本發明提供一種無佐劑多價貓科動物疫苗，其能夠減少與貓病毒性鼻氣管炎、杯狀病毒(包括但不限於毒性全身性貓杯狀病毒)及貓泛白血球減少症相關聯之感染的臨床徵象。本發明之組合物及方法提供與貓病毒性鼻氣管炎(FVR)、貓杯狀病毒(FCV) (包括毒性全身性杯狀病毒(VS FCV))及貓泛白血球減少症(FPV)相關聯之貓科動物疾病之治療。 定義 除非另有定義，否則在申請時本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的意義。術語之含義及範疇應為清楚的；然而，在任何潛在不明確性之情況下，本文所提供之定義優先於任何字典或外部定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。本文中除非另外說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式的使用不具限制性。本文所提及之所有專利及公開案以引用的方式併入本文中。 除非另外指示，否則本發明之實施將採用在此項技術內之分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習知技術。此等技術於文獻中充分解釋。參見，例如，Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第I、II及III卷, 第二版(1989)；DNA Cloning, 第I及II卷(D. N. Glover編1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL出版, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Methods In Enzymology系列(S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編, Oxford University Press IRL出版)；及Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications)。 可在本申請案中互換使用之「貓病毒性鼻氣管炎」或「FVR」係指由貓疱疹病毒導致之感染性疾病。本發明之FVR可為KV或MLV。然而，較佳的是，此分離株為MLV。本發明之FVR描述於US 4,287,178及US 4,031,204中，兩者特此以引用之方式併入本文中。合適的KV FVR寄存於10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209之美國菌種保存中心(ATCC)，且指定寄存編號VR 814。合適的MLV FVR於1982年12月9日寄存在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209之美國菌種保存中心(ATCC)，且指定寄存編號VR 815；且其為本發明之較佳FVR分離株。其他合適的FVR分離株描述於US 4,791,062、US5,374,424以及US 6,1070,103中，所有申請案特此以引用之方式併入。 所有可在本申請案中互換使用之「杯狀病毒」或「貓杯狀病毒」或「FCV」係指能夠突變成新的分離株的單鏈RNA病毒(參見，JN Burroughs等人，「Physio-chemical evidence for the re-classification of the caliciviruses」, J. Gen. Virol. 22: 281-286 (1974))，包括但不限於FCV-255、FCV-2280 (描述於US 4,522,810及US 6,231,863中，特此以引用之方式併入，且於1982年12月9日寄存在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209之美國菌種保存中心(ATCC)，且指定寄存編號VR-2057))、FCV-U1 (描述於US6,355,246中，特此以引用之方式併入)、FCV-Diva (描述於WO 2005/080416中，特此以引用之方式併入)、FCV-Kaos (描述於US 7,264,816及7,309,495中，兩者特此以引用之方式併入)、FCV-Bellingham、FCV-F9 (描述於US 3,944,469中，特此以引用之方式併入)、FCV-F4、FCV-M8以及FCV-DD1 (描述於US 8,685412及US 8,685,42中，兩者特此以引用之方式併入)。存在非出血性及出血性貓杯狀病毒(亦稱為毒性全身性貓杯狀病毒)。較佳地，本發明涵蓋出血性及非出血性貓杯狀病毒兩者(例如，FCV及VS FCV)。更確切而言，疫苗將包含FCV-DD1、FCV-255、FCV-2280及其組合。更佳地，疫苗將含有FCV-DD1與FCV-255之混合物。較佳地，本發明之FCV系列係不活化的或死的，且較佳地使用福馬林使不活化(參見以下不活化論述)。 在本申請案中可互換使用之「毒性全身性貓杯狀病毒」或「VS FCV」係指出血性貓杯狀病毒，且為在貓中導致出血熱症候群之非典型、罕見毒性且高傳染性形式的貓杯狀病毒(FCV)。FCV-DD1、FCV-Kaos以及FCV-Bellingham。FCV-Kaos於2004年9月9日寄存在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209之美國菌種保存中心(ATCC)，且經指定由寄存編號PTA-5798。較佳的是，在本發明中使用FCV-DD1。FCV-DD1於2004年9月9寄存在10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209之美國菌種保存中心(ATCC)，且指定寄存編號PTA-6204。 在本申請案中可互換使用之「貓泛白血球減少症」或「FPV」或「FPL」係指由貓科動物細小病毒導致之病毒。FPV亦稱為貓科動物感染性腸炎、貓科動物細小病毒腸炎、貓科動物共濟失調、貓科動物瘟熱或貓瘟。名稱「泛白血球減少症」係基於藉由受感染動物呈現之較低白血球計數(白細胞)。本發明之合適的FPV分離株描述於US 3,892,627、US 5,374,424及WO 93/01284中，所有申請案以引用之方式併入本文中。本發明之較佳FPV為MLV。Northmead實驗室在1967年自外表普通的小貓之貓科動物腎臟(FK)細胞培養物分離出較佳分離株。其藉由在貓科動物胚胎(KE10 及FK細胞系)中連續傳代來減毒。自澳大利亞Arthur Webster Pty Limited進口第51代病毒儲備液，並使其在克蘭德爾貓科動物腎(Crandell Feline Kidney，CRFK)細胞系中傳代一次。 在本申請案中皆可互換使用之「免疫原性或免疫組合物或疫苗」係指包含本發明之至少一種抗原或其免疫原性部分之物質的組合物，其引發細胞之宿主中之免疫反應或對組合物之抗體介導之免疫學反應。在本發明之一較佳實施例中，免疫原性組合物引起免疫反應，且更佳地，針對貓科動物感染賦予一或多種臨床徵象之保護性免疫。 如本文所用，「免疫原性」或「抗原」係指引發如本文中所描述之免疫學反應的多肽或蛋白質。此包括細胞及/或體液免疫反應。視組合物之預期功能而定，可包括一或多種抗原。「免疫原性」貓科動物蛋白質或多肽包括本文中所識別之貓科動物抗原中之任一者之全長序列或其類似物或免疫原性片段。在本申請案中可互換使用之術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指包括一或多種抗原決定基且因此引發本文中所描述之免疫學反應的抗原的片段或截短及/或經取代形式。一般而言，此類截短及/或經取代形式或片段將包含來自全長蛋白質之至少六個相鄰胺基酸。更佳地，截短或經取代形式或片段將具有來自全長蛋白質之至少10個、更佳至少15個及再更佳至少19個相鄰胺基酸。此類片段可使用此項技術中熟知之任意數目的抗原決定基定位技術識別。
參見
，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷 (Glenn E. Morris編, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性抗原決定基可藉由在固體載體上並行合成大量肽(該等肽對應於蛋白分子之部分)且使肽與抗體反應(而肽仍連接至載體)來測定。此類技術已知且在技術領域中係已知的且予以描述，
參見
，例如，美國專利第4,708,871號、Geysen等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002，以及Geysen等人(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類地似，藉由諸如利用例如x射線結晶學及二維核磁共振測定胺基酸之空間構形易於識別構形抗原決定基。
參見
Epitope Mapping Protocols，同前文獻。合成抗原亦包括在該定義內，例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他重組或合成衍生抗原。
參見
，例如，Bergmann等人(1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人(1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；以及Gardner 等人, (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日至7月3日。(其教示及內容均以引用的方式併入本文中。) 如本文中所使用，術語「疫苗」係指包含在動物中誘發免疫學反應之至少一種免疫活組分及(可能但不必要)一或多種增強活組分之免疫活性之一或多種額外組分的醫藥組合物。疫苗可另外包含對於醫藥組合物常見之其他組分。藉助於區別，疫苗之免疫活性組分可包含呈其原始形式或呈所謂經修飾之活疫苗(MLV)形式的減毒粒子的完整病毒粒子，或所謂死疫苗(KV)中藉由適當方法不活化之粒子。在另一形式中，疫苗之免疫活組分可包含生物體之適當要素(次單位疫苗)，其中此等要素藉由以下方法產生：破壞整個粒子或含有此類粒子之生長培養基且視情況選用之隨後產生所需結構的純化步驟；或包括藉由使用基於例如細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適合系統進行適當操縱的合成製程加上視情況選用之隨後分離及純化程序；或使用適合醫藥組合物直接併入遺傳物質，在需要疫苗之動物中誘發合成過程(聚核苷酸疫苗接種)。疫苗可包含一個或同時超過一個上述要素。如本文中所理解，術語「疫苗」為一種獸醫用的包含抗原物質的經修飾之活的減毒疫苗，且出於引起針對由貓科動物感染引起之疾病之特定及主動免疫來投與。不活化或減毒貓科動物疫苗(尤其如本文所描述之不活化或經修飾之活的減毒貓科動物疫苗)賦予主動免疫，該主動免疫可經由母體抗體針對其所含之免疫原及有時亦針對抗原相關生物體而被動地轉化。 如本文中所使用，同義地使用術語「不活化」或「死」。此項技術中已知不活化之各種物理及化學方法。術語「不活化」係指已經照射(紫外線(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或以化學方式處理以不活化或殺死同時保留其免疫原性之先前毒性或非毒性病毒或細菌。在一個實施例中，本文所揭示之不活化病毒藉由用不活化劑處理而不活化。適合之不活化劑包括β-丙內酯、二或β-或乙醯基-伸乙基亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(甲醛)。 對於藉由福馬林或甲醛不活化，甲醛通常與水及甲醇混合以產生福馬林。添加甲醇防止在活化過程期間降解或交叉反應。一個實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液以使病毒或細菌不活化。調整福馬林之量以確保使物質不活化，而不達到由高劑量引起很多副作用之程度係關鍵的。 另一合適的不活化方法為使用伸乙基亞胺及相關衍生物，諸如二伸乙基亞胺(BEI)及乙醯基伸乙基亞胺，該等物質為適用於使病毒不活化之以化學不活化劑之實例。其他化學不活化劑(例如β-丙內酯、醛類(諸如甲醛)及/或清洗劑(例如，TWEEN®清洗劑、TRITON® X或烷基三甲基銨鹽))亦可用來不活化病毒。可使用熟習此項技術者已知之標準方法進行不活化。樣本可以週期性時間間隔獲得且分析殘餘活病毒。監測適當細胞株所細胞病變效應及/或用適當特定單株或多株抗體進行螢光染色可用於偵測殘餘活病毒之存在。 可藉由將儲備BEI溶液(例如藉由將0.1-0.2 M 2-溴-乙胺氫溴酸鹽添加至0.1-0.2 N NaOH水溶液所形成之溶液)與病毒流體組合至約1-5 mM BEI之最終濃度來達成用BEI不活化。通常藉由將持續24至72小時混合的BEI-病毒混合物保持在35℃至40℃ (例如，37℃)下來進行不活化。病毒不活化可藉由將硫代硫酸鈉溶液添加至超過BEI濃度之最終濃度(例如添加17% BEI體積之硫代硫酸鈉以中和過量BEI)，接著混合來中止。 更特定而言，在病毒之情況下術語「不活化」意謂病毒不能在活體內或活體外複製，且對應地，在病毒之上下文中術語「不活化」意謂病毒不能在活體內或活體外再生。舉例而言，術語「不活化」可指已在活體外繁殖，且接著使用化學或物理方式不活化使得其不再能夠複製的病毒。在另一實例中，術語「不活化」可指已繁殖，且接著使用化學或物理方式去活化，產生病毒、病毒之片段或組分之懸浮液(諸如產生可用作疫苗組分之溶液)的病毒。 術語「活疫苗」係指包含活的，尤其活的病毒活性組分之疫苗。 「醫藥組合物」基本上由能夠改善其投與之生物體或存活在該生物體中或該生物體上之生物體的生理(例如免疫功能)的一或多種成分組成。該術語包括(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑，以及常用以達成諸如(但不限於)以下之某些其他目標之其他組分：加工特性、無菌性、穩定性、經由經腸或非經腸途徑(諸如經口、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或其他適合途徑)投與組合物之可行性、投與後耐受性或控制釋放特性。僅出於示範目的而給出的此類醫藥組合物之一個非限制性實例可如下製備：將感染細胞培養物之細胞培養上清液與穩定劑(例如亞精胺及/或牛血清白蛋白(BSA))混合且隨後藉由其他方法將混合物凍乾或脫水。在疫苗接種前，接著混合物在水性溶液(例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或非水性溶液(例如油乳液、基於鋁之佐劑)中復水。 如本文中所使用，「醫藥學或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗層、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例及尤其包括凍乾免疫原性組合物之彼等實施例中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。 「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸(EDTA)之鹼金屬鹽。 「經分離」意謂「人工」自天然狀態改變，亦即若其存在於自然界中，則其自其原始環境改變或移除或兩者。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽未「經分離」，但與其天然狀態之共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽「經分離」，如該術語在本文中所使用。 「減毒」意謂降低病原體毒性。在本發明中，減毒病毒為毒性已降低，從而使得其不引起貓科動物感染之臨床徵象，但能夠誘發標靶哺乳動物中之免疫反應的病毒，但亦可意謂與感染非減毒之野生型貓病毒且不接受不活化或減毒病毒之動物的「對照組」相比，臨床徵象在感染不活化或減毒貓病毒之動物中發生率或嚴重程度降低。在此背景下，術語「降低/經降低」意謂與如上所定義之對照組相比，降低至少10%，較佳25%，甚至更佳50%，再更佳60%，甚至更佳70%，再更佳80%，甚至更佳90%，且最佳100%。因此，不活化、減毒及/或無毒之貓科動物分離株為適合於併入包含不活化或經修飾之活組分之免疫原性組合物中的貓科動物分離株。 「減毒病毒」為活(「活」)病毒，其中例如經由在特定細胞系中傳代病毒，或經由病毒基因組之基因操作，傳染劑之毒性已降低。病毒之減毒是關於其毒性(病原性)，但不一定影響病毒之複製能力。減毒病毒仍能夠複製。因此，其可為病原性已降低，從而其將起始免疫反應而不會引起特定疾病的病毒株。在本發明之情形下，減毒病毒可為病原性已藉由使至少一種與毒性有關之基因或蛋白質不活化而消除或降低的貓病毒。在本發明中，「減毒」與「無毒」係同義的。在此背景下，術語「降低/經降低」意謂與對照組相比，病原性降低至少10%，較佳25%，甚至更佳50%，再更佳60%，甚至更佳70%，再更佳80%，甚至更佳90%，且最佳100%。 「經修飾之活的」意謂病毒之毒性已藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者降低，諸如包括(但不限於)細胞培養物中重複繼代；迫使適應在正常限定溫度下生長；用化學誘變劑處理以迫使大量突變及針對所需特徵進行選擇；以及使用rDNA技術缺失或插入。術語「非毒性」或「無毒」意謂經修飾之活病毒在投與時展現減少之感染臨床徵象或未展現感染臨床徵象。 「毒性」係指分離株造成與感染相關聯之疾病的能力。毒性可藉由觀測動物中之疾病進展來評估。「毒性」抗原或病原體病毒株之一實例為如本發明中描述及使用，藉由攻擊菌株例示的病毒株。 「無毒」係指缺乏毒性之病毒分離株。亦即，無毒病毒株、分離株或構築體為非致病性的且不能引起疾病。如本文所用，術語「無毒」與術語「非毒性」同義使用。 如本文所用，術語「病毒株」或「分離株」可互換使用。 如本文所用，術語「野生型病毒」尤其係指感染性病原病毒，其特別能夠致使貓科動物感染。 本文中，「有效劑量」意謂(但不限於)在抗原投與之動物中引發或能夠引發使得臨床症狀減輕之免疫反應之抗原的量。 在組合物之情況下，如本文所用，術語「有效量」意謂在動物中能夠誘發，降低感染或發生疾病之發生率或減輕嚴重程度的免疫反應之免疫原性組合物的量。詳言之，有效量係指以組織培養物感染劑量50或空斑形成單位/每劑量量測之力價。可替代地，在療法之情況下，術語「有效量」係指療法足以降低或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間，阻止疾病或病症進展，引起疾病或病症消退，防止與疾病或病症相關之一或多種症狀復發、顯現、發作或進展，或增強或改善另一療法或治療劑之預防或治療的量。 如本文所用，術語「對病毒具有免疫學反應性」意謂肽或片段引發針對病毒之免疫反應。 如本文所用，術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換且係指任何核酸。術語「核酸」及「聚核苷酸」亦特別包括由除五個生物存在之鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的鹼基構成之核酸。 「免疫反應」或「免疫學反應」意謂(但不限於)對所關注之組合物或疫苗形成細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫或免疫學反應包括(但不限於)一或多種以下作用：產生或活化特異性針對相關組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將呈現治療性或保護性免疫(記憶)反應，從而對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度將降低。此類保護將藉由以下證實：症狀次數、症狀嚴重程度減少，或缺乏與病原體感染相關之一或多種症狀，病毒血症發作延遲，病毒續存降低，整體病毒負荷降低及/或病毒分泌減少。 本文中，「特定免疫反應性」係指識別表徵貓科動物感染之免疫反應性蛋白或多肽並不與表徵嚴格攻擊控制之抗原反應。 「避免疾病」、「保護性免疫」、「官能性免疫」及類似短語意謂藉由投與一或多種本發明之治療組合物或其組合產生的針對疾病或病狀之反應，引起之有害作用比在暴露於疾病或感染之未免疫接種個體中預期的有害作用少。亦即，在經疫苗接種之個體中感染之有害作用的嚴重程度減輕。在經疫苗接種之個體中感染可減少、減緩或可能完全預防。本文中，在意謂完全預防感染的情況下，特別陳述其。若未陳述完全預防，則該術語包括部分預防。 本文中，「降低臨床徵象之發生率及/或嚴重程度」或「減少臨床症狀」意謂(但不限於)與野生型感染相比，減少一組中感染個體之數目，減少或消除展示感染臨床徵象之個體之數目，或降低一或多種個體中存在之任何臨床徵象之嚴重程度。舉例而言，其應係指病原體載入、病原體排出之任何減少、病原體傳播之減少或症狀性貓病毒性鼻氣管炎(FVR)、貓杯狀病毒(FCV) (包括毒性全身性杯狀病毒(VS FCV)及貓泛白血球減少症 (FPV))之任何臨床徵象的減少。 較佳地，與未接受組合物且感染之個體相比，接受本發明之治療性組合物的一或多種個體中此等臨床徵象減少至少10%。更佳地，接受本發明之組合物之個體中臨床徵象減少至少20%，較佳至少30%，更佳至少40%，且甚至更佳至少50%。 術語「提高之保護」在本文中意謂(但不限於)：分別在經疫苗接種組之個體對比未經疫苗接種對照組之個體中，與藉由傳染劑(較佳地貓科動物產生之FVR、FCV、VS FCV及/或FPV)感染之相關聯的一或多種臨床症狀統計學上顯著之減少。術語「臨床症狀統計學上顯著之減少」意謂(但不限於)在攻擊感染物後，經疫苗接種之個體組中至少一種臨床症狀之發生頻率比未經疫苗接種之對照組中低至少10%、較佳20%、更佳30%、甚至更佳50%及甚至更佳70%。 「持久保護」應係指持續至少3週、但更佳至少3個月、再更佳至少6個月之「改良功效」。就家畜而言，最佳持久保護應持續直至動物以肉出售之平均年齡。 如本文所用，術語「病毒血症」尤其理解為其中病毒粒子在動物、尤其貓之血流中再生及循環的病狀。 術語由病毒誘發之「病毒血症減少」意謂(但不限於)減少進入動物血流之病毒，其中與未接受組合物且可能感染之個體相比，接受本發明之組合物之個體的血清中病毒血症程度(亦即每毫升血清之病毒複本數目或每分升血清之空斑形成菌落數目)減少至少50%。更佳地，接受本發明之組合物之個體中病毒血症程度減少至少90%，較佳至少99.9%，更佳至少99.99%，且甚至更佳至少99.999%。 「安全性」係指在疫苗接種後經疫苗接種之動物中無包括(但不限於)以下之不良後果：基於細菌之疫苗可能恢復至毒性、臨床上顯著之副作用，諸如持續全身疾病或疫苗投與部位不可接受之發炎。 如本文所用，術語「接種疫苗(vaccination)」或「疫苗接種(vaccinating)」或其變體意謂(但不限於)：包括投與本發明之免疫原性組合物的一過程，當向動物投予其後，在動物中(直接地或間接地)引發或能夠引發免患病毒的免疫反應。 在本發明之上下文中，「死亡」係指由感染所致之死亡，且包括感染如此嚴重以至於將動物安樂死以防止受苦及為其生命提供人道終結的情形。 本發明之疫苗典型地包括用醫藥學上可接受之載劑調配的不活化或減毒之病毒。適於可注射使用之醫藥形式通常包括無菌水溶液(其中水溶)或分散液及用於臨用時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。調配物需應為無菌且流動性應達到容易注射之程度。劑型在製造及儲存條件下應為穩定的，且通常防止微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、其適合混合物及植物油之溶劑或分散介質。一種可能載劑為生理鹽溶液。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由各種抗菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(乙基汞硫代水楊酸鈉)、德黴素(deomycin)、慶大黴素及其類似物來防止微生物作用。在許多情況下，可較佳包括等張劑，例如糖或氯化鈉。可藉由在組合物中使用延緩吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射組合物之吸收。 本發明疫苗之單次劑量之體積可變化，但一般在習知疫苗中通常採用之範圍內。上述濃度下之單次劑量之體積較佳介於約0.1 ml與約3 ml之間，較佳地介於約0.2 ml與約1.5 ml之間，更佳地介於約0.2 ml與約0.5 ml之間。 可藉由任何便利之方式投與本發明之疫苗組合物。 組合物之投與個體較佳為貓。 本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。調配物應適合投與模式。 需要時，免疫原性組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 較佳投與途徑包括(但不限於)鼻內、經口、皮內及肌肉內。希望經肌肉內或陰道內、最佳以單劑量投與。熟練技術人員將認知，本發明之組合物亦可以一個、兩個或超過兩個劑量以及藉由其他投與途徑投與。舉例而言，此類其他途徑包括皮下、皮內、經靜脈內、血管內、動脈內、腹膜內、鞘內、氣管內、皮內、心臟內、葉內、小葉內、髓內、直腸內、陰道內或肺內。視治療之所需持續期間及效力而定，根據本發明之組合物可投與一次或若干次，亦間歇地，例如按每天持續若干天、若干週或若干月且以不同劑量。 本文所述之化合物可以治療有效劑量投與個體以治療貓科動物相關之疾病。劑量將視接受疫苗之宿主以及諸如宿主大小、體重及年齡之因素而定。 組合物之免疫原性可藉由使用此項技術中已知之任何免疫分析監測測試個體在用該組合物免疫接種後之免疫反應來測定。體液(抗體)反應及/或細胞介導之免疫性的產生可視為免疫反應之指示。測試個體可包括動物，諸如豬、小鼠、倉鼠、狗、貓、兔、牛、馬、綿羊，及家禽(例如雞、鴨、鵝及火雞)。 測試個體之免疫反應可藉由如下各種方法分析：所得免疫血清對免疫原性結合物之反應性如藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫墨點、免疫沈澱反應等已知技術分析；或藉由保護經免疫接種之宿主避免感染病原體及/或經免疫接種之宿主中由病原體感染引起之症狀減弱如藉由此項技術中已知之用於分析感染病病原體劑之含量，例如細菌含量(例如藉由培養來自個體之樣品)的任何方法或此項技術中已知之其他技術來判定。感染病病原體劑之含量亦可藉由量測免疫球蛋白所針對之抗原之含量來判定。感染病病原體之含量降低或感染病病原體之症狀改善指示組合物為有效的。 可在動物或人類中活體內使用前，在活體外測試本發明之治療劑的所需治療或預防活性。舉例而言，可用於判定是否指示投與特定治療劑之活體外分析法包括活體外細胞培養分析法，其中來自自患有特定疾病或病症之個體培養之細胞株或細胞的適當細胞暴露於或以其他方式投與治療劑，且觀測治療劑對細胞之作用。 或者，治療劑可藉由以下分析：使治療劑與易感染感染病病原體但未感染感染病病原體之細胞(自個體培養或來自培養細胞株)接觸，使細胞暴露於感染病病原體，且接著確定與治療劑接觸之細胞的感染率是否低於不與治療劑接觸之細胞之感染率。用感染病病原體感染細胞可藉由此項技術中已知之任何方法分析。 另外，治療劑可藉由在療法前、在療法期間或療法後以適合時間間隔量測動物模型或人類個體中抗體所針對之分子之含量來評估。可鑑別分子之量的任何改變或缺乏改變，且與治療對個體之作用相關。分子含量可藉由此項技術中已知之任何方法來測定。 在使用本發明之方法及組合物向動物接種疫苗貓科動物疫苗或免疫原性組合物之後，可使用此項技術中已知之結合分析來分析所得抗體與特定分子之間的結合。亦可進行此等分析來選擇對特定抗原展現較高親和力或特異性之抗體。 一般而言，病毒之減弱可自致病性病毒株，藉由在容許病毒之適合宿主細胞中重複繼代，直至病毒展示所需特性來產生(WO 92/21375、WO 93/06211、WO93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930)。或者，其可藉由基因工程再改造，經由使用感染性純系，通常病毒基因組之全長互補DNA轉錄物來產生(WO 98/18933、EP 1 018 557、WO 03/062407、Nielsen等人, J Virol 2003, 77:3702-371 1)。另外，病毒可在非天然生理條件下傳代，該等非天然生理條件包括(但不限於)經調節之溫度、來自非宿主物種之細胞或在誘變劑存在下。 本發明延伸至經由以一致或相異形式增殖(propagation)或繁殖(multiplication)衍生自病毒株的貓科動物毒株，尤其具有寄存病毒株之基本特徵之後代。當繼續增殖時，該等病毒株可獲得大部分將不會顯著地改變此等病毒株之性質之突變。 本發明之分離株亦可進一步經修飾以賦予其進一步合乎需要之特性。此可藉由經典增殖及選擇技術達成，如在適合宿主細胞持續增殖以擴大減毒表型。或者，分離株可藉由用適合基因工程改造技術對此等病毒株之基因組之核酸序列進行定向突變來遺傳修飾。 適合於本發明疫苗之本發明之貓科動物毒株可藉由此項技術中已知之方法，例如藉由在適合宿主細胞中增殖來生長及收穫。 詳言之，如本文所提及之疫苗為活疫苗及/或經修飾之活疫苗減毒的疫苗。可藉由此項技術中已知之方法(例如藉由在合適的細胞中增殖)來生長及收穫根據本發明之貓科動物之病毒株，經修飾之活疫苗(MLV)典型地被調配以准許以10
1
個至10
7
個病毒粒子每劑量，較佳地以10
3
個至10
6
個粒子每劑量，且更佳以10
4
個至10
6
個粒子每劑量投與(4.0-6.0 log
10
TCID
50
)。 由自使用本發明之貓科動物胜肽而產生的抗體或其結合部分適用於偵測樣本中病毒之存在。此偵測方法包含如下步驟：提供針對本發明之貓科動物肽培養的經分離之抗體或其結合部分，添加經分離之抗體或其結合部分至懷疑含有一定量病毒之樣品中，且偵測包含經分離之抗體或其結合部分與病毒結合之複合物的存在。 本發明之抗體或其結合部分亦可用於偵測樣品中肽之存在。此偵測方法包含以下步驟：提供提高抗肽之經分離抗體或其結合部分，向疑似含有一定量肽之樣本添加經分離抗體或其結合部分，以及偵測包含經分離之抗體或其結合部分與病毒結合之複合物的存在。 結合作為結合對一員之特定分子的免疫球蛋白、尤其抗體(及其功能活性片段)可用於診斷及預後，如本文所述。在各種實施例中，本發明提供結合對之一員之量測，及此類量測在臨床應用中之使用。在本發明中免疫球蛋白可用於例如偵測生物樣品中之抗原，藉此可測試個體之免疫球蛋白結合之分子的異常含量，及/或此類分子之異常形式的存在。「異常含量」意謂相對於來自身體一部分或來自未患病之個體的類似樣本中存在的含量或代表存在的含量之標準含量增加或降低。本發明之抗體亦可作為用於診斷或預後技術之套組中的試劑而包括在內。 在一個態樣中，免疫特異性結合至肽之本發明之抗體可用於貓科動物感染之診斷、預後或篩檢。 在另一態樣中，本發明提供用於診斷或篩檢貓科動物感染或對其免疫之方法，該方法包含：量測個體中抗體與衍生自個體之樣本的免疫特異性結合程度，其中抗體免疫特異性地結合肽；其中該免疫特異性結合程度相對於自未施用感染性疾病藥劑之個體的類比樣本中的該免疫特異性結合程度提高，指示貓科動物感染或對其免疫之存在。 偵測貓科動物肽或其拮抗劑存在之適合分析之實例包括(但不限於)ELISA、放射免疫分析、凝膠擴散沈澱反應分析、免疫擴散分析、凝集分析、螢光免疫分析、蛋白A免疫分析或免疫電泳分析。 特定分子之免疫分析將通常包含在可偵測地標記之抗體存在下培育樣本，諸如生物流體、組織提取物、新鮮收穫之細胞或培養細胞之溶解物，且藉由此項技術中熟知之許多技術中的任一者偵測結合之抗體。 可根據熟知之方法來測定給定抗體之結合活性。熟習此項技術者將能夠藉由使用常規實驗來判定每次測定之操作及最佳分析條件。 本發明之另一態樣係關於用於偵測或量測病毒之診斷套組。提供用於診斷使用之套裝，其在一或多種容器中包含抗肽抗體及(視情況存在之)該抗體之標記結合搭配物。或者，該抗肽抗體可被標記(用可偵測之標記物，例如化學發光、酶、螢光或放射性部分)。因此，本發明提供一種診斷套組，其包含抗貓科動物肽抗體及對照免疫球蛋白。在一特定實施例中，容器之以上化合物之一可被可偵測地標記。套組可視情況在容器中進一步包含預定量之由套組之抗體識別的肽，其用作標準或對照。 本發明之另一實施例包括用於疫苗接種貓以免患與貓科動物科動物相關聯之疾病的套組，其包含：能夠向貓投與疫苗之分配器，及如本文所描述之本發明之疫苗。 實例 包括以下實例以證實本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人發現在本發明實施中起良好作用之技術，且因此可視為構成其較佳實施方式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。 實例1：經VS Code 16D7.20進行疫苗接種之組與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組之間的貓泛白血球減少症病毒(FPV)抗體力價之比較性血清學評估 此研究之目標係藉由比較性血清學分析，針對過度干擾的缺乏來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(測試組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(參考組)之間的FPV抗體力價。過度干擾的缺乏藉由接種疫苗後測試組FPV GMT相對於參考組FPV GMT之非劣性來支援。 此研究之事件計劃表與以下事件計劃表之計劃表一致 表1：事件計劃表
實驗性疫苗(EV)為使用FVR病毒株PM、FPV病毒株E以及FCV病毒株DD1及255之貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)。兩個FCV片段含有最小免疫劑量之各片段且FVR片段及FPV片段為釋放力價。所有四個組分均呈凍乾形式。在D0及D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.6 mL無菌稀釋劑復原。 對照產物(PC)為貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗經修飾之活病毒。PC經調配而含有大致與EV相同滴定之FVR及FPV片段，且採用針對EV產物而生產的相同的主體材料。兩種組分呈凍乾形式。在D0及D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.6 mL無菌稀釋劑復原。此為在宿主動物中進行之盲接種疫苗研究。該研究為完全或不完全隨機區設計。該實驗性單元為個別貓科動物。 四十四隻符合條件的貓科動物被分組至窩(litter)內的兩區，並被分配至研究1區內之治療組。額外44隻符合條件的貓科動物被分組至窩內的兩區，並被分配至研究2區內之治療組。每一區含有一個接種疫苗者及一個對照者。將兩個研究之研究群合併，以獲得用於此研究FPV血清學。研究1之貓科動物在拖車64圍欄1至6中成群圈養並混合，或在圍欄7 (貓科動物126、PC組、D20至D42)中單獨圈養。研究2之貓科動物在拖車63圍欄1至6中成群圈養並混合。用標準市售飼料與水及可得之食物隨意餵養貓科動物。 藉由觀測，研究1及2中之貓科動物在D-1時FPV血清反應呈陰性(SN ≤2)且健康。一旦研究開始，無貓科動物自該研究移除。 EV組(組T02)中之每一動物於D0及D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV SC。PC組(組1)中之每一動物於D0及D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之PC SC。在第-1天、第7天、第14天、第20天、第28天、第25天及第42天，自參加每一研究之每一貓科動物採集大約5 mL全血入血清分離管(SST)中。使SST中之血液在室溫下凝結。短暫離心來自研究1及2之血液樣本，且血清經收穫、分離並轉移至三個合適的試管中。每一治療組中至少75%之貓科動物必須在D42之前對FPV(SN ≥ 1:8)產生抗體以使研究有效。若每一治療組中少於75%之貓科動物未能在D42之前產生抗體，則研究無效。 在與參考組相比的情況下，評估FPV組份之自測試組之宿主動血清學反應的非劣性。藉由在經EV進行疫苗接種之宿主動物組中產生之FPV組份的GMT反應不劣於經PC進行疫苗接種之組之GMT反應不超過等效界值。在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FPV GMT而將等效界值設為EV組之FPV GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 藉由在D35或D42時死杯狀病毒片段對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FPV片段的血清學反應之過度干擾之缺乏的論證支援「有助於預防由貓泛白血球減少症病毒所致之疾病」的標示值。 在廣義線性混合模型中評定抗體力價之非劣性；其中血清力價之對數為因變數，治療、時間及治療時間交互作用作為自變數包括其中，每日重複測量。窩(Litter)作為隨機因素包括其中。 由線性模型在每一時間點產生EV與PC疫苗組之間的最小二乘平均值及90%置信區間。針對多次比較而調節置信區間。相比PC組之EV組之血清力價的幾何平均值，針對多樣性的經調節的下限之反對數提供同時較低90%置信界限。等效界值設為63%。 個別FPV血清學結果呈於章節16.3，表10至表11中。所有貓科動物在D-1時FPV SN力價＜ 2，且所有貓科動物在D42時FPV SN力價＞ 8。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FPV SN力價分別為90,175.67及81,208.64。EV組及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.89之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FPV SN力價分別為109,818.90及104,930.94。EV組及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.80之比率。 此研究之目標係藉由比較性血清學分析，針對過度干擾的缺乏來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(EV組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(PC組)之間的FPV抗體力價。在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FPV GMT而將等效界值設為EV組之FPV GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 選擇第35天及第42天來分析死FCV抗原對FPV MLV片段之血清學反應之干擾的缺乏。第35天及第42天分別對應於增強接種疫苗後第2週及第3週。預期，對死抗原之最大免疫反應將為此等時間點；且若對MLV片段產生任何干擾，則其將最可能在此等時間偵測到。由於此相同原因，未分析D35之前的其他時間點。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FPV SN力價分別為90,175.67及81,208.64。EV及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.89之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FPV SN力價分別為109,818.90及104,930.94。EV及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.80之比率。 FPV SN血清學之D35之0.89的比率且D42之0.808的比率支援：兩種劑量之死FCV抗原未對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FPV MLV片段造成過度干擾。 實例2：經本發明之疫苗進行疫苗接種之組與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組之間的貓病毒性鼻氣管炎(FVR)抗體力價之比較性血清學評估 此研究之目標係藉由比較性血清學分析，針對過度干擾的缺乏來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(測試組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(參考組)之間的貓病毒性鼻氣管炎(FVR)抗體力價。 事件計劃表與描述於實例1中之事件計劃表相同。實驗性疫苗(EV)為具有FVR病毒株PM、FPV病毒株E以及FCV病毒株DD1及255之貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)。兩個FCV片段含有最小免疫劑量之各片段且FVR片段以及FPV片段為釋放力價。所有四個組分均呈凍乾形式。在D0及D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經大約0.6 mL無菌稀釋劑復原。 對照產物(PC)為貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗經修飾之活病毒。PC經調配而含有大致與EV相同滴定之FVR及FPV片段，且採用針對表3中之EV產物而生產的相同主體材料。兩種組分呈凍乾形式。在D0及D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經大約0.6 mL無菌稀釋劑復原。 八十八隻符合條件的貓科動物被分組成兩個區，並被分配至如實例1中之研究的研究方案所描述之治療組中。每一區含有一個接種疫苗者及一個對照者。如對彼等研究描述，針對血清學評估利用整個研究群。對於實例1中之攻擊研究而言，研究群被隨機細分成每組至少20個區之兩個組。將至少20個區之每一組分配至兩個攻擊研究中之一者，如實例1中之研究的研究方案所概述。如實例1中闡述圈養貓科動物，且藉由觀測其必須在Day-1時FVR血清反應已呈陰性(SN ≤2)。 在D0及D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.6 mL無菌稀釋劑復原。每一貓科動物於D0在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV或PC SC，並於D21接受相同治療及劑量之增強接種疫苗。 在第-1天、第7天、第14天、第20天、第28天、第25天及第42天，自參加研究2013080及研究2013081之每一貓科動物採集大約5 mL全血入血清分離管中。使SST中之血液在室溫下凝結。短暫離心來自研究2013080及研究2013081之血液樣本，且血清藉由BIVI-R&D實驗室人員收穫、分離並轉移至三個適合的試管中。將每一試管標記貓科動物之ID編號、研究編號(研究2013080：一個試管2013080、一個試管2013082以及一個試管2013083；研究2013081：一個試管2013081、一個試管2013082以及一個試管2013083)、收集日期、研究日以及樣本類型。使血清樣本保持在-70±10℃下直至測試。 血清中和(SN)分析用於量測在第-1天、第35天及第42天所採集之樣本之對FPV的抗體力價。簡而言之，使此研究3所敍述之加熱不活化血清的序列兩倍稀釋液與相同體積之病毒懸浮液(100 TCID50至300 TCID50)混合。使血清病毒混合物在35±2℃下培育60±10分鐘，並接著接種到活躍的克蘭德爾貓科動物腎(CRFK)分裂細胞上。在96孔組織培養盤中進行分析。使培養盤在潮濕CO
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培育箱(5±2% CO
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)中培育6±1天。使用與螢光染料結合之特定FPV抗體藉由免疫螢光藉由偵測CRFK細胞中之病毒感染來讀取培養盤。根據Reed及Muench法來計算SN抗體力價(TCID50/mL)。 每一治療組中至少75%之貓科動物必須在D42之前對FVR (SN ≥ 1:2)產生抗體以使研究有效。若每一治療組中少於75%之貓科動物未能在D42之前產生抗體，則測試無效。 在與參考組相比的情況下，評估FVR組份之自測試組之宿主動血清學反應的非劣性。藉由在接種疫苗有EV之宿主動物組中產生之FVR組份的幾何平均血清學力價(GMT)反應必須不劣於經疫苗接種PC組之GMT反應不超過等效界值。 在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FVR GMT而將等效界值設為EV組之FVR GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 藉由在D35或D42時死杯狀病毒片段對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FVR片段的血清學反應之過度干擾之缺乏的論證支援「有助於預防由貓病毒性鼻氣管炎所致之疾病」的標示值。 在廣義線性混合模型中評定抗體力價之非劣性；其中血清力價之對數為因變數，治療、時間及治療時間交互作用作為自變數包括其中，每日重複測量。窩作為隨機因素包括其中。 由線性模型在每一時間點產生最小二乘平均值及EV與PC疫苗組之間的差的90%置信區間。針對多次比較而調節置信區間。相比PC組之EV組之血清力價的幾何平均值，針對多樣性的經調節的下限之反對數提供同時較低90%置信界限。等效界值設為63%。 所有貓科動物在D-1 FVR SN力價＜ 2，且所有貓科動物在第42天FVR SN力價＞ 2。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FVR SN力價分別為23.0847及19.3156。D35 90%低置信區間之比較現實出0.94之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FVR SN力價分別為19.8826及16.2753。D42 90%低置信區間之比較現實出0.91之比率。 此研究之目標係藉由比較性血清學分析，針對過度干擾之缺乏來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒) VS Code 16D7.20進行疫苗接種之組(EV組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(PC組)之間的貓泛白血球減少症病毒(FPV)抗體力價。 每一組之所有貓科動物在D42之前對FPV(SN＞2)產生抗體，由此符合有效研究之準則。 選擇第35及第42天來分析死FCV抗原對FVR MLV片段之血清學反應之干擾的缺乏。第35天及第42天分別對應於增強接種疫苗後第2週及第3週。預期，對死抗原之最大免疫反應將為此等時間點；且若對MLV片段產生任何干擾，則其將最可能在此等時間下被偵測到。由於此相同原因，未分析D35之前的其他時間點。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FVR SN力價分別為23.0847及19.3156。EV組及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.94之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FVR SN力價分別為19.8826及16.2753。EV及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.91之比率。 FVR SN血清學之D35之0.94的比率且D42之0.91的比率支援：兩種劑量之死FCV抗原未對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FVR MLV片段造成過度干擾。 實例3：貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之貓杯狀病毒病毒株DD1片段之功效的評估 此研究之目的係評估在用毒性全身性FCV攻擊之後貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之貓杯狀病毒(FCV)病毒株DD1片段(最小免疫劑量)之功效。令人滿意地完成此研究目標及功效之證實將支援預防由毒性全身性貓杯狀病毒所致之疾病的標示值。 達成令人滿意之功效及預防由毒性全身性貓杯狀病毒所致之疾病的標示值之規則係：與對照產物(PC)組相比，實驗性疫苗(EV)組必須針對FCV臨床疾病顯示≥ 80%的預防分數。此外，分析組之間的口/鼻排出物之量值以獲得支援性資料及可能的額外標示值。 此研究之事件計劃表呈現於表2中。 表2：動物事件之計劃表
此研究中之實驗性疫苗(EV)為含有FVR病毒株PM、FPV病毒株E以及FCV病毒株DD1及255之貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)。調配EV，其中兩個FCV片段含有最小免疫劑量之各片段且FVR片段以及FPV片段為釋放力價。所有四個組分均呈凍乾形式。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。在D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.6 mL無菌稀釋劑復原。 對照產物(PC)為含有VR病毒株PM及FPV病毒株E之貓鼻氣管炎泛白血球減少症疫苗經修飾之活病毒。PC調配物含有大致與EV產物相同滴定之FVR及FPV片段。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。在D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.6 mL無菌稀釋劑復原。 攻擊材料(VS FCV)為病毒株DD1。在攻擊之日，解凍足夠體積之攻擊材料並用最小必需培養基(MEM)稀釋至大約1×105.5-6.5 TCID50/mL之目標劑量。製備足夠量的材料用於滴定及攻擊程序。在攻擊之日，滴定經稀釋的前攻擊材料及後攻擊材料。在MEM中進行攻擊材料之十倍連續稀釋液。將每一稀釋液添加至含有CRFK細胞之96孔培養盤中。使培養盤在35℃±2℃培育3至5天。觀測培養盤之FCV感染的細胞病變效應特徵。根據Reed及Muench法計算力價(TCID50/mL)。攻擊材料平均力價為1×105.7 TCID50/mL。 該實驗性單元為個別貓科動物。如可能，八十八隻合格的貓科動物被分組至窩內的兩區。貓科動物被隨機分配至一區中兩個治療組(一個PC及一個EV)之一。研究群被隨機細分成每組至少20區之兩組。至少20區之各組被分配至兩個攻擊研究(研究5及研究6)之一。 貓科動物在建築132隔離室6及8中成群圈養並混合。在D0時，室6中有21隻貓科動物(EV=11，PC=10)，且室8中有22隻貓科動物(EV=11，PC=11)。此等隔離室中之每一者係動物生物安全程度-2 (ABSL-2)。圈養空間遵從動物福祉之適用法規。 用標準市售飼料與水及可得之食物隨意餵養貓科動物。若在場獸醫與研究監管者協商之後認為必要，則對需要醫療照顧之貓科動物處理。若在場獸醫認為必要，則將研究過程期間死亡、瀕死及安樂死之任何動物驗屍並獲取組織，以判定死因。 藉由觀測貓科動物為FCV血清陰性(SN ≤2)、口/鼻拭子之FCV陰性且健康以包括在此研究內。 如在場獸醫所判定，在研究開始之前貓科動物健康及營養狀態良好。在每一血液採集之前，用氯胺酮及布托啡諾IM注射以鎮靜貓科動物。在D-1由在場獸醫對每一可能的貓科動物候選者進行體檢。此研究僅包括體檢認為健康之貓科動物。 在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之EV或PC凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。每一貓科動物在背側肩胛區域接受0.6 mL劑量之EV或PC SC。在D49時鎮靜/麻醉每一貓科動物。在採集血液及口/鼻拭子樣本之後，每一貓科動物接受0.25 mL每鼻孔及經口0.5 mL之攻擊材料。 自D47至D63藉由研究調查員每天一次觀測貓科動物，以觀測與VS FCV相關聯之臨床徵象。觀測包括： 鼻部排泄物：0 = 無任一鼻孔出現排泄物；1 = 注意到一個或兩個鼻孔出現水樣排泄物(Serous discharge)；2 = 注意到一個或兩個鼻孔出現黏液樣排泄物(Mucoid discharge)；且3 = 注意到一個或兩個鼻孔出現黏膿樣排泄物(Mucopurulent discharge)。 眼部排泄物：0 = 無任一眼睛出現排泄物；1 = 注意到一隻或兩隻眼睛出現水樣排泄物；2 = 注意到一隻或兩隻眼睛出現黏液樣排泄物；且3 = 注意到一隻或兩隻眼睛出現黏膿樣排泄物。 噴嚏：0 = 在臨床觀測期間未注意到噴嚏；1 = 在臨床觀測期間注意到非排痰性噴嚏；且2 = 在臨床觀測期間注意到劇烈的排痰性噴嚏爆發。 口潰爛：0 = 在口或外部黏膜上未出現潰爛；1 = 大小＜ 4 mm之一或多種潰爛(小)；且2 = 大小≥4 mm之一或多種潰爛(大)。 臉部、四肢或耳廓水腫：0 = 無臉部、四肢或耳廓水腫；1 = 輕度水腫，藉由觸診臉部、四肢、耳廓區域幾乎無法偵測到；2 = 中度水腫，藉由觸診臉部、四肢或耳廓區域容易偵測到，但貓科動物在檢查台上觀測時肉眼不可見；且3 = 重度水腫，在臉部、四肢或耳廓區域肉眼可見。膿皮症或禿頭症：0 = 未出現膿皮症或禿頭症；1 = 輕度膿皮病或禿頭症，單處出現且直徑＜1 cm；2 = 中度膿皮症或禿頭症，單處出現且直徑≥ 1 cm或多處出現且直徑＜1 cm；且3 = 重度膿皮症或禿頭症，多處出現且直徑≥ 1 cm。死亡(死亡或安樂死)：0 = 否，且1 = 是。 EV組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV SC。PC組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之PC SC。 自D46至D63藉由研究調查員每天一次獲取直腸溫度。 在第-1天、第7天、第14天、第20天、第28天、第35天、第42天、第49天、及第63天，由研究調查員自每一貓科動物將大約5 mL全血採集在血清分離管中。 短暫離心血液樣本，且血清藉由BIVI-R&D實驗室人員收穫、分離並轉移至三個適合的試管中。使血清樣本保持在-70±10℃下直至測試。 血清中和(SN)分析用於量測自此研究所敍述之樣本之對FCV的抗體力價。簡而言之，使加熱不活化血清之序列兩倍稀釋液與相同體積之病毒懸浮液(50至400 TCID
50
)混合。使血清病毒混合物在35± 2℃下培育60±10分鐘，並接著接種到克蘭德爾貓科動物腎(CRFK)細胞之細胞單層上。在96孔組織培養盤中進行分析。使培養盤在潮濕CO
2
培育箱(5± 2%CO
2
)中培育4 ±1 天，並觀測表徵為FCV感染之細胞病變效應。根據Reed及Muench法來計算該SN抗體力價(TCID
50
/mL)。 藉由研究調查員或受派人員在D-1及自D49至D63採集口/鼻拭子樣本。用棉尖拭子擦刷兩個鼻孔之黏膜、牙齦周圍及舌頭下部，並將其放置於試管中。每一試管含有含100 µg/mL慶大黴素之2.0 mL MEM。將每一試管標記研究編號、動物ID編號、收集日期、研究日及樣本類型。 使拭子/試管在≤-50℃下冷凍，直至測試樣本。將拭子/試管造36±1℃水浴中快速解凍，並接著藉由渦流混合樣本。液體自拭子擠出，經0.45 µm濾紙過濾並經含有100 µg/mL慶大黴素之MEM序列稀釋。將每一稀釋液的十分之一mL覆疊在生長在96孔一次性微量滴定培養盤中的CRFK細胞之亞匯合單層上。使培養盤在36 ± 1℃下培育3至4天，並觀測表徵為FCV感染之細胞病變效應。根據Reed及Muench法來計算力價(TCID
50
=/mL)。 研究係有效之準則為：在D-1時，所有貓科動物必須為FCV抗體呈陰性(SN ≤ 2)且口/鼻拭子必須為FCV呈陰性；在研究之攻擊前階段期間，所有PC貓科動物必須保持FCV血清反應呈陰性(SN ≤ 2)；且大於或等於80%之PC貓科動物必須符合FCV感染之陽性臨床案例定義。 為了判定是否達成支援預防由VS FCV所致之疾病的標示值之功效，基於以下案例定義來判定陽性及陰性VS FCV臨床案例之數目： VS FCV陽性臨床案例定義為：若其證實以下後攻擊，則將貓科動物列為VS FCV陽性臨床疾病： 死亡：貓科動物死亡或經安樂死，且屍體解剖結果符合VS FCV疾病(肺出血性或實質性病變、皮下水腫)；抑或無死亡且貓科動物證實在直腸溫度≥105.5℉下下列臨床徵象中之至少一者持續兩天或大於兩天以及高於基線(D46至D49)至少一度：臉部四肢或耳廓水腫由輕度至重度、膿皮症或禿頭症由輕度至重度，或口潰爛。 VS FCV陰性臨床案例定義：無死亡且貓科動物證實在直腸溫度≥105.5℉下下列臨床徵象持續不超過一天以及高於基線(D46至D49)至少一度：臉部、四肢或耳廓水腫由輕度至重度、膿皮症或禿頭症由輕度至重度，或口潰爛。 將每一貓科動物之FCV之排出量評估為次要結局。FCV之排出量係基於自口/鼻拭子樣本獲得之每日TCID50/mL結果。達成令人滿意之功效及預防由VS FCV所致之疾病的標示值之規則係：與PC組相比，EV組必須針對VS FCV臨床疾病顯示≥80%的預防分數。 分析口/鼻排出物，且達成有助於減少口/鼻排出物之標示值的規則係：與PC組相比，EV組之每日平均TCID50/mL值顯著降低(p≤0.05)。 對於出現臨床疾病而言，在以出現臨床疾病(是 = 1或否 = 0)為二項因變數且治療作為自變數包括其中的廣義線性混合模型中來比較治療組之間的符合由VS FCV所致之臨床疾病的規則的貓科動物之數目。區變數(窩)作為隨機因素包括在模型中。分析利用二項分佈及羅吉特聯繫(logit link)。基於自此分析之參數估計值來計算預防分數(針對窩而調節)。 為了評估病毒排出量，在以每日病毒性價為因變數且治療、時間及治療時間相互作用作為自變數包括其中的廣義線性混合模型中來比較治療組之間的病毒每日排出量，每天重複量測。區變數(窩)作為隨機因素包括在模型中。所利用之共變數結構係非結構化的。自線性模型評估最小二乘平均值之天數內的差。 二十隻PC貓科動物中的十三隻及二十一隻EV貓科動物中的一隻在攻擊後至少持續兩天呈現直腸溫度＞105.5℉及高於基線(自D46至D49之平均直腸溫度)至少一度。二十隻PC貓科動物中的十四隻及二十一隻EV貓科動物中的0隻在攻擊後至少持續兩天呈現臉部、四肢或耳廓水腫。無貓科動物在攻擊後至少持續兩天呈現膿皮症/禿頭症。二十隻PC貓科動物中的八隻及二十一隻EV貓科動物中的0隻至少持續兩天呈現口潰爛。 二十隻PC貓科動物中的四隻及二十一隻EV貓科動物中的零隻在攻擊後至少持續一天呈現黏液樣或黏膿樣鼻部排泄物。零隻貓科動物在攻擊後至少持續一天呈現黏液樣或黏膿樣眼部排泄物。二十隻PC貓科動物中的七隻及二十一隻EV貓科動物中的零隻在攻擊後至少持續一天呈現劇烈排痰性噴嚏爆發。 總體而言，20隻PC貓科動物中的20隻及21隻EV貓科動物中的1隻符合如上述章節11.2中之FCV臨床案例定義。經評估預防分數為0.95 (95%置信區間[CI] 0.76，1.00)。 個別口/鼻拭子FCV力價資料(在攻擊後的PC口/鼻拭子中偵測到的病毒之最小二乘平均值)介於0.000至≥4.5 log10 TCID50/mL。在攻擊後的EV口/鼻拭子中偵測到的病毒之最小二乘平均值介於0.000至4.2 log10 TCID50/mL。與PC組相比，在第51、52及54-61天EV組經口/經鼻排出之病毒量顯著較低(p≤0.0061)。在D50、D53、D62及D63時，未在組之間偵測到病毒之口/鼻排出的不同(p≥0.0662)。 所有貓科動物在D-1 FCV血清反應呈陰性，且所有PC貓科動物在整個攻擊日(D49)保持FCV血清反應呈陰性。實驗性疫苗貓科動物在第一次接種疫苗後呈現弱血清轉化，並在第二次接種疫苗之後呈現強血清轉化。在攻擊十四天之後(D63)，所有剩餘貓科動物呈現強FCV血清轉化。 此研究之目標係在用VS FCV攻擊之後評估貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FCV病毒株DD1片段(最小免疫劑量)的功效。 所有貓科動物在D-1對FCV抗體呈血清陰性(SN ≤ 2)且口/鼻拭子對FCV呈陰性；所有PC貓科動物在研究之攻擊前階段期間保持FCV血清反應呈陰性(SN ≤ 2)，且＞80%之PC貓科動物符合VS FCV感染之陽性臨床案例定義。此等結果突出表明符合研究係有效之準則。 貓科動物在D0經基本上半劑量之PC或EV進行疫苗接種並在D21經整劑量之PC或EV進行疫苗接種；並在D49用VS FCV病毒株DD1攻擊。VS FCV陽性臨床案例定義係攻擊後持續≥2天之死亡或臨床症狀(直腸溫度≥105.5℉及高於基線至少一度，臉部、四肢或耳廓水腫由輕度至重度，膿皮症或禿頭症由輕度至重度，或口潰爛)。三隻PC貓科動物及零隻EV貓科動物出於福祉原因而在攻擊後經安樂死。此等三隻PC貓科動物之屍體解剖確認VS-FCV之診斷。基於在攻擊後至少持續2天發熱水腫及/或口潰爛，剩餘17隻PC貓科動物符合VS-FCV之臨床案例定義。相反，21隻EV貓科動物中僅有一隻在攻擊後符合VS FCV臨床疾病之臨床案例定義。經評估預防分數為是95.2% (95%置信區間[CI]76.2%，99.9%)。 分析口/鼻拭子中病毒之偵測結果。與PC貓科動物相比，除第50、53、62及63天研究之外，實驗性疫苗貓科動物口/鼻拭子中所偵測到的病毒顯著較少。PC組之病毒偵測峰值出現在D56，其中PC組口/鼻拭子中所偵測到的病毒之最小二乘平均值為3.289 log10 TCID50/mL。相反，在D56時EV口/鼻拭子中所偵測到的病毒之最小二乘平均值為0.504 log10 TCID50/mL (p＜0.0001)。當用VS FCV攻擊貓科動物時，口/鼻拭子資料支援兩個劑量疫苗之功效。由於三隻PC貓科動物及一隻EV貓科動物在D63仍自口/鼻分泌物排出病毒之事實，故可不分析排出之持續時間，此排除額外標示值之分析。 如上文所論述，所有貓科動物在D-1 FCV血清反應呈陰性，且所有PC貓科動物在整個攻擊日(D49)保持FCV血清反應呈陰性。相反，EV貓科動物在第一次接種疫苗後呈現弱FCV血清轉化，並在第二次接種疫苗之後呈現強FCV血清轉化。 此等結果支援向8週齡易感健康小貓皮下投與貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)並在三週後增強接種免疫保護小貓免患VS FCV相關臨床疾病，以及支援有助於預防由毒性全身性貓杯狀病毒所致之疾病的標示值。 實例4：貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之貓杯狀病毒病毒株255片段之功效的評估 此研究之目的係評估在用毒性全身性FCV攻擊之後貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之貓杯狀病毒(FCV)病毒株255片段(最小免疫劑量)之功效。令人滿意地完成此研究目標及功效之證實將支援預防由貓杯狀病毒所致之疾病的標示值。達成令人滿意之功效及預防由貓杯狀病毒所致之疾病的標示值之規則係：與對照產物(PC)組相比，實驗性疫苗(EV)組必須針對FCV臨床疾病顯示≥ 80%的預防分數。此外，分析組之間口/鼻排出物之量以獲得支援性資料。事件計劃表、實驗單元、隨機分組及圈養與實例3中相同。 FCV血清反應呈陰性(自口/鼻拭子之FCV呈陰性) (SN ≤2)且藉由觀測為健康的貓科動物包括在此研究內。藉由在場獸醫在D-1對每一可能的貓科動物候選者進行體檢。 研究僅包括藉由體檢認為健康之貓科動物。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之EV或PC凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。每一貓科動物在背側肩胛區域接受0.6 mL劑量之EV或PC SC。EV組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV SC。PC組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之PC SC。 在D49時鎮靜/麻醉每一貓科動物。在採集血液及口/鼻拭子樣本之後，每一貓科動物接受0.25 mL每鼻孔及經口0.5 mL之攻擊材料。自D47至D63藉由研究調查員每天一次觀測貓科動物，以觀測與FCV相關聯之臨床徵象。在如實例3中所定義之相同準則下來評估臨床徵象。 自D46至D63藉由研究調查員每天一次獲取直腸溫度。在第-1天、第7天、第14天、第20天、第28天、第35天、第42天、第49天、及第63天，由研究調查員自每一貓科動物將大約5 mL全血採集在血清分離管中。 血清中和(SN)分析用於量測自此研究所敍述之樣本之對FCV的抗體力價。簡而言之，使加熱不活化血清之序列兩倍稀釋液與相同體積之病毒懸浮液(50至400 TCID
50
)混合。使血清病毒混合物在35± 2℃下培育60±10分鐘，並接著接種到克蘭德爾貓科動物腎(CRFK)細胞之細胞單層上。在96孔組織培養盤中進行分析。使培養盤在潮濕CO
2
培育箱(5± 2%CO
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)中培育4 ±1 天，並觀測表徵為FCV感染之細胞病變效應。根據Reed及Muench法來計算該SN抗體力價(TCID
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/mL)。 藉由研究調查員或受派人員在D-1及自D49至D63採集口/鼻拭子樣本。用棉尖拭子擦刷兩個鼻孔之黏膜、牙齦周圍及舌頭下部，並將其放置於試管中。每一試管含有含100 µg/mL慶大黴素之2.0 mL MEM。將每一試管標記研究編號、動物ID編號、收集日期、研究日及樣本類型。 使拭子/試管在≤-50℃下冷凍，直至測試樣本。將拭子/試管造36±1℃水浴中快速解凍，並接著藉由渦流混合樣本。液體自拭子擠出，經0.45 µm濾紙過濾並經含有100 µg/mL慶大黴素之MEM序列稀釋。將每一稀釋液的十分之一毫升覆疊在生長在96孔一次性微量滴定培養盤中的CRFK細胞之亞匯合單層上。使培養盤在36± 1℃下培育3至4天，並觀測表徵為FCV感染之細胞病變效應。根據Reed及Muench法來計算力價(log
10
TCID
50
/mL)。 研究係有效之準則為：在D-1時，所有貓科動物必須為FCV抗體呈陰性(SN ≤ 2)且口/鼻拭子必須為FCV呈陰性；在研究之攻擊前階段期間，所有PC貓科動物必須保持FCV血清反應呈陰性(SN ≤ 2)；且大於或等於80%之PC貓科動物必須符合FCV感染之陽性臨床案例定義。 為了判定是否達成支援預防由貓杯狀病毒所致之疾病的標示值之功效，基於以下案例定義來判定陽性及陰性FCV臨床案例之數目： FCV陽性臨床案例定義意謂：貓科動物至少持續兩天或超過兩天呈現至少一個潰爛，而不管其他上呼吸道感染臨床徵象；若不存在潰爛且其持續≥ 4天呈現下列臨床徵象中之一或多者(而不管至少一個潰爛之存在)，且該等臨床徵象包括：黏液樣至黏膿樣的鼻部排泄物、黏液樣至黏膿樣的眼部排泄物、劇烈排痰性噴嚏爆發，及每日直腸溫度≥103.0℉以及高於基線(自D46至D49之平均直腸溫度)至少一度。 FCV陰性臨床案例定義意謂：未呈現潰爛或任何其他臨床徵象；及包括未出現潰爛或一或多種潰爛持續＜2天，及/或其持續＜4天呈現下列其他臨床徵象中之一或多者。 將每一貓科動物之FCV之排出量評估為次要結局。FCV之排出量係基於自口/鼻拭子樣本獲得之每日TCID50/mL結果。 達成令人滿意之功效及預防由FCV所致之疾病的標示值之規則係：與PC組相比，EV組必須針對FCV臨床疾病顯示≥80%的預防分數。 達成減少口/鼻排出物之規則係：與PC組相比，EV組之每日平均TCID
50
/mL值顯著減小(p ≤ 0.05)。 統計方法與實例3中之描述相同。 無貓科動物在攻擊後至少四天持續呈現黏液樣至黏膿樣眼部排泄物、黏液樣至黏膿樣鼻部排泄物或劇烈排痰性噴嚏爆發。二十二隻PC貓科動物中的五隻及二十二隻EV貓科動物中的一隻在後攻擊後至少持續四天呈現直腸溫度≥103.0℉及高於基線(自D46至D49之平均直腸溫度)至少一度。二十二隻PC貓科動物中的二十隻及二十二隻EV貓科動物中的兩隻在攻擊後至少持續兩天呈現潰爛。 總體而言，22隻PC貓科動物中的21隻及22隻EV貓科動物中的3隻符合FCV臨床案例定義。經評估預防分數為0.86 (95%置信區間[CI] 0.54, 0.96)。 在攻擊後的PC口/鼻拭子中偵測到的病毒之最小二乘平均值介於2.836至4.085 log
10
TCID
50
/mL之FCV力價資料。在攻擊後的EV口/鼻拭子中偵測到的病毒之最小二乘平均值介於2.285至3.111 log
10
TCID
50
/mL。與PC組相比，在第50-61天及D63 EV組經口/經鼻排出之病毒量顯著較低(p≤0.0370)。在D62時，未在組織間偵測到病毒之口/鼻排出的不同(p=0.0879)。 所有貓科動物在D-1 FCV血清反應呈陰性，且所有PC貓科動物在整個攻擊日(D49)保持FCV血清反應呈陰性。實驗性疫苗貓科動物在第一次接種疫苗後呈現弱血清轉化，並在第二次接種疫苗之後呈現強血清轉化。在攻擊十四天之後(D63)，在研究中注意到，所有PC貓科動物呈現FCV血清轉化，而所有EV貓科動物呈現其最高程度的血清轉化。 此研究之目的係評估在用毒性全身性FCV攻擊之後貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之貓杯狀病毒(FCV)病毒株255片段(最小免疫劑量)之功效。 所有貓科動物在D-1對FCV抗體呈血清陰性(SN ≤ 2)且口/鼻拭子對FCV呈陰性；所有PC貓科動物在研究之攻擊前階段期間保持FCV血清反應呈陰性(SN ≤ 2)，且＞80%之PC貓科動物符合FCV感染之陽性臨床案例定義。此等結果突出表明符合研究係有效之準則。 貓科動物在D0經疫苗接種基本上半劑量之PC或EV並在D21經疫苗接種整劑量之PC或EV；並在D49用FCV病毒株255攻擊。貓杯狀病毒感染表徵為口潰爛及上呼吸道症狀。FCV陽性臨床案例定義係：在攻擊後，至少一個口潰爛持續兩天或超過兩天(而不管其他上呼吸道臨床徵象)，或上呼吸道臨床徵象(黏液樣至黏膿樣鼻不排泄物、黏液樣至黏膿樣眼部排泄物、劇烈排痰性噴嚏爆發或每日直腸溫度＞103.0℉且高於基線至少一度)持續≥ 4天。在攻擊後無死亡。在攻擊後，22隻EV貓科動物中的三隻及22隻PC貓科動物中的21隻符合FCV臨床疾病之臨床案例定義。兩個組之FCV臨床案例定義主要藉由觀測持續兩天或超過兩天的口潰爛支援。在22隻PC貓科動物中的20隻及22隻EV貓科動物中的2隻中持續2天或超過2天注意到口潰爛。另外一隻PC貓科動物及另外一隻EV貓科動物在後攻擊後至少持續四天呈現直腸溫度＞103.0℉且高於基線(自D46至D49之平均直腸溫度)至少一度。基於FCV臨床疾病之發病率的經評估預防分數為0.86 (95% CI 0.54, 0.96)。 針對可能的額外標示值，分析口/鼻拭子中之病毒之偵測。與PC貓科動物相比，在除D62之外的所有攻擊後天數中，實驗性疫苗貓科動物口/鼻拭子中所偵測到的病毒顯著減少。儘管EV組排出病毒顯著少於PC貓科動物，但EV貓科動物在攻擊後仍排出中度量之病毒。儘管組之間偵測到統計上的不同，但此等不同並非生物學上顯著的。 在研究之接種疫苗後期間及攻擊前階段，無任一疫苗與不良事件有關聯。在研究中，在D0之前首先注意到，一隻EV貓科動物早期呈現體重未增重。由於人為失誤而無意地斷開室供水，故室410中之貓科動物輕度脫水大約半天。室409中之未成形糞便及室410中之腹瀉可不限於個別貓科動物，且經在一天中注意到。儘管未判定未成形糞便及腹瀉之診斷，但其很可能係由於在該等事件前2週投與之增強疫苗接種所致。 如上文所涵蓋，所有貓科動物在D-1 FCV血清反應呈陰性，且所有PC貓科動物在整個攻擊日(D49)保持FCV血清反應呈陰性。相反，EV貓科動物在第一次接種疫苗後呈現弱FCV血清轉化，並在第二次接種疫苗之後呈現強FCV血清轉化。 總之，此等結果支援向8週齡易感健康貓科動物皮下投與貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)VS Code 16D7.20並在三週後保護相當大數目之貓科動物免患FCV相關臨床疾病，以及支援有助於預防由貓杯狀病毒所致之疾病的標示值。 實例5：經疫苗接種組與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組之間的貓泛白血球減少症病毒(FPV)抗體力價之比較性血清學評估 此研究之目標係藉由比較性血清學分析來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(測試組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(參考組)之間的貓泛白血球減少症病毒(FPV)抗體力價缺乏過度干擾。藉由接種疫苗後相對於參考組FPV GMT之測試組FPV幾何平均力價(GMT)的非劣性來支援缺乏過度干擾。 事件計劃表、EV、隨機分組、統計分析、動物照顧及圈養與實例1中相同。PC為使用FVR病毒株PM及FPV病毒株E之貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)。FVR片段及FPV片段之滴定大致與EV中相同，且將利用表4中針對EV產物而生產的相同的主體材料。兩種組分呈凍乾形式。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。在D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.5 mL無菌稀釋劑復原。 FPV血清反應呈陰性(SN ≤ 2)且藉由觀測為健康的貓科動物包括在此研究內。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。每一貓科動物在背側肩胛區域接受0.6 mL劑量之EV或PC SC。此偏離了方案，該方案要求在向每一貓科動物投與各自0.5 mL之治療劑之前使用0.5 mL無菌稀釋劑以復原每一小瓶治療劑。此偏離之後果係EV及PC貓科動物在D0接受到半劑量之疫苗抗原。 EV組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV SC。PC組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之PC SC。 在第-1、7、14、20、28、35及42天，將大約≤5 mL全血自參加研究2013005及研究2013006之每一貓科動物採集在血清分離管(SST)中。使SST中之血液在室溫下凝結。短暫離心血液樣本，血清經捕獲、分離並轉移至三個合適的試管中。SN分析用於量測抗體對FPV之力價。簡而言之，將此研究所敍述之加熱不活化血清的序列兩倍稀釋液與相同體積之病毒懸浮液(100 TCID50至300 TCID50)混合。使血清病毒混合物在35± 2℃下培育60±10分鐘，並接著接種到活躍的克蘭德爾貓科動物腎(CRFK)分裂細胞上。在96孔組織培養盤中進行分析。使培養盤在潮濕CO
2
培育箱(5± 2% CO
2
)中培育6± 1天。使用與螢光染料結合之特定FPV抗體藉由免疫螢光藉由偵測CRFK細胞中之病毒感染來讀取培養盤。根據Reed及Muench法來計算血清中和抗體力價(TCID50/mL)。 每一治療組中至少75%之貓科動物必須在D42之前對FPV(SN ≥ 1:8)產生抗體以使研究有效。若每一治療組中少於75%之貓科動物未能在D42之前產生抗體，則研究無效。 在與參考組相比的情況下，評估FPV組份之自測試組之宿主動血清學反應的非劣性。藉由在經EV進行疫苗接種之宿主動物組中產生之FPV組份的GMT反應不劣於經PC進行疫苗接種之組之GMT反應不超過等效界值。 在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FPV GMT而將等效界值設為EV組之FPV GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 所有貓科動物在D-1 FPV SN力價＜ 2，且研究中所有剩餘貓科動物在D42 FPV SN力價＞ 8。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FPV SN力價分別為89,581.74及80,621.49。EV組及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.81之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FPV SN力價分別為26,447.68及27,012.90。EV組及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.68之比率。 此研究之目標係藉由比較性血清學分析來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)VS Code 16D7.20進行疫苗接種之組(EV組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗經修飾之活病毒進行疫苗接種之組(PC組)之間的FPV抗體力價缺乏過度干擾。在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FPV GMT而將等效界值設為EV組之FPV GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 研究中之所有貓科動物在D42之前對FPV (SN ≥ 8)產生抗體，由此符合研究係有效之規則。 選擇第35天及第42天來分析死FCV抗原對FPV MLV片段之血清學反應之干擾的缺乏。第35天及第42天分別對應於增強接種疫苗後第2週及第3週。預期，對死抗原之最大免疫反應將為此等時間點；且若MLV片段發生干擾，則其將最可能在此等時間下被偵測到。由於此相同原因，未分析D35之前的其他時間點。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FPV SN力價分別為89,581.74及80,621.49。EV組及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.81之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值FPV SN力價分別為26,447.68及27,012.90。該EV及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.68之比率。 FPV SN血清學在D35時0.81之比率及在D42時0.68之比率支援半劑量及整增強劑量之死FCV抗原未對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FPV MLV片段造成過度干擾。 實例6：經疫苗接種組與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組之間的貓病毒性鼻氣管炎(FVR)抗體力價之比較性血清學評估 此研究之目標係藉由比較性血清學分析來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(測試組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(參考組)之間的貓病毒性鼻氣管炎(FVR)抗體力價缺乏過度干擾。藉由接種疫苗後相對於參考組FVR GMT之測試組FPV幾何平均力價(GMT)的非劣性來支援缺乏過度干擾。 事件計劃表、統計分析、隨機分組、動物健康及福祉、EV及實驗性單元與實例1中相同。PC為使用FVR病毒株PM及FPV病毒株E之貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)。FVR片段及FPV片段之滴定大致與EV中相同，且利用表2中針對EV產物而生產的相同的主體材料。兩種組分呈凍乾形式。在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。在D21，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經0.5 mL無菌稀釋劑復原。 FVR血清反應呈陰性(SN ≤ 2)且藉由觀測為健康的貓科動物包括在此研究內。 在D0，即將進行免疫接種時，每一小瓶之凍乾產物經1.2 mL無菌稀釋劑復原。每一貓科動物在背側肩胛區域接受0.6 mL劑量之EV或PC SC。 在第-1天、第7天、第14天、第20天、第28天、第35天及第42天，將大約≤5 mL全血自參加研究2013005及研究2013006之每一貓科動物採集在血清分離管中。藉由研究調查員採集樣本。 使SST中之血液在室溫下凝結。短暫離心研究2013005及2013006之血液樣本，且血清經收穫、分離並轉移至三個合適的試管中。使血清樣本保持在-70±10℃下直至測試。 血清中和(SN)分析用於量測抗體對FVR之力價。簡而言之，使加熱不活化血清之序列兩倍稀釋液與相同體積之病毒懸浮液(50至400 TCID
50
)混合。使血清病毒混合物在35± 2℃下培育60±10分鐘，並接著接種到克蘭德爾貓科動物腎(CRFK)細胞之細胞單層上。在96孔組織培養盤中進行分析。使培養盤在潮濕CO
2
培育箱(5± 2%CO
2
)中培育6 ±1 天，並觀測表徵為FVR感染之細胞病變效應。根據Reed及Muench法來計算該SN抗體力價(TCID
50
/mL)。 EV組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之EV SC。PC組中之每一動物於D21在背側肩胛區域經由無菌注射器及針頭接受0.5 mL劑量之PC SC。 每一治療組中至少75%之貓科動物必須在D42之前對FVR (SN ≥ 1:2)產生抗體以使研究有效。若每一治療組中少於75%之貓科動物未能在D42之前產生抗體，則測試無效。 在與參考組相比的情況下，評估FVR組份之自測試組之宿主動血清學反應的非劣性。藉由在接種疫苗有EV之宿主動物組中產生之FVR組份的幾何平均血清學力價(GMT)反應必須不劣於經疫苗接種PC組之GMT反應不超過等效界值。 在D35或D42時對比對應研究日之PC組之FVR GMT而將等效界值設為EV組之FVR GMT的63% (63%力價率對應於序列分析中約三分之二之兩倍稀釋度的差)。 所有貓科動物在D-1 FVR SN力價為＜ 2，且在研究中剩餘85隻貓科動物中的84隻在D42 FVR SN力價＞ 2。在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FVR SN力價分別為6.2605及6.2750。D35 90%低置信區間之比較現實出0.65之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值值FVR SN力價分別為11.1764及9.6755。D42 90%低置信區間之比較現實出0.87之比率。 此研究之目標係藉由比較性血清學分析來評估經貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)進行疫苗接種之組(EV組)與經貓鼻氣管炎-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活病毒)進行疫苗接種之組(PC組)之間的貓病毒性鼻氣管炎(FVR)抗體力價過度干擾之缺乏。85隻剩餘貓科動物中的八十四隻(98.8%)在D42之前對FVR血清轉化(SN ＞ 2)，由此符合研究係有效之準則。 選擇第35及第42天來分析死FCV抗原對FVR MLV片段之血清學反應之干擾的缺乏。第35天及第42天分別對應於增強接種疫苗後第2週及第3週。預期，對死抗原之最大免疫反應將為此等時間點；且若對MLV片段產生任何干擾，則其將最可能在此等時間下被偵測到。由於此相同原因，未分析D35之前的其他時間點。 在第二次接種疫苗兩週後，EV組及PC組之D35最小二乘平均值FVR SN力價分別為6.2605及6.2750。該EV組及PC組之D35 90%較低置信區間之比較顯示出0.65之比率。在第二次接種疫苗三週後，EV組及PC組之D42最小二乘平均值值FVR SN力價分別為11.11764及9.6755。該EV及PC組之D42 90%較低置信區間之比較顯示出0.88之比率。 FVR SN血清學在D35時0.68之比率及在D42時0.88之比率支援半劑量及整增強劑量之死FCV抗原未對貓鼻氣管炎-杯狀病毒-泛白血球減少症疫苗(經修飾之活及死病毒)之FVR MLV片段造成過度干擾。 本文中所揭示及主張之所有組合物及/或方法均可根據本發明製備及執行，無需過多實驗。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應清楚變化可在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下施加於本文所述之組合物及/或方法及方法之步驟或步驟順序中。更特定言之，顯而易知在化學上及生理上相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範疇及概念內。