EA034543B1 - Иммуногенная композиция (вакцина) против вируса шмалленберга (sbv), способ ее получения и способ индукции иммунного ответа против sbv - Google Patents

Иммуногенная композиция (вакцина) против вируса шмалленберга (sbv), способ ее получения и способ индукции иммунного ответа против sbv Download PDF

Info

Publication number
EA034543B1
EA034543B1 EA201401352A EA201401352A EA034543B1 EA 034543 B1 EA034543 B1 EA 034543B1 EA 201401352 A EA201401352 A EA 201401352A EA 201401352 A EA201401352 A EA 201401352A EA 034543 B1 EA034543 B1 EA 034543B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sbv
seq
cells
nucleotide sequence
immunogenic composition
Prior art date
Application number
EA201401352A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201401352A1 (ru
Inventor
Велько Николин
Конрад Штадлер
Аксель Лишевски
Александер Брикс
Джеффри П. Ниттел
Катарина Хедвиг Тёпфер
Original Assignee
Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх filed Critical Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Publication of EA201401352A1 publication Critical patent/EA201401352A1/ru
Publication of EA034543B1 publication Critical patent/EA034543B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/12063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области вакцин и лекарственных средств для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний у жвачных животных. Предложены иммуногенная композиция, содержащая инактивированный вирус Шмалленберга (SBV), и вакцина, содержащая данную композицию, которые предназначены для предупреждения или лечения виремии, передачи вируса и пороков развития у новорожденных жвачных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы и козы, индуцированных SBV. Кроме того, предложены способ получения заявленной иммуногенной композиции и основанные на введении данной композиции способы индукции иммунного ответа у животного против SBV, лечения или предупреждения у него инфекции SBV, виремии и пороков развития, обусловленных SBV, а также предупреждения или снижения передачи SBV в стаде животных.

Description

Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретения
Настоящее изобретение относится к области вакцин и лекарственных средств для профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Оно относится, прежде всего, к инактивированным вирусам, которые можно применять в качестве вакцины или лекарственного средства для предупреждения или лечения виремии, переноса инфекции и клинических симптомов, вызываемых вирусом Шмалленберга, прежде всего у новорожденных жвачных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы и козы.
Информация о существующем уровне техники
Новый ортобуньявирус, а именно вирус Шмалленберга (SBV), был открыт в Европе в ноябре 2011 г. После того, как он был впервые обнаружен, количество случаев выявления SBV у овец, крупного рогатого скота и коз резко возросло, при этом в ряде европейских стран было выявлено нескольких тысяч случаев недоразвитых SBV-позитивных по данным ПЦР ягнят и телят (1, 2). Вирус был обнаружен методами метагеномики в институте Фридриха Лёффлера (FLI) в образцах, взятых у коров, у которых были выявлены снижение надоя и лихорадка. Исследованные образцы были собраны на ферме вблизи города Шмалленберг (Северный Рейн-Вестфалия, Германия), и поэтому вирус получил название вирус Шмалленберга (SBV). SBV является представителем рода Orthobunyavirus, относящегося к семейству Bunyaviridae. Он родственен так называемой серогруппе вирусов Симбу (1).
Ортобуньявирусы имеют сегментированный РНК-геном с минус-цепью и в основном передаются насекомыми-переносчиками, такими как мелкие двукрылые насекомые и комары. Три сегмента (S, М и L) генома ортобуньявируса позволяют осуществлять генетическую перегруппировку, которая происходит в естественных условиях и приводит к появлению вирусов с новыми биологическими свойствами (3). Наиболее крупный сегмент L кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу. М-сегменты кодируют вирусные поверхностные гликопротеины Gn и Gc, которые ответственны за слияние с клетками, присоединение вируса и индукцию нейтрализующих антител. Малый S-сегмент кодирует нуклеокапсид N, который также участвует в фиксации комплемента (4). Родственную связь между ортобуньявирусами часто выявляют только путем серологического анализа перекрестной реактивности (5). В эпоху ДНКсеквенирования была проведена дополнительная оценка филогенетических характеристик путем сравнения частичных геномных последовательностей (полноразмерной последовательности N и частичной последовательности Gc гена) (6). Однако доступная и опубликованная информация о геномной последовательности полноразмерных геномов является скудной. Вследствие этого глубокие филогенетические анализы являются затруднительными. Таким образом, подробная и надежная таксономическая классификация SBV не могла быть выполнена. Предварительные исследования продемонстрировали наличие сходства последовательностей М- и L-сегментов с частичными последовательностями вируса AKAV и Aino (AINOV). Ген N является наиболее близкородственным вирусу Shamonda (SHAV) (1).
SBV подобно вирусу Akabane (AKAV) обладает способностью проникать через плацентарный барьер у беременных коров и овец, инфицировать плод и вызывать приводящие к фатальному исходу врожденные дефекты в течение восприимчивой к инфекции стадии беременности (2). Серогруппа Simbu, получившая название по названию прототипного вируса, представляет собой наиболее крупную серогруппу ортобуньявирусов и включает по меньшей мере 25 вирусов, среди которых находятся важные с медицинской точки зрения вирусы, такие как вирус Акабане, вирус Оропуши, Сатупери или вирус Дугласа, большинство из которых могут вызывать пороки развития у новорожденных жвачных животных, но могут поражать также и людей. Например, вирус Акабане вызывает врожденные дефекты у жвачных животных и он циркулирует в Азии, Океании и Африке, в то время как вирус Оропуши ответствен за большие эпидемии лихорадки Оропуши, зооноза, сходного с лихорадкой Денге, в человеческих популяциях в Южной Африке. Вирус Сатупери дал свое название серогруппе Сатупери, к которой относятся также вирус Дугласа и SBV.
SBV был первым ортобуньявирусом из серогруппы Симбу, обнаруженным в Европе. Вирус, повидимому, передается членистоногими-переносчиками. Вероятно, важную роль в переносе играют мокрецы. Согласно современному уровню знаний жвачные животные являются восприимчивыми к заражению SBV. У взрослых животных может развиваться слабое заболевание, если оно имеет место. Однако часто происходит транспланцентарное заражение, и оно может приводить к серьезному врожденному пороку развития позвоночного столба (кифоз, лордоз, сколиоз, искривление шеи) и черепа (макроцефалия, укорочение нижней челюсти), а также к разнообразным порокам развития головного мозга (гидроцефалия, порэнцефалия, гипоплазия мозжечка, гапоплазия ствола головного мозга) и спинного мозга у ягнят, козлят и телят. Инфекция быстро распространяется по большим областям Северо-Западной Европы. К настоящему времени инфекция поразила Бельгию, Германию, Францию, Италию, Люксембург, Нидерланды, Испанию и Великобританию.
Следовательно, SBV представляет собой серьезную угрозу поголовью жвачного скота в Европе, поскольку вакцины в настоящее время отсутствуют.
Таким образом, существует выраженная необходимость в новых вакцинах и лекарственных средствах, позволяющих осуществлять быструю индукцию нейтрализующих антител, для профилактики и лечения вызываемой вирусом Шмалленберга инфекции.
- 1 034543
Описание изобретения
Решение указанной выше технической проблемы достигается с помощью представленных в описании вариантов осуществления изобретения, которые охарактеризованы в формуле изобретения.
Одним из объектов изобретения является иммуногенная композиция, содержащая вирус Шмалленберга (SBV), инактивированный с помощью азиридинового соединения. Причем в ней указанный SBV содержит:
(а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7;
(б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2;
(в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; или (г) их комбинацию.
Кроме того, в иммуногенной композиции указанный SBV может также содержать:
(а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8;
(б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5;
(в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6; или (г) их комбинацию.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения азиридиновое соединение может представлять собой бинарный этиленимин (БЭИ).
Композиция дополнительно может содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Причем указанный по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент выбирается из растворителей, диспергирующих сред, стабилизаторов, разбавителей, консервантов, антибактериальных и противогрибковых средств, агентов для придания изотоничности и замедляющих адсорбцию средств.
В еще одном предпочтительном варианте иммуногенная композиция дополнительно включает гидроксид алюминия, сапонин или их комбинацию.
Вторым объектом данного изобретения является вакцина, предназначенная для лечения или предупреждения у животных инфекции SBV, виремии или пороков развития, обусловленных SBV, а также для предупреждения или снижения передачи SBV в стаде животных, которая содержит указанную иммуногенную композицию и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Третьим объектом данного изобретения является способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии, на которых:
(A) клетки млекопитающих заражают SBV; (Б) культивируют зараженные клетки;
(B) собирают вирусные частицы SBV, продуцируемый указанными клетками;
(Г) инактивируют указанные вирусные частицы с помощью азиридинового соединения.
В предпочтительном варианте данного изобретения клетки млекопитающих представляют собой клетки почки обезьяны, либо ВНК-клетки, а в наиболее предпочтительном - клетки почки обезьяны представляют собой Ma104-клетки или Ма104-АК-клетки, а ВНК-клетки представляют собой ВНК-21клетки.
При этом клетки заражают SBV с величиной M0I, составляющей 0,00001-0,01, а в предпочтительном варианте - с величиной M0I, составляющей 0,0001-0,001.
Как правило, клетки культивируют в среде, содержащей примерно 1-10% FCS, в предпочтительном варианте в среде, содержащей примерно 2-6% FCS. Их культивируют при температуре 25-38°C.
В одном из вариантов осуществления изобретения клетки млекопитающих заражают SBV, который содержит:
(а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7;
(б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2;
(в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; или
- 2 034543 (г) их комбинацию. В другом варианте их заражают SBV, который содержит:
(а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8;
(б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5;
(в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6; или (г) их комбинацию.
Последним объектом данного изобретения является способ индукции иммунного ответа у животного против SBV, лечения или предупреждения у него инфекции SBV, виремии или пороков развития, обусловленных SBV, а также предупреждения или снижения передачи SBV в стаде животных, согласно которому указанному животному вводят казанную иммуногенную композицию.
В предпочтительном варианте осуществления этого способа иммуногенную композицию вводят в виде одной дозы или в виде двух доз.
В контексте настоящего описания понятие индукция иммунного ответа касательно антигена или композиции обозначает развитие гуморального и/или клеточного иммунного ответа у животного на антиген, присутствующий в представляющей интерес композиции.
В контексте настоящего описания понятие предупреждение или снижение, или осуществление предупреждения, или осуществление снижения соответственно означает (но, не ограничиваясь только этим) процесс, который включает введение антигена SBV, а именно, антигена SBV, который включен в композицию, животному, где указанный антиген SBV после введения указанному животному вызывает или способен вызывать иммунный ответ у указанного животного против SBV. В целом, такая обработка приводит к снижению клинических признаков заболевания, вызываемого SBV, или клинических признаков, ассоциированных с заражением SBV соответственно. Более конкретно, в контексте настоящего описания понятие предупреждение или осуществление предупреждения означает, как правило, процесс профилактики, при котором животное подвергают воздействию иммуногенной композиции, до индукции или начала процесса заболевания, вызываемого SBV.
В контексте настоящего описания снижение клинических признаков, ассоциированных с заражением SBV означает (но, не ограничиваясь только ими) снижение количества зараженных индивидуумов в группе, снижение или уменьшение до нуля количества индивидуумов, у которых проявляются клинические признаки инфекции, или снижение серьезности любых клинических признаков, имеющихся у индивидуумов, по сравнению с инфекцией дикого типа. Например, это может относиться к любому снижению патогенной нагрузки, выделения патогена, снижению передачи патогена или снижению любых клинических признаков, симптоматических для заражения SBV, прежде всего, передачи SBV от матери к плоду, или пороков развития, индуцируемых SBV у плода жвачного животного или новорожденного жвачного животного. Предпочтительно указанные клинические признаки у индивидуумов, которым вводят композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, снижают по меньшей мере на 10% по сравнению с индивидуумами, которым не вводили композицию и которые могут подвергаться заражению. Более предпочтительно, клинические признаки у индивидуумов, которым вводят композицию, снижают по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%.
Понятие снижение виремии, индуцируемой SBV (или в другом варианте снижение РНК-емии, индуцированной SBV) обозначает (но, не ограничиваясь только этим) снижение количества вируса SBV, попадающего в кровоток животного, при этом уровень виремии, т.е. количество копий РНК SBV на миллилитр сыворотки крови или количество бляшкообразующих колоний на декалитр сыворотки крови снижают в сыворотке крови индивидуумов, которым вводят композицию, по меньшей мере на 50% по сравнению с индивидуумами, которым не вводят композицию и которые могут подвергаться заражению. Более предпочтительно уровень виремии снижают у индивидуумов, которым вводят композицию, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 99,9%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,99% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99,999%.
В контексте настоящего описания понятие виремия означает, прежде всего, состояние, при котором частицы вируса Шмалленберга размножаются и циркулируют в кровотоке животного, прежде всего млекопитающего или насекомого.
Понятие животное в контексте настоящего описания относится, прежде всего, к млекопитающему или насекомому.
Предпочтительно, указанное в настоящем описании млекопитающее представляет собой жвачное животное. Более предпочтительно указанное в настоящем описании животное выбирают из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец, коз, оленей, лосей, жирафов, бизонов, американских лосей, яков, буйволов, верблюдов, альпак, лам, антилоп, вилорогих антилоп и антилоп нильгау. Наиболее предпочтительно млекопитающее или жвачное животное, указанное в настоящем описании, выбирают из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овец и коз.
Указанное в настоящем описании насекомое предпочтительно выбирают из группы, состоящей из
- 3 034543 мелких двукрылых насекомых, прежде всего, относящихся к Culicoides spp., жалящих мух и комаров.
В контексте настоящего описания понятие пороки развития относится, прежде всего, к пороку развития, выбранному из врожденного порока развития позвоночного столба (кифоз, лордоз, сколиоз, искривление шеи) и/или черепа (макроцефалия, укорочение нижней челюсти), разнообразных пороков развития головного мозга (гидроцефалия, порэнцефалия, гипоплазия мозжечка, гапоплазия ствола головного мозга) и спинного мозга, пороков развития и/или ригидности передних и/или задних конечностей. Более конкретно, понятие пороки развития относится к порокам развития у ягнят, козлят и телят.
В контексте настоящего описания понятие инфицировать (заражать) относится, прежде всего, к процессу приведения в контакт клеток с SBV, например, посредством инокуляции.
Указанное заражение клеток SBV включает, прежде всего, прикрепление вируса к клетке, проникновение вируса в клетку, декапсидацию вириона в цитоплазме, репликацию и транскрипцию вирусного генома, экспрессию вирусных белков и сборку, и высвобождение новых инфекционных вирусных частиц.
В контексте настоящего описания понятие культивирование относится, прежде всего, к поддержанию и предпочтительно росту клеток в пригодных условиях.
В контексте настоящего описания понятие сбор относится, прежде всего, к сбору супернатанта, который содержит вирусные частицы, например, посредством центрифугирования контейнера, содержащего культуру инфицированных вирусом клеток, и последующей декантации клеточного супернатанта.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что SBV сохраняет инфекционность и, следовательно свой антигенный потенциал, в том случае, когда осуществляют его пересев поочередно в клетки насекомых и клетки млекопитающих.
Ниже приведены примеры, которые подтверждают возможность осуществления изобретения, но не ограничивающие его.
Пример 1. Подробное описание первого выделения SBV.
Клетки линии BHK-21 нашли широкое применение для выращивания ортобуньявирусов. Благодаря этому вирус SBV впервые был успешно выделен с использованием указанной клеточной линии исследователями из FLI в ноябре 2011 г. Кроме BHK использовали клетки личинок Culicoides variipennis (обозначены как KC-клетки, полученные из Коллекции клеточных линий для ветеринарной медицины, Институт Фридриха Лёффлера, Грейфсвальд-Инзель Римс, Германия). KC-клетки инкубировали в течение 10 дней с разрушенной путем обработки ультразвуком кровью, разведенной в среде Шнейдера. Затем клетки лизировали путем замораживания и оттаивания. Лизатом инокулировали монослой клеток почки детеныша хомячка-21 (BHK, клон 13). Через 1 ч лизат удаляли и заменяли минимальной эссенциальной средой Игла (ЕМЕМ). Через 5 дней проявлялось выраженное цитопатическое действие, и анализ супернатанта культуры на присутствие нового вируса дал положительные результаты, по данным специфической cRT-q ПЦР (изолят 2) величина Cq составляла примерно 14, при этом величина TCID50 на мл составляла 3х106.
Процесс получения: общее описание.
Процесс получения, описанный ниже, осуществляли, следуя стандартным методам получения, например его осуществляли в стерильных условиях и после проверки соблюдения правильных технологических условий, таких как воздушная фильтрация.
Описание процесса получения.
1. Получение MSV (исходный вакцинный вирус).
Для получения MSV (исходный вакцинный вирус) применяли изолят 2 SBV. Роллер-флаконы, засеянные клетками BHK-21 (5х107 клеток), заражали с величиной MOI, равной 0,0001. После инкубации в течение 54 ч роллер-флаконы замораживали при -20°C, подвергали оттаиванию и центрифугировали при 2000g в течение 5 мин. Собирали супернатант и аликвоты по 1 мл помещали на хранение при -80°C до использования в следующем процессе.
2. Получение антигена SBV.
Клетки линии BHK-21 (рабочая клеточная культура - WCS) хранили в замороженном состоянии в жидком азоте. WCS подвергали оттаиванию и размножали в колбах для клеточных культур (Т-160 см2) с использованием среды ЕМЕМ, дополненной обработанной гамма-излучением 10% FCS. Клетки трипсинизировали с помощью рекомбинантного (не животного происхождения) трипсина. Содержимое одной колбы Т160 обрабатывали трипсином и ресуспендировали в 150 мл среды ЕМЕМ, дополненной 2% FCS. Эту клеточную суспензию использовали для засева одного роллер-флакона (495 см2). Роллер-флаконы, содержащие клеточную суспензию, помещали в инкубатор при 37°C и вращали со скоростью 0,5 об./мин. Через 12-16 ч после посева клетки высевали с плотностью 5х107 на флакон. Заражение осуществляли с величиной MOI, составляющей 0,0001. Клетки непрерывно инкубировали при 37°C и вращали со скоростью 0,5 об./мин в течение 50-56 ч до тех пор, пока специфическое цитопатическое действие (ЦПД) SBV не поражало примерно 60-70% клеток. В этот момент времени все роллер-флаконы замораживали при 20°C и затем подвергали оттаиванию в водной бане при 37°C, и помещали на хранение при -80°C до использования в следующем процессе.
- 4 034543
Титрование вируса осуществляли согласно следующей процедуре.
Необходимые материалы:
1. Клетки линии BHK-21 (клон 13).
2. Колбы Т75.
3. Плоскодонные 96-луночные планшеты.
4. Плоскодонные 48-луночные планшеты.
5. 8-канальная матричная пипетка фирмы Thermo + наконечники.
6. 8-канальная пипетка 50-1250 фирмы Eppendorf + наконечники.
7. Резервуар для многоканальных пипеток.
8. Трипсин + ЭДТК.
9. Среда ZB5.
10. Пипетки 5, 10 и 25 мл.
11. Пипеточный дозатор типа Pipetboy.
12. Инвертированный микроскоп.
Процедура.
Обрабатывают трипсином содержащиеся в колбе Т75 клетки с высокой степенью конфлюэнтности и осторожно ресуспендируют в 20 мл среды (10% FCS).
Добавляют 100 мл среды (0% FCS) и хорошо перемешивают.
Полученную клеточную суспензию сливают в резервуар для многоканальных пипеток.
С использованием многоканальной пипетки вносят по 100 мкл клеточной суспензии в лунки первых 8 столбцов 96-луночных планшетов.
Помещают планшеты в CO2-инкубатор при 37°C в атмосферу на 6-12 ч для того, чтобы дать клеткам прикрепиться.
По истечении указанного периода времени подготавливают 48-луночные планшеты и в каждую лунку вносят по 1080 мкл бессывороточной среды.
Лунки первой колонки инокулируют 120 мкл предназначенного для титрования материала.
Сначала перемешивают содержимое в лунках первой колонки, которые инокулировали материалом, с использованием 8-канальной пипетки Эппендорф с программой Р/М (четыре раза осуществляют пипетирование 120 мкл и смешение 620 мкл).
Удаляют наконечники.
Из лунок первой колонки забирают пипеткой (с новыми наконечниками) по 120 мкл, вносят в лунки второй колонки и перемешивают.
Удаляют наконечники.
Повторяют указанный процесс, пока не заполнят последнюю колонку.
С использованием матричной пипетки аспирируют 800 мкл из первого ряда 48-луночного планшета (который содержит серийный разведения одного образца).
При присоединении наконечников их необходимо зажимать плотно, но не слишком сильно, иначе функция матрицы не будет выполняться.
Распределяют по 100 мкл в 8 рядов 96-луночного планшета.
Инкубируют при 37°C в течение 3-4 дней.
Считывают результаты с использованием инвертированного микроскопа. 3. Препараты вакцины
3.1. Процедура инактивации.
Процесс инактивации конечного антигена длился в общей сложности 72 ч, применяемая концентрация БЭИ составляла 15 мМ. Конечный антиген инактивировали путем добавления 0,1 М БЭИ в соотношении 100 мл на 1 л предназначенного для инактивации антигена (конечная концентрация 10 мМ). После добавления БЭИ смесь гомогенизировали в течение по меньшей мере 15 мин и проверяли значение рН. После осуществления процесса гомогенизации смесь сливали в стерильный контейнер, который выдерживали при перемешивании при 37±1°C в течение 24 ч. Через 24 ч осуществляли вторую инактивацию конечного антигена путем добавления 0,1М БЭИ в соотношении 50 мл на 1 л подлежащего инактивации антигена (конечная концентрация 5 мМ). После второго добавления БЭИ процесс повторяли в тех же самых условиях, которые описаны выше для первого добавления, но смесь выдерживали при перемешивании в течение 48 ч.
3.2. Нейтрализация оставшегося БЭИ.
После завершения процесса инактивации добавляли 1 М раствор тиосульфата натрия в соотношении 5 мл на 1 литр инактивированного антигена (конечная концентрация 5 мМ) для нейтрализации БЭИ. После гомогенизации смеси проверяли значение рН. При необходимости осуществляли регулирование рН с помощью соляной кислоты, доводя его значение до 7,2±0,2.
3.3 Адъюванты.
В качестве адъювантов применяли Alhydrogel (гидроксид алюминия) и Quil-A (сапонин).
4. Эксперимент по проверке концепции на крупном рогатом скоте.
Эксперимент осуществляли с использованием восемнадцати (18) голов крупного рогатого скота
- 5 034543 возрастом 7 месяцев. Животных разделяли на четыре группы по четыре животных в каждой группе, а оставшиеся два животных служили в качестве контролей контакта. Все животные при начале эксперимента были серонегативными по SBV. Первую группу (четыре животных) вакцинировали, применяя вакцину в дозе, соответствующей ГОТВзо/мл 106 SBV, вторую - ТСГОзо/мл 105 SBV, третью - ГОТВзо/мл 104 SBV и, наконец, четвертую группу не вакцинировали, так же как и оставшихся двух животных, служивших в качестве контролей контакта. В каждой группе 4 животных вакцинировали путем подкожного введения (2 мл) и спустя 3 недели осуществляли ревакцинацию. Всех животных, на которых проводили опыт, за исключением животных, служивших в качестве контролей контакта, подвергали контрольному заражению через две недели после ревакцинации (доза контрольного заражения, соответствующая TCIB50 107 живого вируса/животное). У всех невакцинированных животных развивалась виремия после контрольного заражения SBV, начиная со дня 3 (dpi, дни после заражения), и она продолжалась в течение 2-3 дней. У вакцинированных животных по сравнению с невакцинированными животными уровень виремии был существенно ниже, и он не сопровождался клиническими симптомами после контрольного заражения SBV.
Пример 2.
1. Введение.
В этом опыте получали несколько препаратов инактивированной вакцины и затем тестировали на овцах и крупном рогатом скоте в отношении их способности индуцировать нейтрализующие антитела и предупреждать виремию после экспериментального контрольного заражения. Материалы и методы.
Вакцины.
Получали пять различных прототипов препаратов вакцины (табл. 1); все они представляли собой препараты инактивированного SBV в водном растворе. SBV выращивали либо на двух различных линиях клеток почки детеныша хомячка (BHK-21) (вакцины BHKCT-HT, BHK13-HT, BHK13-LT), либо на клетках линии MA-104 (вакцины MA-HT и MA-LT).
Концентрацию антигена получали с использованием инфекционного титра SBV до инактивации бинарным этиленимином (БЭИ), применяя либо длинный (с использованием 10 мМ БЭИ в течение 72 ч при 37°C), либо короткий (с использованием 2 мМ БЭИ в течение 12 ч при 37°C) протокол.
Вакцины-кандидаты содержали антиген в следующих концентрациях: TCIB50/мл (средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% животных, на мл) 6,1 log10 (МА-НТ) или TCIB50/мл 5,7 log10 (BHKCT-HT, BHK13-HT, MA-LT) или TCIB50/мл 4,7 log10 (BHK13-LT). В качестве адъювантов применяли сапонин и гидроксид алюминия (0,125 мкг сапонина на 1 мл и 6,65 мг гидроксида алюминия на 1 мл для всех препаратов вакцин-кандидатов). Все препараты тестировали в отношении отсутствия бактериального загрязнения и применяли в двух повторностях для осуществления успешной инактивации путем двух пересевов с использованием клеток линии BHK-21. Значения рН для каждого прототипа вакцины доводили до 6,8-7,2 при 20°C. Вакцины хранили при 4°C до применения. Таблица 1. Вакцины и группы животных
Вакцины Животные
Название Линия клеток Применяемый Инактивация Группа Количество инфекционный титр животных животных
ВНКСТ-НТ
ВНК-21, клон
СТ
5,7 loglO ТСЮ50/мл «длинный» протокол
А(овца)
S01 - S05
ВНК13-НТ
ВНК-21, клон
5,7 loglO ТСЮ50/мл
BHK13-LT
ВНК-21, клон
4,7 loglO ТСЮ50/мл
МА-НТ
МА-104
6,1 loglO ТСЮ50/мл «короткий» протокол «короткий» протокол «короткий» протокол
G(корова)
В (овца)
С (овца)
D (овца)
MA-LT
МА-104
5,7 loglO ТСШ50/мл «длинный» протокол
Н(корова)
Е (овца)
С01 - С06
S06 - S10
Sil - S15
S16 - S20
С07 - СЮ
S21 - S25 невакцинированный контроль
I(корова)
F(овца)
СП - С16
S26 - S30
К(корова)
С17 - С22
Животные.
Двадцать пять не инфицированных SBV овец европейской домашней породы (возрастом 7-9 месяцев) распределяли на 5 групп по 5 животных в каждой, которые одновременно иммунизировали путем подкожного введения одного из прототипов вакцины (см. табл. 1). Другие 5 овец служили в качестве невакцинированных контролей. Самцов и самок животных распределяли по группам поровну.
Кроме того, 22 негативных по антителам к SBV самок коров голштино-фризской породы распределяли на четыре группы по четыре (группа Н) или шесть (группы G, I и K) животных в каждой. Животных в группах G, Н и I иммунизировали путем подкожного введения вакцин BHKCT-HT, MA-HT и MALT
- 6 034543 соответственно. Коровы в группе K служили в качестве невакцинированных контролей. В день первой вакцинации возраст животных составлял от 8 до 12 месяцев.
В каждом случае животных вакцинировали дважды с интервалом в три недели и после второй вакцинации инокулировали как вакцинированным, так и контрольным животным по 2x0,5 мл полевого штамма SBV, который пересевали только в его естественного хозяина. На протяжении всего опыта ежедневно измеряли ректальную температуру, и ветеринары обследовали животных в отношении клинических признаков.
Отбор образцов, ОТ-ПЦР в реальном времени и серологический анализ.
После первой вакцинации брали образцы сыворотки в дни 0, 3, 4, 7 и затем еженедельно. После второй вакцинации образцы сыворотки брали с недельными интервалами. После контрольного заражения образцы сыворотки брали ежедневно в течение первых восьми дней, а затем в дни 14 и 21. Образцы селезенки, миндалин и мезентериальных и нижнечелюстных лимфатических узлов брали при осуществлении аутопсии в дни 22-29 после контрольного заражения и гомогенизировали в 1 мл MEM.
РНК из сыворотки и образцов ткани, взятых при осуществлении аутопсии, экстрагировали с использованием набора MagAttract Virus Mini M48 для автоматической экстракции (фирма Qiagen, Германия) согласно рекомендациям производителя. Геномную нагрузку SBV определяли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-q ПЦР) (7) с использованием внешнего стандарта на основе сегмента S генома. Кроме того, образцы сыворотки анализировали методом ELISA с использованием поступающего в продажу антитела к SBV (ID Screen® Schmallenberg virus Indirect, фирма IDvet, Франция), применяя рекомендованное отсекающее значение 70% для относительной оптической плотности по сравнению с положительным контролем, и с помощью стандартного анализа микронейтрализации.
Результаты.
Клинические обследования и посмертные обследования.
После осуществления первой вакцинации с использованием прототипов вакцины не было выявлено побочных действий; ни у одного животного не было обнаружено лихорадки или другого клинического признака. После второй вакцинации у одной коровы, иммунизированной вакциной MA-HT (группа H) в течение 2 дней имело место небольшое опухание в области инъекции.
После контрольного заражения у одной невакцинированной коровы развилась лихорадка в день 3, у другой была обнаружена слабая диарея, продолжавшаяся три дня. У одного животного в группе I в течение одного дня имели место назальные выделения.
При аутопсии животных не было выявлено никаких значительных макроскопических повреждений. Мезентериальные лимфатические узлы у всех невакцинированных животных, кроме одного (S30), имели позитивный по данным ПЦР статус; в среднем было обнаружено 2,86Е+03 геномных копий на мг (копий/мг). Кроме того, РНК SBV была обнаружена в нижнечелюстных лимфатических узлах у 3 из 5 невакцинированных овец (S27-S29) и у всех контрольных коров (в среднем 2,68Е+01 копий/мг), в миндалинах у S27-S29 и у С18-С20 (в среднем 9,90Е+01 копий/мг) и в селезенке у 4 из 5 невакцинированных овец (S26-S29; в среднем 4,57Е+03 копий/мг) и у двух контрольных телят (С17, С21; в среднем 1,40Е+01 копий/мг). Ни у одного из вакцинированных животных вирусная РНК не была обнаружена.
Гуморальный иммунный ответ.
В день первой вакцинации все животные имели негативный статус по данным обоих серологических анализов.
До осуществления контрольного заражения у невакцинированных животных антитела не были выявлены. Через три недели после заражения было установлено, что все контрольные овцы и коровы, за исключением одного животного (S30), имели позитивный статус по данным анализа нейтрализации. Антитела были обнаружены также методом ELISA у коров и у 2 из 5 невакцинированных овец (S26, S29). Несмотря на более высокую ОП образца по отношению к величине ОП положительного контроля (S/P), по данным ELISA обе контрольные овцы S27 и S28 имели негативный статус.
Через три недели после первой иммунизации вакциной ВНКСТ-НТ, BHK13-HT или BHK13-LT (SBV выращен на BHK-клетках) все овцы и коровы имели негативный статус по данным ELISA, в то время как у S07, S08, S10 (BHKCT-HT) и S04 (BHK13-HT) были выявлены низкие титры антител по данным анализа нейтрализации. После второй вакцинации антитела были выявлены при проведении по меньшей мере одного серологического анализа, в большинстве случаев было обнаружено значительное увеличение нейтрализующий антител. Через три недели после контрольного заражения 8 из 15 овец (S04, S06, S07, S09, S10, S11, S12, S15) и 5 из 6 коров (С01-С05) имели позитивный статус по данных обоих анализов, 7 овец (S01-S03, S05, S08, S13, S14) и оставшаяся корова (С6) имели позитивный статус только по данным теста на нейтрализацию, a S15 - по данным только ELISA.
После одной иммунизации вакцинами МА-НТ или MA-LT (SBV выращенный на МА-104-клетках) все коровы и все овцы за исключением двух имели негативный статус по данным обоих серологических анализов. По данным анализа нейтрализации S22 и S23 имели титры 1:5 и 1:7 соответственно. После второй вакцинации у S19, S24, С08 и С14 антитела не были обнаружены. S16, S21, С07, С09 и С10 имели
- 7 034543 позитивный статус по данным обоих серологических анализов, в то время как остальные животные имели позитивный статус по данным только анализа нейтрализации. Через три недели после контрольного заражения все овцы в группе D и 4 из 5 овец в группе Е имели позитивный статус по данным анализа нейтрализации, у животного S16 антитела не были обнаружены методом ELISA, а животное S24 имело негативный статус по данным обоих анализов. У всех коров в группе Н (высокий титр SBV) оказалось возможным выявить антитела как с помощью ELISA, так и с помощью анализа нейтрализации. Такой же результат был получен для С12 и С13 (группа I, низкий титр SB), C11, С15 и С16 имели позитивный статус только по данным анализа нейтрализации, а у C14 ни один из тестов не выявил присутствие антител.
После второй иммунизации было выявлено повышение средних титров нейтрализующих антител, при этом после контрольного заражения в большинстве случаев нейтрализующие титры оставались на постоянном уровне во всех вакцинированных группах.
ОТ-ПЦР в реальном времени.
После первой вакцинации геном SBV не был обнаружен ни у одного животного (данные не представлены), что подтверждает успешность инактивации SBV, проведенной путем как короткой, так и длинной процедуры инактивации БЭИ.
После контрольного заражения все невакцинированные овцы, кроме одной (S30), имели позитивный статус по данным OT-q ПЦР в период между днем 2 и днем 4 (S27-S29) или 5 (S26). У 1 из 6 невакцинированных коров (С19) геном SBV оказалось возможным впервые обнаружить в день 1 после заражения, остальные 5 телят впервые были оценены как имеющие позитивный статус в день 2. Геном SBV можно было обнаружить вплоть до дня 5 (С17, С19-С21), 6 (С22) или 7 (С18). Три из 6 коров, иммунизированных вакциной MA-LT (С12, С13, С16), имели позитивный статус по данным OT-q ПЦР в день 3, в то время как у животных, вакцинированных вакцинами МА-НТ, РНК-емия (присутствие РНК в крови) не развилась после контрольного заражения.
В образцах сыворотки, взятых у всех вакцинированных овец, у контрольной овцы S30 и у всех коров из групп G и Н (группы, обработанные вакциной с высоким титром) вирусная РНК не была обнаружена после контрольного заражения.
Заключение.
Было создано пять различных препаратов инактивированной вакцины, после чего они были протестированы на коровах и овцах. В экспериментах ни у одного из животных не были выявлены значительные побочные действия, и у всех животных имела место сероконверсия после вакцинации. Кроме того, у большинства, но не у всех, животных после вакцинации возникали поддающиеся обнаружению уровни антител, нейтрализующих SBV. Важно отметить, что РНК-емия после контрольного заражения полностью предупреждалась при применении четырех прототипов вакцины и значительно снижалась при применении пятого прототипа. Эти данные позволяют сделать предположение о том, что защита от вирусной инфекции лишь частично опосредуется нейтрализующими антителами, и что существуют дополнительные еще не изученные механизмы, наиболее вероятно ассоциированные с клеточным иммунитетом, которые вносят существенный вклад в клиренс вируса после контрольного заражения SBV. Двумя главными характеристиками инактивированных вакцин являются: (I) полная инактивация инфекционного вируса, что продемонстрировано путем осуществления пересевов с использованием клеточных культур и установлением отсутствия РНК-емии после первой иммунизации, и (II) индукция защитного иммунитета. Хотя нейтрализующие антитела не были обнаружены у каждого из вакцинированных животных до контрольного заражения, РНК-емия полностью предупреждалась при применении четырех прототипов вакцины и значительно снижалась при применении пятого прототипа. В рассматриваемом опыте обнаружение вирусной РНК в лимфоретикулярной системе применяли в качестве диагностического инструмента, отличного от выявления РНК-емии. В отличие от контролей, все вакцинированные животные имели четко выраженный негативный SBV-РНК-статус в лимфоидной системе (в лимфоидных органах в момент проведения аутопсии), а также мезентериальных лимфатических узлов. У одной невакцинированной контрольной овцы не было выявлено ни РНК-емии, ни положительных результатов OT-q ПЦРанализа образцов ткани, ни сероконверсии после контрольного заражения, причина таких результатов остается невыясненной. Возможными объяснениями могут являться неудачная инъекция или статус (естественный) устойчивости к заражению SBV.
Тем не менее, отсутствие обнаруживаемой РНК в большинстве обработанных вакциной групп позволяет сделать вывод о том, что даже в том случае, когда нельзя обнаружить вирусные геномы (в сыворотке), это не означает, что вирус, вводимый при контрольном заражении, не может передаваться в плод.
Хотя вакцинация позволяет предупреждать или заметно снижать РНК-емию, антитела не были выявлены у каждого животного в каждом тесте до контрольного заражения. В целом, наблюдалась более выраженная корреляция между результатами анализа методом ELISA и результатами анализа нейтрализации для образцов, взятых у коров, чем для образцов, взятых у овец, прежде всего, после контрольного заражения невакцинированного животного.
Наиболее высокие уровни антител во всех группах овец были выявлены при анализе нейтрализации после контрольного заражения невакцинированных овец. Такой же результат был получен после иммунизации несколькими вакцинами против лихорадки долины Рифт и последующего контрольного зараже- 8 034543 ния (8), однако, в этом случае применяемые вакцины не обеспечивали абсолютный иммунитет, а приводили лишь к снижению виремии. В отличие от этого, прототипы вакцины против SBV, охарактеризованные в опыте, проведенном при создании настоящего изобретения, полностью предупреждали РНК-емию у овец, несмотря на низкий уровень нейтрализующих антител.
В исследовании, проведенном при создании настоящего изобретения, титры нейтрализующих антител зависели от продуцирующей клеточной линии и вирусного титра до инактивации. Дозовая зависимость для супернатанта клеточной культуры, используемого для получения вакцины, была описана также для AKAV, она имела место вне зависимости от того, применяли инактивированные или ослабленные живые вакцины (9; 10). Опубликованы данные о том, что для создания вакцины необходимо количество вируса, составляющее по меньшей мере 105,5 ТСЮ51/мл. Когда применяли 2 мл вакцины, содержащей вирус, выращенный на МА-104-клетках, с ТСШ50/мл, составляющей 6,1 log10, то она полностью предупреждала РНК-емию, однако у половины телят, иммунизированных с использованием ТСГО50/мл, составляющей 5,7 log10, вирусный геном можно было обнаруживать в течение одного дня, можно предположить, что сходная минимальная доза может иметь место и в случае SBV. Однако, в случае вакцин, полученных с использованием BHK-21-клеток, более низкий вирусный титр (ТСГО50/мл, составляющая 5,7 log10) полностью предупреждал РНК-емию у обоих видов животных, для овец требовалась величина ТСГО50/мл, составляющая лишь 4,7 log10.
Таким образом, с помощью рассмотренной предназначенной для проверки концепции характеризации различных вакцин-кандидатов удалось продемонстрировать высокую эффективность четырех из пяти прототипов вакцин против SBV для обоих важных видов-мишеней. В результате продемонстрировано, что удалось разработать убитую вакцину против вируса Шмалленберга, которая является эффективной и безопасной для применения на крупном рогатом скоте и овцах. Результаты, полученные в опыте, проведенном при создании настоящего изобретения, свидетельствуют о том, что вакцину на основе инактивированного SBV можно успешно применять для поддержания усилий, направленных на контроль распространения SBV, а также для предупреждения заболевания домашних жвачных животных.
Пример 3.
Ниже описаны альтернативная процедура инактивации и последующий процесс нейтрализации, которые также позволяют осуществлять получение (дальнейшие стадии производства осуществляли согласно процедуре, описанной в примере 1) эффективной вакцины для успешного предупреждения заражения SBV:
Процедура инактивации.
Процесс инактивации конечного антигена продолжали в общей сложности в течение 12 ч, применяемая концентрация БЭИ была равна 2 мМ. Конечный антиген инактивировали путем добавления 0,17М БЭИ в соотношении 11,9 мл на 1 литр подлежащего инактивации антигена (конечная концентрация 2 мМ). После добавления БЭИ смесь выдерживали при перемешивании в течение 12 ч при 37±1°С.
Нейтрализация оставшегося БЭИ.
После завершения процесса инактивации добавляли 1М раствор тиосульфата натрия в соотношении 10 мл на 1 литр инактивированного антигена (конечная концентрация 10 мМ) для нейтрализации БЭИ.
Пример 4.
Ниже описан альтернативный процесс получения MSV (исходный вакцинный вирус), который также позволяет получать (дальнейшие стадии производства осуществляли согласно процедуре, описанной в примере 1, в то время как процедуру инактивации осуществляли, как описано в примере 3) эффективную вакцину для успешного предупреждения заражения SBV:
5. Получение MSV (исходный вакцинный вирус).
Для получения MSV (исходный вакцинный вирус) применяли изолят 2 SBV. Роллер-флаконы, засеянные Ma104-Ak (5х 107 клеток), заражали с величиной MOI, равной 0,0001. После инкубации в течение 54 ч роллер-флаконы замораживали при -20°С, подвергали оттаиванию и центрифугировали при 2000g в течение 5 мин. Супернатант собирали и аликвоты по 1 мл помещали на хранение при -80°С до использования в дальнейшем процессе.
6. Получение антигена SBV.
Ma104-Ak (рабочий банк клеток - WCS) хранили в замороженном состоянии в жидком азоте. WCS подвергали оттаиванию и размножали в колбах для культур ткани (Т-160 см2) с использованием среды ЕМЕМ, дополненной обработанной гамма-излучением 10% FCS. Клетки трипсинизировали с использованием рекомбинантного (не животного происхождения) трипсина. Содержимое одной Т160-колбы обрабатывали трипсином и ресуспендировали в 150 мл среды ЕМЕМ, содержащей 2% FCS. Эту клеточную суспензию высевали в один роллер-флакон (495 см2). Роллер-флаконы, содержащие клеточную суспензию, помещали в инкубатор при 37°С и вращали со скоростью 0,5 об./мин. Через 12-16 ч после посева клетки высевали с плотностью 5х107 на флакон. Заражение осуществляли с величиной MOI, составляющей 0,001. Зараженные клетки непрерывно инкубировали при 37°С и вращали со скоростью 0,5 об./мин в течение 72-96 ч до тех пор, пока специфическое цитопатическое действие (ЦПД) SBV не поражало примерно 60-70% клеток. В этот момент времени все роллер-флаконы замораживали при -20°С, затем под- 9 034543 вергали оттаиванию в водяной бане при 37°C и помещали на хранение при -80°C до использования в дальнейшем процессе.
В перечне последовательностей:
SEQ ID NO: 1 соответствует полной геномной последовательности сегмента S инфекционного вируса Шмалленберга (ВН80/11-4),
SEQ ID NO: 2 соответствует полной геномной последовательности сегмента М инфекционного вируса Шмалленберга (ВН80/11-4),
SEQ ID NO: 3 соответствует полной геномной последовательности сегмента L инфекционного вируса Шмалленберга (ВН80/11-4),
SEQ ID NO: 4 соответствует последовательности РНК, антипараллельной (т.е. полностью комплементарной и инвертированной) SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 5 соответствует последовательности РНК, антипараллельной SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 6 соответствует последовательности РНК, антипараллельной SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 7 соответствует SEQ ID NO: 1, в которой нуклеотид в положении 9 представляет собой а вместо g, и
SEQ ID NO: 8 соответствует последовательности РНК, антипараллельной SEQ ID NO: 7, и, таким образом, соответствует SEQ ID NO: 4, в которой нуклеотид в положении 831 представляет собой и вместо с.
Ссылки
Все процитированные в настоящем описании ссылки полностью включены в него в качестве ссылки.
1. В. Hoffmann, М. Scheuch, D. Нбрег, R. Jungblut, М. Holsteg, Н.
Schirrmeier, М. Eschbaumer, K.V. Goller, К. Wernike, М. Fischer, A. Breithaupt,
T.C. Mettenleiter, M. Beer, Novel orthobunyavirus in Cattle, Europe, 2011. Emerg.
Infect. Dis. 18, 2012, cc. 469-472.
2. M.-M. Gariglinany и др., Schmallenberg Virus in calf born at term with porencephaly, Belgium Emerg. Infect. Dis. 18, 2012, doi: 10.3201/eidl806.120104.
3. M.D. Bowen и др., A reassortant bunyavirus isolated from acute hemorrhagic fever cases in Kenya and Somalia, Virology. 291, 2001, cc. 185-190.
4. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, под ред. A.M. Q. King, M.J. Adams, E.B. Carstens, E.J. Lefkowitz, издво Elsevier, San Diego, USA, 2011, cc. 725-731.
5. R.M. Kinney, C.H. Calisher, Antigenic relationships among Simbu serogroup (Bunyaviridae) viruses, Am. J. Trop. Med. Hyg. 30, 1981, cc. 1307-1318.
6. M.F. Saeed, L. Li, H. Wang, S.C. Weaver, A.D. Barrett, Phylogeny of the
Simbu serogroup of the genus Bunyavirus, J. Gen. Virol. 82, 2001, cc. 2173-2181.
7. Bilk S., Schulze C., Fischer M., Beer M., Hlinak A., Hoffmann B., Organ distribution of Schmallenberg Virus RNA in malformed newborns, Veterinary microbiology, 30 марта 2012 г.
8. Kortekaas J., Antonis A.F., Kant J., Vloet R.P., Vogel A., Oreshkova N. и др., Efficacy of three candidate Rift Valley fever vaccines in sheep, Vaccine, 30(23), мая 2012 г., cc. 3423-3429.
9. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E., Sato K., Goto Y., Satoda К. и др.,
Development of inactivated vaccine for Akabane disease, National Institute of Animal
Health quarterly; 18(3-4), зима 1978 г., cc. 97-108.
10. Kurogi H., Inaba Y., Akashi H., Takahashi E., Sato K., Satoda К. и др.,
Immune response of various animals to Akabane disease live virus vaccine, National
Institute of Animal Health quarterly; 19(1-2), лето 1979 г. cc. 23-31.
- 10 034543
Перечень последовательностей <110> Бёрингер Ингельхайм Ветмедика ГМБХ <120> Иммуногенная композиция (вакцина) против вируса Шмалленберга (SBV) способ ее получения и способ индукции иммунного ответа против SBV <130> Р01-2825 <160>8 <170> Patentin® version 3.3 <210>1 <211>839 <212> ДНК <213> вирус Шмалленберга <400>1
agtagtgagc tccactatta actacagaaa tatgt caagc caattcattt ttgaagatgt 60
accacaacgg aatgcagcta catttaaccc ggaggtcggg tatgtggcat ttattggtaa 120
gtatgggcaa caactcaact tcggtgttgc tagagtcttc ttcctcaacc agaagaaggc 180
caagatggt с ctacataaga cggcacaacc aagtgtcgat cttacttttg gtggggtcaa 240
atttacagtg gttaataacc attttcccca atatgtctca aatcctgtgc cagacaatgc 300
cattacactt cacaggatgt caggatatct agcacgttgg attgctgata catgcaaggc 360
tagtgtcctc aaactagctg aagctagtgc tcagattgtc atgccccttg ctgaggttaa 420
gggatgcacc tgggccgatg gttatacaat gtatcttgga tttgcacctg gggccgaaat 480
gttccttgat gcttttgact tctatccact agtt attgaa atgcataggg tcctcaagga 540
caatatggat gtaaatttta tgaaaaaagt cctccgccaa cgctatggaa caatgactgc 600
tgaagaatgg atgactcaga aaataacaga aataaaagct gcttttaatt ctgttggaca 660
gcttgcctgg gccaaatctg gattctctcc tgctgctaga accttcttgc agcaattcgg 72 0
tatcaacatc taaacctctt catcacagat cttcaatttc cgtgcaatat gtctatgtat 780
tgcacaccat tatactgcaa ggcttctgtt aagatagtta ataagtggag aacactact 839
<210>2 <211>4373 <212> ДНК <213> вирус Шмалленберга
- 11 034543 <400> 2
agtagtgaac taccacaatc aaaatgcttc tcaacattgt cttgatatct aacttagcct 60
gtttagcttt tgcactccca cttaaggaag gcactagagg gtctaggtgc ttcctgaatg 120
gcgaactggt taaaactgtt aacacatcaa aggtcgtttc agaatgctgt gtgaaagacg 180
acatatctat cattaaatca aatgctgaac attataaatc aggagatcgg ttggctgctg 240
taataaaata ttatcgttta tatcaggtga aggattggca ttcttgcaat ccaatttatg 300
atgaccacgg ttcctttatg atattagata tagataatac tggcacatta atccctaaaa 360
tgcatacatg cagagttgaa tgcgaaatag cactgaataa agatactggc gaagttatat 420
tgaattcata tcgaattaac cactaccgaa tctcgggcac aatgcatgta tcaggttggt 480
ttaaaaacaa aattgagatt cctttggaaa acacatgcga atccattgag gtaacatgtg 540
gattaaaaac acttaatttt catgcatgtt tccataccca taagtcatgc acccgctat t 600
ttaaaggat c aatcctgccg gaattgatga tcgaatcatt ttgtacgaat cttgaattaa 660
tactgctagt aactttcata ttagttgggt ctgtcatgat gatgatattg acgaaaacat 720
atatagtata tgtgttcatt cctatatttt atccatttgt gaaattatat gcttatatgt 780
acaacaaata ttttaaattg tgtaaaaatt gcctgttagc agtacatccc tttacaaatt 840
gcccatcgac atgcatctgt ggaatgattt acactaccac tgaatcactc aaattgcatc 900
gcatgtgtaa caattgttct ggctataaag cattgccgaa aacaaggaaa ttgtgtaaaa 960
gtaaaatatc caatatagtg ctatgtgtga taacatcact gatat tttt c tcatttatca 1020
cacctatatc gagt caatgt at cgatatag aaaaactgcc agacgagtat attacatgta 1080
aaagagagct agctaatatc aaaagcttga caattgatga cacatatagc tttatatatt 1140
cctgtacatg cataattgtg ttaatattac ttaaaaaggc agcaaagtat atcttgtact 1200
gcaactgcag cttttgtggt atggtacatg aacgacgtgg attgaagata atggacaact 1260
ttacaaacaa gtgcctaagt tgtgtatgcg cagaaaacaa gggcttaaca attcacagag 1320
cctctgagaa atgtctgttc aaatttgaat caagttataa taggaccggg ttgataatct 1380
ttatgcttct gttagtccca acaattgtaa tgacgcaaga aactagtatt aactgcaaaa 1440
acattcaatc aactcagctt acaatagagc acctgagtaa gtgcatggca ttttatcaaa 1500
- 12 034543
ataaaacaag ctcaccagtt gtaatcaatg aaataatttc agatgctt ca gtagacgaac 1560
aagaattaat aaaaagttta aacttgaact gtaatgtcat agataggttt atttccgaat 1620
ctagtgttat tgagactcaa gtttattatg agtatataaa atcacagttg tgccctctcc 1680
aagtgcatga tattttcact at caatt cag caagtaacat acaatggaaa gcactggccc 1740
gaagtttcac cttaggagtg tgcaatacga at cot cataa acatatatgt agatgcttgg 1800
agtctatgca aatgtgcaca tcaaccaaga сада ccacgc tagggaaatg tcaatatatt 1860
atgatggtca tccagatcgc tttgagcatg acatgaaaat aatattgaat ataatgagat 1920
atatagtccc tggattaggt cgagtcttgc ttgatcaaat caaacaaaca aaagactacc 1980
aagctttacg ccacatacaa ggtaagcttt ctcctaaatc gcagt caaat ttacaactta 204 0
aaggatttct ggaatttgtt gattttatcc ttggtgcaaa cgtgacaata gaaaaaaccc 2100
ctcaaacatt aactacatta tctttgataa aaggagccca cagaaacttg gat caaaaag 2160
atccaggtcc aacaccaata ctggtatgca aatcaccaca aaaagtggta tgctactcac 2220
cacgtggtgt cacacaccca ggagattata tatcatgcaa atctaagatg tataagtggc 2280
catctttagg ggtatacaaa cataatagag accagcaaca agcctgcagc agtgacacac 2340
attgcctaga gatgtttgaa ccagcagaaa gaacaataac tacaaaaata tgcaaagtaa 2400
gtgatatgac ttattcagaa tcgccatata gtactggaat accatcatgc aacgtgaaga 2460
gatttggatc atgtaatgta aggggtcatc aatggcaaat tgcagaatgc tcaaatggct 2520
tattttacta tgtttcagct aaagcccatt cgaaaactaa cgatataaca ctgtactgtt 2580
tatcagcaaa ttgcctggac ttgcgttatg cattcagatc cagtagttgt tcagatatag 2640
tatgggatac aagttatcga aataaattaa cacctaaatc tattaatcat ccagatattg 2700
aaaactacat agcagcgctt cagtcagata ttgcaaatga tttaactatg cactacttta 2760
aaccattaaa aaacctt cca gcaataattc ctcaatacaa aacaatgaca ttgaatgggg 2820
acaaggtatc aaatggtatt agaaatagtt atatcgagtc gcacatccct gcaattaatg 2880
gtttatcagc agggattaat attgccatgc caaatggaga aagcctcttt tccattatta 2940
tctatgtcag aagagtaata aataaagcat cgtat cgatt tctatatgaa acaggaccca 3000
caattggaat aaatgccaag cacgaagagg tatgtaccgg gaagtgccca agcccaatac 3060
- 13 034543
cacatcaaga tggttgggtc acattctcaa aggaaagatc aagtaattgg ggctgtgaag 3120
aatggggttg cttggcaata aatgatggtt gtttatatgg gtcatgtcaa gacataataa 3180
ggcctgaata taagatatac aagaagt eta gtattgaaca aaaggatgtt gaagtttgta 3240
taaccatggc ccatgaatca tt etgeagta ccgttgatgt tctccaacct ttaattagcg 3300
acaggataca attagatatc caaacgattc aaatggactc tatgccaaat ataattgeag 3360
tcaagaatgg gaaagtttat gttggagata teaatgaett aggttcgaca gcaaagaaat 3420
gtggctcagt ccaattatat tetgaaggga tcattggatc gggaacccca aaatttgatt 3480
atgtttgcca tgcattcaat cgtaaagatg t cat cctt eg aagatgcttt gataactcat 3540
atcagtcttg tcttctcttg gaacaagata atacattaac tattgettet accagtcata 3600
tggaagtgca taaaaaagtt teaagegtgg gtacaatcaa ttataaaatt atgttagggg 3660
attttgacta caatgcatat tcaacacaag caacagt cac aat agatgag at caggtgtg 3720
gtggttgtta tggctgccct gaaggaatgg cttgcgcact caaattgagt accaatacca 3780
tcgggagttg tt caataaaa agtaactgcg atacatacat taaaataata gcagtcgatc 3840
cgatgcagag cgagtattcc attaagttaa actgcccact agcaacagag acagtttcag 3900
taagtgtgtg ctcagcttct gcttacacaa aaccttcaat atetaaaaat caaccaaaaa 3960
ttgttttgaa tt ccttagat gaaacat ett acatcgagca acatgataaa aagtgttcta 4020
catggctttg cagagtttat aaagaaggga ttagegtaat atttcagcct ctatttggca 4080
acctatcttt ctattggaga ctgacaatat atataataat ctctttgatt atgetaatte 4140
tgtttctata catattaata ccactgtgca aacggctaaa aggtttattg gaatacaatg 4200
agagaatata ccaaatggaa aataaattta agtgataagc cttataacaa tgagcaatta 4260
taaatgaata aataaaaaca ataaaagata aacaaataac aacatatata tgtggttaca 4320
catatatatg taattattca getgagaagt ttttcatgtg gtagaacact act 4373
<210>3 <211>6882 <212> ДНК <213> вирус Шмалленберга <400>3 agtagtgtac ccctaattac aatcactatg gagacataca agattaacat ttttagagat 60
- 14 034543
aggatcaacc agtgtcgaag tgctgaagaa gccaaagaca ttgttgctga tcttctcatg 120
gctagacatg actactttgg tagagaggta tgttattacc tggatatcga att ccggcag 180
gatgttccag cttacgacat acttcttgaa tttctgccag ctggcactgc ttt caacatt 240
cgcaattgta caccagacaa ttttatcatt cacaatggca agctttatat cattgactat 300
aaagtat caa ctgatcatgc atatggtcaa aaaacttatg aaaagtacac ccagatcttt 360
ggagacgcat tgtcagaatt gccgtttgat tttgaagttg tgatcatccg tgctgaccct 420
ctgcgagata ctatccatgt taatt caaat caattcttgg aaatatttgg gccgctcaac 480
ataaaccttg attttacttg gttctttaat ttgcgatccc tgatatatga gaaatataag 540
gatgacgaca gattcctaga aattgtgaat caaggtgaat ttacgatgac tggaccctgg 600
attgatgagg ataccccgga gctctattca caccctgtct ttttggaatt ctatgatt ct 660
ttagatgaga tggctaaact gacattccat gagtctatga catttgatgc aactcgcggt 720
gagaaatgga atcaaaatct acaaaaggtt ataaatagat atggcaatga ttataacatt 780
tttgtgaaag aggccgctgc aggaatcttt agatgtgaag ggaactaccc aaaaccaaat 840
catgatgaaa tcacaatcgg ttggaatcaa atggttcaaa gagtgagtac tgagagaaac 900
ctgactcaag atgtcagcaa gcaaaaacca tctattcatt tcatatgggg tcaacctgac 960
gaaacatcaa atgcgacaac accaaaacta atcaagattg caaaagcact ccaaaatatt 1020
tctggcgagt ctacatatat aagcgcattc agagcattgg gtatgcttat ggacttttct 1080
gagaacacag ctttatatga agcacacact agcaaactaa aaagtatggc aagacagaca 1140
tcgaaaagaa ttgatactaa actggaacca at caaaatag gcacggcgac aatttattgg 1200
gaacagcagt ttaaactgga tactgaaata atgaatacaa aagacaaatc acatttgcta 1260
aaagattttc ttggcatagg gggtcacgtg caattttcaa aaaagaccat tgacgatttg 1320
gatactgaca aacctactat attagatttc aacaaaaagg aagtcattga tttttgcaaa 1380
ttccagtatg aaaatgtaaa gaaaatacta tccggagata ataat ctaga gcgtatagga 1440
tgttatttag aagaatatgg tgcaaatatt gcatcatgtt caaaggatac atgggatcag 1500
attaaccaga tagggaagt c aaattactgg gcttgtatta aagatttttc agtcttgatg 1560
aaaaatatgt tggcagtttc tcaatataat aggcacaata cttttcgtgt agtgtgttgt 1620
- 15 034543
gcaaacaata atctgtttgg gtttgtaatg ccttcttctg atattaaagc aaagcgat cc 1680
acacttgttt acttcttagc tgtgttgcat tctactcctc agaatgtgat gcaccacggt 1740
gcattgcatg cgacatttaa aactggttca aaatacctta gtat ct ctaa aggaatgcgt 1800
ttagataaag aacgatgtca acgcatagtt agttcaccgg gactttttat gttgactaca 1860
ttgatgtttg caggagacaa tccgacactc aatttgactg atgtcatgaa ttttacattc 1920
cacacttccc tgtctataac caaagctatg ctgtcattga cagaaccatc aagatatatg 1980
ataatgaatt cattagccat at ccagt cat gttagagatt atatagcaga aaaatttggc 2040
ccttatacaa agaccagctt ct ctgtagta atggcaaact tgattaaaag gggatgttat 2100
atggcatata at caaagaga taaagtagac atgaggaata tctgcctaac agattatgaa 2160
ataactcaaa aaggtgtgag agataacaga gacctatcat caatctggtt tgaaggctat 2220
gtat cactaa aagaatatat taaccaaata tatctaccat tttacttcaa ttcaaaaggt 2280
ttgcatgaaa agcatcatgt tatgatagat ctggctaaga caatcttaga tatagaaagg 2340
gaccagagat taaatat ccc aggaatatgg tctacaacac ctagaaaaca aactgcaaat 2400
ttaaatataa ctatctatgc agttgcaaaa aatctaataa tggacactgc tagacataat 2460
tatattagat cacggataga aaacacaaac aacttaaata gat cgatatg cactattt ct 2520
acattcacca gctctaaatc atgtattaaa gtaggcgact ttgagaaaga aaaaagct ca 2580
gcaacaaaaa aggctgcaga ttgcatgtca aaagagataa agaagtatac aattgcaaac 2640
ccagaatttg ttgatgaaga gttactaaat gcaactataa gacattcacg ctatgaagac 2700
ttaaaaaaag caat cccgaa ttatattgac attatgtcaa ctaaagtatt tgattctctg 2760
taccagaaaa taaaaaggaa ggagatagat gataa accca ctgtgtatca tatactctct 2820
gctatgaaga atcacacaga ttttaagttt acattcttta acaaaggcca aaaaacagca 2880
aaggataggg aaatattcgt aggcgaattt gaggcaaaaa tgtgcttgta tttagtggag 2940
aggatatcta aagaacgctg taagttgaat ccagatgaga tgattagtga accaggcgat 3000
tctaaattga aaaaattaga agagcttgca gagtctgaaa tacgattcac agcagcaact 3060
atgaaacaga tcaaagaacg ctatttagca gaaatgggag aagcaagcca tatgatcgca 3120
tataaaccac attctgttaa gattgaaatc aatgcagaca tgt caaaatg gagtgcccaa 3180
- 16 034543
gatgttttat tcaaatattt ctggttgttt gcattagatc ccgcacttta tctgcaagaa 3240
aaagaaagga tattgtactt cctatgcaat tatatgcaaa aaaagctaat tctgcctgat 3300
gaaatgctct gtagcatcct tgaccaacgt at caaacatg aggatgatat aatatatgaa 3360
atgaccaatg gcttatcgca aaattgggtc aatattaaac ggaactggct gcaggggaat 3420
ctcaattaca caagtagcta cctacattca tgttctatga atgtttataa ggatattcta 3480
aagagagcag ccactttact agaaggggaa gttttagtca attctatggt tcattctgat 3540
gacaatcaca cttcaatagt gatgatccaa gataaattag atgatgatat tgttattgaa 3600
tttt ctgcaa aactatttga aaaaatatgt ctaacttttg gaaat caagc aaatatgaag 3660
aagacatata taacaaattt cataaaggag ttcgtttcac tttttaatat ttatggtgag 3720
ccattttctg tttatggtcg ctttattttg acatctgttg gcgattgtgc ttttcttgga 3780
ccatatgagg atgttgccag taggttgtct gcaacgcaga cagcaattaa gcatg gagca 3840
cctccatcac ttgcatggac tgctattgca ttaactcagt ggataacaca tagcacatat 3900
aacatgctt c caggtcaaat caatgat cct acttcatctt tacctagtca tgatagattt 3960
gagctgccta tagaattgtg tggcttaata aattcagaat tacccactat agctatagca 4020
ggtttggaag cagataatct aagttattta gttaggttat caaaaagaat gtcccctata 4080
catctttgcc gtgaaccaat ccagcat caa tatgagaata tacatacatg ggatataagt 4140
aaactgacac aatgtgatat tttcagactt aagcttttaa gatacatgac gttagactca 4200
actatgt cat ctgatgatgg aatgggcgaa actagtgaaa tgagatctag gtctcttctg 4260
acaccaagaa aattcactac tgcaagttcg ttatctagat tgcattcata tgctgattat 4320
caaaaaacaa tacaagacca acagaaaatt gaagaattat ttgaatattt tatagccaac 4380
cctcaactat tggttacaaa aggtgagact tgtgaagagt tctgtatgtc tgtattgttc 4440
agatacaaca gt cgtaaatt taaagaat ca ttgtctattc aaaacccagc tcagctcttc 4500
atagaacaag tattgtttgc aaataaacca atgatagact atacaagtat tcatgatagg 4560
ttgtttggta tacaagatga cccaaatata aatgatgcta catgtattat tggcaagaag 4620
acttttgttg aaacatatca gcaaataaaa attgatgtag aaaaatttac acttgatgta 4680
gaggatataa agacgatata tagcttctgt ataatgaacg accctatatt agttgcttgt 4740
- 17 034543
gcaaacaact tgttaatttc aatacaggga gtggagatgc aacgattggg tatgacatgc 4800
tgttatatgc cggagattaa gagccttaaa gtaatttatc atagtcctgc tctcgtatta 4860
cgtgcttatg taacagataa ctatgagcaa aaagggatgg agccagatga aatgcggaga 4920
gatatatatc atttagaaga atttatagag aagacaaaat tgaggacaaa tatgcaaggg 4980
agaattgcaa ataatgaaat taagttaatg aagcgagatt tgaaatttga agtgcaggaa 5040
ttgactaaat tctatcagat ctgttatgaa tatgtgaaat caacagaaca caaaattaaa 5100
atattcatcc tt ccaaaaaa ggcttacact cccattgatt tctgctcatt agtaacaggt 5160
aatctgatat cagacaacaa atggatggtt gttcactatt taaaacaaat aactgtccca 5220
gcaaagaagg cacaaatagc cacatctata gatctggaaa tacaaatagc ctacgaatgt 5280
ttcaggctaa ttgcacattt tgctgatatg ttcctaaatg atgactccaa aaaagcttat 5340
attaatgcaa ttattaacac atatacatac aaggatgttc aagtatccag tctctacaag 5400
aaaatcaaaa attcgagact acgtt caaaa attataccat tattatatca cctgggcgat 5460
ttgcaacaaa tagacgttga cagatttgat gcagaaaaag cagaagagca gatcacatgg 5520
aataactggc aaacatctcg agaatttact actggtccaa ttgatctatc aat caaaggt 5580
tatggacggt caataaggat cgtaggtgag gacaacaagc ttacagctgc agaaatgcaa 5640
ttgt caagag tgagaagtga tatagtatca aggcatggac aggctttatt gaacaaacct 57 00
catgggctaa aattagagaa aatggaacca gtgactgatc taaatcctaa attatggtat 5760
attgcatacc aattgcgtga gaaaaagcgg tatcactatg gggtctttag tacatcttat 5820
atagaagagc ataactcaag gatagaagca tctcggatac gtaagactaa taaatggata 5880
ccagtttgcc ctattgctat atcaaaacaa t cat ctgatg gaaagcctag tcttgcaaaa 5940
atccctatgt taaatattgg ggagattaaa tttacaaaac tacagattgc agtagatgat 6000
catgcaatga ttaggaaagc cccatttagt aagatggtgt tctttgatgg cccacccata 6060
cagagcggtg gcattgacat tggaaagctt atgaagaacc aaaatattct caatttgagg 6120
ttagataata tacagagtat aacattatta gatttgtgcc gcatattttc atgccgaggg 6180
tctaaagtgg at caagatgc atttgaattc ttatctgatg aacctttgga tgaagatgtt 6240
attgatgaat tagatagct c acctgcatta gtggtatctt acacaaagaa atcaaccaaa 6300
- 18 034543
tccaatagtt tcaaaaatgt tatagttaga gcattgataa gagaatgtga tatatttgaa 6360
gatataatgg acataacaga cgatggattc acatctgata gcaat ctaga ggtgttagaa 6420
aacttaacat ggattttaaa tatgctcgca acaaatcagt ggtctacaga actgttagca 6480
tgcatacaca tgtgtttata tcgcaatgag atggatcata tctatcacaa ttt tcaagtt 6540
ccagaaatat ttgtcgacaa tccaatctca ttaaatgtaa agtgggatga agtaattatg 6600
ttcttaaaca tactgcgaga cagagattac aaatttgagc catgggtgtc tatactgaat 6660
cattccttaa ctaaagctat agagtatgct tacaaaaaga tggaagagga gaggaagcag 6720
aaatcaacag gcat caa caa attcttaaag ggtaaaaaaa tgggtggcag atcaaagttt 6780
gatttccagt agcttgatct taaataatac ataatctttg ccccaaat ct gtattatata 6840
aataattcta aagtagtttc atgtaattag gggcacacta ct 6882
<210>4 <211>839 <212> PHK <213> вирус Шмалленберга <400>4
aguaguguuc uccacuuauu aacuaucuua acagaagccu ugcaguauaa uggugugcaa 60
uacauagaca uauugcacgg aaauugaaga ucugugauga agagguuuag auguugauac 120
cgaauugcug caagaagguu cuagcagcag gagagaaucc agauuuggcc caggcaagcu 180
guccaacaga auuaaaagca gcuuuuauuu cuguuauuuu cugagucauc cauucuucag 240
cagucauugu uccauagcgu uggcggagga cuuuuuucau aaaauuuaca uccauauugu 300
ccuugaggac ccuaugcauu ucaauaacua guggauagaa gucaaaagca ucaaggaaca 360
uuucggcccc aggugcaaau ccaagauaca uuguauaacc aucggcccag gugcaucccu 420
uaaccucagc aaggggcaug acaaucugag cacuagcuuc agcuaguuug aggacacuag 480
ccuugcaugu aucagcaauc caacgugcua gauauccuga cauccuguga aguguaaugg 540
cauugucugg cacaggauuu gagacauauu ggggaaaaug guuauuaacc acuguaaauu 600
ugaccccacc aaaaguaaga ucgacacuug guugugccgu cuuauguagg accaucuugg 660
ccuucuucug guugaggaag aagacucuag caacaccgaa guugaguugu ugcccauacu 720
- 19 034543
usccaauaaa ugccacauac ccgaccuccg gguuaaaugu agcugcauuc cguuguggua 780
caucuucaaa aaugaauugg cuugacauau uucuguaguu aauaguggag cucacuacu 839
<210> 5 <211> 4373 <212> PHK <213> вирус Шмалленберга
<4OO> 5 aguaguguuc uaccacauga aaaacuucuc agcugaauaa uuacauauau auguguaacc 60
acauauauau guuguuauuu guuuaucuuu uauuguuuuu auuuauucau uuauaauugc 120
ucauuguuau aaggcuuauc acuuaaauuu auuuuccauu ugguauauuc ucucauugua 180
uuccaauaaa ccuuuuagcc guuugcacag ugguauuaau auguauagaa acagaauuag 240
cauaaucaaa gagauuauua uauauauugu cagucuccaa uagaaagaua gguugccaaa 300
uagaggcuga aauauuacgc uaaucccuuc uuuauaaacu cugcaaagcc auguagaaca 360
cuuuuuauca uguugcucga uguaagaugu uucaucuaag gaauucaaaa caauuuuugg 420
uugauuuuua gauauugaag guuuugugua agcagaagcu gagcacacac uuacugaaac 480
ugucucuguu gcuagugggc aguuuaacuu aauggaauac ucgcucugca ucggaucgac 540
ugcuauuauu uuaauguaug uaucgcaguu acuuuuuauu gaacaacucc cgaugguauu 600
gguacucaau uugagugcgc aagccauucc uucagggcag ccauaacaac caccacaccu 660
gaucucaucu auugugacug uugcuugugu ugaauaugca uuguagucaa aauccccuaa 720
cauaauuuua uaauugauug uacccacgcu ugaaacuuuu uuaugcacuu ccauaugacu 780
gguagaagca auaguuaaug uauuaucuug uuccaagaga agacaagacu gauaugaguu 840
aucaaagcau cuucgaagga ugacaucuuu acgauugaau gcauggcaaa cauaaucaaa 900
uuuugggguu cccgauccaa ugaucccuuc agaauauaau uggacugagc cacauuucuu 960
ugcugucgaa ccuaagucau ugauaucucc aacauaaacu uucccauucu ugacugcaau 1020
uauauuuggc auagagucca uuugaaucgu uuggauaucu aauuguaucc ugucgcuaau 1080
uaaagguugg agaacaucaa cgguacugca gaaugauuca ugggccaugg uuauacaaac 1140
uucaacaucc uuuuguucaa uacuagacuu cuuguauauc uuauauucag gccuuauuau 1200
gucuugacau gacccauaua aacaaccauc auuuauugcc aagcaacccc auucuucaca 1260
- 20 034543
gccccaauua cuugaucuuu ccuuugagaa ugugacccaa ccaucuugau gugguauugg 1320
gcuugggcac uucccgguac auaccucuuc gugcuuggca uuuauuccaa uugugggucc 1380
uguuucauau agaaaucgau acgaugcuuu auuuauuacu cuucugacau agauaauaau 1440
ggaaaagagg cuuucuccau uuggcauggc aauauuaauc ccugcugaua aaccauuaau 1500
ugcagggaug ugcgacucga uauaacuauu ucuaauacca uuugauaccu uguccccauu 1560
caaugucauu guuuuguauu gaggaauuau ugcuggaagg uuuuuuaaug guuuaaagua 1620
gugcauaguu aaaucauuug caauaucuga cugaagcgcu gcuauguagu uuucaauauc 1680
uggaugauua auagauuuag guguuaauuu auuucgauaa cuuguauccc auacuauauc 1740
ugaacaacua cuggaucuga augcauaacg caaguccagg caauuugcug auaaacagua 1800
caguguuaua ucguuaguuu ucgaaugggc uuuagcugaa acauaguaaa auaagccauu 1860
ugagcauucu gcaauuugcc auugaugacc ccuuacauua caugauccaa aucucuucac 1920
guugcaugau gguauuccag uacuauaugg cgauucugaa uaagucauau cacuuacuuu 1980
gcauauuuuu guaguuauug uucuuucugc ugguucaaac aucucuaggc aauguguguc 204 0
acugcugcag gcuuguugcu ggucucuauu auguuuguau accccuaaag auggccacuu 2100
auacaucuua gauuugcaug auauauaauc uccugggugu gugacaccac guggugagua 2160
gcauaccacu uuuuguggug auuugcauac caguauuggu guuggaccug gaucuuuuug 2220
auccaaguuu cugugggcuc cuuuuaucaa agauaaugua guuaauguuu gagggguuuu 2280
uucuauuguc acguuugcac caaggauaaa aucaacaaau uccagaaauc cuuuaaguug 2340
uaaauuugac ugcgauuuag gagaaagcuu accuuguaug uggcguaaag cuugguaguc 2400
uuuuguuugu uugauuugau caagcaagac ucgaccuaau ccagggacua uauaucucau 2460
uauauucaau auuauuuuca ugucaugcuc aaagcgaucu ggaugaccau cauaauauau 2520
ugacauuucc cuagcguggu cugucuuggu ugaugugcac auuugcauag acuccaagca 2580
ucuacauaua uguuuaugag gauucguauu gcacacuccu aaggugaaac uucgggccag 2640
ugcuuuccau uguauguuac uugcugaauu gauagugaaa auaucaugca cuuggagagg 2700
gcacaacugu gauuuuauau acucauaaua aacuugaguc ucaauaacac uagauucgga 2760
aauaaaccua ucuaugacau uacaguucaa guuuaaacuu uuuauuaauu cuuguucguc 2820
- 21 034543
uacugaagca ucugaaauua uuucauugau uacaacuggu gagcuuguuu uauuuugaua 2880
aaaugccaug cacuuacuca ggugcucuau uguaagcuga guugauugaa uguuuuugca 2940
guuaauacua guuucuugcg ucauuacaau uguugggacu aacagaagca uaaagauuau 3000
caacccgguc cuauuauaac uugauucaaa uuugaacaga cauuucucag aggcucugug 3060
aauuguuaag cccuuguuuu cugcgcauac acaacuuagg cacuuguuug uaaaguuguc 3120
cauuaucuuc aauccacguc guucauguac cauaccacaa aagcugcagu ugcaguacaa 3180
gauauacuuu gcugccuuuu uaaguaauau uaacacaauu augcauguac aggaauauau 3240
aaagcuauau gugucaucaa uugucaagcu uuugauauua gcuagcucuc uuuuacaugu 3300
aauauacucg ucuggcaguu uuucuauauc gauacauuga cucgauauag gugugauaaa 3360
ugagaaaaau aucagugaug uuaucacaca uagcacuaua uuggauauuu uacuuuuaca 3420
caauuuccuu guuuucggca augcuuuaua gccagaacaa uuguuacaca ugcgaugcaa 3480
uuugagugau ucagugguag uguaaaucau uccacagaug caugucgaug ggcaauuugu 3540
aaagggaugu acugcuaaca ggcaauuuuu acacaauuua aaauauuugu uguacauaua 3600
agcauauaau uucacaaaug gauaaaauau aggaaugaac acauauacua uauauguuuu 3660
cgucaauauc aucaucauga cagacccaac uaauaugaaa guuacuagca guauuaauuc 3720
aagauucgua caaaaugauu cgaucaucaa uuccggcagg auugauccuu uaaaauagcg 3780
ggugcaugac uuauggguau ggaaacaugc augaaaauua aguguuuuua auccacaugu 3840
uaccucaaug gauucgcaug uguuuuccaa aggaaucuca auuuuguuuu uaaaccaacc 3900
ugauacaugc auugugcccg agauucggua gugguuaauu cgauaugaau ucaauauaac 3960
uucgccagua ucuuuauuca gugcuauuuc gcauucaacu cugcauguau gcauuuuagg 4020
gauuaaugug ccaguauuau cuauaucuaa uaucauaaag gaaccguggu caucauaaau 4080
uggauugcaa gaaugccaau ccuucaccug auauaaacga uaauauuuua uuacagcagc 4140
caaccgaucu ccugauuuau aauguucagc auuugauuua augauagaua ugucgucuuu 4200
cacacagcau ucugaaacga ccuuugaugu guuaacaguu uuaaccaguu cgccauucag 4260
gaagcaccua gacccucuag ugccuuccuu aagugggagu gcaaaagcua aacaggcuaa 4320
guuagauauc aagacaaugu ugagaagcau uuugauugug guaguucacu acu 4373
- 22 034543 <210>6 <211>6882 <212> PHK <213> вирус Шмалленберга <400>6
aguagugugc cccuaauuac augaaacuac uuuagaauua uuuauauaau acagauuugg 60
ggcaaagauu auguauuauu uaagaucaag cuacuggaaa ucaaacuuug aucugccacc 120
cauuuuuuua cccuuuaaga auuuguugau gccuguugau uucugcuucc ucuccucuuc 180
caucuuuuug uaagcauacu cuauagcuuu aguuaaggaa ugauucagua uagacaccca 240
uggcucaaau uuguaaucuc ugucucgcag uauguuuaag aacauaauua cuucauccca 300
cuuuacauuu aaugagauug gauugucgac aaauauuucu ggaacuugaa aauugugaua 360
gauaugaucc aucucauugc gauauaaaca cauguguaug caugcuaaca guucuguaga 420
ccacugauuu guugcgagca uauuuaaaau ccauguuaag uuuucuaaca ccucuagauu 480
gcuaucagau gugaauccau cgucuguuau guccauuaua ucuucaaaua uaucacauuc 540
ucuuaucaau gcucuaacua uaacauuuuu gaaacuauug gauuugguug auuucuuugu 600
guaagauacc acuaaugcag gugagcuauc uaauucauca auaacaucuu cauccaaagg 660
uucaucagau aagaauucaa augcaucuug auccacuuua gacccucggc augaaaauau 720
gcggcacaaa ucuaauaaug uuauacucug uauauuaucu aaccucaaau ugagaauauu 780
uugguucuuc auaagcuuuc caaugucaau gccaccgcuc uguaugggug ggccaucaaa 840
gaacaccauc uuacuaaaug gggcuuuccu aaucauugca ugaucaucua cugcaaucug 900
uaguuuugua aauuuaaucu ccccaauauu uaacauaggg auuuuugcaa gacuaggcuu 960
uccaucagau gauuguuuug auauagcaau agggcaaacu gguauccauu uauuagucuu 1020
acguauccga gaugcuucua uccuugaguu augcucuucu auauaagaug uacuaaagac 1080
cccauaguga uaccgcuuuu ucucacgcaa uugguaugca auauaccaua auuuaggauu 1140
uagaucaguc acugguucca uuuucucuaa uuuuagccca ugagguuugu ucaauaaagc 1200
cuguccaugc cuugauacua uaucacuucu cacucuugac aauugcauuu cugcagcugu 1260
aagcuuguug uccucaccua cgauccuuau ugaccgucca uaaccuuuga uugauagauc 1320
- 23 034543
aauuggacca guaguaaauu cucgagaugu uugccaguua uuccauguga ucugcucuuc 1380
ugcuuuuucu gcaucaaauc ugucaacguc uauuuguugc aaaucgccca ggugauauaa 1440
uaaugguaua auuuuugaac guagucucga auuuuugauu uucuuguaga gacuggauac 1500
uugaacaucc uuguauguau auguguuaau aauugcauua auauaagcuu uuuuggaguc 1560
aucauuuagg aacauaucag caaaaugugc aauuagccug aaacauucgu aggcuauuug 1620
uauuuccaga ucuauagaug uggcuauuug ugccuucuuu gcugggacag uuauuuguuu 1680
uaaauaguga acaaccaucc auuuguuguc ugauaucaga uuaccuguua cuaaugagca 1740
gaaaucaaug ggaguguaag ccuuuuuugg aaggaugaau auuuuaauuu uguguucugu 1800
ugauuucaca uauucauaac agaucugaua gaauuuaguc aauuccugca cuucaaauuu 1860
caaaucucgc uucauuaacu uaauuucauu auuugcaauu cucccuugca uauuuguccu 1920
caauuuuguc uucucuauaa auucuucuaa augauauaua ucucuccgca uuucaucugg 1980
cuccaucccu uuuugcucau aguuaucugu uacauaagca cguaauacga gagcaggacu 2040
augauaaauu acuuuaaggc ucuuaaucuc cggcauauaa cagcauguca uacccaaucg 2100
uugcaucucc acucccugua uugaaauuaa caaguuguuu gcacaagcaa cuaauauagg 2160
gucguucauu auacagaagc uauauaucgu cuuuauaucc ucuacaucaa guguaaauuu 2220
uucuacauca auuuuuauuu gcugauaugu uucaacaaaa gucuucuugc caauaauaca 2280
uguagcauca uuuauauuug ggucaucuug uauaccaaac aaccuaucau gaauacuugu 2340
auagucuauc auugguuuau uugcaaacaa uacuuguucu augaagagcu gagcuggguu 2400
uugaauagac aaugauucuu uaaauuuacg acuguuguau cugaacaaua cagacauaca 2460
gaacucuuca caagucucac cuuuuguaac caauaguuga ggguuggcua uaaaauauuc 2520
aaauaauucu ucaauuuucu guuggucuug uauuguuuuu ugauaaucag cauaugaaug 2580
caaucuagau aacgaacuug caguagugaa uuuucuuggu gucagaagag accuagaucu 2640
cauuucacua guuucgccca uuccaucauc agaugacaua guugagucua acgucaugua 2700
ucuuaaaagc uuaagucuga aaauaucaca uugugucagu uuacuuauau cccauguaug 2760
uauauucuca uauugaugcu ggauugguuc acggcaaaga uguauagggg acauucuuuu 2820
ugauaaccua acuaaauaac uuagauuauc ugcuuccaaa ccugcuauag cuauaguggg 2880
- 24 034543
uaauucugaa uuuauuaagc cacacaauuc uauaggcagc ucaaaucuau caugacuagg 2940
uaaagaugaa guaggaucau ugauuugacc uggaagcaug uuauaugugc uauguguuau 3000
ccacugaguu aaugcaauag caguccaugc aagugaugga ggugcuccau gcuuaauugc 3060
ugucugcguu gcagacaacc uacuggcaac auccucauau gguccaagaa aagcacaauc 3120
gccaacagau gucaaaauaa agcgaccaua aacagaaaau ggcucaccau aaauauuaaa 3180
aagugaaacg aacuccuuua ugaaauuugu uauauauguc uucuucauau uugcuugauu 3240
uccaaaaguu agacauauuu uuucaaauag uuuugcagaa aauucaauaa caauaucauc 3300
aucuaauuua ucuuggauca ucacuauuga agugugauug ucaucagaau gaaccauaga 3360
auugacuaaa acuuccccuu cuaguaaagu ggcugcucuc uuuagaauau ccuuauaaac 3420
auucauagaa caugaaugua gguagcuacu uguguaauug agauuccccu gcagccaguu 3480
ccguuuaaua uugacccaau uuugcgauaa gccauugguc auuucauaua uuauaucauc 3540
cucauguuug auacguuggu caaggaugcu acagagcauu ucaucaggca gaauuagcuu 3600
uuuuugcaua uaauugcaua ggaaguacaa uauccuuucu uuuucuugca gauaaagugc 3660
gggaucuaau gcaaacaacc agaaauauuu gaauaaaaca ucuugggcac uccauuuuga 3720
caugucugca uugauuucaa ucuuaacaga augugguuua uaugcgauca uauggcuugc 3780
uucucccauu ucugcuaaau agcguucuuu gaucuguuuc auaguugcug cugugaaucg 3840
uauuucagac ucugcaagcu cuucuaauuu uuucaauuua gaaucgccug guucacuaau 3900
caucucaucu ggauucaacu uacagcguuc uuuagauauc cucuccacua aauacaagca 3960
cauuuuugcc ucaaauucgc cuacgaauau uucccuaucc uuugcuguuu uuuggccuuu 4020
guuaaagaau guaaacuuaa aaucugugug auucuucaua gcagagagua uaugauacac 4080
aguggguuua ucaucuaucu ccuuccuuuu uauuuucugg uacagagaau caaauacuuu 4140
aguugacaua augucaauau aauucgggau ugcuuuuuuu aagucuucau agcgugaaug 4200
ucuuauaguu gcauuuagua acucuucauc aacaaauucu ggguuugcaa uuguauacuu 4260
cuuuaucucu uuugacaugc aaucugcagc cuuuuuuguu gcugagcuuu uuucuuucuc 4320
aaagucgccu acuuuaauac augauuuaga gcuggugaau guagaaauag ugcauaucga 4380
ucuauuuaag uuguuugugu uuucuauccg ugaucuaaua uaauuauguc uagcaguguc 4440
- 25 034543
cauuauuaga uuuuuugcaa cugcauagau aguuauauuu aaauuugcag uuuguuuucu 4500
agguguugua gaccauauuc cugggauauu uaaucucugg ucccuuucua uaucuaagau 4560
ugucuuagcc agaucuauca uaacaugaug cuuuucaugc aaaccuuuug aauugaagua 4620
aaaugguaga uauauuuggu uaauauauuc uuuuagugau acauagccuu caaaccagau 4680
ugaugauagg ucucuguuau cucucacacc uuuuugaguu auuucauaau cuguuaggca 4740
gauauuccuc augucuacuu uaucucuuug auuauaugcc auauaacauc cccuuuuaau 4800
caaguuugcc auuacuacag agaagcuggu cuuuguauaa gggccaaauu uuucugcuau 4860
auaaucucua acaugacugg auauggcuaa ugaauucauu aucauauauc uugaugguuc 4920
ugucaaugac agcauagcuu ugguuauaga cagggaagug uggaauguaa aauucaugac 4980
aucagucaaa uugagugucg gauugucucc ugcaaacauc aauguaguca acauaaaaag 5040
ucccggugaa cuaacuaugc guugacaucg uucuuuaucu aaacgcauuc cuuuagagau 5100
acuaagguau uuugaaccag uuuuaaaugu cgcaugcaau gcaccguggu gcaucacauu 5160
cugaggagua gaaugcaaca cagcuaagaa guaaacaagu guggaucgcu uugcuuuaau 5220
aucagaagaa ggcauuacaa acccaaacag auuauuguuu gcacaacaca cuacacgaaa 5280
aguauugugc cuauuauauu gagaaacugc caacauauuu uucaucaaga cugaaaaauc 5340
uuuaauacaa gcccaguaau uugacuuccc uaucugguua aucugauccc auguauccuu 5400
ugaacaugau gcaauauuug caccauauuc uucuaaauaa cauccuauac gcucuagauu 5460
auuaucuccg gauaguauuu ucuuuacauu uucauacugg aauuugcaaa aaucaaugac 5520
uuccuuuuug uugaaaucua auauaguagg uuugucagua uccaaaucgu caauggucuu 5580
uuuugaaaau ugcacgugac ccccuaugcc aagaaaaucu uuuagcaaau gugauuuguc 5640
uuuuguauuc auuauuucag uauccaguuu aaacugcugu ucccaauaaa uugucgccgu 57 00
gccuauuuug auugguucca guuuaguauc aauucuuuuc gaugucuguc uugccauacu 5760
uuuuaguuug cuagugugug cuucauauaa agcuguguuc ucagaaaagu ccauaagcau 5820
acccaaugcu cugaaugcgc uuauauaugu agacucgcca gaaauauuuu ggagugcuuu 5880
ugcaaucuug auuaguuuug guguugucgc auuugauguu ucgucagguu gaccccauau 5940
gaaaugaaua gaugguuuuu gcuugcugac aucuugaguc agguuucucu caguacucac 6000
- 26 034543
ucuuugaacc auuugauucc aaccgauugu gauuucauca ugauuugguu uuggguaguu 6060
cccuucacau cuaaagauuc cugcagcggc cucuuucaca aaaauguuau aaucauugcc 6120
auaucuauuu auaaccuuuu guagauuuug auuccauuuc ucaccgcgag uugcaucaaa 6180
ugucauagac ucauggaaug ucaguuuagc caucucaucu aaagaaucau agaauuccaa 6240
aaagacaggg ugugaauaga gcuccggggu auccucauca auccaggguc cagucaucgu 6300
aaauucaccu ugauucacaa uuucuaggaa ucugucguca uccuuauauu ucucauauau 6360
cagggaucgc aaauuaaaga accaaguaaa aucaagguuu auguugagcg gcccaaauau 6420
uuccaagaau ugauuugaau uaacauggau aguaucucgc agagggucag cacggaugau 6480
cacaacuuca aaaucaaacg gcaauucuga caaugcgucu ccaaagaucu ggguguacuu 6540
uucauaaguu uuuugaccau augcaugauc aguugauacu uuauagucaa ugauauaaag 6600
cuugccauug ugaaugauaa aauugucugg uguacaauug cgaauguuga aagcagugcc 6660
agcuggcaga aauucaagaa guaugucgua agcuggaaca uccugccgga auucgauauc 6720
cagguaauaa cauaccucuc uaccaaagua gucaugucua gccaugagaa gaucagcaac 6780
aaugucuuug gcuucuucag cacuucgaca cugguugauc cuaucucuaa aaauguuaau 6840
cuuguauguc uccauaguga uuguaauuag ggguacacua cu 6882
<210>7 <211>839 <212> ДНК <213> вирус Шмалленберга <400>7
agtagtgaac tccactatta actacagaaa tatgt caagc caattcattt ttgaagatgt 60
accacaacgg aatgcagcta catttaaccc ggaggtcggg tatgtggcat ttattggtaa 120
gtatgggcaa caactcaact tcggtgttgc tagagtcttc ttcctcaacc agaagaaggc 180
caagatggt c ctacataaga cggcacaacc aagtgt cgat cttacttttg gtggggtcaa 240
atttacagtg gttaataacc attttcccca atatgtctca aatcctgtgc cagacaatgc 300
cattacactt cacaggatgt caggatatct agcacgttgg attgctgata cat gcaaggc 360
tagtgtcctc aaactagctg aagctagtgc tcagattgtc atgcccct tg ctgaggttaa 420
gggatgcacc tgggccgatg gttatacaat gtatcttgga tttgcacctg gggccgaaat 480
- 27 034543
gttccttgat gcttttgact tctatccact agttattgaa atgcataggg tcctcaagga 540
caatatggat gtaaatttta tgaaaaaagt cctccgccaa cgctatggaa caatgactgc 600
tgaagaatgg atgact сада aaataacaga aataaaagct gcttttaatt ctgttggaca 660
gcttgcctgg gccaaatctg gattctctcc tgctgctaga accttcttgc agcaattcgg 720
tatcaacatc taaacctctt catcacagat cttcaatttc cgtgcaatat gtctatgtat 780
tgcacaccat tatactgcaa ggcttctgtt aagatagtta at aagtggag aacactact 839
<210>8 <211>839 <212> PHK <213> вирус Шмалленберга <4OO>8
aguaguguuc uccacuuauu aacuaucuua acagaagccu ugcaguauaa uggugugcaa 60
uacauagaca uauugcacgg aaauugaaga ucugugauga agagguuuag auguugauac 120
cgaauugcug caagaagguu cuagcagcag gagagaaucc agauuuggcc caggcaagcu 180
guccaacaga auuaaaagca gcuuuuauuu cuguuauuuu cugagucauc cauucuucag 240
cagucauugu uccauagcgu uggcggagga cuuuuuucau aaaauuuaca uccauauugu 300
ccuugaggac ccuaugcauu ucaauaacua guggauagaa gucaaaagca ucaaggaaca 360
uuucggcccc aggugcaaau ccaagauaca uuguauaacc aucggcccag gugcaucccu 420
uaaccucagc aaggggcaug acaaucugag cacuagcuuc agcuaguuug aggacacuag 480
ccuugcaugu aucagcaauc caacgugcua gauauccuga cauccuguga aguguaaugg 540
cauugucugg cacaggauuu gagacauauu ggggaaaaug guuauuaacc acuguaaauu 600
ugaccccacc aaaaguaaga ucgacacuug guugugccgu cuuauguagg accaucuugg 660
ccuucuucug guugaggaag aagacucuag caacaccgaa guugaguugu ugcccauacu 720
uaccaauaaa ugccacauac ccgaccuccg gguuaaaugu agcugcauuc cguuguggua 780
caucuucaaa aaugaauugg cuugacauau uucuguaguu aauaguggag uucacuacu 839
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция, содержащая вирус Шмалленберга (SBV), инактивированный с помощью азиридинового соединения.
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, в которой указанный SBV содержит:
    (а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7;
    (б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2;
    (в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; или (г) их комбинацию.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.1, в которой указанный SBV содержит:
    (а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8;
    (б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5;
    - 28 034543 (в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6; или (г) их комбинацию.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.1, в которой азиридиновое соединение представляет собой бинарный этиленимин (БЭИ).
  5. 5. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
  6. 6. Иммуногенная композиция по п.5, в которой указанный по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент выбран из растворителей, диспергирующих сред, стабилизаторов, разбавителей, консервантов, антибактериальных и противогрибковых средств, агентов для придания изотоничности и замедляющих адсорбцию средств.
  7. 7. Иммуногенная композиция по пп.1 или 5, дополнительно включающая гидроксид алюминия, сапонин или их комбинацию.
  8. 8. Вакцина, предназначенная для лечения или предупреждения у жвачных животных инфекции SBV, виремии или пороков развития, обусловленных SBV, а также для предупреждения или снижения передачи SBV в стаде жвачных животных, содержащая иммуногенную композицию по пп.1-3 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
  9. 9. Способ получения иммуногенной композиции по любому из пп.1-3, включающий стадии, на которых:
    (A) клетки млекопитающих заражают SBV;
    (Б) культивируют зараженные клетки;
    (B) собирают вирусные частицы SBV, продуцируемые указанными клетками; и (Г) инактивируют указанные вирусные частицы с помощью азиридинового соединения.
  10. 10. Способ по п.9, в котором клетки млекопитающих представляют собой клетки почки обезьяны либо ВНК-клетки.
  11. 11. Способ по п.10, в котором клетки почки обезьяны представляют собой Ма104-клетки или Ма104-АК-клетки, а ВНК-клетки представляют собой BHK-21-клетки.
  12. 12. Способ по п.9, в котором клетки заражают SBV с величиной M0I, составляющей 0,00001-0,01.
  13. 13. Способ по п. 12, в котором клетки заражают SBV с величиной M0I, составляющей 0,0001-0,001.
  14. 14. Способ по п.9, в котором клетки культивируют в среде, содержащей примерно 1-10% FCS.
  15. 15. Способ по п. 14, в котором клетки культивируют в среде, содержащей примерно 2-6% FCS.
  16. 16. Способ по п.9, в котором клетки культивируют при температуре 25-38°C.
  17. 17. Способ по п.9, в котором клетки млекопитающих заражают SBV, который содержит:
    (а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7;
    (б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2;
    (в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, идентичной по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; или (г) их комбинацию.
  18. 18. Способ по п.9, в котором клетки млекопитающих заражают SBV, который содержит:
    (а) малый (S) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 97,8% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8;
    (б) средний (М) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 82,2% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5;
    (в) большой (L) сегмент РНК, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 93% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6; или (г) их комбинацию.
  19. 19. Способ индукции иммунного ответа у жвачного животного против SBV, лечения или предупреждения у него инфекции SBV, виремии или пороков развития, обусловленных SBV, а также предупреждения или снижения передачи SBV в стаде жвачных животных, согласно которому указанному жвачному животному вводят иммуногенную композицию по любому из пп.1-7.
  20. 20. Способ по п.19, в котором иммуногенную композицию вводят в виде одной дозы или в виде двух доз.
EA201401352A 2012-06-01 2013-05-29 Иммуногенная композиция (вакцина) против вируса шмалленберга (sbv), способ ее получения и способ индукции иммунного ответа против sbv EA034543B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12170631 2012-06-01
EP13157875 2013-03-05
PCT/US2013/043146 WO2013181270A1 (en) 2012-06-01 2013-05-29 Schmallenberg virus (sbv) vaccine, methods of production, and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201401352A1 EA201401352A1 (ru) 2015-05-29
EA034543B1 true EA034543B1 (ru) 2020-02-19

Family

ID=48607368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201401352A EA034543B1 (ru) 2012-06-01 2013-05-29 Иммуногенная композиция (вакцина) против вируса шмалленберга (sbv), способ ее получения и способ индукции иммунного ответа против sbv

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9370562B2 (ru)
EP (1) EP2855513B1 (ru)
JP (1) JP6250649B2 (ru)
CN (1) CN104350066B (ru)
AR (1) AR091240A1 (ru)
AU (1) AU2013267453C1 (ru)
BR (1) BR112014029515A2 (ru)
CA (1) CA2872961A1 (ru)
DK (1) DK2855513T3 (ru)
EA (1) EA034543B1 (ru)
ES (1) ES2617351T3 (ru)
IN (1) IN2014DN08927A (ru)
MX (1) MX363044B (ru)
PL (1) PL2855513T3 (ru)
SG (1) SG11201407619SA (ru)
UY (1) UY34840A (ru)
WO (1) WO2013181270A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9241960B2 (en) 2012-06-01 2016-01-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious Schmallenberg virus from cloned CDNAS and uses thereof
US9370562B2 (en) 2012-06-01 2016-06-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Schmallenberg virus (SBV) vaccine, methods of production, and uses thereof
US9556419B2 (en) * 2013-03-12 2017-01-31 Merial Inc. Reverse genetics Schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
CN104232587B (zh) * 2014-09-02 2016-08-17 中国检验检疫科学研究院 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的细胞系及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0811736B2 (ja) * 1986-08-07 1996-02-07 財団法人化学及血清療法研究所 牛流行熱・イバラキ病・アカバネ病３種混合不活化ワクチン
GB9110808D0 (en) * 1991-05-17 1991-07-10 Retroscreen Ltd Aids vaccine and method for its production
US6114108A (en) * 1995-08-29 2000-09-05 V.I. Technologies, Inc. Methods and compositions for the selective modification of viral nucleic acids
CA2681159A1 (en) * 2007-03-13 2008-09-18 Peros Systems Technologies, Inc. Immunoactive compositions for improved oral delivery of vaccines and therapeutic agents
EP2062594A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-27 Wyeth Farma, S.A. Bluetongue virus vaccine and immunogenic compositions, methods of use and methods of producing same
US9241960B2 (en) 2012-06-01 2016-01-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious Schmallenberg virus from cloned CDNAS and uses thereof
US9370562B2 (en) 2012-06-01 2016-06-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Schmallenberg virus (SBV) vaccine, methods of production, and uses thereof

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERND HOFFMANN, SCHEUCH MATTHIAS, H�PER DIRK, JUNGBLUT RALF, HOLSTEG MARK, SCHIRRMEIER HORST, ESCHBAUMER MICHAEL, GOLLER KATJA V.,: "Novel Orthobunyavirus in Cattle, Europe, 2011", EMERGING INFECTIOUS DISEASES, U.S. NATIONAL CENTER FOR INFECTIOUS DISEASES, vol. 18, no. 3, pages 469 - 472, XP055054135, ISSN: 10806040, DOI: 10.3201/eid1803.111905 *
ELLIOTT R M, BLAKQORI G, VAN KNIPPENBERG I C, KOUDRIAKOVA E, LI P, MCLEES A, SHI X, SZEMIEL A M: "Establishment of a reverse genetics system for Schmallenberg virus, a newly emerged orthobunyavirus in Europe.", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY., SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, SPENCERS WOOD., GB, vol. 94, no. Part 4, 1 April 2013 (2013-04-01), GB, pages 851 - 859, XP002700255, ISSN: 0022-1317, DOI: 10.1099/vir.0.049981-0 *
IKEGAMI, T. ; MAKINO, S.: "Rift Valley fever vaccines", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 27, 5 November 2009 (2009-11-05), AMSTERDAM, NL, pages D69 - D72, XP026694008, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.07.046 *
KERSTIN WERNIKE, VELJKO M. NIKOLIN, SILKE HECHINGER, BERND HOFFMANN, MARTIN BEER: "Inactivated Schmallenberg virus prototype vaccines", VACCINE, ELSEVIER, 1 May 2013 (2013-05-01), XP055070055, ISSN: 0264410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.062 *
KERSTIN WERNIKE;MICHAEL ESCHBAUMER;ANGELE BREITHAUPT;BERND HOFFMANN;MARTIN BEER: "Schmallenberg virus challenge models in cattle: infectious serum or culture-grown virus?", VETERINARY RESEARCH, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 43, no. 1, 11 December 2012 (2012-12-11), London, UK, pages 84, XP021134454, ISSN: 1297-9716, DOI: 10.1186/1297-9716-43-84 *
MUTIEN-MARIE GARIGLIANY; CALIXTE BAYROU; DBORAH KLEIJNEN; DOMINIQUE CASSART; SANDRA JOLLY; ANNICK LINDEN; DANIEL DESMECHT;: "Schmallenberg virus: A new Shamonda/Sathuperi-like virus on the rise in Europe", ANTIVIRAL RESEARCH, ELSEVIER BV, NL, vol. 95, no. 2, 25 May 2012 (2012-05-25), NL, pages 82 - 87, XP028426110, ISSN: 0166-3542, DOI: 10.1016/j.antiviral.2012.05.014 *
TOHRU YANASE; TOMOKO KATO; MAKI AIZAWA; YOZO SHUTO; HIROAKI SHIRAFUJI; MAKOTO YAMAKAWA; TOMOYUKI TSUDA: "Genetic reassortment between Sathuperi and Shamonda viruses of the genusin nature: implications for their genetic relationship to Schmallenberg virus", ARCHIVES OF VIROLOGY ; OFFICIAL JOURNAL OF THE VIROLOGY DIVISIONOF THE INTERNATIONAL UNION OF MICROBIOLOGICAL SOCIETIES, SPRINGER-VERLAG, VI, vol. 157, no. 8, 16 May 2012 (2012-05-16), Vi, pages 1611 - 1616, XP035091855, ISSN: 1432-8798, DOI: 10.1007/s00705-012-1341-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2872961A1 (en) 2013-12-05
AU2013267453B2 (en) 2017-04-06
US20130323277A1 (en) 2013-12-05
JP6250649B2 (ja) 2017-12-20
EP2855513B1 (en) 2016-12-07
WO2013181270A1 (en) 2013-12-05
IN2014DN08927A (ru) 2015-05-22
MX2014014521A (es) 2015-02-24
ES2617351T3 (es) 2017-06-16
PL2855513T3 (pl) 2017-05-31
US9872897B2 (en) 2018-01-23
JP2015519367A (ja) 2015-07-09
AR091240A1 (es) 2015-01-21
SG11201407619SA (en) 2014-12-30
DK2855513T3 (en) 2017-03-13
BR112014029515A2 (pt) 2017-07-25
EA201401352A1 (ru) 2015-05-29
EP2855513A1 (en) 2015-04-08
AU2013267453C1 (en) 2017-08-10
US9370562B2 (en) 2016-06-21
CN104350066B (zh) 2018-06-19
UY34840A (es) 2013-12-31
AU2013267453A1 (en) 2014-11-13
US20160250317A1 (en) 2016-09-01
CN104350066A (zh) 2015-02-11
MX363044B (es) 2019-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10953088B2 (en) Vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus
US9872897B2 (en) Schmallenberg virus (SBV) vaccine, methods of production, and uses thereof
CN107949398A (zh) 灭活的犬流感疫苗以及其制备方法和其用途
KR102243374B1 (ko) 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물
Wellenberg et al. Presence of European bat lyssavirus RNAs in apparently healthy Rousettus aegyptiacus bats
Rodríguez et al. Immune response of horses to inactivated African horse sickness vaccines
RU2701808C2 (ru) Вакцина широкого спектра действия против реовируса птиц
US8361776B2 (en) Adaptation of Pitman Moore strain of rabies virus to primary chick embryo fibroblast cell cultures
CN1929859A (zh) 抗睾丸bvdv感染的疫苗接种方法
KR102239927B1 (ko) 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물
TW201731526A (zh) 混成核心之貓科動物疫苗
RU2395297C1 (ru) Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота
US20240226270A1 (en) Novel Vaccine Compositions for Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Deltacoronavirus
US6833133B2 (en) Escape mutants of Newcastle disease virus as marker vaccines
Caveney Immune response of horses to inactivated African horse sickness vaccines
Barrat et al. Is it possible to vaccinate young canids against rabies and to protect them
김연희 Seroprevalence of five bovine arboviruses and development of inactivated trivalent vaccine for Aino, Akabane and Chuzan viruses in Korea
Eschbaumer Recent developments in immunoprophylaxis, diagnosis and epizootiology of bluetongue virus in Germany
El Daous Some Epidemiological Studies On Foot And Mouth Disease In Egypt
Madbouly et al. Preparation of inactivated tissue culture rabies vaccine adjuvanted with natural immune stimulants
Bhat et al. Enhanced Immune Responses and Protection Against Viral Challenge in Sheep with a Novel Nanoemulsion-Based Inactivated Bluetongue Virus Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM