있다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(어쥬번트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클(Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
상기 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 보조제로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50(셉픽(Seppic), 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(셉픽(Seppic), 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴 및 몬타나이드 01 겔로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트이다. 상기 어쥬번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.
상기 백신 조성물에 포함되는 상기 불활화된 바이러스와 어쥬번트의 혼합비율은 부피 기준으로, 5~9 : 1~5, 바람직하게는 6~9 : 1~4, 더 바람직하게는 7~9 : 1~3, 가장 바람직하게는 7 : 3 또는 9 : 1일 수 있다.
상기 백신 조성물에 포함되는 불활화된 바이러스는 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화시킨 것이다.
상기 백신 조성물에 포함되는 항생제로는 겐타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물은 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동-건조, 동결-건조 또는 탈수 형태(단, 투여 전에 제약상 허용되는 비히클(예컨대, 멸균 식염수, 완충액 등)로 재수화 또는 현탁됨)로 제조될 수 있다.
상기 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)로서, 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물(Ruminant)에서 소 로타바이러스 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
상기 백신 조성물은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물의 소 로타바이러스에 대한 면역반응 유도용일 수 있다.
상기 반추동물은 소, 산양, 면양, 사슴, 낙타 및 기린으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "소"란 용어는 수소, 암소, 수송아지, 암송아지, 임신우, 수유중인 암소, 임신우의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 임신중인 암소(임신우), 수유중인 암소, 임신우의 태아 등의 소과 동물이 모두 포함된다.
목적 동물(숙주 동물)의 면역반응 유도를 위한 효과적인 소 로타바이러스 백신 조성물의 용량은 백신 조성물의 성분 및 목적 동물(숙주 동물) 투여 스케쥴에 따라 달라진다. 특히 백신 조성물에 포함되는 소 로타바이러스 백신주의 정확한 용량은 목적 동물(숙주 동물)의 면역반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 양(유효량)을 의미하며, "효과량(유효량)"이란 용어는 백신 조성물이 투여되는 동물에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 백신 조성물의 양을 말한다.
상기 면역반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스, 목적 동물(예컨대, 소)의 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본원 명세서에서, '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로에 의해 소에게 투여하지만, 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구 투여, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 정맥주사, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여), 또는 이들 투여 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직한 투여 경로는 피하 투여 또는 근육내 투여이며, 가장 바람직한 투여 경로는 동물의 목 부분의 근육내 투여이다.
상기 "TCID50(Tissue Culture Infective Dose 50%)"는 바이러스의 "감염유발 단위"로, 세포 또는 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사망시키는데 필요한 양으로 정의된다. 상기 TCID50의 계산방법을 간략하게 설명하면, 먼저 바이러스 시료를 연속계단희석(Serial Dilution)하고 각 희석된 바이러스 시료를 세포배양용 플레이트(예컨대, 96-well plate)의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 숙주세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID50 값을 계산한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 로타바이러스 함유 추정 시료의 소 로타바이러스의 검출 또는 소 로타바이러스 유전형의 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 로타바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 포함하는 소 로타바이러스 함유 추정 시료의 소 로타바이러스의 검출 또는 소 로타바이러스 유전형의 판별용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 추가로 상기 항체와 소 로타바이러스 함유 추정 시료 내 소 로타바이러스, 또는 소 로타바이러스의 파편들(Fragments)간 혼성화되는 반응을 탐지하기 위한 검출시약을 더 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지시약(Labelled Reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성성분이 구비될 수 있다.
상기 표지시약 즉, 표지된 검출시약은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 상기 표지는 예컨대 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타아제, 퍼옥시다아제 등, 보다 구체적인 예로는 염기성 포스퍼타아제와 호스래디시 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase, HRP) 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플루우레세인(Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine) 등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate Latex), 발색 지시약(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color Matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘(Avidin), 바이오틴(Biotin), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 항-FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항-마우스 면역 글로불린 항체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소 로타바이러스 함유 추정 시료의 소 로타바이러스를 검출하고 소 로타바이러스의 유전형을 판별하는 단계를 포함하는 소 로타바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 로타바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법, 방사능면역분석법, 효소결합 면역흡착 검사법, 웨스턴블럿팅, 면역침전분석법, 면역확산분석법, 보체고정분석법, FACS 및 단백질칩 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 접종한 포유동물(단, 인간은 제외), 바람직하게는 반추동물의 혈청으로부터 수확한 항체를 이용하여 소 로타바이러스 함유 추정 시료의 서로 다른 유전형의 소 로타바이러스를 판별하고 검출하는 단계를 포함하는 서로 다른 유전형의 소 로타바이러스에 대한 교차면역반응 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 소 로타바이러스의 판별 또는 검출은 조직면역염색법, 방사능면역분석법, 효소결합 면역흡착 검사법, 웨스턴블럿팅, 면역침전분석법, 면역확산분석법, 보체고정분석법, FACS 및 단백질칩 분석법으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "시료(검체)"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(Biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 소 로타바이러스와 혼합된 시료이거나 소 로타바이러스에 감염된 개체(예컨대, 소 등)의 시료일 수 있으며, 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직(Tissue) 또는 기관(Organ)으로부터 유래될 수 있다.
상기 조직의 대표적인 예로는, 결합 조직(Connective Tissue), 피부 조직, 근육 조직 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(Fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(Medium)도 포함하며, 이는 인간 또는 동물로부터 채취된 시료, 또는 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물과 같은 동물에 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 함유하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 투여하기 위해 제제화된, 본원 명세서에 개시된 면역원성 조성물인 소 로타바이러스 백신주를 포함하는 조성물 및 기타 면역원성 조성물들을 포함할 수 있다.
상기 소 로타바이러스 백신주를 포함하는 면역원성 조성물의 "면역원성"은 소 로타바이러스의 서로 다른 유전형, 특히 유전형 G6P[5]형의 소 로타바이러스에 대해 목적 동물(숙주 동물)에서 면역 반응을 유발하는 소 로타바이러스의 능력(항원으로서의 작용력)을 의미한다. 면역반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역반응, 또는 B-세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도하는 보조 T-세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있다.
특히, "면역원성"이라는 용어는 목적 동물(숙주 동물)에서 면역반응을 유발하는 소 로타바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.
상기 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 목적 동물(숙주 동물)에 도입 시 면역반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있는데, 이와 같은 면역반응은 백신 접종된 목적 동물(숙주 동물)의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화 여부로 검출하되, 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출 가능하다.
소 로타바이러스는 분변-경구 방식으로 소 로타바이러스 감염 개체로부터 다수의 소 로타바이러스 비감염 개체들에게 전파된다. 특히, 소 로타바이러스 감염 징후를 유발하는데 필요한 바이러스 수는 소 로타바이러스의 유전형 및 소 로타바이러스 발생 지역(Origin)의 특성에 따라 바이러스의 병원성 및 동물 무리 전체에 전파되는 속도와 연관이 있는 것으로 보고된 바 있다.
동물의 소 로타바이러스의 감염 여부는 증상학(Symptomology)에 의해 확인될 수 있다. 소 로타바이러스에 감염된 동물의 통상적인 증상으로는 수양성설사, 우울감, 식욕부진, 탈수증세 등이 포함될 수 있으며, 현재까지의 소 로타바이러스 감염증의 진단은 상기 증상들을 기준으로 이루어져 왔다.
그러나 혈청학적 연구에 따르면, 소 로타바이러스로 감염된 소들은 임상적 증후가 나타나지 않더라도, 지속감염(Persistent Infection, PI)이 되어 있는 것으로 보고된 바 있다.
따라서, 소 로타바이러스 감염 동물의 바람직한 확인방법은 증상학에 의존하기보다는 혈청학적 분석방법을 통해 소 로타바이러스 자체의 존재를 검출하는 것이다. 예컨대, 소 로타바이러스 및/또는 소 로타바이러스-감염 동물의 정확한 검출방법으로는 바이러스 분리법(Virus Isolation), 바이러스 역가 측정(Virus Titration), 역전사-중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 조직면역염색법(Immunohistochemistry, IHC), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 효소결합 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 웨스턴블럿팅(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(Protein Chip) 분석법이 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 바이러스 분리법, 역전사-중합효소 연쇄 반응, 조직면역염색법, 효소결합 면역흡착 검사법이 포함된다(Haines et al., Vet. Pathol ., 29(1):27-32, 1992; Homer et al., Vet. Microbiol., 43(1):75-84, 1995).
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물, 가장 바람직하게는 소 또는 송아지에 투여하여 소 로타바이러스에 의한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 임신우 및 임신우의 젖을 먹는 송아지를 포함하는 소에 투여되는 효과량의 백신 조성물은 소 로타바이러스(유전형 G6P[5], 즉 G 유전형이 G6이고, P 유전형이 P[5]인 유전형)와 관련된 질병 및 태아 감염에 대한 효과적인 면역성을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 백신 조성물을 송아지에게 약 1 내지 4주의 간격으로 2회 투여한다. 예를 들어, 제1 투여는 동물이 약 1 내지 약 3개월이 되었을 때 수행된다. 제2 투여는 백신 조성물의 제1 투여 이후 약 1 내지 약 4주 후 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 투여는 교미 5주 전에 수행된다. 제2 투여는 교미 2주 전에 수행된다. 후속 백신 조성물의 투여량의 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 약 6개월이 되기 전에 백신 접종된 동물은 6개월이 된 후 다시 백신 접종되어야 한다. 후속 백신 투여는 바람직하게는 해마다 실시해온 바에 근거하여 수행된다. 효과적인 백신의 투여량은 백신의 성분 및 투여 일정에 따라 좌우된다. 전형적으로, 불활성화된 소 로타바이러스(유전형 G6P[5]) 제제가 백신 조성물에 사용되는 경우, 약 3 내지 4주의 기간 동안 목적 동물(숙주 동물)에 2회 투여될 때 소 로타바이러스(유전형 G6P[5]) 투여량 당 1x105. 0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106. 0TCID50/mL 이상, 더 바람직하게는 1x107. 0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 백신의 양이 효과적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[실시예 1]: 소 로타바이러스 백신주의 제작
[1-1]: 2017~2018년도에 유행한 소 로타바이러스의 모니터링
최근 국내(한국)에서 유행하는 소 로타바이러스 분리를 위해 2017~2018년에 걸쳐 전국에서 183개의 소 설사병 의심 분변 시료를 수집하였다. 상기 수집한 각 시료의 분변 약 2g에 1% 겐타마이신(Gentamicin, Sigma, USA)을 함유하는 1X PBS(Phosphate-Buffered Saline, Welgene, South Korea) 3mL을 첨가하여 현탁시킨 후 3,000rpm에서 약 15분간 원심분리하였다. 그다음, 각 시료의 분변 현탁액(Suspension)의 상층액을 수거한 후 RNA 분리 시약을 이용하여 상기 상층액에 포함된 핵산을 분리(추출)한 다음, RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 통해 소 로타바이러스의 양성반응 여부를 확인하였다.
< RT- PCR 분석방법 >
RT-PCR 분석방법에 필요한 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104), Qiagen Inc., USA), PCR Premix Kit(AccuPower Profi Taq PCR Premix(Cat.No.K-2632), Bioneer Inc. South Korea) 및 cDNA 합성 키트(HelixCript Easy cDNA Synthesis Kit(Cat.No.ECDNA100), Nanohelx Inc., South Korea)를 준비하였다
먼저, RNA 추출 키트를 이용하여 상기 분변 현탁액의 RNA를 분리하고, 상기 분리한 RNA를 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성된 cDNA와 소 로타바이러스 특이적 프라이머(아래 표 1 참조)를 PCR Premix Tube(시험약에 Taq Polymerase 포함)에 첨가한 후, 하기 반응조건으로 PCR을 수행하여 소 로타바이러스에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.
RT- PCR 반응조건
(1) RT: 상기 cDNA 합성 키트 및 상기 분변 현탁액의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
(2) PCR: 상기 합성된 cDNA를 이용하여, [95℃: 5분], [(95℃: 45초; 50℃: 45초; 68℃: 60초) x 40cycle], 및 [68℃: 5분]으로 PCR 반응을 수행하였다.
상기 RT-PCR 반응생성물을 1%(W/V) 겔 상에서 전기영동한 후, 상기 반응생성물의 증폭된 핵산의 분자량을 확인하여 소 로타바이러스에 대한 양성/음성반응을 확인하였다.
표 1은 소 로타바이러스의 VP4 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.
프라이머 명칭 프라이머 염기서열(5' to 3') 유전자 크기 유전자 서열번호
VP4-01-F ATG GCT TCG CTC ATA TAC AGA CAG 1085bp VP4 1
VP4-01-R AAT GCT TGT GAA TCG TCC CA 2
그 결과, 상기 수집된 183개의 소 설사병 의심 분변 시료의 총 개수 중 45%(83개)가 소 로타바이러스에 대한 양성반응을 보이는 것으로 나타났다.
[1-2]: 2017~2018년도에 유행한 소 로타바이러스의 분리 및 선별
[1-2-1] 소 로타바이러스의 분리
상기 소 로타바이러스에 대해 양성반응을 나타낸 83개 각각의 소 설사병 의심 분변 시료에 함유된 소 로타바이러스의 표적 세포에 대한 감염 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 시험을 시료별로 수행하였다.
먼저, 실시예 1의 [1-1]에서 준비한 소 설사병 의심 분변 시료 현탁액의 상층액을 0.45μm의 주사필터(Syringe Filter, Merck)에 통과시켜 세균 등의 불순물을 제거하여 얻은 여과액에 트립신(Trypsin, Sigma, USA)을 첨가하여 트립신의 최종 농도가 10μg/mL이 되도록 하였다. 트립신이 첨가된 상기 여과액을 10μg/mL 트립신이 함유된 α-MEM(Alpha Minimum Essential Media, Cat.No.12571-063, Gibco., USA)을 이용하여 10진 계단 희석(Serial Dilution; [희석율] 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000)한 다음, 36℃에서 약 30분 동안 전처리(pre-incubation)하여 소 로타바이러스 접종액을 준비하였다.
그다음, 10%(V/V) FBS(Fetal Bovine Serum, Biowest, USA) 함유 α-MEM을 이용하여 5% CO2/37℃ 조건하에서 24시간 동안 배양한 TF-104 세포(African Green Monkey Kidney Cells)[5x105. 0cells/well]가 담긴 24-웰 플레이트(24-well plate, Eppendorf, Inc., USA)의 사용된 배지를 제거하고, 상기 계단 희석된 각각의 소 로타바이러스 접종액을 첨가하여 5% CO2/37℃ 조건하에서 약 1시간 동안 TF-104 세포를 접종시켰다. 그다음, 첨가한 소 로타바이러스 접종액을 신선한 배지(5μg/mL 트립신이 함유된 α-MEM)로 교체한 다음, 5% CO2/37℃ 조건하에서 5일간 배양하였다. 이후, 배양된 TF-104 세포의 소 로타바이러스에 의한 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE) 여부는 광학현미경 하에서 확인하였고, 소 로타바이러스에 의한 감염 여부는 아래 면역형광검증법(Immunofluorescence Assay, IFC)을 이용하여 형광현미경 하에서 확인하였다.
< 면역형광검증법 >
면역형광검증법에 필요한 소 로타바이러스에 특이적인 형광항제 시약 키트(VD Pro ROTA FA Reagent(Cat.No.RS-ROT-11), Median Diagnostics, South Korea)를 준비하였다.
먼저, 소 로타바이러스로 감염된 TF-104 세포를 고정제(Fixative)로 처리하여 고정시킨 다음, 상기 키트의 1차 항체인 소 로타바이러스 특이적 단클론항체를 상기 고정된 TF-104 세포와 실온에서 약 1시간 동안 반응시켰다.
그 다음, 상기 1차 항체와 반응시킨 TF-104 세포를 1X 세척용액(1X Washing Buffer)으로 3~5회 세척한 후, 상기 키트의 2차 항체인 FITC로 표지된 항-생쥐 IgG(단클론항체)와 실온에서 약 1시간 동안 반응시킨 다음, 1X 세척용액으로 3~5회 세척하였다. 이후, 상기 1차 항체 및 2차 항체와 반응한 TF-104 세포를 형광현미경(Nikon Ti-S/L-100, Japan) 하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 가장 낮은 희석율인 1:10,000의 소 로타바이러스 접종액으로 감염된 TF-104 세포는 3계대(3rd Passage)부터 변성되어 탈락(Detach)되는 특이한 세포변성효과를 나타내는 것을 광학 현미경 하에서 확인할 수 있었다(도 1의 A, B 패널 참조). 또, 희석율 1:10, 1:100, 1:1,000의 소 로타바이러스 접종액으로 감염된 TF-104 세포에서도 3계대부터 변성/탈락되는 세포변성효과를 확인할 수 있었다(데이터 미제시).
아울러, 희석율 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:10,000의 소 로타바이러스로 감염된 TF-104 세포는 소 로타바이러스 특이적 단클론항체와 반응하여 세포질(Cytoplasm)이 밝은 녹색 형광을 나타내었다(데이터 미제시).
[1-2-2] 소 로타바이러스의 선별
증식능이 우세한 소 로타바이러스의 선별을 위해, 세포변성효과를 나타낸 각 소 설사병 의심 분변 시료로부터 유래된 소 로타바이러스를 TF-104 세포에 적정 바이러스 역가로 감염시켜 8대까지 연속계대배양한 다음, 가장 높은 바이러스 역가를 나타낸 시료의 소 로타바이러스를 선별하였다. 이때, 상기 TF-104 세포의 소 로타바이러스의 감염 및 증식 여부는 상술한 면역형광검증법을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 각 소 설사병 의심 분변 시료로부터 유래된 소 로타바이러스를 24-웰 플레이트의 TF-104 세포[2x105. 0cells/well]에 1x104. 0TCID50/mL의 바이러스 역가로 감염시킨 후, 감염시킨 TF-104 세포를 5% CO2/37℃ 조건하에서 8대 계대배양하였다. 상기 계대배양 시 3회로 동결-해동(Freeze-Thaw) 과정을 거쳐서 각 배양물을 수거한 후 3,000rpm으로 원심분리하여 수거한 상층액을 그다음 계대배양에 사용하였다.
상기 여과된 각 배양물을 10μg/mL 트립신이 함유된 α-MEM을 이용하여 연속계단희석하고 각 희석된 배양물을 96-웰 플레이트의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 TF-104 세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 5% CO2/37℃ 조건하에서 1시간 동안 배양하였다. 그다음, 첨가한 희석 배양물을 신선한 배지(5μg/mL 트립신이 함유된 α-MEM)로 교체한 후, 5% CO2/37℃ 조건하에서 3일간 배양한 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID50 값을 계산하였다.
그 결과, 상기 83개의 소 설사병 의심 분변 시료 유래 소 로타바이러스 중 한 시료는 TF-104 세포 감염 후 8대 연속계대배양 시 가장 우수한 바이러스 역가, 즉 1x107.0TCID50/mL 이상의 높은 바이러스 역가를 나타내는 것으로 확인되어 이를 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412로 명명하였다.
[1-3]: 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 상관계통도 분석
실시예 1의 [1-2]에서 선별한 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 정확한 유전형을 확인하기 위해 아래 표 2에 제시된 각각의 프라이머 쌍(정방향 프라이머[F] 및 역방향 프라이머[R])을 이용하여 실시예 1의 [1-1]에서 분리(추출)한 소 로타바이러스의 RNA에 포함된 VP7과 VP4 각각의 유전자를 실시예 1의 RT-PCR 반응과 동일한 조건으로 증폭시켰다. 이후 증폭생성물의 시퀀싱을 통해 염기서열 분석을 수행하였고, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 외 다른 국내 소 로타바이러스 검출주 및 기존의 백신주와의 상관계통도 분석(Phylogenic tree analysis)을 수행하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 VP7 유전자 계통도의 분석 결과 G6형이었고, VP4 유전자 계통도의 분석 결과 P[5]형인 것으로 확인되었다(소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 VP7 유전자 염기서열: 서열번호 7; 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 VP4 유전자 염기서열: 서열번호 8 참조).
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표 2는 소 로타바이러스의 VP7과 VP4 각각의 유전자를 확인하기 위해 사용된 프라이머 쌍을 나타낸 것이다.
프라이머 명칭 프라이머 염기서열(5' to 3') 유전자 크기 유전자 서열번호
VP4-01-F ATG GCT TCG CTC ATA TAC AGA CAG 1085bp VP4 1
VP4-01-R AAT GCT TGT GAA TCG TCC CA 2
VP7-01-F GGC TTT AAA AGC GAG AAT TT 1062bp VP7 3
VP7-01-R GGT CAC ATC ATA CAA CTC TA 4
VP7-02-F GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G 1062bp VP7 5
VP7-02-R GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG 6
결국, 상기 [1-1] 및 [1-2]의 시험결과와 본 시험결과를 토대로, 2017~2018년에 걸쳐 전국에서 183개의 소 설사병 의심 분변 시료 중에서 소 로타바이러스에 대해 양성반응을 나타낸 83개의 소 설사병 의심 분변 시료로부터 유래된 소 로타바이러스 각각을 TF-104 세포에 적정 바이러스 역가로 감염시켜 8대까지 연속계대배양한 다음, 가장 높은 바이러스 역가를 나타낸 시료의 소 로타바이러스를 선별하여 Bovine Rotavirus 17KBR412로 명명하고 백신주로서 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 11월 7일자로 수탁(기탁)하여 수탁번호 KCTC18739P를 부여받았다.
[1-4]: 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 증식도 확인
실시예 1의 [1-2]에서 선별한 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 증식능을 확인하기 위해서 TF-104 세포에 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 MOI(Multiplicity of Infection, 세포 당 감염되는 바이러스 개수) 기준으로, 서로 다른 초기 접종량, 즉 1 MOI, 0.1 MOI, 0.01 MOI로 접종(감염)시킨 후 시간대별로 바이러스 역가를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 TF-104 접종 후 48시간 전까지 초기 접종량에 비례하여 바이러스 역가가 상승하는 효과가 있었으나, 접종 후 48~72시간이 경과된 시점부터는 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 초기 접종량과 무관하게 모두 최고수준, 즉 1x108.5~1x109.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 나타내었다. 즉, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 매우 낮은 초기 접종량으로도 매우 높은 증식도(Proliferation Rate)를 나타내는 것으로 확인되었다.
[실시예 2]: 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 백신으로서의 평가
[2-1]: 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 이용한 불활화 백신의 제조
실시예 1의 [1-2]에서 선별한 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412의 불활화를 위해서 1x107.0TCID50/mL의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412에 BEI(Binary ethyleneimine)를 9mM의 농도가 되도록 첨가하여 24~33시간 동안 37℃에서 처리하였다. 그다음, BEI의 중화를 위해서 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 첨가하여 실온에서 약 1시간 동안 반응시킨 후에 불활화/안정화 공정을 마무리하였다.
구체적으로, 상기 BEI 처리 방법은, 0.1M BEI를 실시예 1의 [1-2]에서 제조한 1x107.0TCID50/mL의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 배양물에 BEI의 최종 농도가 9mM이 되도록 첨가한 후, NaOH 용액으로 pH8.0으로 조정하여 37℃에서 24~30시간 동안 교반하면서 상기 배양물을 불활화시켰다. 상기 불활화시킨 배양물에 멸균된 20％(W/V) 티오황산나트륨을 최종 농도가 2％(W/V)가 되도록 첨가하고 실온에서 약 1시간 동안 교반하여 BEI를 중화시켰다. 필요에 따라 pH를 7.0~7.5로 조정하여 불활화시킨 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 배양물을 TF-104 세포에 접종하여 바이러스 증식 여부로 불활화 유무를 측정하였다. 상기 BEI는 2-BEA(2-Bromoethylamine Hydrobromide, Sigma, USA)를 0.2N NaOH 용액에 0.1M이 되도록 용해하여 37℃ 항온 수조에서 1시간 처리하여 0.1M BEI로 제조한 것이다(4℃ 보관).
그 결과, 불활화/안정화 공정을 마친 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 TF-104 세포 접종 후 72시간 동안 배양하더라도 세포변성효과가 없는 것으로 나타나 불활화 처리가 완료된 것을 확인하였다(데이터 미제시).
이와 같이 준비한 불활화된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412(소 로타바이러스 항원)에 에쥬번트로 IMS1313, 몬타나이드 01 겔(Montanide01 gel), 또는 카보폴(Cabopol)을 각각 30%(v/v), 10%(v/v) 및 10%(v/v)가 되도록 혼합하여 소 로타바이러스가 불활화된 3종의 백신 후보를 제조하였다.
[2-2]: 불활화된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 함유 백신의 기존 백신과의 교차중화방어능 비교 평가
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실시예 1의 [1-2]에서 선별한 G6P[5]형의 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412는 기존의 국내 소 로타바이러스 백신주인 P44(G6P[1]) 및 678(G10(8)P[11])와는 유전형이 다르므로 기존 백신과의 교차중화방어능의 확인을 위해 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412, 소 로타바이러스 백신주 P44(G6P[1]) 및 소 로타바이러스 백신주 678(G10(8)P[11]) 각각의 백신주를 에쥬번트 IMS1313과 혼합(부피비로, 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 : IMS1313 = 50 : 50)하여 SPF 생쥐(체중: 15~20g) 2마리 각각에 복강내접종법(IP)으로 마리당 0.5mL씩 3주 간격으로 2회 접종한 후에 최종접종 2주 경과 후 각 생쥐의 혈청을 채취하여(도 5 참조), SPF 생쥐 2마리 중 한 마리의 혈청에 함유된 각 유전형별 소 로타바이러스 백신주에 대한 항체의 교차중화방어능을 아래 중화시험법을 통해 평가하였다.
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< 중화시험법 >
1 단계: 먼저, 중화항체시험 실시 하루 전에, TF-104 세포를 96-웰 플레이트(SPL, South Korea) #1에 10%(V/V) FBS 함유 α-MEM을 이용하여 분주한 다음, 5% CO2 및 37℃ 조건하에서 24시간 배양하였다.
2 단계: 10μg/mL 트립신이 함유된 α-MEM을 이용하여 약 56℃에서 약 30분간 비동화 처리한 검사혈청을 2~4,096배까지 2진 희석(Binary Dilution; 2-Fold Serial Dilution)하여 96-웰 플레이트 #2에 한 웰(well) 당 50μl의 혈청희석액을 분주하였다.
3 단계: 소 로타바이러스 백신주의 바이러스 함량(역가)이 200 TCID50/50μl이 되도록 준비한 다음, 상기 2 단계의 혈청희석액이 담긴 웰에 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 약 30분 동안 반응(감작: Sensitize)시켰다.
4 단계: 상기 1 단계에서 24시간 동안 배양한 96-웰 플레이트 #1에 담긴 TF-104 세포를 Serum-Free α-MEM로 1회 세척하였다.
5 단계: 상기 3 단계의 96-웰 플레이트 #2의 각 웰에 담긴 혈청희석액과 바이러스가 혼합된 혼합액을 100μl 용량으로 상기 4 단계의 세척된 TF-104 세포가 담긴 96-웰 플레이트 #1의 각 웰에 옮기고 5% CO2 및 37℃ 조건하에서 약 1시간 동안 반응시켰다.
6 단계: 상기 5 단계에서 반응시킨 TF-104 세포가 담긴 96-웰 플레이트 #1의 각 웰에 Serum-Free, Trypsin-Free α-MEM를 100μl씩 첨가하여 최종 트립신 농도가 5μg/mL가 되도록 한 후 5% CO2 및 37℃ 조건하에서 6일간 배양하였다.
7 단계: 상기 6 단계에서 6일간 배양한 96-웰 플레이트 #1의 TF-104 세포를 고정제로 처리하여 고정시키고, 앞서 설명한 실시예 1의 [1-2-1]의 면역형광검증법에 따라 면역형광염색 후 상기 표지된 TF-104 세포의 형광의 정도를 형광현미경 하에서 관찰하여 교차중화방어능을 평가하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 소 로타바이러스 교차중화능 평가에 따르면, 기존 백신인 소 로타바이러스 백신주 P44(G6P[1]) 또는 소 로타바이러스 백신주 678(G10(8)P[11])로 접종한 생쥐에서 채취한 혈청은 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412에 대해 낮은 중화항체가를 나타내는 것으로 확인되어, 기존 백신주는 국내 유행주에 대한 방어능이 낮은 것으로 확인되었다.
표 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412와, 기존 소 로타바이러스 백신주들의 유전형별 평균 교차중화항체가를 비교한 결과를 나타낸 것이다(항체가 단위: log2).
< 항원 1 >
소 로타바이러스 백신주 P44		 < 항원 2 >
소 로타바이러스 백신주 678		 < 항원 3 >
소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412
소 로타바이러스 백신주 P44 접종 후 채취한 생쥐 혈청 10.50 5.75 7.25
소 로타바이러스 백신주 678 접종 후 채취한 생쥐 혈청 5.75 8.50 5.25
소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 접종 후 채취한 생쥐 혈청 9.25 6.00 10.25

[2-3]: 불활화 백신의 안전성 및 면역원성 평가
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실시예 2의 [2-2]에서 서로 다른 아쥬번트를 이용하여 제조한 불활화된 소 로타바이러스 백신 후보 3종을 SPF 생쥐(체중: 15~20g)에 복강내접종법(IP)으로 마리당 0.5mL씩 3주 간격으로 2회 접종한 후에 최종접종 2주 후에 각 생쥐의 혈액을 채취하여 소 로타바이러스에 대한 중화 항체가를 검사하였다(각 백신 후보에 사용된 생쥐 마리수 = 10). 또한. 접종 전부터 접종 후 5주까지 접종된 생쥐를 임상 관찰하여 소 로타바이러스 백신 후보 3종에 대한 안전성에 대한 평가를 수행하였다(도 5 참조).
그 결과, 표 4 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 백신 후보 3종을 2회 접종 시 임상 증상 등의 위해요소는 없는 것으로 확인되었다. 아울러, 면역원성 평가에서 상기 백신 후보 3종은 어쥬번트의 종류에 상관없이 모두 높은 수준의 중화항체가를 나타내는 것으로 확인되었다(아래 표 4의 평균 항체가는 10마리의 접종 생쥐들로부터 수거한 혈액 시료들의 평균 항체가임).
표 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412를 함유하는 불활화된 백신의 안정성 및 면역원성을 나타낸 것이다(항체가 단위: log2).
접종 백신 접종백신 항원량과 어쥬버트 비율 접종 두수 백신 접종량(mL) 임상관찰 평균 항체가(log2)
IMS1313(30%(V/V) 함유) 70% 30% 10 0.5 정상 8.89
몬타나이드 01 겔(10%(V/V) 함유) 90% 10% 10 0.5 정상 9.50
카보폴(10%(V/V) 함유) 90% 10% 10 0.5 정상 9.75
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18739P 20181107
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Vaccine Composition Containing Inactivated Bovine Rotavirus <130> YPD201812-0039 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP4-01-F <400> 1 atggcttcgc tcatatacag acag 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP4-01-R <400> 2 aatgcttgtg aatcgtccca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7-01-F <400> 3 ggctttaaaa gcgagaattt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7-01-R <400> 4 ggtcacatca tacaactcta 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7-02-F <400> 5 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP7-02-R <400> 6 ggtcacatca tacaattcta atctaag 27 <210> 7 <211> 975 <212> DNA <213> VP7 Gene of Bovine Rotavirus Vaccine Strain 17KBR412(KCTC18739P) <400> 7 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atcttcttga catcgattac attgttgagt 60 tatatcttaa aatcaataac gagaatgatg gactatataa tttacaggtt tctacttata 120 gtgacaatct tggccaccat gataaatgcg cagaactatg gagtaaattt gccaattaca 180 ggttcaatgg atactgcgta tgcaaactct acgcaaagtg agccattttt gacatcaact 240 ctttgcttgt attatcctgt tgaggcatca aacgaaatag ctgatactga atggaaagat 300 actttatcac aactgttctt gacaaaagga tggccaacag gatcggtgta ctttaaagaa 360 tatgctgata tagcggcctt ttcagtggaa ccacaactat actgtgatta taatttagtt 420 ttgatgaaat atgattccac acaggaacta gatatgtctg aattggccga tcttatactg 480 aacgaatggc tgtgcaatcc aatggacata acgctgtatt attatcaaca gactgatgaa 540 gcaaataaat ggatatcaat gggttcttct tgcacagtca aagtgtgtcc attaaataca 600 caaacgcttg gtattggatg tctaataact aacccagaca cgtttgaaac agttgcaaca 660 acggagaagt tagtgattac agatgttgta gatggtatca accataaatt aaacgttaca 720 acagcaacgt gtaccatacg caactgcaaa aaattaggac caagggagaa cgtagcagtt 780 atacaggtag gtggtgcgaa tgttttagac atcacagctg atccaacaac aacaccacag 840 acagagagaa tgatgcgaat aaattggaaa aaatggtggc aagtgtttta cacagtagta 900 gattacgtca accaaataat tcaaacgatg tccaaaagat ctagatcact taattcgtca 960 gcgttctatt acaga 975 <210> 8 <211> 1032 <212> DNA <213> VP4 Gene of Bovine Rotavirus Vaccine Strain 17KBR412(KCTC18739P) <400> 8 tcttatgcag tggatttgtc tgatgagata cagtcagttg gatcagagaa gaaccaacgt 60 gttacagtga atccaggacc atttgcgcag acaggatatg cgccagtgaa ctgggggcca 120 ggtgaagtga atgactcgac tgtggtgcaa cctgtgttgg atggaccgta tcaaccagcg 180 tcgtttgatc taccagtagg aaattggatg ttgctagcgc caacaggacc aggtgtggtg 240 gtagaaggga cggacaattc tggcagatgg ttatctgtaa ttctaattga gccaggtgtc 300 acatcagaga cgagaacgta tacaatgttt ggatcaagta aacaggtgtt agtgtcgaac 360 gtgtccgata cgaaatggaa atttgtcgaa atgatgaaga cgacagttga cggtgattat 420 gcggaatggg gaacattatt gtcggacacc aaactctatg gaatgatgaa atatggagag 480 agactattta tatatgaagg agaaactcca aatgtcacga ccaaaggata cattgtaacg 540 aattatgcat cagttgaggt aaggccatat agtgactttt atataatttc cagatcacag 600 gagtcggcat gcactgagta tataaataac gggctgccac ccatccaaaa taccaggaat 660 gtagtgcctg tggcaatatc atcaagatca attaaacaga gagaagtgca ggctaatgaa 720 gatatcatag tttctaagac ttcactatgg aaagaaatgc aatataatag agatatcata 780 attagattta agtttgataa ttcgataata aaatccggag gtttgggcta taagtgggct 840 gaaatctcat ttaaagccgc aaattatcaa tataattaca taagagatgg agaagaggtt 900 acagcgcaca cgacgtgctc agttaatggt gttaatgatt ttagctttaa cggaggctca 960 ttaccaacgg atttcgcaat atcgagatat gaagtaatta aagaaaattc gtatgtatac 1020 gttgactatt gg 1032

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC18739P로 수탁된 소 로타바이러스 백신주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소 로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대 배양 후, 1x106. 0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 소 로타바이러스 백신주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소 로타바이러스 백신주를 불활화 처리 및 중화화 처리하여 준비한 불활화된 바이러스는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에 접종하여 72시간 이상 계대 배양 시, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 소 로타바이러스 백신주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 불활화 처리는 상기 소 로타바이러스 백신주에 BEI(Binary ethyleneimine)을 처리하는 것이고, 상기 중화화 처리는 상기 소 로타바이러스 백신주에 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 처리하는 것임을 특징으로 하는, 소 로타바이러스 백신주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소 로타바이러스 백신주는 RNA 세그먼트 4(RNA Segment 4)에 위치하는 VP4 유전자가 P[5]형이고, RNA 세그먼트 9(RNA Segment 9)에 위치하는 VP7 유전자가 G6형인 G6P[5] 유전형을 갖는 것을 특징으로 하는, 소 로타바이러스 백신주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 소 로타바이러스 백신주의 VP7 유전자 염기서열은 서열번호 7로 표기되고, 상기 소 로타바이러스 백신주의 VP4 유전자 염기서열은 서열번호 8로 표기되는 것을 특징으로 하는, 소 로타바이러스 백신주.
  7. 수탁번호 KCTC18739P로 수탁된 소 로타바이러스 백신주의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 함유하는 소 로타바이러스의 감염 예방 및 소 로타바이러스 감염증의 치료 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위한 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 IMS1313, 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel), 또는 카보폴(Cabopol)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 상기 불활화된 바이러스와 어쥬번트를 부피 기준으로, 5~9 : 1~5로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 반추동물의 소 로타바이러스에 대한 면역반응 유도용임을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
KR1020190120970A 2019-09-30 2019-09-30 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물 KR102239927B1 (ko)

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