DE69632658T2

DE69632658T2 - Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom

Info

Publication number: DE69632658T2
Application number: DE69632658T
Authority: DE
Inventors: Petrus Alphonsus Maria Van Woensel; Karl-Klaus Conzelmann
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2016-03-13
Also published as: ATE268783T1; CN1139703A; DK0732340T3; EP0732340B1; DE69632658D1; EP0732340A3; CA2171699A1; JP4149008B2; PT732340E; JPH08308577A; EP0732340A2; CN1079832C; US5858729A; CA2171699C; ES2223058T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung einer glykosylierten Form des ORF3 oder ORF4 Proteins, eine Wirtszelle oder ein Vektorvirus für die Verwendung in diesem Verfahren, ein DNA-Molekül, das besagtes ORF3 oder ORF4 Protein kodiert, eine glykosylierte. Form des besagten ORF3 oder ORF4 Proteins und einen Impfstoff, der besagte ORF3 oder ORF4 Proteine umfasst.
Das Porcine Reproduktive und Respiratorische Syndrom-Virus (PRRSV) ist die Ursache einer neuen porcine Erkrankung, die über 5000 nordeuropäische Schweinefarmen seit den späten 90er Jahren befallen hat. Diese Erkrankung, jetzt Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom (PRRS) genannt, ist auch als Mysteriöse Schweinekrankheit bekannt. Das Problem wurde zunächst im Dezember 1990 in Deutschland identifiziert und wurde dann zu Beginn des Jahres 1991 immer kritischer. Im Januar und Februar 1991 breitete sich die Krankheit in den Niederlanden und Belgien aus. Auch aus Spanien wurden Ausbrüche berichtet. Es wird angenommen, dass die Erkrankung vom ökonomischen Standpunkt aus gesehen sehr teuer wird, vergleichbar oder sogar noch teurer als die Aujeszky-Krankheit.
Die grundsätzlichen klinischen Zeichen in den Sauen sind Anorexie und ein später Abort bis zum Tag 110 der Trächtigkeit. Bei den Ferkeln wird ausser respiratorischen Problemen eine hohe Inzidenz von totgeborenen oder schwachen Ferkeln beobachtet. Bei Mastschweinen tritt eine chronische Pneumonie und eine erhöhte Mortalität auf.
Um einen Impfstoff für den Schutz von Schweinen vor PRRSV oder ein Verfahren für eine diagnostisches Methode zu entwickeln, muss das verursachende Agens der Erkrankung identifiziert, isoliert und zu einem geeigneten Immunogen in einem Impfstoff oder zu einem Antigen in einem diagnostischen Assay verarbeitet werden.
Herkömmliche Impfstoffe können chemisch inaktivierte Virusimpfstoffe oder modifizierte Lebendvirusimpfstoffe umfassen. Inaktivierte Impfstoffe erfordern jedoch zusätzliche Immunisierungen, enthalten nachteiligerweise Adjuvanzien, sind teuer in der Herstellung und aufwändig in der Verabreichung. Darüber hinaus ist es möglich, dass einige infektiöse Partikel den Inaktivierungsprozess überleben und nach ihrer Verabreichung eine Erkrankung des Tieres verursachen.
Im allgemeinen werden attenuierte Lebendvirusimpfstoffe bevorzugt, weil sie eine Immunantwort hervorrufen, die oft sowohl auf humoralen als auch zellulären Reaktionen beruht. Bis jetzt konnten solche auf PRRSV basierenden Impfstoffe nur durch Züchten und serielles Passagieren der virulenten Stämme in Makrophagen-Zellkulturen hergestellt werden. Durch diese Behandlung werden jedoch unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt, was zu einer Population von Viruspartikeln führt, die in ihrer Virulenz und Immunisierungseigenschaften heterogen sind. Ausserdem ist bekannt, dass solche traditionell attenuierten Lebendvirusimpfstoffe wieder virulent werden können, was in der Erkrankung der inokulierten Tiere und der möglichen Ausbreitung des Krankheitserregers auf andere Tiere resultiert. Ausserdem ist das Züchten der PRRSV-Stämme auf einer Makrophagen-Zelllinie sehr arbeitsaufwändig und resultiert in einer geringen Ausbeute des Virus.
Verbesserte Impfstoffe, sowohl Lebend- als auch Untereinheitsimpfstoffe, können auf rekombinanter DNA-Technologie basierend hergestellt werden. Diese Impfstoffe würden nur das notwendige und relevante immunogene PRRSV-Material enthalten, das fähig ist eine Immunantwort gegen PRRSV-Krankheitserreger auszulösen oder die genetische Information, die das besagte Material kodiert und nicht die oben genannten Nachteile des Lebend- oder inaktivierten Impfstoffes besitzen.
Von dem verursachenden Agens dieser Erkrankung ist nun bekannt, dass es sich um ein kleines umhülltes RNA-Virus handelt, und der europäische Typ dieses Virus wurde von Wensvoort et al. (The Vet. Quarterly 13, 121–130, 1991) beschrieben. Seine Verwandtschaft mit dem Laktat-Dehydrogenase Erhöhenden Virus (LDV) und dem Schweineartritis-Virus wurde von Conzelmann et al. (Virology 193, 329–339, 1993) und Meulenberg et al., (Virology 192, 62–72, 1993) beschrieben und platzierte das Virus in die Gruppe der Arteriviridae.
Ein Stamm des europäischen Typs, als „Lelystad-Virus" (LV) bezeichnet, wurde beim Institut Pasteur, Paris, Frankreich unter der Nummer I-1102 in Verbindung mit der PCT WO 92/21375 des Zentralen Veterinärinstituts, Lelystad, Niederlande, hinterlegt.
Ein weiterer europäischer Stamm wurde in der WO 93107898 beschrieben und bei der Nationalen Sammlung von Mikroorganismen-Kulturen (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I-1140 hinterlegt.
Dieser europäische Stamm wurde kürzlich von Conzelmann et al. (Virology 193, 329–339, 1993) beschrieben.
Der amerikanische Typ des Virus wurde von Benfield et al. (J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127–133, 1992) beschrieben. Ein Stamm des amerikanischen Typs wurde bei der ATCC unter der Nummer VR-2332 hinterlegt und ist in der PCT WO 93/03760 und der europäischen Patentanmeldung 0.529,.584 erwähnt. Eine wichtige Beobachtung wurde von Wensvoort et al. (J. Vet. Diagn. Invest. 4, 134–138, 1992) kurz nachdem das Virus gefunden wurde, beschrieben, als er amerikanische und europäische Stämme auf der Basis ihrer antigenen Eigenschaften beschrieb und zeigte, dass die europäischen und amerikanischen Stämme beträchtliche antigene Unterschiede aufweisen.
Die Genome zweier europäischer PRRSV-Stämme und Teile des Genoms von US-Isolaten wurden molekular geklont und sequenziert (PCT WO 92/21375); Meulenberg et al., Virology 192, 62–72, 1993; Conzelmann et al., supra; Kwang et al., J. Diagn. Invest. 6, 293–296, 1994; Mardassi et al., J. Gen. Virol. 75, 681–685, 1994; Meng et al., Proc. 13th IPVS Congress, 61, 1994).
Die RNA des PRRSV-Genoms umfasst ungefähr 15 kB und 8 offene Leserahmen (ORFs) können darin identifiziert werden. ORF 1A, B und ORFs 2 bis 7. ORF 1A, B kodiert u. a. die virale RNA-Polymerase, wohingegen die ORFs 2–6 die viralen Membran(Hüll-) Proteine kodieren. ORF 7 kodiert das Nukleokapsid-Protein. In infizierten Zellen kann sowohl in europäischen als auch in amerikanischen Stämmen ein 3'-coterminales Nest aus sechs wichtigen subgenomischen mRNAs aufgezeigt werden (Meng et al., supra). Tabelle 1 fasst die Eigenschaften der ORFs zusammen, die die Strukturproteine von PRRSV (Conzelmann et al., supra) kodieren.
Tabelle 1
Die Verteilung der ORFs auf dem PRRSV-Genom ist in 1 dargestellt und entspricht derjenigen, die von Meulenberg et al. (supra) gefunden wurde.
Nur wenig ist über die PRRSV-Proteine bekannt, die von den zuvor genannten ORFs exprimiert werden. Es wurden 5 virale Proteine von ungefähr 15–26 kD in Zelllysaten identifiziert, die mit einem europäschen oder amerikanischen PRRSV-Isolat inokuliert wurden (Nelson et al., J. Clin. Microbiol. 31, 3184–3189, 1993 und Benfield et al., Proc. 13th IBV Congress, 62, 1994). Es wurde gezeigt, dass die ORF 7, ORF 6 und ORF 5-Proteine in Virionen vorkommen (Meulenberg et al., Virology 206, 155–163, 1995).
Jetzt wurde festgestellt, dass zwei verschiedene Formen, eine kleine und eine grosse Form der ORF 3 und ORF 4 Proteine in mit PRRSV infizierten Zellen vorhanden ist, jedoch nur eine Form ist in den gereinigten Virionen vorhanden, die aus dem Überstand der infizierten Zellen isoliert wurden. Die beiden Formen eines jeden ORF-Proteins werden auf der Ebene der Verarbeitung ihrer Kohlehydratketten unterschieden. Die grossen Formen, die in den gereinigten Virionen vorkommen, sind Endoglykosidase (Endo-H) H-resistent, wohingegen die kleinen Formen Endoglykosidase H-sensitiv sind. Das Substrat des Enzyms Endo-H besteht nur aus der „hoch-mannosylierten" Form des Glykoproteins. Diese Enzym spaltet die Oligosaccharidkette direkt hinter der Kohlehydratgruppe GlcNac, die an die Aminosäure Asparagin (Asn) gekoppelt ist. Komplexere Formen, d. h. Formen in denen der Glykosylierungsprozess vollständig ist, sind gegenüber einer Endo-H Spaltung resistent. Die Endo-H-Resistenz wurde hier verwendet, um das Stadium des Glykosilerungsprozesses der ORF3 und ORF4 Proteine zu bestimmen und zwischen den kleinen („hoch-Mannose"-haltigen Formen der ORF Proteine und deren grossen („komplexen") Form zu unterscheiden. Das Enzym Peptid-N-Glykohydrolase (PnGase-F) wurde verwendet um die vollständig entglykosilierte Form (Polypeptidgerüst) von ORF3 und 4 zu erhalten. Es wurde festgestellt, dass die ORF3 und 4 Glykoproteine, die in die Virionen inkorporiert sind, die grossen („komplexen") Formen sind, die aus ihren Vorläufern, den kleinen („hoch-Mannose") Formen durch weiteres Verarbeiten entstanden sind, als deren Ergebnis die besagten grossen Formen Endo H-resistent wurden. Das Molekulargewicht (MG) des ORF3 und des ORF4 Proteins, das mittels SDS-PAGE bestimmt wurde, ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Nach der Expression der individuellen ORFs in eukaryotischen Zellen, die mit den einzelnen ORFs transformiert worden waren, wurde festgestellt, dass im Gegensatz zu Virus-infizierten Zellen ausschliesslich die kleinen Formen der ORF3 und ORF4 Proteine produziert wurden. Da die individuellen Proteine in den eukaryotischen Zellen nicht vollständig prozessiert werden, ist wahrscheinlich der Transport des Proteins vom Endoplasmatischen Retikulum zur medialen Zisterne der Golgi-Apparats nicht möglich. Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass, um die grossen Formen der PRRSV ORF3 und ORF4 Proteine zu erhalten, eine Koexpression von ORF2, ORF3 und ORF4 in einer Zelle erforderlich und ausreichend ist. Während des Infektionsprozesses sind die Tiere mit den reifen (grossen) Formen der Proteine konfrontiert. Daher liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung reifer grosser Formen der PRRSV ORF3 und ORF4 Proteine mittels rekombinanter DNA.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer glykosylierten Form des PRRSV ORF3 oder ORF4 Proteins zur Verfügung, das die Schritte des Kultivierens einer geeigneten mit einem das ORF3 oder ORF4 kodierenden DNA-Fragment transformierten Wirtszelle umfasst, oder eine Wirtszelle, die mit einem Vektorvirus infiziert ist, der das ORF3 oder ORF4 kodierenden DNA-Fragment trägt, unter Protein exprimierenden Bedingungen und Ernten des exprimierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass die selbe Wirtszelle gleichzeitig PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Proteine exprimiert.
ORF2, ORF3 und ORF4 sind als das grosse Protein definiert, das (teilweise überlappende) Regionen kodiert, die stromabwärts (3'-Richtung) des die Polymerase Region kodierenden ORF1 liegen, wie die Karte mit der Verteilung der ORFs auf dem PRRSV-Genom in 1 zeigt. Diese Karte entspricht der in Meulenberg et al., (supra) gezeigten und wird als repräsentative Karte für alle PRRSV-Viren betrachtet. ORFs 5–7 werden ebenfalls durch ihre Position auf den zuvor genannten Karten definiert.
Insbesondere sind die oben genannten ORFs durch die Aminosäuresequenzen des PRRSV Proteins gekennzeichnet, die von den entsprechenden von Conzelmann et al. (supra) offenbarten ORFs kodiert werden.
Es versteht sich von selbst, dass natürliche Varianten der bestimmten ORF-Proteine zwischen individuellen PRRSV-Isolaten vorhanden sein können. Diese Varianten können mittels Unterschiede von einer oder mehreren Aminosäuren in der gesamten Sequenz gezeigt werden. Ein Beispiel einer solchen PRRSV Varianten und die Aminosäuressequenz dieser ORF Proteine wird von Meulenberg et al. (supra) offenbart.
Vorzugsweise besitzen die in der vorliegenden Erfindung verwendeten ORF Proteine mindestens 55% Homologie, bevorzugter mindestens 70% auf der Aminosäurestufe mit den von Conzelmann et al. (supra) offenbarten Aminosäuresequenzen.
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass ein und dieselbe Wirtszelle die PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Proteine koexprimiert. Dies kann durch die Transformation der Wirtszelle mit einem DNA-Fragment erreicht werden, das die besagten drei ORFs umfasst oder durch Transformieren der Zelle mit mehr als einem DNA-Fragment, so dass alle drei ORFs in die Zelle eingeführt werden. Zum Beispiel kann die Wirtszelle mit den drei DNA-Fragmenten co-transformiert werden, wobei das erste ORF2 umfasst, das zweite ORF3 und das dritte ORF4.
Auf gleiche Weise kann die Wirtszelle mit einem oder mehreren Vektorviren (co)-infiziert werden, so lange die drei obengenannten ORFs in die gleiche Zelle eingeführt werden.
Obwohl die simultane Expression von ORF2, ORF3 und ORF4 in einer Wirtszelle erforderlich und ausreichend ist, um die grossen reifen Formen der ORF3 und ORF4 Proteine zu bilden, können, falls erwünscht, auch andere ORFs von PRRSV, wie beispielsweise ein oder mehrere ORFs 5–7, insbesondere ORF5 und/oder ORF7 von der besagten Zelle co-exprimiert werden.
Darüber hinaus sind in dem erfindungsgemässen Verfahren alle der ORF2, ORF3 und ORF4 unter der Transkriptionskontrolle von Promotorsequenzen, so dass die Expression der genannten ORFs garantiert ist. Vorzugsweise ist jeder ORF mit einem separaten Promotor verbunden.
Ein in der vorliegenden Erfindung zu verwendendes DNA-Fragment kann verschiedene Replikations-wirksame DNA-Sequenzen enthalten, mit denen der ORF natürlicherweise nicht verbunden ist, was in einem so genannten rekombinanten Nukleinsäuremolekül resultiert, das für die Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann. Solche Hybrid-DNA-Moleküle stammen vorzugsweise zum Beispiel von Plasmiden ab. Spezielle Vektoren, die verwendet werden können um die PRRSV ORFs zu klonieren sind bekannt und schliessen unter anderem Plasmidvektoren wie pBR322-, verschiedene pUC-, pGEM- und Bluescript-Plasmide ein (siehe auch Rodrigquez, R. L. und D. T. Denhardt, Hrsg., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J. A. et al., Arch. Virol. 110, 1–24, 1990). Die für die Konstruktion solch eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls anzuwendenden Verfahren sind dem Fachmann bekannt und werden unter anderem in Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbour Laboratory, 2. Ausgabe, 1989) beschrieben.
Eine geeignete Wirtszelle ist eine Zelle, die von einem ein PRRSV ORF Protein kodierendes DNA-Fragment transformiert werden kann und die fähig ist, PRRSV ORF Protein in glykosylierter Form zu exprimieren.
„Transformation", wie hier verwendet, bezieht sich, unabhängig von der angewandten Methode, auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, zum Beispiel durch direkte Aufnahme oder Transduktion. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann in das Wirtsgenom integriert werden. Für die Expression ist das heterologe DNA-Fragment mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen ausgestattet, die mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind und die Expression der inserierten Nukleinsäuresequenz regulieren können.
Der Wirt ist vorzugsweise eukaryotischen Ursprungs, wie Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder eine höhere eukaryotische Zelle, wie eine Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzelle, einschliesslich HeLa-Zellen und Ovarzellen chinesischer Hamster (CHO). Insektenzellen schliessen die Sf9-Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47–55, 1988) ein. Informationen bezüglich des Klonierens und Exprimierens der PRRSV ORFs in eukaryotischen Klonierungssystemen können bei Esser, K. et al (Plasmids of Eukaryotes, Springer Verlag, 1986) gefunden werden.
Wenn die Wirtszelle Hefe ist, schliessen beispielhafte Expressionskontrollsequenzen z. B. α-Paarungsfaktoren ein. Für Insektenzellen können der Polyhedrin- oder p10-Promotor von Bacculoviren verwendet werden (Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156–65, 1983). Wenn die Wirtszelle von Säugetieren stammt, schliessen beispielhafte geeignete Expressionskontrollsysteme z. B. den SV-40-Promotor (Berman, P. W. et al., Science 222, 524–527, 1983) oder zum Beispiel den Metallthion-Promotor (Brinster, R. L., Nature 296, 39–42, 1982) oder einen Hitzeschockpromotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4949–53, 1985) ein.
Im Gegensatz dazu ist eine geeignete Wirtszelle eine Zelle, die für eine Infektion durch einen Vektorvirus empfänglich ist, der die PRRSVs kodierende DNA-Fragmente trägt. Das heterologe DNA-Fragment ist in dem Vektorvirus in eine nicht-essentielle Region des Virus inseriert, d. h. eine Region, die für den Einbau des genannten DNA-Fragments verwendet werden kann ohne wesentliche Funktionen des Virus zu zerstören, wie beispielsweise solche, die für die Infektion und Replikation des Virus von Bedeutung sind. Solche Regionen sind im Stand der Technik im Allgemeinen von verschiedenen Viren, einschliesslich Herpesviren und Pocken-Viren, bekannt.
Um grosse Mengen von PRRSV ORF Proteinen zu erhalten, ist das bevorzugte Expressionsystem das Baculovirus-Expressionssystem (BVES). In diesem System werden Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda (Sf; IPLB-Sf21) Zellen als Wirt für Baculoviren, zum Beispiel ein Autographa californica nuclear polyhedrosis-Virus (AcNPV) in Kultur gehalten. Einige der AcNPV-Gene werden in grossen Mengen exprimiert, sind für den viralen Infektionszyklus jedoch nicht essentiell. Diese Gene sind das Ziel für eine homologe Rekombination in transfizierten Zellen, zwischen einem Baculotransferplasmid wie pAcAS3 und Wildtyp (wt) AcNPV-DNA. In pAcAs3 (J. Vlak et al., Virology 179, 312–320, 1990) werden heterologe Gene stromabwärts des p10-Promotors anstatt des nicht-essentiellen p10-Gens inseriert, das von Sequenzen des wt AcNPV umgeben ist, die auf den Rekombinationsprozess zielen. Um das Screening nach Rekombinanten zu vereinfachen, enthält pAcAS3 auch das LacZ-Gen, das rekombinante Plaques nach Zugabe von Xgal in das Medium blau färbt.
In dem beanspruchten Verfahren können die oben definierten Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert werden, die für eine Expression der PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Proteine vorteilhaft sind. Impfstoffe oder diagnostische Assays können unter Verwendung von Proben der Rohkultur, Wirtszelllysate oder Wirtszellextrakte, hergestellt werden, obwohl in einer anderen Ausführungsform gereinigte ORF3 oder ORF4-Proteine, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, hergestellt werden können. Um die hergestellten Proteine zu reinigen, werden Wirtszellen, die sowohl ORF2, ORF3 als auch ORF4 exprimieren, in einem geeigneten Volumen gezüchtet und die produzierten Proteine werden aus solchen Zellen oder aus dem Medium isoliert, falls die Proteine ausgeschieden werden. Proteine, die in das Medium abgegeben werden, können mittels Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, z. B. durch Salzfraktionierung, Zentrifugation, Ultrafiltration, Chromatographie, Gelfiltration, Immuno-präzipitation oder Immunaffinitätschromatographie, wohingegen intrazelluläre Proteine isoliert werden, in dem zuerst die besagten Zellen gesammelt werden, die Zellen zerstört werden, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder durch andere mechanisch zerstörende Mittel, wie die Französische Presse, falls erwünscht gefolgt von einer Trennung des Proteins von anderen zellulären Komponenten. Die Zellzerstörung kann auch durch chemische (z. B. EDTA- Behandlung) oder enzymatische Mittel wie ein Lysozym-Verdau erreicht werden.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektorvirus zur Verfügung gestellt, der ein oder mehrere heterologe DNA-Fragmente enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das (die) DNA-Fragment(e) PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Protein kodieren. Solch ein Vektorvirus wurde oben bereits im allgemeinen Sinn beschrieben. Dieses Vektorvirus kann für eine neue Annäherung an die Impfstoffentwicklung verwendet werden, d.h, die Expression von Genen fremder Krankheitserreger unter Verwendung attenuierter Lebendimpfstämme als Träger (virale Impfvektoren). Expression von Antigen durch ein lebendes Vektorvirus kann die Expression nach einer natürlichen Infektion nachahmen und sowohl die humoralen als auch die zellulären Immunantworten stimulieren. Solche Vektoren können für die Immunisierung gegen Krankheiten verwendet werden, für die derzeit keine adequaten Impfstoffe zur Verfügung stehen oder die nicht auf einfache und ungefährliche Weise hergestellt werden können. Wie oben dargestellt, wurde festgestellt, dass die Expression von Immunogenen durch ein Vektorvirus, das PRRSV ORF3 oder ORF4 enthält, eine natürliche Infektion nur nachahmt, wenn der Virusvektor gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Virusvektoren, die für die simultane Expression von PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und schliessen Pockenviren, wie Vakzinia (Piccini und Paoletti, Adv. Vir. Res. 34, 43–64, 1988; Riviere et al., J. Virol. 66, 3424–3434, 1992; Megeling et al., Arch. Virol. 134, 259–269, 1994), Schweinepocken (van der Leek et al., The Vet. Record 134, 13–18, 1984), Adenovirus (Hsu et al., Vaccine 12, 1994) und Herpesvirus, wie beispielsweise Pseudorabiesvirus ein.
Bevorzugte, in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektorviren stammen von Pseudorabiesviren (PRV).
Für PRV wurden zum Beispiel verschiedene nicht-essentielle Regionen offenbart und für den Einbau heterologer DNA-Sequenzen, wie die Gene, die für gp50, gp63, gI, gIII, gX, 11K, Thymidinkinase (TK), Ribonukleotidreduktase (RR), Proteinkinase (PK) oder 28K verwendet (Peeters et al., J. Viral. 67, 170–177, 1993; de Wind, N. et al., J. Virol. 64, 4691–4696, 1990; Moorman, R. J. M. et al., J. Gen. Virol. 71, 1591–1595, 1990; Petrovskis, E. A. et al., Virology 159, 193–195, 1987; van Zijl, M. et al., J. Gen. Virol. 71, 1747–1755, 1990; Thomsen, D. R. et al., Gene 57, 261–265, 1987; Keeler C. L. et al., Gene 50, 215–224, 1986; Whealey, M. E. et al., J. Virol. 62, 4185–4194, 1988; van Zijl, M. et al., J. Viral. 65, 2761–2765, 1991; Mettenleiter, Th. C. et al., Virology 179, 498–503, 1990; US-Patent Nr. 4,609,548; Europäisches Patent Nr. 0263207, europäische Patentanmeldung Nr. 0695885 und PCT-Anmeldung WO/94/01573).
Es können bekannte Verfahren für die Insertion von DNA-Sequenzen in einen Klonierungsvektor und eine homologe Rekombination in vivo oder Cosmidklonierungstechniken angewendet werden, um die ORFs in die nicht-essentielle Region des Herpesvirusgenoms zu inserieren (Maniatis, T. et al., in „Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Europäische Patentanmeldung Nr. 074808; Roizman, B. und Jenkins, F. J., Science 229, 1208, 1985; Higuchi, R. et al., Nucleic Acids Res. 16, 7351, 1988; de Wind, N. et al., J. Virol. 64, 4691–4696, 1990; van Zijl, M. et al., J. Virol. 62, 2191–2195, 1988; Ackermann, M., J. Vet.-Med. B., 35, 379–396, 1988 und in dem obigen Abschnitt beschriebene Verfahren).
Die DNA-Fragmente, die die PRRSV ORF2, ORF3 oder ORF4 Proteine kodieren, können in die selbe oder verschiedene Regionen des Vektorvirusgenoms inseriert werden.
Die Erfindung stellt selbstverständlich auch ein Gemisch von zwei oder mehr, bevorzugt von zwei oder drei Vektorviren zur Verfügung, wobei das besagte Gemisch fähig ist eine Wirtszelle in vivo zu co-infizieren, so dass die PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4-Proteine simultan in vivo von der selben Zelle exprimiert werden. Dieses Gemisch kann auch als eine aktive Komponente in einem Impfstoff verwendet werden. Im Fall, dass das Gemisch zwei Vektorviren umfasst, enthält das eine Virus zwei der drei oben genannten ORFs und das zweite Virus beinhaltet den dritten erforderlichen ORF. In dem Fall, dass das Gemisch drei Vektorviren umfasst, so besitzt jedes Virus einen der erforderlichen ORFs. Falls erwünscht, kann ein oder mehrere der Vektorviren in dem Gemisch ein oder mehrere der ORFs 5–7 von PRRSV.
Vorzugsweise stammt das in das genannte Gemisch einzuschliessende Virus von einem PRV-Impfvirus, vorzugsweise wird ein PRV-Stamm verwendet, der genotypisch gD^– ist (und falls erwünscht phänotypisch gD+) und/oder gE^– (PCT-Anmeldung WO 94/01573, EP-Anmeldungsnummer 0659885) ist.
Ein erfindungsgemässes Vektorvirus oder die in das oben beschriebene Gemisch eingebrachten Vektorviren können durch Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektorvirus infiziert ist, hergestellt werden, wonach die Virus enthaltenden Zellen und/oder die in den Zellen gewachsenen Viren, gegebenenfalls in reiner Form, gesammelt werden und in einen Impfstoff gegebenenfalls in lyophilisierter Form eingebracht oder in einem diagnostischen Assay verwendet werden.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein DNA-Fragment zur Verfügung, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die das PRRSV Protein ORF2, ORF3 und ORF4 Protein kodiert, worin jeder die besagten Proteine kodierende ORF operativ an einen Promotor gebunden ist. Solch ein DNA-Fragment kann, wie oben beschrieben, für die Herstellung einer Wirtszelle oder eines Vektorvirus verwendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein gereinigtes Endo-H resistentes PRRSV ORF3 oder ORF4 Protein zur Verfügung. Eine bevorzugte Form des Endo-H resistenten ORF3 oder ORF4 Proteins hat ein Molekulargewicht von 55–60 kD beziehungsweise von 40–47 kD.
Diese Endo-H resistenten ORF Proteine können in einer im wesentlichen reinen Form zur Verfügung gestellt werden, frei von PRRSV-Material, mit dem sie normalerweise in der Natur verbunden sind, oder als ein Gemisch aus PRRSV Proteinen, die aus dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
Diese Endo-H resistenten ORF Proteine können für die Herstellung eines Impfstoffs verwendet werden, der eine wirksame Immunantwort in Schweinen gegen ein PRRS Virus induziert. Dieser Impfstoff kann ein die ORF3 und/oder ORF4 Proteine umfassender Untereinheitsimpfstoff sein, der gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger- oder Verdünnungsmittel.
Als Alternative wird ein Vektorimpfstoff zur Verfügung gestellt, der das. erfindungsgemässe Vektorvirus oder ein Gemisch aus den oben definierten Vektorviren zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger- oder Verdünnungsmittel umfasst.
Der Impfstoff kann zum Beispiel auch ein wässriges Medium oder eine Wasser enthaltende Suspension sein, die häufig mit anderen Bestandteilen gemischt ist, um z. B. die Aktivität und/oder die Haltbarkeit zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salze, pH-Puffer, Stabilisatoren (wie Magermilch, Kaseinhydrolysat oder Zitronensäure) oder Konservierungsmittel wie Thimerosal, Merthiolat und Gentamycin sein.
Falls erwünscht werden dem erfindungsgemässen Impfstoff ein oder mehrere Adjuvanzien zugegeben. Geeignete Beispiele sind Saponine wie Quil A, Aluminiumhydroxid, Cholera- oder Tetanustoxoid, Ölemulsionen (Ö/W oder W/Ö) und wässrige Vitamin E-Dispersionen.
Der Impfstoff kann in einem herkömmlichen aktiven Immunisierungsschema verabreicht werden: einzelne oder wiederholte Verabreichungen auf eine Art und Weise, die mit der Dosisformulierung verträglich ist und in einer Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam und immunogen ist. Die Verabreichung des Impfstoffs kann zum Beispiel intradermal, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, intranasal oder oral erfolgen.
Mindestens eines der gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten ORF3 oder ORF4 Proteine kann auch in einem „immunochemischen Reagenz" verwendet werden.
Die Bezeichnung „immunochemisches Reagenz" bedeutet, dass die besagten Proteine an einen geeigneten Träger gebunden oder mit einer markierenden Substanz ausgestattet worden sind.
Die Träger, die verwendet werden können, sind zum Beispiel die innere Wand einer Vertiefung einer Mikrotestplatte oder einer Küvette, ein Reagenzglas oder eine Kapillare, eine Membran, ein Filter, Teststreifen oder die Oberfläche eines Partikels wie zum Beispiel ein Latexpartikel, ein Erythrozyt, eine Farbkolloidlösung, eine Metallkolloidlösung oder eine Metallverbindung als Kolloidlösung.
Geeignete Markierungssubstanzen sind unter anderem radioaktive Isotope, eine Fluoreszenzverbindung, ein Enzym, ein Farbkolloidlösung, eine Metallkolloidlösung oder eine Metallverbindung als Kolloidlösung.
Das „immunochemische Reagenz" kann in einem diagnostischen Assay verwendet werden, worin das besagte Reagenz mit einer Probe inkubiert wird, von der angenommen wird, dass sie anti-PRRSV-Antikörper enthält, wonach die An- oder Abwesenheit der Antikörper bestimmt wird.
Das „immunochemische Reagenz" kann auch in einem Test-Set für einen Immunassay verwendet werden.
Die immunochemische Reaktion, die bei der Verwendung des Test-Sets stattfindet, ist vorzugsweise eine Sandwich-Reaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
BEISPIEL 1
Simultane transiente Expression von PRRSV ORFs im Vakzinia-Virus

Die Herstellung und Analyse des cDNA-Klons pRRSV-T1 von PRRSV wurde von Conzelmann et al. (supra) beschrieben. Fragmente, die die gesamten ORFs des PRRSV enthalten und die nahe des entsprechenden ATG-Initiationscodons starten, wurde stromabwärts des T7-Promotors des Vektors pBlueskript SKII- (Stratagene) in die EcoRV-Restriktionsstelle (ORFS2 und 5) oder in die Smal-Restriktionsenzymstelle (ORFs 3 und 4) nach Behandlung mit Klenow-Polymerase kloniert. Die Insertionen enthielten die folgenden PRRSV-T1-Sequenzreste (Conzelmann et al., supra):

ORF2:	(EcoRI-Ndel, Auffüllung mit Klenow) 1602–2381
ORF3:	(HincII-HinfI, Auffüllung mit Klenow) 2207–3040
ORF4:	(BstYI-SpeI, Auffüllung mit Klenow) 2673–4920
ORF5:	(BstXI-HindIII, Auffüllung mit Klenow) 3304–3954

Transfektionsexperimente wurden in BHK-21 (Baby Hamster Kidney)-Zellen durchgeführt, Klon BSR nach Infektion mit einer M. O. I. von 5 mit vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, PNAS 83, 8122–8126), T7-PNA-Polymerase exprimierend. Eine Stunde past infectionem wurden die Zellen mit 2 μg Plasmid unter Verwendung des Stratagene „Säugetier-Transfektionssets" gemäss den Anleitungen des Herstellers transfiziert.
Die Zellen wurde 4 Stunden nach der Transfektion mit Methioninfreiem Medium gewaschen. Nach 30-minütigem Aushungern wurden 50 μCi Tran(³⁵S)-Markierung pro Petrischale zugegeben und die Zellen 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, in 1% Triton lysiert und die Proteine bei 95°C und mit 2% SDS denaturiert.
Die rohen Proteinproben wurden mit anti-ORF4 monoklonalem Antikörper (MAK35) und fixierten Staphylococcus aureus nach Kessler (Methods Enzymol. 73, 442–459, 1981) präzipitiert. Die Immunkomplexe wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Die resultierenden Pellets wurden im 30 μl Laemmli-Probenpuffer resuspendiert und in 10%-igen SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Gele wurden fixiert, mit En3Hance imprägniert, auf Whatman 3MM-Filterpapier getrocknet und bei –70°C auf KodakX-AR5-Filme aufgelegt.
Die Entglykosylierung des exprimierten Proteins durch Endo-H wurde wie folgt durchgeführt: die präzipitierten und gewaschenen Immunkomplexe wurden in NEB-Puffer (New England Biolabs) resuspendiert. 1,5 Einheiten Endo-H wurden zugegeben und die Probe 16 Stunden bei 37°C inkubiert, und anschliessend in 30 μl Laemmli-Probenpuffer für SDS-PAGE-Analysen resuspendiert.
In einem ersten Experiment (2) wurde die Co-Expression verschiedener ORF-Kombinationen durchgeführt. Es wird gezeigt, dass die Co-Expression von ORF2, ORF3 und ORF4 erforderlich und ausreichend ist, um die Expression der reifen grossen Form des ORF4 (40–47 kD) zu unterstützen. Um zu zeigen, dass die beobachtete Molekulargewichtsform des ORF4-Proteins mit derjenigen in Virionen identisch ist, wurden Entglykosylierungsexperimente mit Endo-H bei verschiedenen Expressionsprodukten verschiedener Kombinationen durchgeführt (3). Es wird gezeigt, dass nur solche Zellen, die mit ORF2, ORF4 und ORF4 co-transformiert wurden, die grosse Form des ORF4 Proteins exprimieren und dass diese grossen Formen gegenüber einer Endo-H-Behandlung resistent sind.
BEISPIEL 2
Gemisch aus PRV-Vektorviren, die ORF2, 3 und 4 von PRRSV exprimieren
Konstruktion von PRV gD- und gE-Vektorviren
Von dem PRV NIA-3-Stamm wurde das gD enthaltende PstI NcoI-Fragment in den pGEM5ZF(+)-Vektor kloniert. Mit dem Transformer^TM-Verfahren (Clonetech) wurden SpeI- und AvrII-Restriktionsstellen eingeführt. Die SpeI-Stelle wurde 17 Nukleotide stromaufwärts des ATG-Startcodons des gD eingeführt. Die AvrII-Stelle wurde beim ersten Nukleotid nach dem TAG-Stopcodon eingeführt. Nachdem diese Mutationen eingeführt worden waren, wurde das vollständige gD-Gen durch Restriktionsenzymverdau mit SpeI und AvrII entfernt. An der früheren gD-Stelle wurde ein Oligonukleotid inseriert, das die SpeI, EcoRI, EcoRV, HindIII und die AvrII-Restriktionsstellen enthielt. Dann wurde das PstI-NcoI-Fragment aus dem Plasmid isoliert und für eine homologe Rekombination mit dem PRV R1-Stamm (de Wind et al., J. Virology 64, 4691–4696, 1990) mit Hilfe der von Peeters et al., J. Virology 66, 894–905, 1992) beschriebenen Methode verwendet.
Um eine gD- und gE-negative Mutante zu erhalten, wurde das NdeI-StuI-Fragment des HindIII-B-Fragments von PRV durch das NdeI-StuI-Fragment ersetzt, dass die gD-Deletion enthält. Dieses HindIII-Fragment enthielt auch eine Deletion, die gE betraf (von der DraI-Stelle an Position 6831 bis zur Linker-Insertionsstelle der Mutante 324 (de Wind et al., 1990, supra) an Position 8562). Das daraus resultierende Plasmid wurde dann verwendet, um gD-, gE-Virus durch Rekombination mit den Wildtyp-Cosmiden c-179, c-27 und c-443 zu generieren (van Zijl et al., J. Virology 62, 2191–2195, 1988).
Konstruktion der PRV-ORF2, 3 und 4 exprimierenden gD-Mutanten Jeder ORF wurde, wie oben beschrieben, getrennt in den Pseudorabies gD-, gE- Vektor D57 inseriert. Die folgende Strategie wurde angewendet, um rekombinante Viren zu erhalten. Die ORFs wurden einzeln unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion vermehrt. Die vermehrten Klone wurden in den pCR^tmII-Vektor kloniert. Anschliessend wurden die ORFs aus diesem Vektor isoliert und in den Transfervektor pDHβ kloniert. Dieser Vektor wurde dann verwendet, um die ORFs des PRRSV in das virale Genom des PRV D57-Stamms zu transferieren.
PCR-Amplifikation der PRRSV-ORFs

Um die einzelnen ORFs zu vermehren, wurden die folgenden Primer-Paare, die mit den PRRSV-Sequenzen korrespondierten, verwendet:

ORF2:	Oberer Primer; Nukleotide 1609–1628 einschliesslich Unterer Primer; Komplementärsequenz der Nukleotide 2351–2370 einschliesslich
ORF 3:	Oberer Primer; Nukleotide 2211–2230 einschliesslich Unterer Primer; Komplementärsequenz der Nukleotide 3025–3044 einschliesslich
ORF 4:	Oberer Primer; Nukleotide 2747–2766 einschliesslich Unterer Primer; Komplementärsequenz der Nukleotide 3296–3315 einschliesslich

Alle Nukleotidnummern beziehen sich auf die von Conzelmann et al., (Virology 193, 329–339, 1993) bereitgestellte PRRSV-Sequenz.
Die ORFs wurden mit dem folgenden Verfahren von einem Plasmid vermehrt, das alle Strukturgene von PSSRV (pPRRSV) enthielt: Die PCR-Mischung wurde durch Zugabe von: 5 μl (10 ×) PCR-Puffer (von dem Enzymlieferanten erworben), 5 μl (2 mM) dNTPs, 5 μl (10 μM) oberer Primen, 5 μl (10 μM) unterer Primen, 0,2 E Super Taq (Separo Q), 1 μl (1 μg/μl) pPRRSV und Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 μl hergestellt. Nachdem ein Tropfen Mineralöl auf die Mischung gegeben wurde, wurde eine PCR mit 30 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C durchgeführt. Nach der Amplifikation wurden die Produkte auf einem 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthaltenden 2%-igen Agarosegel sichtbar gemacht.
Klonierung der amplifizierten ORFs
Die amplifizierten Produkte wurden unter Anwendung des Invitrogen TA-Klonierungssets in den pCR^tmII-Vektor kloniert. Alle Verfahren wurden gemäss den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Von diesem Vektor wurden die ORFs in den Transfervektor pDHβ kloniert. Diejenigen PCR-Produkte, die in der richtigen Orientierung kloniert worden waren (ATG-Startcodon ORF auf der Seite des T7-Promotors des pCR^tmII-Vektors) wurden durch einen BamHI-Verdau aus dem Vektor entfernt, gefolgt von einer Klenow-Behandlung um stumpfe Enden zu bilden und danach einem XbaI-Verdau. Die Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel getrennt und das den ORF enthaltende Band aus dem Gel mit Geneclean nach Anleitung des Herstellers gereinigt. Der Vektor wurde zunächst mit EcoRI und danach mit XbaI verdaut, auf einem Gel getrennt und der lineare Vektor unter Verwendung von Geneclean gereinigt. Alle ORF enthaltenden Fragmente wurden in den linearisierten Vektor unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Alle Enzyme wurden von Pharmacia erworben und alle Verfahren gemäss Standardmethoden durchgeführt (Current Protocolls in Molecular Bioiogy).
Herstellung von PRV-Mutanten mit PRRSV-Insertionen
Das PRV-Virus mit seinem deletierten gD- und gE-Gen (D57-Stamm) wurde auf gD-komplementierenden Vero-Zellen gezüchtet. Bei vollem CPE wurde das Virus geerntet und seine DNA nach Standardverfahren isoliert. Die virale DNA wurde mit EcoRI, die einzige EcoRI-Stelle in dem früheren gD-Lokus verwendend, geschnitten. Die pDHβ-Vektoren, die die PRRSV-Insertionen enthielten, wurden mit MluI linearisiert. Sowohl das linearisierte Plasmid als auch die geschnittene virale D57-DNA wurden mit DOTAP (Boehringer Mannheim) gemäss der Anleitung des Herstellers gemischt. Eine Gesamtmenge von 5 μg DNA wurde mit 10 μl DOTAP in einem Gesamtvolumen von 500 μl 20 mM HEPES-Puffer gemischt. Für die DNA wurde ein molares Verhältnis von 10 Kopien Plasmid-DNA zu einer Kopie viraler DNA verwendet. Die Mischung wurde 6 Stunden bei 37°C auf einem zu 80% konfluenten Monolayer aus gD-komplementierenden Vero-Zellen inkubiert, von denen das Medium entfernt worden war. Nach dieser Inkubationsperiode wurde Medium zugegeben und die Platten weiter bei 37°C inkubiert. Bei vollen CPE wurde das Medium geerntet. Schliesslich wurden die rekombinanten Viren aus dem geernteten Medium durch limitierende Verdünnung isoliert und durch Expression der inserierten PRRSV-Gene unter Verwendung von Immunfluoreszenz exprimiert. Es wurde eine Mischung der Viren, die die ORFs 2, 3 und 9 exprimierten, hergestellt und für die Immunisierung von Schweinen verwendet.
LEGENDE ZU DEN FIGUREN
1
Verteilung der offenen Leserahmen in der bestimmten PRRSV-Sequenz und Lokalisierung der subgenomischen mRNAs (sg mRNAs, die Kästchen stellen die „Leader"-RNA dar).
2
Radioimmunpräzipitation von transient exprimierten ORFs von PRRSV. Die exprimierten Proteine wurden auf einem 10%-igen SDS-Pa-Gel aufgetrennt. Die linke Spur umfasst Marker (M)-Proteine. Die anderen Spuren stellen die Elektrophorese der markierten Proteine dar, die von den mit den oben erwähnten ORFs transformierten Wirtszellen exprimiert wurden.
3
Siehe A. Es wurden zusätzlich einige Expressionsprodukte mit Endo-H (EH) behandelt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer glykosylierten Form von ORF3 Protein oder ORF4 Protein des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom-Virus (PRRSV), dadurch gekennzeichnet, dass eine Wirtszelle verwendet wird, in welcher PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 durch Transformation der Wirtszelle mit einem oder mehreren DNA Fragment(en), die ein oder mehrere der besagten ORF Proteine kodieren, eingeführt wurden, wobei die Wirtszelle PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Proteine co-exprimiert und das exprimierte Protein geerntet wird.
Verfahren zur Herstellung einer glykosylierten Form von ORF3 Protein oder ORF4 Protein des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom-Virus (PRRSV), dadurch gekennzeichnet, dass eine Wirtszelle verwendet wird, in welcher PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 eingeführt wurden, wobei jedes der besagten ORFs durch (Co-)Infektion der Zelle mit einem oder mehreren Vektorvirus(en), die ein oder mehrere heterologe(s) DNA Fragment(e) enthalten, die PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Protein kodieren, eingeführt wurde, wobei die Wirtszelle PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Proteine co-exprimiert und das exprimierte Protein geerntet wird.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieselbe Wirtszelle PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 als Folge einer (Co-)Infektion mit einem oder mehreren Vektorviren umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektorvirus ein Baculovirus ist.
Wirtszelle, in welcher PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 durch Transformation der Wirtszelle mit einem oder mehreren DNA Fragment(en), die ein oder mehrere der besagten, unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors stehenden ORF Proteine kodieren, eingeführt wurden, wobei die Wirtszelle fähig ist, die ORF Proteine zu exprimieren.
Vektorvirus enthaltend ein oder mehrere heterologe(s) DNA Fragment(e), dadurch gekennzeichnet, dass das (die) DNA Fragment(e) PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Protein kodieren.
Vektorvirus gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Pseudorabies Virus ist.
Ein Gemisch von zwei oder mehr Vektorviren gemäss Anspruch 6, wobei das besagte Gemisch fähig ist, eine Wirtszelle zu co-infizieren und PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 in der Zelle zu exprimieren.
DNA Molekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die PRRSV ORF2, ORF3 und ORF4 Protein kodiert, wobei jedes ORF operativ mit einem separaten Promotor verknüpft ist.