TWI627281B - 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供降低包含PCV-2抗原之組合物之殺病毒活性的方法,以及包含PCV-2抗原之抗原性製劑及免疫原性組合物,其殺病毒活性已降低。此外,本發明亦關於一種提高包含PCV-2抗原之免疫原性組合物之免疫原性的方法,以及具有提高免疫原性之免疫原性組合物。
Description
本發明係關於用於降低通常會具有一定程度之殺病毒活性的組合物之殺病毒活性的方法及組合物。藉由使用本發明方法可使該等組合物之殺病毒活性與不包括本發明步驟的組合物之殺病毒活性相比降低。更特定言之,本發明係關於製備抗原性II型豬環狀病毒(PCV-2)組合物之方法,特徵在於該等組合物與在此項技術中已知之組合物相比,尤其與並非藉由本發明方法製備之組合物相比不具有或具有較低殺病毒活性。本發明進一步係關於一種新穎免疫原性組合物,較佳為根據本專利申請案提供之方法製備的含有PCV-2之組合物,其較佳特徵在於與此項技術中已知之組合物相比,具有降低的或不具有殺病毒活性。根據另一態樣,本發明亦提供包含純化PCV-2抗原(較佳具有改良免疫原性之純化PCV-2抗原)的免疫原性組合物。
本申請案包括根據37 C.F.R. 1.821-1.825之序列表。本申請案隨附之序列表以引用的方式全部併入本文中。
2型豬環狀病毒(PCV-2)為小型(直徑為17-22 nm)二十面體無包膜DNA病毒,其含有單股圓形基因組。PCV-2與1型豬環狀病毒(PCV-1)具有約80%序列一致性。然而,與通常無毒力之PCV-1相比,感染有PCV-2之豬展現通常稱為離乳後多系統消耗性症候群(PMWS)之症候群。PMWS之臨床特徵為消瘦、皮膚蒼白、身體憔悴、呼吸窘迫、腹瀉及黃疸(icterus/jaundice)。在一些受感染之豬中,所有症狀之組合將顯而易見而其他受感染之豬將僅僅具有此等症狀中之一或兩者。在屍檢期間,顯微鏡可見及肉眼可見之病灶亦出現於多個組織及器官上,淋巴器官為最常見之病灶部位。已觀測到PCV-2核酸或抗原之量與顯微鏡可見淋巴病灶的嚴重性之間密切相關。感染有PCV-2之豬之死亡率可達80%。除PMWS外,PCV-2與包括以下之若干其他感染相關:假性狂犬病、豬生殖及呼吸症候群(PRRS)、格拉氏疾病(Glasser's disease)、鏈球菌性腦膜炎、沙門氏桿菌病、離乳後大腸桿菌病、飲食性肝障礙及化膿性支氣管肺炎。
可利用若干疫苗來減少PCV-2感染對豬之影響。美國專利第6,703,023號提供用於預防豬之PMWS的基於DNA之疫苗。在WO 03/049703中,描述活嵌合疫苗之製備,該疫苗包含非病原性PCV1病毒,但其中ORF2蛋白經病原性PCV-2之ORF2蛋白置換。WO 99/18214及WO 99/29717已提供若干PCV-2菌株及製備PVC2死疫苗之程序。WO 99/18214及WO 99/2971亦已描述次單位疫苗之製備。WO 06/072065已報導基於ORF2之有效次單位疫苗。WO 07/28823亦描述另一基於ORF-2之次單位疫苗。然而,先前技術中所述之疫苗均不包括非殺病毒及/或純化的PCV-2抗原,較佳高度純化之PCV-2 ORF2抗原。
針對PCV-2之免疫原性組合物及針對其他病原體之各種免疫原性組合物常常對其他抗原具有殺病毒效應。當前管理標準(9 CFR 113.35)允許多價組合物中有一些殺病毒活性,但在與免疫原性組合物之其他組份組合時,此殺病毒活性不能造成超過0.7 log/ml之活病毒或小於0.7 log/ml之活細菌CFU的損失。殺病毒活性高於所允許者之組合物不能與其他抗原組合來形成多價疫苗。
PCV-2之開放閱讀框架2(ORF2)蛋白當在SDS-PAGE凝膠上跑行時具有30 kDa之近似分子量,其在以往用作PCV-2之疫苗及免疫原性組合物中之抗原組份。獲得適用於該等疫苗及組合物中的ORF2之典型方法一般由以下步驟組成:擴增編碼ORF2之PCV-2 DNA、在宿主細胞內表現ORF2蛋白及經由細胞溶解自宿主細胞提取ORF2蛋白。接著將回收的ORF2細胞溶解物用作免疫原性組合物或疫苗之抗原部分。在一些情況下,將含有ORF2之細胞溶解物與細胞碎片分離。
需要一種降低含有PCV-2之免疫原性組合物及其中之抗原的殺病毒活性的方法,以便滿足管理要求且投與有效的多價組合物。另外需要減小或降低含有PCV-2之組合物對豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之殺病毒活性及效應的方法。另外需要彼等免疫原性組合物,其已經歷本發明方法使得其殺病毒活性已降低至可接受標準且可與其他抗原組合以形成多價免疫原性組合物。
除非另有所述,否則本發明之實施將採用此項技術技能範圍內之習知分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白質化學及免疫學技術。參見,例如,Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第I,II及III卷,第二版(1989);DNA Cloning,第I及II卷(D. N. Glover編,1985);Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編,1984);Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins編,1984);Animal Cell Culture(R. K. Freshney編,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986);Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);the series,Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan編,Academic Press,Inc.);Protein purification methods-a practical approach(E.L.V. Harris及S. Angal編,IRL Press at Oxford University Press);及Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編,1986,Blackwell Scientific Publications)。
在詳細描述本發明之前,應瞭解本發明不限於特定DNA、多肽序列或過程參數,其當然可變化。亦應瞭解本文中所使用之術語僅為了達成描述本發明之特定實施例之目的且並非意欲限制本發明。應注意,除非文中明確另外指示,否則如本說明書及隨附申請專利範圍所用之單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此,舉例而言,「一抗原」包括兩種或兩種以上抗原之混合物,「一賦形劑」包括兩種或兩種以上賦形劑之混合物,及其類似情況。
本發明解決先前技術中所固有之問題且相對於當前技術有明顯進步。一般而言,本發明提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。該PCV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用於該PCV-2抗原性組合物中。
出於本發明之目的,「第一液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗及其類似物組合使用的液體、水性或流體培養基。第一液體較佳包含抗原性組合物之培養基,第一液體更佳包含用於在培養宿主細胞中產生重組蛋白的細胞培養基或較佳由其組成。該等培養宿主細胞可為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞及哺乳動物細胞,以昆蟲及哺乳動物細胞尤佳。因此,第一流體可包含用於培養細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或哺乳動物細胞之培養基或由其組成。當使用昆蟲細胞時,細胞培養基較佳為不含血清之細胞培養基,且該培養基最佳為Excell 420不含血清培養基。
出於本發明之目的,「第二液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗及其類似物組合使用的任何液體,其不同於第一液體。第二液體較佳為水溶液,甚至更佳為醫藥學上可接受之溶液,且甚至更佳為緩衝液,諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液及其類似物。最佳,第二流體之特徵在於當活病毒或活細菌在該流體中培養或儲存時,其不對任何活病毒或活細菌有殺病毒作用。
出於本發明之目的,「部分」係指不包涵所有量之任何量。舉例而言,一部分液體將為小於100%液體之體積,諸如90%液體、80%液體、70%液體之任何量且所有量均介於超過0%與小於100%之間。
「PCV-2抗原」係指包含至少一種當投與動物(較佳豬)時可誘導、刺激或增強針對PCV-2感染之免疫反應的抗原的任何物質組合物。該PCV-2抗原較佳為全PCV-2病毒(較佳呈滅活形式)、經修飾或減毒之PCV-2活病毒、包含至少一個PCV-2免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒、包含至少一個PCV-2免疫原性胺基酸序列(較佳ORF2)的任何其他多肽或組份。如本文中所用之術語「免疫原性蛋白」、「免疫原性多肽」或「免疫原性胺基酸序列」係指引發宿主中針對PCV-2之免疫反應的任何PCV-2胺基酸序列。該PCV-2免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性胺基酸較佳為國際專利申請案WO 2006/072065(其教示內容以引用的方式併入本文中)中所揭示或提供之任一者,或為在此項技術中已知之任何其他PCV-2多肽。舉例而言,PCV-2 ORF2 DNA之代表性序列包含核苷酸序列Genbank寄存編號AF086834(SEQ ID NO: 3)及SEQ ID NO: 4。
然而,熟習此項技術者應瞭解此序列在序列同源性方面可變化高達1%-10%但仍保持使其適用於免疫原性組合物中之抗原特徵。免疫組合物之抗原特徵可例如藉由WO 06/072065之實例4所提供之攻毒實驗來評估。此外,當經修飾抗原與由如WO 06/072065中提供之SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之聚核苷酸序列編碼的PCV-2 ORF2蛋白相比賦予至少70%,較佳80%,更佳90%之保護性免疫力時,仍保留經修飾抗原之抗原特徵。其他較佳PCV-2 ORF2抗原為下文描述者:
i) 包含WO 06/07065之SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11序列的多肽;
ii) 與i)之多肽有至少80%同源性及/或一致性之任何多肽;
iii) i)及/或ii)之多肽之任何免疫原性部分;
iv) iii)之免疫原性部分,包含至少5個,較佳8個,更佳,甚至更佳10個包括於WO 06/072065之SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11序列中之鄰接胺基酸;
v) 由包含WO 06/072065之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4序列之DNA編碼的多肽;
vi) 由與v)之聚核苷酸有至少80%同源性及/或一致性的聚核苷酸編碼之任何多肽;
vii) 由v)及/或vi)之聚核苷酸編碼的多肽之任何免疫原性部分;
viii) vii)之免疫原性部分,其中編碼該免疫原性部分之聚核苷酸包含至少30個包括於WO 06/072065之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4序列中的鄰接核苷酸。
WO 06/072065之序列表與本申請案隨附之序列表相同。
上述任一免疫原性部分較佳具有由WO 06/07065之SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之序列編碼的PCV-2 ORF2抗原之抗原特徵。
如此項技術中已知,「序列一致性」係指兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以上聚核苷酸序列(亦即參考序列與有待與參考序列比較之指定序列)之間的關係。序列一致性係藉由在指定序列與參考序列經最佳比對以產生最高序列相似度後,將其比較而測定,如由此等序列串之間的匹配度所測定。在此比對後,逐個位置測定序列一致性,例如,若在一特定位置處核苷酸或胺基酸殘基一致,則該等序列在彼位置處「一致」。隨後,此等位置一致性之總數除以參考序列中核苷酸或殘基之總數得到序列一致性百分比。舉例而言,核苷酸序列與參考核苷酸序列之「序列一致性」為至少(例如)85%,較佳90%,甚至更佳95%的聚核苷酸意謂除參考核苷酸序列之每100個核苷酸,指定聚核苷酸序列可能包括至多15個,較佳至多10個,甚至更佳至多5個點突變外,指定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之,在核苷酸序列相對於參考核苷酸序列具有至少85%,較佳90%,甚至更佳95%之一致性的聚核苷酸中,參考序列中至多15%,較佳10%,甚至更佳5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代,或可將參考序列中數量為至多15%,較佳10%,甚至更佳5%核苷酸總數之核苷酸插入參考序列中。參考序列之此等突變可發生在參考核苷酸序列之5'末端位置或3'末端位置處或彼等末端位置之間的任何地方,個別地散佈於參考序列中之核苷酸間或參考序列內之一或多個鄰接基團中。類似地,指定胺基酸序列具有與參考胺基酸序列之至少(例如)85%,較佳90%,甚至更佳95%序列一致性的多肽意謂除參考胺基酸序列之每100個胺基酸,指定多肽序列可能包括至多15個,較佳至多10個,甚至更佳至多5個胺基酸改變外,該多肽之指定胺基酸序列與參考序列一致。換言之,為獲得具有與參考胺基酸序列之至少85%,較佳90%,甚至更佳95%序列一致性之指定多肽序列,參考序列中至多15%,較佳至多10%,甚至更佳至多5%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代,或可將參考序列中數量為至多15%,較佳至多10%,甚至更佳至多5%胺基酸殘基總數之胺基酸插入參考序列中。參考序列之此等改變可發生於參考胺基酸序列之胺基末端或羧基末端位置處或彼等末端位置之間的任何地方,個別地散佈於參考序列之殘基間或參考序列內之一或多個鄰接基團中。較佳地,不一致的殘基位置的不同之處為保守性胺基酸取代。然而,測定序列一致性時不包括保守取代作為匹配。
出於本發明之目的,「活」病毒或細菌係指能夠在宿主中複製之病毒或細菌。本發明之較佳活病毒及較佳活細菌分別為PRRS病毒及豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumonia)細菌。然而,術語活病毒或活細菌分別不限於PRRS及豬肺炎黴漿菌。
可藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體,其中該第二液體不同於該第一液體(參見第二流體之定義)。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中藉由以第二液體交換該部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體,且其中該第二液體不同於該第一液體。較佳地,以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)藉由以第二液體交換至少一部分第一液體自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。
可使用過濾器藉由過濾步驟自PCV-2抗原移除部分第一液體。然而,可使用熟習此項技術者已知之任何其他方法自PCV-2抗原移除部分任何流體,包括第一流體及(當適用時)一部分第二流體。舉例而言,該方法包括(但不限於)離心及/或層析。然而,過濾最佳。移除該部分第一流體或(當適用時)任何其他流體之較佳過濾方法包含超濾及/或透濾。超濾及透濾為熟習此項技術者已知之標準方法,例如在以下文獻中有詳細描述:Protein Purification Methods-A Practical Approach-編者:E.L.V. Harris及S. Angel,Oxford University Press 1995(其內容及教示以引用的方式併入本文中)。詳言之,在彼教科書之第3章中,描述若干方法及設備類型,一般技術者可出於本發明之目的以例示性方式使用所有該等方法及設備。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中藉由過濾(較佳藉由透濾或超濾)自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳地,藉由以第二液體交換至少一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體,該交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。
如上所定義,欲用於所述任一方法中之較佳第二液體為緩衝液,較佳為生理學上可接受之緩衝液且以生理食鹽水尤佳。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)藉由用緩衝液交換,較佳生理學上可接受之緩衝液(諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液或其類似物)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。較佳地,藉由過濾,較佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除該部分第一液體。更佳地,以緩衝液,較佳生理學上可接受之緩衝液(諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液或其類似物)交換至少一部分第一液體之操作包含以下步驟:a)將該緩衝液,較佳該生理學上可接受之緩衝液(諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液或其類似物)添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)較佳藉由過濾,甚至更佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除一部分該第一液體及該流體來濃縮PCV-2抗原,該流體為緩衝液,較佳生理學上可接受之緩衝液,諸如生理食鹽水或磷酸鹽緩衝液或其類似物。
如本文所述之方法之濃縮步驟及該液體添加步驟可實質上同時執行,或者該濃縮步驟與該液體添加步驟依次執行。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)藉由以第二液體交換一部分第一液體自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原,其中實質上同時或依次執行液體添加步驟。較佳地,藉由過濾,較佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除該部分第一液體且在添加第二液體之情況下移除第一流體與第二流體之混合物。
當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。舉例而言,在另一態樣中,在該濃縮步驟之前進行該液體添加步驟且在一替代態樣中,在該液體添加步驟之前進行該濃縮步驟。可多次執行該液體添加步驟及該濃縮步驟,不管執行該等步驟之順序如何。舉例而言,此等各別步驟之每一者可執行至少兩次,至少三次,至少四次,至少五次,至少十次,直至所需之多次。在一態樣中,該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少兩次。在另一態樣中,該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少三次。因此,根據本申請案之另一態樣,提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其中該方法一般包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)藉由以第二液體交換至少一部分該第一液體自該PCV-2抗原移除該部分第一液體,其中多次執行該交換操作。較佳地,以一部分第二流體交換部分第一流體之操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原,其中多次(例如兩次、三次、五次、十次等)執行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳地,兩次,最佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。如上所述,過濾為自PCV-2抗原移除一部分該第一液體或在如上所述多個移除步驟之情況下,移除一部分第一與第二流體之混合物的較佳方法。
過濾器可為此項技術中之任何習知過濾器。較佳地,該過濾器包括半透膜。在另一較佳形式中,該半透膜具有小於PCV-2抗原之平均孔徑,藉此防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且由過濾器截留PCV-2抗原。在另一態樣中,該過濾器具有防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質通過的平均孔徑,更佳地,該過濾器具有防止至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質通過的平均孔徑,且最佳地,該過濾器具有防止至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過的平均孔徑。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。在另一態樣中,該半透膜包括選自由聚碸、聚醚碸及再生纖維素組成之群的材料。然而,可使用能夠自PCV-2抗原移除一部分第一流體且在多個方法步驟之情況下移除第一與第二流體之混合物的任何其他材料。該過濾器可選自由中空纖維膜超濾筒、平板或過濾片(cassette)組成之群,以中空纖維膜超濾筒尤佳。因此,根據本申請案之另一態樣,如上所述提供製備PCV-2抗原性組合物之方法。該方法一般包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)藉由過濾步驟自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該過濾器較佳為半透膜或包含半透膜。較佳地,該半透膜具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。較佳地,半透膜之平均孔徑防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質通過,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質通過,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。如上所述,移除步驟一般包括以一部分第二流體交換部分第一流體,該交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體濃縮PCV-2抗原,其中多次(例如兩次、三次、五次、十次等)執行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳兩次,最佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。
執行本文中所提供之方法之濃縮步驟,以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍。更佳地,進行該濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮4倍至20倍。最佳地,進行濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮7倍至10倍。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中自PCV-2抗原移除部分該第一液體,且其中該PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮了3倍至50倍,較佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一流體,該交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍,較佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。較佳地,半透膜之平均孔徑防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
在另一態樣中,藉由本文之方法製備的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至少10%。更佳地,PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地,PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第一液體相比降低至少70%。
出於本發明之目的,術語「殺病毒活性」意謂當流體、溶液或組合物與活病毒或活細菌混合時,該流體、溶液或組合物在某種程度上滅活或殺滅該活病毒或活細菌。因此,流體、溶液或組合物之殺病毒活性降低至少10%意謂活病毒或活細菌在經歷本文所述之任一方法之流體、溶液或組合物中之存活率比在未經歷本文所述之任一方法之流體、溶液或組合物中的存活率高90%。根據本發明,PRRS病毒(較佳具有ATCC寄存編號VR 2332之PRRS)為用於測定殺病毒活性之參考病毒。為測定對於細菌之殺病毒活性,建議使用豬肺炎黴漿菌,較佳豬肺炎黴漿菌之J-菌株。
因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中在步驟ii)之後獲得的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性(較佳對於PRRS病毒)與第一液體之殺病毒活性相比降低至少10%,較佳至少50%,更佳至少70%,甚至更佳至少90%。較佳地,藉由以第二液體交換一部分具有殺病毒活性之第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
在另一態樣中,該方法進一步包含收集在自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後所獲得的PCV-2抗原之步驟。
如本文中所用,「收集(harvesting/harvest)」係指收集或回收PCV-2抗原。當製備為本申請案之方法及組合物使用的抗原時,或當PCV-2抗原經歷本文所述之方法時,可使用此項技術中已知之任何習知方法來回收PCV-2抗原。在一尤佳收集方式中,經由過濾步驟自該PCV-2抗原移除部分該第一液體且自過濾器阻滯物回收或收集PCV-2抗原。在一更佳形式中,自具有本文所述之孔徑的半透膜之阻滯物收集或回收PCV-2抗原。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中收集在該步驟ii)之後獲得的PCV-2抗原。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
將在經歷本文所提供之方法之後(較佳在自過濾器阻滯物收集之後)剩餘的PCV-2抗原與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組份混合。較佳地,該另一組份為佐劑,甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,且更佳其中該佐劑為卡波姆(Carbomer)。
如本文中所用之「醫藥學上可接受之載劑」及「獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗料、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。
如本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)之皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。該乳液可尤其基於輕液體石蠟油(European Pharmacopea型);類異戊二烯油,諸如角鯊烷或角鯊烯;由烯烴(尤其異丁烯或癸烯)之低聚合產生的油;含有直鏈烷基之酸或醇之酯,更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;支鏈脂肪酸或醇之酯,尤其異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子界面活性劑,尤其為視情況經乙氧基化之脫水山梨糖醇酯、二縮甘露醇酯(例如無水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、異硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羥基硬脂酸酯,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其為Pluronic產物,特別為L121)。參見Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull,D. E. S.編)。John Wiley及Sons,NY,第51-94頁(1995)及Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。舉例而言,可使用由M. Powell及M. Newman所編之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」,Plenum Press,1995之第147頁所述之SPT乳液及同一本書中第183頁所述之乳液MF59。其他合適之佐劑包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(E. coli)之熱不穩定性腸毒素(重組或其他方式)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯基二肽等。在順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物中,包括共聚物EMA(Monsanto),其為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物在水中溶解產生酸性溶液,將其中和,較佳中和至生理pH值以產生佐劑溶液,將向該佐劑溶液中併入免疫原性、免疫性或疫苗組合物本身。
佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐劑化合物為尤其與糖類或多元醇類之聚烯基醚交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物以術語卡波姆來指稱(Phameuropa第8卷,第2期,1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號,其描述與具有至少3個羥基,較佳不超過8個羥基之多羥基化合物交聯之丙烯酸聚合物,至少三個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團為彼等含有2至4個碳原子之基團,例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。該等不飽和基團本身可含有諸如甲基之其他取代基。以名稱卡波莫(Carbopol)出售之產品(BF Goodrich,Ohio,USA)特別適合。其與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中,可提及卡波莫974P、934P及971P。最佳使用卡波莫971P。
較佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約500 μg至約5 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約750 μg至約2.5 mg之量添加佐劑。最佳地,以每劑量約1 mg之量添加佐劑。
「稀釋劑」可包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖等。穩定劑包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽等。
如本文中所用之「防腐劑」係指抗微生物活性劑,諸如慶大黴素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)及其類似物。詳言之,添加防腐劑對於製備多劑量組合物而言最佳。以有效防止相關組合物受任何微生物污染或抑制相關組合物內的任何微生物生長之濃度添加彼等抗微生物活性劑。
因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,進一步包含以下步驟:將在步驟ii)之後剩餘的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較佳地,其中該另一組份為佐劑,甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
上述方法中所用之PCV-2抗原可為本文中所定義之任何PCV-2抗原。PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳包含PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳包含ORF-2蛋白之病毒樣粒子,且甚至更佳包含INGELVAC CIRCOFLEX中所包括之抗原。因此,根據本申請案之另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。
較佳地,執行液體添加步驟及濃縮步驟多次,較佳兩次,甚至更佳三次。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有平均孔徑小於PCV-2抗原,且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備PCV-2抗原呈全病毒或病毒樣粒子時,此孔徑較佳。
所用含有PCV-2抗原之第一液體可由此項技術中已知之任何方法獲得。較佳地,含有PCV-2抗原之該第一液體以及PCV-2抗原可由國際專利申請案WO 2006/072065中所述之任何方法(其內容及教示以引用的方式併入本文中)獲得。特別地,當PCV-2抗原於宿主細胞中於活體外重組表現時,PCV-2抗原可經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體,較佳重組桿狀病毒之病毒載體獲得。
用於表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之載體及製造及/或使用該等載體(或重組載體)之方法可藉由或類似於以下所揭示之方法實現:美國專利第4,603,112號;第4,769,330號;第5,174,993號;第5,505,941號;第5,338,683號;第5,494,807號;第4,722,848號;第5,942,235號;第5,364,773號;第5,762,938號;第5,770,212號;第5,942,235號;第382,425號;PCT公開案WO 94/16716;WO 96/39491;WO 95/30018;Paoletti,「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」,PNAS USA 93: 11349-11353,1996年10月;Moss,「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety」,PNAS USA 93: 11341-11348,1996年10月;Smith等人,美國專利第4,745,051號,(recombinant baculovirus);Richardson,C.D.(編者),Methods in Molecular Biology 39,「Baculovirus Expression Protocols」(1995 Humana Press Inc.);Smith等人,"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」,Molecular and Cellular Biology,1983年12月,第3卷,第12期,第2156-2165頁;Pennock等人,「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」Molecular and Cellular Biology 1984年3月,第4卷,第3期,第399-406頁;EPA0 370 573;1986年10月16日申請之美國申請案第920,197號;EP專利公開案第265785號;美國專利第4,769,331號(recombinant herpesvirus);Roizman,「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,」PNAS USA 93:11307-11312,1996年10月;Andreansky等人,「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,」PNAS USA 93: 11313-11318,1996年10月;Robertson等人「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」,PNAS USA 93: 11334-11340,1996年10月;Frolov等人,「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,」PNAS USA 93: 11371-11377,1996年10月;Kitson等人,J. Virol. 65,3068-3075,1991;美國專利第5,591,439號;第5,552,143號;WO 98/00166;已核准之美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號,均申請於1996年7月3日(recombinant adenovirus);Grunhaus等人,1992,「Adenovirus as cloning vectors」,Seminarsin Virology(第3卷)第237-52頁,1993;Ballay等人EMBO期刊,第4卷,第3861-65頁,Graham,Tibtech 8,85-87,1990年4月;Prevec等人,J. Gen Virol. 70,42434;PCT WO 91/11525;Felgner等人(1994),J. Biol. Chem. 269,2550-2561,Science,259: 1745-49,1993及McClements等人,「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone orin combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」,PNAS USA 93: 11414-11420,1996年10月;及美國專利第5,591,639號;第5,589,466號及第5,580,859號;以及WO 90/11092;WO93/19183;WO94/21797;WO95/11307;WO95/20660;Tang等人,Nature及Furth等人Analytical Biochemistry,relating to DNA expression vectors,等等。亦參見WO 98/33510;Ju等人,Diabetologia,41: 736-739,1998(lentiviral expression system);Sanford等人,美國專利第4,945,050號;Fischbach等人(Intracel),WO 90/01543;Robinson等人,seminars in Immunology第9卷,第271-283頁(1997),(DNA vector systems);Szoka等人,美國專利第號(method of inserting DNA into living cells);McCormick等人,美國專利第5,677,178號(use of cytopathic viruses);及美國專利第5,928,913號(vectors for gene delivery)以及本文中所引用之其他文獻。PCV-2 ORF2抗原在昆蟲細胞中之表現描述於例如WO 06/072065中。本發明之純化PCV-2 ORF2抗原可藉由此項技術中已知之若干方法獲得。較佳方法為本文所述之彼等方法。PCV-2 ORF2抗原可藉由包含以下步驟之方法活體外重組製得:i)允許用含有PCV-2 ORF2編碼序列之重組病毒載體感染於培養物中之易感細胞,其中由重組病毒載體表現PCV-2 ORF2蛋白,及ii)此後自細胞培養物回收PCV-2 ORF2抗原。藉由收集表現PCV-2 ORF2抗原之全(亦即完整)SF+細胞來回收PCV-2 ORF2抗原。
因此,根據本申請案之另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。當使用含有及表現該PCV-2抗原之病毒載體(尤其重組桿狀病毒)製備/獲得PCV-2抗原時,上述方法進一步包含較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)之步驟。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後,更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活步驟。甚至更佳地,在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除部分第一液體之後執行滅活步驟。當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍,在該濃縮之後進行滅活步驟。當多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟時,在最後一次液體添加步驟及濃縮步驟之後執行該滅活步驟。當使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟時,在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步驟之後,執行該滅活步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
出於本發明之目的,「DNA滅活劑」係指滅活DNA(較佳病原體之DNA)使得病原體不能引起主動感染或具有傳染性或複製但仍能誘導個體之免疫反應的任何化學試劑。DNA滅活劑較佳為福馬林(formalin)。
因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,其中該方法進一步包含較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)之步驟,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後,更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除部分第一液體之後執行滅活步驟。當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,甚至更佳7倍至10倍,在該濃縮之後進行滅活步驟。當多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟時,在最後一次液體添加步驟及濃縮步驟之後執行該滅活步驟。當使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟時,在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步驟之後,執行該滅活步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
在本發明方法中使用DNA滅活劑之情況下,該方法進一步包含添加一定量之中和該DNA滅活劑之試劑的步驟,該量等於該DNA滅活劑之量,其中中和DNA滅活劑之試劑包含濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉且其中該DNA滅活劑為BEI。較佳地,在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後執行該滅活步驟。
如本文中所用「中和滅活劑之試劑」或「中和劑」係指能中和上列滅活劑使得滅活劑不能滅活DNA之任何試劑。中和滅活劑之試劑較佳為硫代硫酸鈉。
因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中滅活劑較佳包含BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後,更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活及中和步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體之後執行滅活及中和步驟。當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍,在該濃縮步驟之後進行滅活及中和步驟。當多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟時,在最後一次液體添加步驟及濃縮步驟之後執行該滅活及中和步驟。當使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟時,在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步驟之後,執行該滅活及中和步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
在本申請案之另一態樣中,上述方法進一步包含將在該滅活及中和步驟之後獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合之步驟:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量較佳等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中滅活劑較佳包含BEI;及v)將在步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較佳該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在步驟ii)中,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
根據另一態樣,獲得具有降低殺病毒活性之PCV-2抗原的上述任何方法可包括進一步純化步驟以獲得純化PCV-2抗原。意外地發現包含純化PCV-2抗原(較佳與佐劑組合)之抗原性或免疫原性組合物不僅展示如本文所述之降低殺病毒活性,而且展示與不包含純化PCV-2抗原(意謂其包含非純化或粗PCV-2抗原)之免疫原性組合物相比,提高的免疫原性。
術語「純化」PCV-2抗原意謂PCV-2抗原在製劑中純化至以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過50%(w/w),較佳超過60%(w/w),較佳超過70%(w/w),較佳超過80%(w/w),較佳超過85%(w/w),更佳超過90%(w/w),甚至更佳超過95%(w/w)之程度。換言之,若製劑包含具有80%(w/w)純度等級之PCV-2抗原,則該製劑包含以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計不超過20%(w/w)之非PCV-2蛋白。較佳地,在製劑中,亦即在與佐劑或任何其他賦形劑或滅活劑混合之前的免疫原性組合物中量測純度等級。然而,若用於最終免疫原性組合物中之佐劑為非蛋白基佐劑,則添加佐劑對純度值無任何影響。可藉由熟習此項技術者已知之標準方法評估PCV-2抗原之純度等級,例如藉由在SDS-PAGE分離之後的Imperial Protein Stain(Pierce)、氣相層析、HPLC分析等。評估製劑(亦即免疫原性組合物)中的PCV-2抗原之純度或純度等級的本發明之較佳方法為Imperial Protein Stain(Pierce)染色,其如下進行:使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)分離出包含PCV-2抗原之製劑。在變性(所有緩衝液中均含有SDS)及還原條件(載入緩衝液含有2-巰基乙醇)下跑膠。在將樣品載入凝膠之後,在200伏特恆定電壓下跑膠55分鐘。在跑膠完成之後,使用Imperial Protein Stain(Pierce)對凝膠進行染色且根據製造商說明書脫色。
相比而言,術語「非純化」或「粗」PCV-2抗原係指包含PCV-2抗原之粗製劑。通常在細胞培養物中活體外製備PCV-2抗原。因此,粗PCV-2抗原係指PCV-2抗原與用於製備PCV-2抗原之細胞培養物或細胞培養材料之混合物。此外,非純化PCV-2抗原亦意謂部分純化之PCV-2抗原,其較佳具有以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計小於50%(w/w),更佳小於40%(w/w),甚至更佳小於30%(w/w),甚至更佳小於20%(w/w)之純度等級。
此外,如本文中所用術語「提高免疫原性或改良免疫原性」意謂與包含不同抗原或不同純度等級之抗原的參考免疫原性組合物相比,由包含相關抗原之免疫原性組合物所引起的免疫反應增強,不管此免疫反應為細胞介導及/或抗體介導之免疫反應。根據一較佳實施例,術語提高免疫原性或改良免疫原性意謂與包含不同抗原或不同純度等級之抗原的參考免疫原性組合物相比,由包含相關抗原之免疫原性組合物所引發的抗體介導之免疫反應增強。就此而言,抗體介導之免疫反應意謂與由包含不同抗原或不同純度等級之抗原的參考免疫原性組合物引發之抗體產生相比,對相關抗原有特異性之抗體產生增加。
術語「增強」意謂與由包含不同抗原或不同純度等級之抗原的參考免疫原性組合物所引發之細胞及/或抗體介導之免疫反應相比,細胞及/或抗體介導之免疫反應增強至少10%,較佳至少20%,更佳至少30%,甚至更佳至少40%,甚至更佳至少50%,甚至更佳至少75%,最佳至少100%。
熟習此項技術者一般知曉如何量測細胞及/或抗體介導之免疫反應。詳言之,熟習此項技術者很清楚要比較相關免疫原性組合物之細胞介導之免疫反應與參考組合物之細胞介導之免疫反應,或比較相關免疫原性組合物之抗體介導之免疫反應與參考組合物之抗體介導之免疫反應,而不比較相關免疫原性組合物之細胞介導之免疫反應與參考組合物之抗體介導之免疫反應或相關免疫原性組合物之抗體介導之免疫反應與參考組合物之細胞介導之免疫反應。此外,可例如藉由量測相關免疫原性組合物/抗原對細胞毒性T細胞之活化來量測細胞介導之免疫反應。可例如藉由量測由於向動物投與包含該抗原之免疫原性組合物而產生的抗原特異性抗體之量來量測抗體介導之免疫反應。可例如藉由使用小鼠模型來量測細胞及/或抗體介導之免疫反應。根據本發明,小鼠模型用作參考方法。
術語「免疫原性組合物」意謂(但不限於)包含至少一種在宿主中引發針對相關抗原之細胞及/或抗體介導之免疫反應的抗原之物質組合物。通常,「免疫反應」包括(但不限於)一或多種以下效應:產生或活化特異性針對在相關組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。宿主較佳將展現治療或保護性免疫反應以便增強對新感染之抵抗力及/或降低疾病之臨床嚴重性。在該情況下,免疫原性組合物為「疫苗」。該種保護將由通常受感染宿主所呈現之症狀減輕或缺失、受感染宿主之恢復時間縮短及/或病毒力價降低來證明。
可藉由層析程序(較佳兩步層析程序)實現PCV-2抗原之進一步純化。若PCV-2抗原裝配至病毒樣粒子(VLP)中,則一步(較佳第一步驟)較佳為大小排阻(凝膠過濾)層析,其可例如藉由使用Sephacryl S300基質進行。在實驗室規模下,最佳使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而,可使用熟習此項技術者已知之任何其他大小排阻層析基質,其能夠自培養濾液或上清液中分離出PCV-2 ORF2 VLP。合適之基質描述於例如E.L.V. Harris及S. Angel(編者),Protein purification methods-a practical approach,IRL Press Oxford 1995)中。可例如藉由以1.0 mL/min之流動速率用包含PCV-2抗原之粗製劑裝載管柱且以1.5個管柱體積的包含20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT之緩衝液溶離管柱來進行凝膠過濾層析。然而,亦可藉由使用親和性層析,例如,經由選擇性結合至已固定PCV-2 ORF2特異性抗體或熟習此項技術者已知之任何其他方法純化PCV-2 ORF2抗原。
因此,根據一較佳實施例,本發明提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及iii)藉由層析程序純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2)之步驟ii)收集物。較佳如本文所述,較佳如實例3中所述執行大小排阻層析。較佳地,大小排阻產生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過80%(w/w),較佳超過90%(w/w)純度等級之免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10%Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進行SDS PAGE之後,藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。
因此,根據一較佳實施例,本發明提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及iii)藉由大小排阻層析(凝膠過濾)純化包含PCV-2抗原之步驟ii)收集物。
為了獲得更高純度等級,可進行不同於第一層析步驟之第二層析步驟。舉例而言,若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾),則第二步驟應不同於其,為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地,若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析,則第二步驟可為離子交換層析,較佳陰離子交換層析(AIEX)。用於純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中,最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進行陰離子交換層析。簡言之,可將來自大小排阻層析步驟之約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3.0 ml/min之流動速率裝載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後,可以8個管柱體積之下列緩衝液(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單一步驟來溶離蛋白質。可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高產率。此兩步技術(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有效地分離。
因此,根據一較佳實施例,本發明提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及iii)藉由兩步層析純化包含PCV-2抗原之步驟ii)收集物。第一層析步驟較佳不同於第二步驟。若第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析,則第二步驟可為離子交換層析,較佳陰離子交換層析(AIEX)。較佳地,在包括一或多個進一步純化步驟以獲得純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2蛋白)的上述任何方法中,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。在較佳形式中,上述製備PCV-2抗原性組合物之方法進一步包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中滅活劑較佳包含BEI;及v)將在步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。進一步純化(較佳包括預過濾步驟之兩步純化策略)產生具有以在與任何佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過80%(w/w),較佳超過85%(w/w),甚至更佳超過90%(w/w),最佳超過95%(w/w)之純度等級的免疫原性組合物。
當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,藉由本文所述之方法製備的PCV-2抗原性組合物造成小於1 log TCID50活病毒或小於1 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,藉由本文所述之方法製備的PCV-2抗原性組合物更佳造成小於0.9 log TCID50/毫升活病毒或小於0.9 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,藉由本文所述之方法製備的PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小於0.7 log TCID50/毫升活病毒或小於0.7 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,藉由本文所述之方法按步驟製備的PCV-2抗原性組合物更佳造成小於0.5 log TCID50/毫升活病毒或小於0.5 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,藉由本文所述之方法製備的PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小於0.3 log TCID50/毫升活病毒或小於0.3 log CFU/毫升活細菌之損失。活病毒可為任何活病毒,但活病毒較佳為PRRS病毒,較佳具有ATCC寄存編號VR 2332之PRRS病毒。活細菌可為任何細菌,但較佳為豬肺炎黴漿菌,較佳豬肺炎黴漿菌之J-菌株。可藉由能夠評估活病毒之量的標準活體外滴定檢定評估TCID50/毫升。亦可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定測定CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係指1毫升流體。該純化PCV-2抗原不僅具有如本文所定義之降低殺病毒活性,而且亦具有與如本文所定義之非純化PCV-2抗原相比提高的免疫原性,較佳該純化PCV-2抗原使細胞及/或抗體介導之免疫反應與由包含非純化PCV-2抗原之參考免疫原性組合物引發的細胞及/或抗體介導之免疫反應相比增強至少10%,較佳至少20%,更佳至少30%,甚至更佳至少40%,甚至更佳至少50%,甚至更佳至少75%,最佳至少100%。
因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中當活病毒(較佳PRRSV)或活細菌(較佳豬肺炎黴漿菌)與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,最佳2年以上時,在步驟ii)之後獲得的PCV-2抗原性組合物造成小於1 log TCID50(較佳/毫升),較佳小於0.9 log TCID50(較佳/毫升),甚至更佳小於0.7 log TCID50(較佳/毫升),甚至更佳小於0.5 log TCID50(較佳/毫升),最佳小於0.3 log TCID50(較佳/毫升)活病毒(較佳活PRRSV)或小於1 log CFU(較佳/毫升),較佳小於0.9 log CFU(較佳/毫升),甚至更佳小於0.7 log CFU(較佳/毫升),甚至更佳小於0.5 log CFU(較佳/毫升),最佳小於0.3 log CFU(較佳/毫升)活細菌(較佳豬肺炎黴漿菌)之損失。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。當該PCV-2抗原經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得時,該方法進一步包含iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中滅活劑較佳包含BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後,更佳在收集PCV-2抗原之後執行滅活及中和步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體之後執行滅活及中和步驟。當藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,甚至更佳7倍至10倍,在該濃縮步驟之後進行滅活及中和步驟。當多次,較佳兩次且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟時,在最後一次液體添加步驟及濃縮步驟之後執行該滅活及中和步驟。當使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟時,在較佳使用半透膜進行的上述該過濾步驟之後,執行該滅活及中和步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。較佳地,獲得如本文所定義之純化PCV-2抗原之進一步純化可藉由執行包含以下步驟之進一步純化步驟來實現:iii)藉由層析步驟純化在移除一部分第一液體之後獲得的包含PCV-2抗原之步驟ii)收集物。為了獲得更高純度等級,可進行不同於第一步驟之第二層析步驟。舉例而言,若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾),則第二步驟應不同於其,為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地,若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析,則第二步驟可為離子交換層析,較佳陰離子交換層析(AIEX)。用於純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中,最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進行陰離子交換層析。簡言之,可將來自大小排阻層析步驟之約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3.0 ml/min之流動速率裝載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後,可以8個管柱體積之下列緩衝液(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單一步驟溶離蛋白質。可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高產率。此兩步技術(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有效地分離。
根據上述方法獲得之PCV-2抗原性組合物或上述方法之步驟i)中所用之PCV-2抗原可與至少一種另外抗原(較佳病毒或細菌抗原,且甚至更佳來自豬中至少一種其他致病有機體的病毒或細菌抗原)組合。另外抗原可為國際專利申請案WO 2007/094893(其內容及教示以引用的方式併入本文中)中所揭示之任何彼等抗原。簡言之,該另外抗原可為豬之任何其他致病有機體的抗原。豬之「另一致病有機體」較佳選自由以下組成之群:胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia)(1);腺病毒(2);α病毒,諸如東方馬腦脊髓炎病毒(3);支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)(4);短螺旋體屬(Brachyspira spp.)(5);較佳豬痢疾短螺旋體(B. hyodyentheriae)(6);結腸菌毛樣短螺旋體(B. piosicoli)(7);豬布氏桿菌(Brucella suis),較佳生物變種1、2及3(8);經典豬瘟病毒(9);芽胞梭菌屬(Clostridium spp.)(10);較佳難養芽胞梭菌(Cl. difficile)(11);A型、B型及C型產氣莢膜芽胞梭菌(Cl. perfringens)(12);諾維氏芽胞梭菌(Cl. Novyi)(13);敗血芽胞梭菌(Cl.septicum)(14);破傷風梭菌(Cl. tetani)(15);冠狀病毒(16);較佳豬呼吸道冠狀病毒(17);豬附紅血球體(Eperythrozoonosis suis)(18);豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhsiopathiae)(19);大腸桿菌(Escherichia coli)(20);豬副嗜血桿菌(Haemophilus parasuis);較佳亞型1、7及14(21);血球凝集性腦脊髓炎(Hemagglutinating encephalomyelitis)病毒(22);日本腦炎病毒(23);胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)(24);鉤端螺旋體屬(Leptospira spp.)(25),較佳澳洲鉤端螺旋體(Leptospira australis)(26);犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)(27);感冒傷寒性鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)(28);出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagicae)(29);及問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)(30);波莫那鉤端螺旋體(Leptospira pomona)(31);塔拉索夫鉤端螺旋體(Leptospira tarassovi)(32);分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)(33);較佳,鳥分枝桿菌(M. avium)(34);細胞內分枝桿菌(M. intracellulare)(35)及牛分枝桿菌(M.bovis)(36);豬肺炎黴漿菌(37);多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)(38);豬細胞巨大病毒(39);豬小病毒(40);豬生殖及呼吸症候群病毒(41);假性狂犬病病毒(42);輪狀病毒(43);沙門桿菌屬(Salmonella spp.)(44);較佳,鼠傷寒沙門桿菌(S. thyhimurium)(45)及豬霍亂沙門桿菌(S. choleraesuis)(46);豬葡萄球菌(Staph. hyicus)(47);葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)(48);較佳,鏈球菌屬(Streptococcus spp.)(49);較佳,豬鏈球菌(50);豬疱疹病毒(51);豬流感病毒(52);豬痘病毒(53);豬痘病毒(54);水泡性口炎病毒(55);豬水疱疹病毒(56);哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira Hardjo)(57);及/或豬關節滑膜黴漿菌(58)。
因此,根據本發明之另一態樣,本發明提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;及將該PCV-2抗原與至少一種另外抗原(較佳病毒或細菌抗原,且更佳來自豬中至少一種其他致病有機體的病毒或細菌抗原)組合。較佳該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純化PCV-2抗原。
在較佳形式中,上述製備PCV-2抗原性組合物之方法進一步包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中滅活劑較佳包含BEI;及v)將在步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。
在該方法之另一態樣中,該至少一種另外抗原為病毒抗原,較佳來自豬生殖及呼吸症候群病毒之抗原。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒,且更佳經修飾之活病毒,甚至更佳經修飾之減毒活病毒。該經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及將該PCV-2抗原與來自豬生殖及呼吸症候群病毒之抗原組合。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原較佳包含活病毒,更佳經修飾之活病毒,且甚至更佳經修飾之減毒活病毒。該經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純化PCV-2抗原。
在本申請案之另一態樣中,該至少一種另外抗原為細菌抗原,較佳為豬肺炎黴漿菌。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及將該PCV-2抗原與細菌抗原(較佳豬肺炎黴漿菌)組合。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。該PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純化PCV-2抗原。
在本申請案之另一態樣中,該至少一種另外抗原包括病毒抗原,較佳如上所述之豬生殖及呼吸症候群病毒抗原;及細菌抗原,較佳如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原較佳包含活病毒,更佳經修飾之活病毒,且更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。因此,根據另一態樣,本申請案提供一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,及將該PCV-2抗原與病毒抗原(較佳如上所述之豬生殖及呼吸症候群病毒抗原)及細菌抗原(較佳如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原)組合。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原較佳包含活病毒,更佳經修飾之活病毒,且更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。該PCV-2抗原較佳包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,且甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行該液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純化PCV-2抗原。
本申請案不僅提供製備PCV-2抗原性組合物之方法,而且係關於PCV-2抗原性組合物。因此,根據另一態樣,本專利申請案進一步提供一種PCV-2抗原性組合物,其特徵在於當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物造成小於1 log TCID50活病毒或小於1 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物更佳造成小於0.9 log TCID50/毫升活病毒或小於0.9 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小於0.7 log TCID50/毫升活病毒或小於0.7 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物更佳造成小於0.5 log TCID50/毫升活病毒或小於0.5 log CFU/毫升活細菌之損失。當活病毒或活細菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小於0.3 log TCID50/毫升活病毒或小於0.3 log CFU/毫升活細菌之損失。活病毒可為任何活病毒,但活病毒較佳為PRRS病毒,較佳具有ATCC寄存編號VR 2332之PRRS病毒。活細菌可為任何細菌,但較佳為豬肺炎黴漿菌,較佳豬肺炎黴漿菌之J-菌株。可藉由能夠評估活病毒之量的標準活體外滴定檢定評估TCID50/毫升。亦可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定測定CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係指1毫升流體。
在另一態樣中,上述PCV-2抗原性組合物包含選自由以下組成之群的另一組份:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑,甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。甚至更佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約500 μg至約5 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約750 μg至約2.5 mg之量添加佐劑。最佳以每劑量約1 mg之量添加佐劑。
本申請案不僅提供製備PCV-2抗原性組合物之方法及/或如上文所定義之PCV-2抗原性組合物,其亦係關於可藉由本文所述之任何方法獲得的PCV-2抗原性組合物。因此,在另一態樣中,本申請案係關於藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。該PCV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用於該PCV-2抗原性組合物中。術語「藉由本文所提供之方法獲得的PCV-2抗原性組合物」亦意謂該PCV-2抗原性組合物可藉由本文中所提供之方法獲得。根據另一態樣,本申請案亦係關於藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體獲得的PCV-2抗原性組合物,其中該第二液體不同於該第一液體。因此,根據另一態樣,本申請案係關於藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物,i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體,其中該第二液體不同於該第一液體。較佳地,以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。
根據另一態樣,較佳藉由以下方法獲得PCV-2抗原性組合物:其中使用過濾器藉由過濾步驟自PCV-2抗原移除部分該第一液體。然而,可使用熟習此項技術者已知之任何其他方法(例如,離心及/或層析)自PCV-2抗原移除部分第一及第二流體。然而,最佳為過濾。移除該部分第一流體之較佳過濾方法包含超濾及/或透濾。如本文所述之方法之濃縮步驟及該液體添加步驟可實質上同時或另外執行,依次執行該濃縮步驟與該液體添加步驟。因此,根據另一態樣,本申請案係關於藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物,i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除部分該第一液體,其中該第二液體不同於該第一液體。較佳地,以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原,其中實質上同時或依次執行液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。舉例而言,在另一態樣中,該液體添加步驟在該濃縮步驟之前進行且在一替代態樣中,該濃縮步驟在該液體添加步驟之前進行。
在另一態樣中,本申請案係關於可使用本文所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中可多次執行該液體添加步驟及該濃縮步驟,不管執行該等步驟之順序如何。舉例而言,此等各別步驟之每一者可執行至少兩次,至少三次,至少四次,至少五次,至少十次,直至所需之多次。在一態樣中,該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少兩次。在另一態樣中,該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執行至少三次。
在本申請案之另一態樣中,如上所述獲得本發明之PCV-2抗原性組合物,其中過濾為自PCV-2抗原移除一部分該第一液體或在如上所述多個移除步驟之情況下,移除一部分第一流體與第二流體之混合物的較佳方法。過濾器可為此項技術中之任何習知過濾器。該過濾器較佳包括半透膜。在另一較佳形式中,該半透膜具有小於PCV-2抗原之平均孔徑,藉此防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且由過濾器截留PCV-2抗原。在另一態樣中,該過濾器具有防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質通過的平均孔徑,更佳地,該過濾器具有防止至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質通過的平均孔徑,且最佳地,該過濾器具有防止至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過的平均孔徑。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。在另一態樣中,該半透膜包括選自由聚碸、聚醚碸及再生纖維素組成之群的材料。然而,可使用能夠自PCV-2抗原移除一部分第一流體且在多個方法步驟之情況下移除第一流體與第二流體之混合物的任何其他材料。在另一態樣中,該過濾器係選自由中空纖維膜超濾濾筒、平板或過濾片組成之群,以中空纖維膜超濾濾筒尤佳。
因此,根據另一態樣,本申請案係關於使用如上所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中過濾器較佳為半透膜或包含半透膜。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。如上所述,移除步驟一般包括以一部分第二流體交換部分第一流體,該交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原,其中多次(例如兩次、三次、五次、十次等)執行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳地,兩次,最佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。
執行本文所提供之獲得PCV-2抗原性組合物之方法之濃縮步驟,以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍。更佳地,進行該濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮4倍至20倍。最佳地,進行濃縮步驟以便使PCV-2抗原與第一液體之體積相比濃縮7倍至10倍。因此,根據另一態樣,本申請案係關於藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中與該第一液體之體積相比,該PCV-2抗原濃縮了3倍至50倍,較佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一流體,該交換操作包含以下步驟:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍,較佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。液體添加步驟較佳與濃縮步驟實質上同時或依次執行。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
較佳地,獲得包含如本文中所定義之純化PCV-2抗原之PCV-2抗原性組合物的進一步純化可藉由執行包含以下步驟之進一步純化步驟來實現:iii)藉由層析步驟純化在移除一部分第一液體之後獲得的包含PCV-2抗原的步驟ii)收集物(本文所述任何方法)。為了獲得更高純度等級,可進行不同於第一步驟之第二層析步驟。舉例而言,若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾),則第二純化步驟應不同於其,為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地,若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析,則第二步驟可為離子交換層析,較佳陰離子交換層析(AIEX)。用於純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中,最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進行陰離子交換層析。簡言之,可將來自大小排阻層析步驟之約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3.0 ml/min之流動速率裝載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT移除未結合材料之洗滌步驟之後,可以8個管柱體積之下列緩衝液(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單一步驟溶離蛋白質。可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高產率。此兩步技術(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有效地分離。
在另一態樣中,由本文所述方法製備的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至少10%。更佳地,該PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地,該PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該第一液體相比降低至少70%。
因此,根據另一態樣,本案係關於藉由一種包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中在步驟ii)之後獲得的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性(較佳針對PRRS病毒)與第一液體之殺病毒活性相比降低至少10%,較佳至少50%,更佳至少70%,甚至更佳至少90%。較佳地,藉由第二液體交換第一液體之一部分而自PCV-2抗原移除第一液體具有殺病毒活性之部分。較佳以包含以下之步驟進行交換:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,甚至更佳7倍至10倍。如上所述,液體添加步驟較佳與濃縮步驟實質上同時或依次執行。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備PCV-2抗原呈全病毒或病毒樣粒子時,此孔徑較佳。可如上所述進行進一步純化以獲得純化之PCV-2抗原。
根據另一態樣,本申請案係關於藉由本文所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中當活病毒(較佳PRRSV)或活細菌(較佳豬肺炎黴漿菌)與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時或2小時以上,較佳4小時以上,甚至更佳12小時以上,甚至更佳24小時以上,甚至更佳2天以上,甚至更佳4天以上,甚至更佳7天以上,甚至更佳2週以上,甚至更佳4週以上,甚至更佳2個月以上,甚至更佳3個月以上,甚至更佳4個月以上,甚至更佳6個月以上,甚至更佳9個月以上,甚至更佳12個月以上,甚至更佳18個月以上,且最佳2年以上時,該PCV-2抗原性組合物造成小於1 log TCID50(較佳/毫升),較佳小於0.9 log TCID50(較佳/毫升),甚至更佳小於0.7 log TCID50(較佳/毫升),甚至更佳小於0.5 log TCID50(較佳/毫升),最佳小於0.3 log TCID50(較佳/毫升)活病毒(較佳活PRRSV)或小於1 log CFU(較佳/毫升),較佳小於0.9 log CFU(較佳/毫升),甚至更佳小於0.7 log CFU(較佳/毫升),甚至更佳小於0.5 log CFU(較佳/毫升),最佳小於0.3 log CFU(較佳/毫升)活細菌(較佳豬肺炎黴漿菌)之損失。活病毒可為任何活病毒,但活病毒較佳為PRRS病毒,較佳具有ATCC寄存編號VR 2332之PRRS病毒。活細菌可為任何細菌,但較佳為豬肺炎黴漿菌,較佳豬肺炎黴漿菌之J-菌株。可藉由能夠評估活病毒之量的標準活體外滴定檢定評估TCID50/毫升。亦可藉由能夠評估活細菌之量的標準活體外滴定檢定測定CFU/毫升。術語「每毫升」較佳係指1毫升流體。
在另一態樣中,本專利申請案係關於藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物,上述方法進一步包含收集步驟ii)之後剩餘的PCV-2抗原之步驟。可以任何習知方式進行此收集操作。在一尤佳收集方式中,經由過濾步驟自該PCV-2抗原移除部分該第一液體且自過濾器阻滯物回收或收集PCV-2抗原。
在另一態樣中,將藉由本文所述之任何方法獲得的PCV-2抗原性組合物與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑,甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,且更佳其中該佐劑為卡波姆。
因此,根據另一態樣,本申請案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物,該方法進一步包含以下步驟:將藉由本文所述之方法獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑,甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。甚至更佳以每劑量約100 μg至約10 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約500 μg至約5 mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約750 μg至約2.5 mg之量添加佐劑。最佳以每劑量約1 mg之量添加佐劑。
在另一態樣中,上述PCV-2抗原性組合物包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。因此,根據本申請案之另一態樣,本申請案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。
如上所述,本文所述之方法中使用的PCV-2抗原可藉由此項技術中已知之任何方法獲得。較佳地,PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得。在較佳形式中,該PCV-2抗原係根據WO2006/072065(其教示及內容先前以引用的方式併入)中所述之程序獲得。因此,根據本申請案之另一態樣,本申請案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物,其中該PCV-2抗原係經由含有及表現PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得,且其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。
在本申請案之另一態樣中,PCV-2抗原性組合物係藉由上述方法獲得且該方法進一步包含較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該重組桿狀病毒病毒載體之步驟。在較佳形式中,該方法進一步包含添加一定量之中和該DNA滅活劑之試劑,該量等於該DNA滅活劑之量,其中中和DNA滅活劑之試劑包含濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液,且其中該DNA滅活劑為BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之後執行該滅活步驟。
在本申請案之另一態樣中,PCV-2抗原性組合物係藉由上述方法獲得,該方法進一步包含混合在滅活及中和步驟之後獲得的PCV-2抗原之步驟。因此,根據另一態樣,本申請案提供藉由包含以下步驟之上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;iii)較佳在約1至約20 mM二元伸乙基亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體;iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑,該中和劑量等於滅活劑之量,其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20 mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液且其中滅活劑較佳包含BEI;及(較佳)步驟v),包含將步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。
在本申請案之另一態樣中,較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進一步包含至少一種另外抗原,較佳病毒或細菌抗原,且更佳來自豬中至少一種其他致病有機體的病毒或細菌抗原。在另一態樣中,該至少一種另外抗原為豬生殖及呼吸症候群病毒。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒,且更佳包含經修飾之活病毒。該經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。在本申請案之另一態樣中,該至少一種另外抗原為豬肺炎黴漿菌。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVACMYCOFLEX。在本申請案之另一態樣中,較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進一步包含豬生殖及呼吸症候群病毒抗原,較佳經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒,更佳具有ATCC寄存編號VR 2332之豬生殖及呼吸症候群病毒,或在INGELVAC PRRS MLV或INGELVAC PRRS ATP中所包括的豬生殖及呼吸症候群病毒。在本申請案之另一態樣中,較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進一步包含豬肺炎黴漿菌,較佳豬肺炎黴漿菌菌苗,且更佳INGELVAC MYCOFLEX或INGELVAC MYCOFLEX中所包括的豬肺炎黴漿菌菌苗。在另一態樣中,本文所述之PCV-2抗原性組合物包含豬生殖及呼吸症候群病毒,較佳上述彼等任一者;及豬肺炎黴漿菌,較佳上述彼等任一者。
當包含至少一種來自如上所述豬中至少一種其他致病有機體的另外抗原(較佳豬生殖及呼吸症候群病毒及/或豬肺炎黴漿菌抗原)之PCV-2抗原性組合物藉由本文所述之方法獲得時,該方法包含以下步驟:i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原;ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體;及將該PCV-2抗原與至少一種另外抗原,較佳病毒或細菌抗原,且更佳來自豬中至少一種其他致病有機體的病毒或細菌抗原混合。較佳該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白,更佳PCV-2之重組ORF-2蛋白,且更佳ORF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地,藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進行交換操作:a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中,及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體,使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍,甚至更佳4倍至20倍,且甚至更佳7倍至10倍。較佳地,多次,較佳兩次,甚至更佳三次執行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下,不僅移除第一液體,而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地,如上所述,實質上同時或依次執行各液體添加步驟。當依次執行濃縮步驟及液體添加步驟時,步驟之順序無關緊要。此外,較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜),藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小於PCV-2抗原且防止至少90%該PCV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內以便收集或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其他過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50 kDa至500 kDa之蛋白質,更佳至少90%大小為75 kDa至400 kDa之蛋白質,且最佳至少90%大小為100 kDa至300 kDa之蛋白質通過。當製備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時,此孔徑較佳。
如上文所定義之本發明提供製備PCV-2抗原及包含PCV-2抗原之免疫原性組合物的新方法,其中PCV-2抗原展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定義),其中該方法包含以下步驟:i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體,ii)自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體。此外,本發明亦提供PCV-2抗原以及包含該PCV-2抗原之免疫原性組合物,該PCV-2抗原展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定義)。根據另一態樣,PCV-2抗原以及包含展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性之純化PCV-2抗原之免疫原性組合物可另外藉由下列方法(II)獲得。本發明之純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)可藉由純化PCV-2病毒製劑,尤其藉由純化全病毒獲得。全病毒製劑描述於例如WO 99/18214或WO 03/049703中。此外,純化PCV-2抗原亦可藉由純化重組表現之PCV-2抗原,較佳藉由純化重組PCV-2 ORF2抗原獲得。製備重組PCV-2抗原(較佳製備重組PCV-2 ORF2抗原)之表現系統在此項技術中熟知且包括(但不限於)細菌表現系統、酵母表現系統、昆蟲細胞或哺乳動物表現系統。表現PCV-2抗原之載體及製造及/或使用該等載體(或重組載體)之方法在本申請案中別處描述。
較佳細胞為彼等易受含有PCV-2 ORF2 DNA且表現PCV-2 ORF2蛋白的適當重組病毒載體感染之細胞。細胞較佳為昆蟲細胞,且其更佳包括以商標SF+昆蟲細胞(Protein Sciences Corporation,Meriden,CT)出售之昆蟲細胞。較佳細胞培養物具有介於約0.3-2.0×106個細胞/毫升,更佳約0.35-1.9×106個細胞/毫升,更佳約0.4-1.8×106個細胞/毫升,甚至更佳約0.45-1.7×106個細胞/毫升,且最佳約0.5-1.5×106個細胞/毫升之間的細胞計數。
較佳之病毒載體包括桿狀病毒,諸如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA),尤其只要該等生產細胞為昆蟲細胞。雖然桿狀病毒表現系統較佳,但熟習此項技術者應瞭解其他表現系統(包括上述彼等)將用於本發明之目的,亦即用於表現PCV-2 ORF2抗原。
適當生長培養基亦將由熟習此項技術者確定,較佳之生長培養基為不含血清之昆蟲細胞培養基,諸如Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS)及其類似物。
含有PCV-2 ORF2 DNA序列之重組病毒載體當用於感染易感細胞時具有介於約0.03-1.5,更佳約0.05-1.3,更佳約0.09-1.1,且最佳約0.1-1.0之間的較佳感染倍率(MOI)。上述MOI較佳係指1毫升細胞培養流體。本文所述之方法較佳包含以含有PCV-2 ORF2 DNA且表現PCV-2 ORF2抗原蛋白之重組病毒載體感染0.35-1.9×106個細胞/毫升,更佳約0.4-1.8×106個細胞/毫升,甚至更佳約0.45-1.7×106個細胞/毫升且最佳約0.5-1.5×106個細胞/毫升,該重組病毒載體之MOI(感染倍率)介於約0.03-1.5,更佳約0.05-1.3,更佳約0.09-1.1,且最佳約0.1-1.0之間。
接著培育受感染細胞至多10天時間,更佳約2天至約10天,更佳約4天至約9天,且最佳約5天至約8天。較佳培育條件包括約22-32℃,更佳約24-30℃,更佳約25-29℃,甚至更佳約26-28℃,且最佳約27℃之溫度。較佳地,在接種之後觀察到SF+細胞之特徵性桿狀病毒誘導之變化。該觀察可包括監測感染後期間細胞密度趨勢及生存率降低。發現在感染之後3-5天觀察到病毒力價峰值且在感染後5至8天及/或當細胞生存率降低至小於10%時細胞中PCV-2ORF2抗原產生達到峰值。
可藉由熟習此項技術者已知之標準方法,例如藉由Protein purification methods-a practical approach(E.L.V. Harris及S. Angal,編者,IRL Press at Oxford University Press)中所述之彼等方法由收集物純化PCV-2 ORF2抗原。彼等方法包括(但不限於)藉由離心及/或過濾進行分離、沈澱、大小排阻(凝膠過濾)層析、親和性層析、金屬螯合物層析、離子交換層析、共價層析、疏水性相互作用層析等。
PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之回收方法較佳以經由分離步驟將細胞碎片與已表現之PCV-2 ORF2抗原分離開始。較佳分離步驟包括過濾、在至多約20,000×g之速度下離心、連續流動離心、使用離子交換或凝膠過濾進行層析分離及習知免疫親和方法。熟習此項技術者由例如(E.L.V. Harris及S. Angel(編者),Protein purification methods-a practical approach,IRL Press Oxford 1995)已知彼等方法。最佳分離方法包括在至多約20,000×g之速度下離心及過濾。較佳過濾方法包括死端型微過濾及切向流動(或交叉流動)過濾,包括中空纖維過濾死端型微過濾。在此等過濾方法中,死端型微過濾較佳。死端型微過濾之較佳孔徑介於約0.30-1.35 μm之間,更佳介於約0.35-1.25 μm之間,更佳介於約0.40-1.1 μm之間,且最佳介於約0.45-1.0 μm之間。咸信任何習知濾膜將用於本發明之目的且聚醚碸膜較佳。在過濾步驟期間移除任何低分子量核酸物質。
PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之進一步純化可藉由層析程序(較佳兩步層析程序)實現。然而,若裝載材料不包含細胞碎片,則亦可以層析程序起始。
若PCV-2抗原裝配至病毒樣粒子(VLP)中,則第一步驟較佳為大小排阻(凝膠過濾)層析,其可例如藉由使用Sephacryl S300基質進行。在實驗室規模下,最佳使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而,可使用熟習此項技術者已知之任何其他大小排阻層析基質,其能夠自培養濾液或上清液中分離出PCV-2 ORF2 VLP。合適之基質描述於例如E.L.V. Harris及S. Angel(編者),Protein purification methods-a practical approach,IRL Press Oxford 1995)中。可例如藉由以1.0 mL/min之流動速率用包含PCV-2抗原之粗製劑裝載管柱且以1.5個管柱體積的包含20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT之緩衝液溶離管柱來進行凝膠過濾層析。然而,亦可藉由使用親和性層析,例如,經由選擇性結合至已固定PCV-2 ORF2特異性抗體或熟習此項技術者已知之任何其他方法純化PCV-2 ORF2抗原。
因此,根據一較佳實施例,包含純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得:
a)在宿主細胞中表現PCV-2抗原,較佳PCV-2 ORF2抗原;
b)收集獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之細胞培養物;
c)藉由大小排阻層析(凝膠過濾)純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之收集物;
d)將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)與佐劑混合。
根據一較佳實施例,如本文所述,較佳如實例3中所述執行大小排阻層析。較佳地,大小排阻產生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過80%(w/w),較佳超過90%(w/w)純度等級之免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進行SDS PAGE之後,藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。
為了獲得更高純度等級,可進行不同於第一步驟之第二層析步驟。舉例而言,若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾),則第二步驟應不同於其,為例如親和性層析、離子交換層析等。
較佳地,若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析,則第二步驟可為離子交換層析,較佳陰離子交換層析(AIEX)。用於純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質為Q瓊脂糖凝膠。在約50 ml之小規模中,最佳使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱。可例如如實例3中所述進行陰離子交換層析。簡言之,可將來自大小排阻層析步驟之約50 ml空隙體積溶離份彙集物以3.0 ml/min之流動速率裝載於AIEX管柱上。在使用例如20 mM Tris(pH 6.5)、5 mMDTT移除未結合材料之洗滌步驟之後,可以8個管柱體積之下列緩衝液(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單一步驟溶離蛋白質。可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離以提高產率。此兩步技術(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 ORF2抗原與培養收集物之大部分其他蛋白組份有效地分離。
因此,根據一較佳實施例,包含純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得:
a) 在宿主細胞中表現PCV-2抗原,較佳PCV-2 ORF2抗原;
b) 收集獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之細胞培養物;
c) 藉由大小排阻層析(凝膠過濾),繼之以陰離子交換層析純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之收集物;
d) 將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)與佐劑混合。
根據一較佳實施例,如本文所述,較佳如實例3中所述執行大小排阻層析及陰離子交換層析。較佳地,兩步純化策略產生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過90%(w/w),較佳超過95%(w/w)純度等級之免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進行SDS PAGE之後,藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。
如上所述,PCV-2抗原(較佳PCV ORF2抗原)之回收方法以經由分離步驟將細胞碎片與已表現之PCV-2 ORF2抗原分離開始。較佳分離步驟包括經由具有約0.6 μm至約2 μm之孔徑,較佳具有約0.8 mm至約1.2 μm之孔徑的過濾器進行微過濾。
因此,包含純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得:
a)在宿主細胞中表現PCV-2抗原,較佳PCV-2 ORF2抗原;
b)收集獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之細胞培養物;
c)經由具有0.6至2.0 μm之孔徑的過濾器過濾在步驟b)獲得的收集物;
d)藉由大小排阻層析(凝膠過濾),視情況繼之以陰離子交換層析純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)且在步驟c)獲得之濾液;
e)將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)與佐劑混合。
根據一較佳實施例,如本文所述,較佳如實例3中所述執行微過濾、大小排阻層析及陰離子交換層析。較佳地,包括預過濾步驟的兩步純化策略產生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過90%(w/w),較佳超過95%(w/w)純度等級之免疫原性組合物。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進行SDS PAGE之後,藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。
包含純化PCV-2抗原(較佳本文所述之純化PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性組合物(較佳可藉由本文所述之方法獲得者)之特徵在於與不包含該純化PCV-2抗原或純化PCV-2 ORF2抗原之免疫原性組合物相比提高的免疫原性。
若使用諸如重組痘病毒、腺病毒或桿狀病毒之病毒載體製備PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原),則建議藉由適當滅活處理來滅活病毒核酸。該滅活可在純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)期間的任何時間進行。因此,滅活可在收集包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之細胞培養流體之後,或在微過濾PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)之後(若進行微過濾),在純化步驟之前或之後,例如在凝膠過濾之前或之後,且在陰離子交換層析之前或之後(若進行此操作)進行。
任何習知滅活方法可用於本發明之目的。因此,可藉由化學及/或物理處理執行滅活。在較佳形式中,測定收集流體之體積且使溫度介於約32℃-42℃,更佳約34℃-40℃,且最佳約35℃-39℃之間。較佳滅活方法包括添加較佳濃度為約1至約20 mM,較佳約2至約10 mM,更佳約2至約8 mM,更佳約3至約7 mM,最佳約5 mM之環化二元伸乙基亞胺(BEI)。舉例而言,滅活包括向流體中添加較佳約0.4 M之2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA)(其已環化為0.2 M二元伸乙基亞胺(BEI))於0.3 N NaOH中之溶液以得到約5 mM BEI之最終濃度。較佳接著連續攪拌流體2-96小時且可將滅活收集流體冷凍儲存於-40℃或-40℃以下或約1℃-7℃之間。在完成滅活之後,添加較佳1.0 M之硫代硫酸鈉溶液以中和任何剩餘BEI。較佳添加與在滅活之前添加的BEI相比等量的硫代硫酸鈉。舉例而言,若添加BEI至5 mM之最終濃度,則添加1.0 M硫代硫酸鈉溶液以得到5 mM之最終最小濃度,以中和任何剩餘BEI。
在將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)與佐劑混合之前,亦建議使純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)相對於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH 7.4)或任何其他生理緩衝液透析。
上述方法產生具有如本文中所定義之降低殺病毒活性以及改良免疫原性之PCV-2抗原,只要該PCV-2抗原具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過50%(w/w),較佳超過70%(w/w),甚至更佳超過80%(w/w),甚至更佳超過85%(w/w),甚至更佳超過90%(w/w),最佳超過95%(w/w)之純度等級。然而,可根據方法II獲得的純化PCV-2抗原亦可與佐劑(較佳與本文所述之任何佐劑)混合且一起使用。較佳佐劑為卡波莫,其較佳濃度為約0.1至10 mg/mL,更佳濃度為0.5至5 mg/mL,最佳為約1 mg/mL最終免疫原性組合物。
再者,本發明不僅提供本文所述之任何方法(包括替代性方法II),其亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)獲得的PCV-2抗原,較佳純化PCV-2抗原,最佳純化PCV-2 ORF-2蛋白。此外,本發明亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)獲得的包含PCV-2抗原(較佳純化PCV-2抗原,最佳純化PCV-2 ORF-2蛋白)之PCV-2抗原性組合物。在最終免疫原性組合物中的PCV-2抗原(詳言之純化PCV-2 ORF2抗原)之量以最終免疫原性組合物計應在每劑量約0.25至約400 μg之範圍內。較佳地,最終免疫原性組合物應包括含量在每劑量約2至約200 μg,甚至更佳每劑量約3至約150 μg,更佳每劑量約4至約100 μg,更佳每劑量約5至約80 μg,更佳每劑量約6至約60 μg,甚至更佳每劑量約7至約50 μg,甚至更佳每劑量約8至約40 μg,更佳每劑量約8至約32 μg,甚至更佳每劑量約8至約24 μg且最佳每劑量約8至約16 μg範圍內之PCV-2抗原,較佳PCV-2 ORF2抗原。
本文所提供之免疫原性組合物(包括彼等可藉由方法II獲得者)包含一或多種來自另一致病有機體的另外抗原。上文定義彼等「另一致病有機體」。該另外抗原較佳為豬生殖及呼吸症候群病毒。該豬生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒,且更佳包含經修飾之活病毒。該經修飾之豬生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號VR 2332之經修飾之活病毒株,且更佳包含INGELVACPRRS MLV。在本申請案之另一態樣中,該另外抗原為豬肺炎黴漿菌。該豬肺炎黴漿菌抗原較佳為菌苗,且該豬肺炎黴漿菌菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。最佳為豬生殖及呼吸症候群病毒與豬肺炎黴漿菌兩種抗原的組合。
由於包括純化PCV-2抗原(較佳本文所提供之純化PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性組合物的免疫原性提高,所以與不接受該免疫原性組合物之動物相比,該免疫原性組合物可用於降低或減輕由PCV-2感染所引起或與PCV-2感染相關的臨床徵象之發生率或嚴重程度。
術語「臨床徵象之發生率降低或嚴重程度減輕」應意謂接受疫苗投藥之動物與動物「對照組」相比,該等徵象中之任一者的發生率降低或嚴重程度減輕,兩種動物均已受產生免疫活性組份的病原體感染或攻毒且其中對照組並未接受疫苗或免疫原性組合物之投藥。在此情況下,術語「減輕」或「降低」意謂與不接種疫苗之對照組相比,已接種疫苗組有至少10%,較佳25%,甚至更佳50%,最佳超過100%的降低。
如本文中所用,「臨床症狀」或「臨床徵象」係指可由活動物直接觀察到的病原體感染之徵象,諸如症狀。代表性實例將視所選病原體而定,可包括諸如流涕、嗜睡、咳嗽、發燒、體重增加或減輕、脫水、腹瀉、腫脹、跛行及其類似物。PCV-2臨床徵象可包括消瘦、皮膚蒼白、身體憔悴、呼吸窘迫、腹瀉及黃疸。
動物由PCV-2感染引起或與PCV-2感染相關的臨床徵象之發生率降低或嚴重程度減輕可藉由向需要該處理之動物僅投與單劑量之該免疫原性組合物而實現。然而,本文所提供之免疫原性組合物亦可以兩個或兩個以上劑量投與,首次劑量與任何後續劑量之投與間隔時間為2至4週。因此,根據另一實施例,可向有需要之動物以一個、兩個或兩個以上劑量投與本文所提供之包括純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 ORF2抗原)的免疫原性組合物。
詳言之,在本申請案之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物,其中該免疫原性組合物當向動物投與時使動物之淋巴流失及炎症與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕至少80%。因此,在本申請案之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物且該免疫原性組合物使已接受該免疫原性組合物投藥之動物的淋巴流失及炎症與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕至少80%。
在本申請案之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物,其中該免疫原性組合物當向動物投與時使動物之肺病變與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕至少80%。因此,在本申請案之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物且該免疫原性組合物使已接受該免疫原性組合物投藥之動物的肺病變與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕至少80%。
在本發明之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物之免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後,該免疫原性組合物誘導針對PCV-2之保護性免疫反應。包含PCV-2抗原性組合物之免疫原性組合物可為任何體積,包括1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml及5 ml以上。在較佳形式中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該PCV-2抗原。因此,在本發明之另一態樣中,提供如上所述之免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後,包含PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物誘導針對PCV-2之保護性免疫反應。在另一態樣中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該PCV-2抗原。
如本文中所用,「保護性免疫反應」係指相關病原體感染之臨床、病理學或組織病理學徵象或症狀的發生率降低或嚴重程度減輕,直至且包括完全預防該等徵象或症狀。
術語「病理學」徵象係指在顯微鏡或分子層面上經由生物化學試驗,或屍檢時肉眼可觀察之感染徵象。對於PCV-2而言,病理學徵象將包括多個組織及器官上顯微鏡及肉眼可見的病變,淋巴器官為最常見之病變部位。
術語「病理組織學」徵象係指由感染引起的組織變化之徵象。
術語「臨床症狀」或「臨床徵象」由上文定義。
在本發明之另一態樣中,提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物及PRRRS抗原(較佳本文所述之任一PRRS抗原)的免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後,該免疫原性組合物誘導針對PRRS病毒之保護性免疫反應。再者,可製備任何劑量體積,但在較佳形式中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該PRRS抗原及一個劑量之PCV-2抗原。因此,在本發明之另一態樣中,提供如上所述之包含PRRSV及如本文所述之PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後,該免疫原性組合物誘導針對PRRS之保護性免疫反應。在另一態樣中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該PRRS抗原及一個劑量之該PCV-2抗原。
在本發明之另一態樣中,提供包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如上所述之豬肺炎黴漿菌抗原的免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之該免疫原性組合物之後,該免疫原性組合物誘導針對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫反應。再者,可製備任何劑量體積,但在較佳形式中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該豬肺炎黴漿菌抗原及一個劑量之PCV-2抗原。因此,在本發明之另一態樣中,提供如上所述之免疫原性組合物,其中在投與一個劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及豬肺炎黴漿菌抗原之該免疫原性組合物之後,該免疫原性組合物誘導針對豬肺炎黴漿菌之保護性免疫反應。在另一態樣中,2 ml該免疫原性組合物包含一個劑量之該豬肺炎黴漿菌抗原。
在本申請案之另一態樣中,如上所述之免疫原性組合物製備成每劑量投與2毫升。
在本申請案之另一態樣中,提供一種使動物PCV-2感染之一或多種臨床症狀與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言,該方法包含向動物投與任一包含如上所述之PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物的步驟。較佳地,在投與單劑量之該免疫原性組合物之後PCV-2感染之一或多種臨床症狀減輕。因此,根據本申請案之另一態樣,提供一種使動物PCV-2感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言,該方法包含向動物投與任一包含上述PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物的步驟,其中較佳在投與單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物的該免疫原性組合物之後PCV-2感染之一或多種臨床症狀減輕。
在本申請案之另一態樣中,提供一種使動物PRRS感染之一或多種臨床症狀與不接受該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言,該方法包含向動物投與任一上述包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物的步驟。較佳地,在投與單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物之後PRRS感染之一或多種臨床症狀減輕。因此,根據本申請案之另一態樣,提供一種使動物PRRS感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之臨床徵象包括(但不限於)食慾不振、發熱、流產、短暫變色、乏情期延長、咳嗽、呼吸徵象、乳房炎、無乳、嗜睡、木乃伊化仔豬、死產、新生仔豬虛弱、母豬產仔率減少、早產、腹瀉、消瘦、打噴嚏、眼分泌物、皮膚蒼白、死亡及其組合。
在本申請案之另一態樣中,提供一種使動物豬肺炎黴漿菌感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原的該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。一般而言,該方法包含向動物投與任一上述該免疫原性組合物的步驟。較佳地,在投與單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原之該免疫原性組合物之後豬肺炎黴漿菌感染之一或多種臨床症狀減輕。因此,根據本申請案之另一態樣,提供一種使動物豬肺炎黴漿菌感染之一或多種臨床症狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎黴漿菌抗原的該免疫原性組合物之動物相比減輕的方法。豬肺炎黴漿菌(M. hyo)感染之臨床症狀包括(但不限於)乾咳、行為障礙(impaired performance)及肺病變。
包含純化PCV-2抗原(較佳如本文所提供之PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性組合物具有改良免疫原性。因此,本文所提供之免疫原性組合物適用於改良接受該免疫原性組合物之動物的免疫反應。因此,根據另一實施例,本發明提供一種改良動物針對PCV-2之免疫反應的方法,其包含以下步驟:向有需要之動物投與如本文所述具有純化PCV-2抗原(較佳本文所提供之純化PCV-2 ORF-2蛋白)的免疫原性組合物。根據一較佳態樣,將用於該方法中之PCV-2抗原(較佳PCV-2 ORF2抗原)純化至以免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計超過60%(w/w),較佳超過60%(w/w),甚至更佳超過70%(w/w),甚至更佳超過80%(w/w),甚至更佳超過90%(w/w),最佳超過95%(w/w)之程度。可在使用NuPAGE MOPS緩衝系統(Invitrogen),經由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進行SDS PAGE之後,藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評估純度等級。可使用熟習此項技術者所熟知之習知方法純化PCV-2,且較佳PCV-2 ORF2。
以下實例闡述根據本發明之較佳材料及程序。然而,應瞭解僅僅經由說明提供此等實例且不應認為其中之實例限制本發明之總範疇。
此實例描述製造具有降低殺病毒活性之濃縮PCV-2 ORF2抗原之實驗室規模及試驗規模方法與不包括本發明步驟之製造方法的比較。特定言之,將確定本發明對PCV-2 ORF2抗原對PRRS病毒之殺病毒活性之作用。
PCV SUB037 H1-F,18.94 kg
PCV 1025,20.6 kg
PCV 180/181,20.0 kg
PCV SUB 504PD,40 kg
PCV SUB 506PD,362 kg
PCV SUB 507PD,384 kg
PCV SUB512PD,430 kg
PCV SUB 513PD,405 kg
超濾濾筒:GE Healthcare,Steam-In-Place(SIP),中空纖維膜濾筒UFP-100-E-55-STM:100,000 NMWC,1 mm直徑之小管;用於X109中之UF-002中,實驗室規模。
UFP-300-E-55-STM:300,000 NMWC,1 mm直徑之小管;用於X109中之UF-002中,實驗室規模。
UFP-100-E-65-MSM:100,000 NMWC,1 mm直徑之小管;用於APU-1中之UF-B2614中,試驗規模。
UFP-300-E55-SMO:300,000 NMWC,1 mm直徑之小管;用於VP-1中之UF-2713中,試驗規模。
下列超濾設備係用於可行性評估及初始方法開發中:
以GE Healthcare(Amersham) Flex Stand 30 L容量之UF skid #002進行的濃縮方法中使用含有在構築(building)P中產生的經過濾、滅活、中和之PCV-2 ORF2材料之50公升籐護罈。
初始濃縮製程使用「成批」透濾流程,藉以將約20 kg抗原材料轉移至UF skid中且經由100,000 NMWC中空纖維濾筒(UFP-100-E-55-STM)濃縮。100,000 NMWC濃縮製程使用分別來自PD及Manufacturing之PCV-2 ORF2批次SUB037PD及PCV1025材料。
初始兩輪濃縮原始體積約4倍且在進料槽中具體量化(Q.S.'d,quantity substantiated)回原始轉移體積。以此方式處理濃縮材料,每批號總共進行2次濃縮,第三次及最後一次濃縮收集作為濃縮物且一部分具體量化為1倍原始體積。在濃縮前、每次濃縮步驟及每次具體量化步驟時抽取樣品。在每次濃縮步驟期間抽取透過樣品。
接下來的連續兩輪在不用生理食鹽水洗滌之情況下濃縮PCV-2 ORF2抗原。在約4倍及接著最後一次濃縮時對濃縮材料取樣。將約20 kg抗原材料轉移至UF skid儲料槽中且經由300,000 NMWC中空纖維濾筒(UFP-300-E-55-STM)濃縮。將第二個20 L體積添加至含有來自首個20 L之濃縮物的儲料槽中。將其濃縮至最終體積。300,000 NMWC濃縮製程使用分別由Manufacturing及PD生產的PCV-2 ORF2批次PCV 180/181池及SUB504PD。在濃縮前及每次濃縮步驟時抽取樣品。在每次濃縮步驟期間抽取透過樣品。
試驗規模方法使用SUB批次506PD、512PD及513PD。濃縮前之抗原體積在約350 L至430L範圍內。將SUB506PD及SUB513PD批次轉移至DSP(下游處理)2602且使用表面積為4.2 m2之100,000 NMWC過濾器(UFP-100-65-E-MSM),在APU-1中以UF-B2614進行濃縮。將SUB512PD轉移至DSP 2701且使用表面積為2.1 m2之300,000 NMWC過濾器(UFP-300-E-SMO),以UF-2713進行濃縮。對於每個批次,收集最終濃縮材料且在4℃下儲存以供分析。
以100,000 NMWC(100 kDa)對比300,000 NMWC(300 kDa)過濾器進行之過濾在濃縮時間上相當且當考慮到全規模方法時係可行的。100 kDa過濾器之過濾時間在濃縮4倍時(約18 L至26 L)在14分鐘至32分鐘之範圍內,生理食鹽水洗滌步驟產生較短時間(表2)。300 kDa過濾器之過濾時間(在濃縮3.2倍、7倍(對於PCV180/181)及21.5倍(對於SUB504PD)時)為在25分鐘時得到3.2倍,在23分鐘時得到7倍且在32分鐘時得到21.5倍,其中約40 L材料以兩個連續20 L體積濃縮。由於需要時間使濃縮製程達到10.25 psi之目標跨膜壓力(TMP),因此預見到有一些時間變化。
製程通量值對於PCV180/181批次而言在27.43 lmh至32.00 lmh之範圍內,由朝向濃縮製程終點之尖峰(spike)產生32.00 lmh的值。SUB 504PD材料之通量值在首個20 L濃縮期間為28.57 lmh且在第二個20 L濃縮期間為35.71 lmh。(表3及4)
當濃縮材料具體量化回1倍體積時,發現過濾後無效能變化,SUB 037復原材料及PCV 1025複原材料亦如此。濃縮抗原含量值使得檢定之限值超過約64 μg之驗證限值,如在表5至8中之值所見,其中抗原含量與預期計算量相比。來自使用SUB 037、PCV 180/181及SUB 504PD抗原執行的濃縮之透過值展示過濾不造成顯著材料損失。所有透過抗原含量均在檢定之不可偵測範圍內。未收集PCV 1025抗原之透過抗原含量。
以來自R&D之PCV 180/181及SUB 504PD材料進行SDS-PAGE凝膠跑膠。圖1中位於約27 kDa處之ORF2紋帶與條帶10處的參考物之帶型一致。早先已確定此紋帶大小為ORF2。來自SUB 504PD(300 kDa過濾濃縮)之透過材料顯示缺失在27 kDa位置處之紋帶。在此孔徑過濾器處顯然無ORF2蛋白損失。在還原條件下進行跑膠。
測試濃縮前抗原、濃縮抗原、復原抗原及過濾透過物針對PRRS病毒疫苗之殺病毒活性。SUB 037濃縮前及濃縮(100 kDa過濾器)材料(已用生理食鹽水復原回1倍)之品質控制(QC)初始結果不符合要求。然而,當將濃縮材料調配至疫苗中時,疫苗中至多80%內含物之濃度降低此殺病毒活性至符合要求之水準,恰好在0.7 log/ml PRRS病毒力價損失之接受限值之下。來自SUB 037之透過材料展示接近不符合要求之殺病毒活性水準的界線。參見表9。
發現PCV 1025濃縮前材料對PRRS之殺病毒活性不符合要求,PRRS力價損失為1.5 log/ml。三種用生理食鹽水復原之濃縮(100 kDa過濾器)材料具有0.5 log/ml損失及0.6 log/ml損失,一種復原濃縮物因PRRS力價「無變化」而符合要求。不測試此批次之透過樣品。參見表10。
PCV 180/181濃縮前疫苗材料在所製備的3種疫苗中有2種對PRRS之殺病毒活性不符合要求。抗原內含物百分比水準在37.0%至55.5%之範圍內。發現最高內含物%的濃縮前疫苗符合要求。
發現自1倍(以生理食鹽水復原至1倍之濃縮物)材料製備之疫苗對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。抗原內含物百分比水準在44%至66%之範圍內。參見表11。
自濃縮前抗原所製備的具有79.5%疫苗內含物之SUB 504PD疫苗對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。自4.3倍濃縮抗原製備的具有23.5-35%疫苗內含物之疫苗及自21.5倍濃縮抗原製備的具有3.5-5.5%疫苗內含物之疫苗亦符合要求。最後,發現所製備的具有72%內含物水準之過濾器洗滌液抗原對PRRS病毒之殺病毒活性符合要求。
2型豬環狀病毒疫苗滅活桿狀病毒載體為由Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.(St. Joseph,Missouri)製造的全球性產品且用於INGELVAC CIRCOFLEX產品中。在收集時,將病毒流體以無菌方式經由一或多個2-15 μm預過濾器過濾隨後經由0.8-1.0 μm過濾器進行最終過濾。將BEI(二元伸乙基亞胺)儲備溶液添加至收集流體中至5 mM BEI之最終濃度。連續攪拌流體最少72小時且最多96小時且可在40℃或在4℃±3℃下冷凍儲存。添加1.0 M硫代硫酸鈉溶液至5 mM之最終濃度以中和任何剩餘BEI。
將中和抗原與0.5%卡波莫溶液摻和至20% v/v,藉由添加生理食鹽水調整最終產物中之PCV-2 ORF2蛋白含量以滿足大於或等於1.0之相對效能的最小釋放需要。在混合在一起之後,可將系列液在4℃下儲存或填充。
在中和後,藉由中空纖維濾筒超濾濃縮PCV-2 ORF2材料。以兩個透濾體積之生理食鹽水溶液進一步處理濃縮材料。測定出較佳超濾標稱分子量截斷(NMWC)孔徑包括100,000 NMWC及300,000 NMWC,其中各者具有1.0 mm管腔直徑。兩種孔徑均包括在內以便在製造商中斷供應過濾器濾筒時提供製造靈活性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS PAGE)凝膠及效能數據指示兩個過濾器孔徑之間的抗原蛋白或效能無差異。
此實例比較使用本發明方法與使用先前技術中已知方法的ORF2相對產率。應瞭解此實例表示用於獲得為本發明方法及組合物使用的PCV-2 ORF2之許多可能方法中的一種。
將四個1000 mL旋轉燒瓶各自以大約1.0×106個Sf+細胞/毫升接種於300 mL無血清昆蟲培養基Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS)中。將母細胞培養物標識為SF+(草地黏蟲(Spodoptera frugiperda))母細胞儲備物(Master Cell Stock),第19代,批號N112-095W。由Protein Sciences Corporation,Inc.,Meriden,CT獲得用於產生SF+母細胞儲備物之細胞。將此實例之SF+細胞株限制在第19代與第59代之間。其他繼代可用於本發明之目的,然而為了將方法規模擴大至大規模生產,至少19代將為必需的且超過59之繼代可能對表現有影響,但此未作研究。更詳言之,在恆定攪動下,使來自液氮貯槽之初始SF+細胞培養物懸浮生長於無菌旋轉燒瓶中的Excell 420培養基中。使培養物生長於含有25 mL至150 mL Excell 420無血清培養基之100 mL至250 mL旋轉燒瓶中。當細胞繁殖至1.0-8.0×106個細胞/毫升之細胞密度時,將其以0.5-1.5×106細胞/毫升之種植密度分至新容器中。使後續擴增培養物於高達36公升容量之旋轉燒瓶中或高達300公升容量之不鏽鋼生物反應器中在25℃-29℃下生長2-7天。
接種後,將燒瓶在27℃下培養四小時。隨後,用含有PCV-2 ORF-2基因(SEQ ID NO: 4)之重組桿狀病毒接種各燒瓶。如下產生含有PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒:將來自PCV-2北美菌株的PCV-2 ORF2基因PCR擴增以含有5' Kozak序列(SEQ ID NO: 1)及3' EcoR1位點(SEQ ID NO: 2),選殖至pGEM-T-Easy載體(Promega,Madison,WI)中。隨後,將其切除且次選殖至轉移載體pVL1392(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)中。次選殖部分在本文中以SEQ ID NO: 7表示。含有PCV-2 ORF2基因之pVL1392質體稱為N47-064Y且隨後將其與BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒DNA一起共轉染至Sf+昆蟲細胞(Protein Sciences,Meriden,CT)中以產生含有PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒。新構築體在本文中以SEQ ID NO: 8提供。將含有PCV-2 ORF2基因之重組桿狀病毒空斑純化且將母種病毒(MSV)在SF+細胞株上增殖,製成等分試樣且在-70℃下儲存。藉由PCR-RFLP使用桿狀病毒特異性引子將MSV正性鑑別為PCV-2 ORF2桿狀病毒。如在間接螢光抗體檢定中由多株血清或單株抗體所偵測,感染有PCV-2 ORF2桿狀病毒以產生MSV或工作病毒種株之昆蟲細胞表現PCV-2 ORF2抗原。另外,藉由N-末端胺基酸定序確證PCV-2 ORF2桿狀病毒之身分。亦根據9 C.F.R. 113.27(c),113.28及113.55測試PCV-2 ORF2桿狀病毒MSV之純度。接種至旋轉燒瓶中之每一重組桿狀病毒具有不同感染倍率(MOI)。燒瓶1用7.52 mL之.088 MOI種株接種;燒瓶2用3.01 mL之0.36 MOI種株接種;燒瓶3用1.5 mL之0.18 MOI種株接種;且燒瓶4用0.75 mL之0.09 MOI種株接種。
用桿狀病毒接種後,隨後將燒瓶在27℃±2℃下培養7天且在彼時間期間,亦以100 rpm攪動。該等燒瓶使用通風蓋以允許空氣流動。在接下來之7天,每24小時自每一燒瓶取樣。取出後,將每一樣品離心且將離心塊及上清液兩者分離且隨後經由0.45 μm-1.0 μm孔徑之薄膜微過濾。
隨後,經由ELISA檢定,定量所得樣品中存在之ORF2之量。以在0.05 M碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中1:6000稀釋之蛋白G純化(在PBS中1:250稀釋)之捕捉抗體豬抗PCV-2 Pab IgG進行ELISA檢定。接著將100 μL抗體置於微量滴定盤之孔中,密封且在37℃下培育隔夜。接著以包含0.5 mL Tween 20(Sigma,St. Louis,MO)、100 mL 10X D-PBS(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)及899.5 mL蒸餾水之洗滌溶液洗滌該盤三次。隨後,將250 μL阻斷溶液(於10 mL D-PBS中之5 g Carnation脫脂奶粉(Nestle,Glendale,CA),用蒸餾水補足至100 mL)添加至每一孔中。下一步為洗滌測試盤且隨後添加預先稀釋之抗原。藉由將200 μL稀釋劑溶液(於999.5 mL D-PBS中之0.5 mL Tween 20)添加至稀釋盤上之每一孔中產生預先稀釋之抗原。隨後,將樣品以1:240之比率及1:480之比率稀釋,隨後將100 μL此等稀釋樣品之每一者添加至稀釋盤上之一個頂部孔中(亦即,一個頂部孔容納100 μL之1:240稀釋物且另一者容納100 μL之1:480稀釋物)。隨後,藉由自每一連續孔移出100 μL且將其轉移至盤上之下一個孔中來對盤中剩餘者進行連續稀釋。將每一孔混合,然後進行下一次轉移。測試盤之洗滌包括用洗滌緩衝液洗滌該盤三次。隨後,將該盤密封且在37℃下培養一小時,然後用洗滌緩衝液再洗滌三次。所使用之偵測抗體為PCV ORF2之單株抗體。將偵測抗體以稀釋劑溶液1:300稀釋,隨後將100 μL經稀釋偵測抗體添加至孔中。隨後,將該盤密封且在37℃下培養一小時,然後用洗滌緩衝液洗滌三次。隨後,藉由將正常兔血清(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)添加至稀釋劑溶液中至1%濃度來製備結合稀釋劑。將結合抗體山羊抗小鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)在結合稀釋劑中1:10,000稀釋。接著將100 μL經稀釋結合抗體添加至每一孔中。隨後,將該盤密封且在37℃下培養45分鐘,然後用洗滌緩衝液洗滌三次。將與等體積過氧化物酶受質B(KPL)混合之100 μL受質(TMB過氧化物酶受質,Kirkgaard及Perry Laboratories(KPL),Gaithersberg,MD)添加至每一孔中。將該盤在室溫下培養15分鐘。隨後,將100 μL之1 N HCL溶液添加至所有孔中以終止反應。隨後,使該盤通過ELISA讀取器。
此檢定之結果提供於下表17中:
此等結果表明當培育時間延長時,表現至離心細胞及培養基之上清液中的ORF2多於表現至離心細胞及培養基之離心塊中的ORF2。因此,使ORF2表現進行至少5天且在上清液中回收而非使表現進行少於5天且自細胞回收ORF2提供ORF2產率之極大提高及優於先前方法之顯著改良。
藉由微過濾方法繼之以兩步層析流程實現ORF2之純化。經由孔徑為1.2 μm之微過濾膜過濾實例1中獲得的收集物。接著藉由大小排阻(凝膠過濾)使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱純化微過濾物。將20 ml包含PCV-2 ORF2之濾液的起始樣品以1.0 mL/min之流動速率裝載至HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱上且以1.5個管柱體積之緩衝液A(20 mM Tris(pH 6.5),5 mM DTT)溶離。在溶離步驟期間收集8毫升溶離份。彙集來自大小排阻層析之第10-16號溶離份(微量滴定盤(milititer)10至16溶離液)且將其用作陰離子交換(AIEX)層析之起始樣品。此等溶離份表示大小分級管柱(sizing column)之空隙體積,其中PCV-2 ORF2因PCV-2 ORF2蛋白之較大分子量而溶離出。此項技術將ORF2與抗原樣品之大部分其他蛋白組份有效地分離。
使用5 ml HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱執行AIEX。將來自大小排阻實驗之約48 ml空隙體積溶離份彙集物以3.0 mL/min之流動速率裝載於AIEX HiTrap Q瓊脂糖凝膠HP管柱上。在以裝載緩衝液A(20 mM Tris(pH 6.5),5 mM DTT)進行洗滌步驟移除未結合材料之後,以8個管柱體積之緩衝液B(20 mM Tris(pH 6.5)、5 mM DTT、1.0 M NaCl)之單一步驟溶離蛋白質且收集5 ml溶離份。收集且彙集第8號及第9號溶離份峰。將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q瓊脂糖凝膠管柱上且如上所述進行溶離。將來自第二輪的第7號、第8號及第9號溶離份與來自第一輪之溶離份彙集在一起。第三輪流過材料並未在溶離液中產生顯著溶離份峰,因此此輪未留下溶離份。
在4℃下使約25 ml之溶離份彙集物相對於2公升之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH 7.4,Gibco)透析隔夜。在透析之後,基於SDS-PAGE分析,ORF2之純度>95%。
製備2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA)、氫氧化鈉(NaOH)及硫代硫酸鈉(Na2S2O3)之溶液。藉由稱取1.63 g BEA(Sigma,B65705,批號05316EE)且溶解於20 ml純水(dH2O,蒸餾水,此處:「水」)中製得BEA溶液。此溶液之最終濃度為0.4 M BEA。藉由稱取0.33 g NaOH(JTBaker,3722-01,批號E01470)且溶解於20 ml水中製得NaOH溶液。此溶液之最終濃度為0.41 M NaOH。藉由稱取25 g Na2S2O3(Sigma S7026,批號106K0178)且溶解於100 ml水中製備硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液。一旦溶解之後,使溶液經由0.2 μm瓶頂過濾器過濾以殺菌。此溶液之最終濃度為1.0 M Na2S2O3。
為了製備二元伸乙基亞胺(BEI),將20 ml 0.4 M BEA溶液與20 ml 0.41 M NaOH混合且測定初始pH值為約12.5-14.0。在37℃下培育混合物1小時且再次核查pH值。培育之後的pH值為約7.0-7.5,且此表明BEA成功地環化反應為BEI。BEI之最終濃度經計算為約0.2 M(於40 ml體積中,20 ml 0.4 M BEA經過量鹼(0.41 M)環化)。
如下進行滅活反應(每100 ml待滅活材料):將待滅活材料與2.5 ml新鮮製備之BEI混合。在37℃下且在攪拌(以持續混合溶液)下培育滅活反應物72小時。72小時之後,藉由添加0.5 ml 1.0 M硫代硫酸鈉中和反應物。在使硫代硫酸鹽充分混合至溶液中(混合約15分鐘)之後,在4℃下儲存經滅活及中和之材料,之後與佐劑調配。
為了評估高度純化之ORF2抗原(純度等級高於90%)與未純化或較低程度純化之ORF2抗原相比之免疫原性:製備若干批5 ml測試樣品:
如下製備測試樣品1:如實例1中所述製備PCV-2 ORF2抗原且如實例3中所述進行高度純化。如實例4中所述以BEI滅活高度純化之PCV-2 ORF 2抗原。在BEI滅活之後,將PCV-2 ORF2抗原含量調整為每毫升測試樣品約32至32.5 μg之量且每毫升測試樣品與1 mg卡波莫971P(BF Goodrich,Ohio,USA)混合。
如下製備測試樣品2:如實例1中所述製備PCV-2 ORF2抗原且如實例3中所述進行高度純化。如實例4中所述以BEI滅活高度純化之PCV-2 ORF 2抗原。在BEI滅活之後,將PCV-2 ORF2抗原與昆蟲細胞碎片及卡波莫混合。最終測試樣品包括每毫升測試樣品約2.06×106個昆蟲細胞、約32至32.5 μg及1 mg卡波莫971P。
藉由將每毫升測試樣品約2.06×106個昆蟲細胞與1 mg卡波莫971P混合來製備測試樣品3。在混合之前,如實例3中所述藉由BEI滅活昆蟲細胞。
如下製備測試樣品4:如實例1中所述製備PCV-2 ORF2抗原。將上清液中的PCV-2 ORF2抗原含量調整為每毫升測試樣品約32至32.5 μg之量且每毫升測試樣品與1 mg卡波莫971P混合。
如下製備測試樣品5:如實例1中所述製備PCV-2 ORF2抗原。接著如實例3中所述將上清液用於BEI滅活。在BEI滅活之後,將PCV-2 ORF2抗原與昆蟲細胞碎片及卡波莫混合。最終測試樣品包括每毫升測試樣品約2.06×106個昆蟲細胞、約32至32.5 μg及1 mg卡波莫971P。
如下製備測試樣品6:如實例1中所述製備PCV-2 ORF2抗原。接著使實例1之上清液經由1.2 μm實驗室規模之過濾器過濾。此過濾器尺寸先前經測定足以過濾完整及破碎的昆蟲細胞,同時允許PCV-2 ORF2抗原穿過過濾器。此後,如實例3中所述以BEI滅活濾液。在BEI滅活之後,將PCV-2 ORF2抗原含量調整為每毫升測試樣品約32至32.5 μg之量且與1 mg卡波莫971P混合。
由傑克遜實驗室(Jackson Laboratories,美國)獲得150隻雌性Balb/C小鼠且對其進行馴養7天。每籠任意選擇一隻小鼠在第0天採集血液,總共有26個樣品。總共10隻小鼠各自藉由皮下途徑以0.1-0.2 mL達爾伯克磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's Phosphate Buffer)接種。
總共二十隻小鼠各自藉由皮下途徑以0.1-0.2 mL每一測試樣品(測試樣品1至6)接種。每一籠含有5隻小鼠且在每一籠中之所有小鼠均在同一處理組中。在第21天,對所有小鼠進行最後一次採血。使每一血樣凝結且藉由離心收集血清。將所有樣品保存於單獨的試管中且在-80℃±10℃下儲存直至測試。藉由焚化處置小鼠。
藉由使用自建(in-house)PCV-2特異性ELISA量測每一測試樣品之PCV-2特異性抗體反應來評估每一測試樣品之免疫原性。每一測試樣品之免疫原性值在表2中以相對免疫原性(RI)值形式給出。此相對免疫原性值為每標準化量之用於免疫之ORF2抗原在受免疫動物中獲得的ORF2特異性抗體力價之量度。
除使用自建ELISA之外,PCV-2特異性抗體之量亦可藉由使用由Nawagitgul,P.,等人於Modified indirect porcine circovirus(PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40(2002)中所述之ELISA檢定來量測,該文獻之教示及內容以引用的方式併入本文中。該檢定中所量測之值亦可用以計算相對免疫原性值(參見下文)。
對於第21天,總共26個樣品,將每一小鼠之血清的等分試樣同籠彙集在一起。將所有第0天之血清樣品的等分試樣彙集至一個樣品中。將參考物稀釋兩倍,以1:2開始且一式三份添加至每一相應孔中。一式三份添加陽性及陰性對照。將每一樣品連續稀釋兩倍且添加至盤中,以1:200開始,一式三份。使用每月校正之SoftMaxTM平板讀取器讀取在450 nm下之最終吸光度且用電子儀器捕獲所有原始OD值且用Statlia(Brendan Scientific)分析以計算相對免疫原性(RI)值。
免疫之後產生抗體之量的RI計算值展示純化PCV-2 ORF2調配物引起針對高度純化PCV-2 ORF2抗原之最高血清(抗體)反應。純化PCV-2 ORF2與昆蟲細胞碎片一起調配導致與單獨的高度純化PCV-2 ORF2相比ORF2之相對免疫原性(亦即免疫原性)降低。單獨昆蟲細胞根本不產生針對PCV-2 ORF2抗原之抗體反應。亦不含有高度純化PCV-2 ORF2抗原之測試樣品4至6亦展示與單獨的高度純化PCV-2 ORF2相比相對免疫原性降低。
<110> 美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司
<120> 降低PCV-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV-2組合物
<130> P10-0121
<140> 099129539
<141> 2010-09-01
<150> 61/239,192;61/309,408
<151> 2009-09-02;2010-03-01
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 此為經修飾之Kozak序列。
<400> 1
<210> 2
<211> 6
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 此為重組Eco R1序列。
<400> 2
<210> 3
<211> 713
<212> DNA
<213> 豬環狀病毒
<400> 3
<210> 4
<211> 713
<212> DNA
<213> 豬環狀病毒
<400> 4
<210> 5
<211> 233
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<400> 5
<210> 6
<211> 233
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<400> 6
<210> 7
<211> 756
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 此序列係來自2型豬環狀病毒之開放閱讀框架2,連通來自pGEM T-easy載體之一部分。
<400> 7
<210> 8
<211> 10387
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 此為2型豬環狀病毒之ORF-2構築體,其包括桿狀病毒及pGEM T-easy編碼序列。
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<400> 10
<210> 11
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 此為2型豬環狀病毒之開放閱讀框架2的胺基酸序列。
<400> 11
圖1為展示在本發明之過濾製程之後存在ORF2之SDS-PAGE凝膠照片。
Claims (17)
- 一種製備PCV-2抗原性組合物之方法,其包含以下步驟:i)藉由包含以下步驟之方法獲得含有PCV-2抗原之第一液體:a)在宿主細胞中表現PCV-2抗原;b)收集包含PCV-2抗原之細胞培養物;c)經由具有約0.6至約2.0μm之孔徑的過濾器過濾在步驟b)獲得的收集物,藉此自細胞培養物中回收含有PCV-2抗原之第一液體,其中細胞碎片經由過濾而與已表現之PCV-2抗原分離;及d)添加DNA滅活劑;及ii)藉由第二液體交換該第一液體之該部分而自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該第二液體不同於該第一液體,及其中以該第二液體交換該第一液體之該部分包含以下步驟:a)液體添加,包含將該第二液體添加至含有該PCV-2抗原之該第一液體中;及b)藉由使用過濾器之過濾作用來移除一部分該第一及第二液體以濃縮該PCV-2抗原,使該抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍,其中該過濾器包括半透膜,其具有小於該PCV-2抗原之平均孔徑,且可防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質通過該半透膜孔。
- 如請求項1之方法,其中實質上同時執行該濃縮步驟及該液體添加步驟。
- 如請求項1之方法,其中至少兩次執行該濃縮步驟及該液體添加步驟。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經歷該方法之該液體相比降低至少10%。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中當活病毒或活細菌與該PCV-2抗原性組合物混合2小時或2小時以上時,由步驟i)至ii)製備的PCV-2抗原性組合物造成小於1 log TCID50/ml該活病毒或小於1 log CFU/ml該活細菌之損失。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中當活病毒或活細菌與該PCV-2抗原性組合物混合2小時或2小時以上時,由步驟i)至ii)製備的PCV-2抗原性組合物造成小於0.7 log TCID50/ml該活病毒或小於0.7 log CFU/ml該活細菌之損失。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該方法進一步包含收集在步驟ii)之後剩餘PCV-2抗原之步驟。
- 如請求項7之方法,其中該方法進一步包含藉由層析程序純化包含該PCV-2抗原之步驟ii)收集物的步驟。
- 如請求項8之方法,其中該PCV-2抗原經純化至以蛋白質總量計超過50%(w/w)之該PCV-2抗原之純度等級。
- 如請求項1至3中任一項之方法,進一步包含將步驟ii)後剩餘的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合之步驟:醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。
- 如請求項10之方法,其中該另一組份為佐劑。
- 如請求項11之方法,其中該佐劑為卡波姆(Carbomer)。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該PCV-2抗原包含ORF-2蛋白之病毒樣粒子。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該方法進一步包含將該PCV-2抗原性組合物與至少一種其他抗原組合之步驟。
- 如請求項15之方法,其中該至少一種其他抗原包括豬生殖及呼吸症候群病毒抗原及/或豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原。
- 一種改良免疫原性組合物對豬環狀病毒之免疫原性的方法,其包含以下步驟:a.在宿主細胞中表現PCV-2抗原;b.藉由包含以下步驟之方法獲得含有PCV-2抗原之第一液體:a)收集包含PCV-2抗原之細胞培養物;b)經由具有約0.6至約2.0μm之孔徑的過濾器過濾在步驟b)獲得的收集物,藉此自細胞培養物中回收含有PCV-2抗原之第一液體,其中細胞碎片經由過濾而與已表現之PCV-2抗原分離;及c)添加DNA滅活劑;c.藉由第二液體交換該第一液體之該部分而自該PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體,其中該第二液體不同於該第一液體,及其中以該第二液體交換該第一液體之該部分包含以下步驟:a)液體添加,包含將該第二液體添加至含有該PCV-2抗原之該第一液體中;及b)藉由使用過濾器之過濾作用來移除一部分該第一及第二液體以濃縮該PCV-2抗原,使該抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍,其中該過濾器包括半透膜,其具有小於該PCV-2抗原之平均孔徑,且可防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質通過該半透膜孔;d.收集該PCV-2抗原;e.純化該PCV-2抗原至以該免疫原性組合物中所包括的蛋白質總量計高於50%(w/w)之純度等級;f.將該純化PCV-2抗原與佐劑混合。
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US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
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EP2859900A1 (en) | 2006-12-11 | 2015-04-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
AU2007333857B2 (en) | 2006-12-15 | 2014-05-15 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Treatment of pigs with PCV2 antigen |
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EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
US7829274B2 (en) | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
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CN103102397A (zh) * | 2011-11-09 | 2013-05-15 | 韩健宝 | 预防和治疗pcv-2病毒的肽核酸及其制剂 |
CN105246505A (zh) * | 2013-04-30 | 2016-01-13 | 勃林格殷格翰动物保健公司 | PCV2a亚型(PCV2a)的ORF2蛋白用于交叉保护中的用途 |
WO2014182872A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-11-13 | Protatek International, Inc. | Vaccine for pcv2 and mycoplasma |
WO2015051099A1 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof |
KR102166196B1 (ko) * | 2015-12-28 | 2020-10-15 | 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 | M hyo 다가 백신 및 이의 용도 |
RS64144B1 (sr) * | 2016-11-03 | 2023-05-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vakcina protiv svinjskog parvovirusa i virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja i postupci njegove proizvodnje |
US11957746B2 (en) * | 2018-03-26 | 2024-04-16 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Method of producing an immunogenic composition |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
CN113957059B (zh) * | 2021-11-26 | 2023-08-22 | 山东滨州沃华生物工程有限公司 | 一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
WO2007076520A2 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
CN101180406A (zh) * | 2004-12-30 | 2008-05-14 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法 |
Family Cites Families (210)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2909462A (en) | 1955-12-08 | 1959-10-20 | Bristol Myers Co | Acrylic acid polymer laxative compositions |
US3137631A (en) | 1959-12-01 | 1964-06-16 | Faberge Inc | Encapsulation in natural products |
US3080291A (en) | 1960-06-10 | 1963-03-05 | Jensen Salsberg Lab Inc | Serial passage of distemper virus in tissue cultures of chick embryo and canine tissue and vaccine therefrom |
US3959457A (en) | 1970-06-05 | 1976-05-25 | Temple University | Microparticulate material and method of making such material |
US4015100A (en) | 1974-01-07 | 1977-03-29 | Avco Everett Research Laboratory, Inc. | Surface modification |
US4122167A (en) | 1977-02-09 | 1978-10-24 | Merck & Co., Inc. | Respiratory synctial vaccine |
US4205060A (en) | 1978-12-20 | 1980-05-27 | Pennwalt Corporation | Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use |
US4224412A (en) | 1979-05-01 | 1980-09-23 | Dorofeev Viktor M | Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same |
US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
US4554159A (en) | 1981-11-12 | 1985-11-19 | Institute Merieux | Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2) |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
US5364773A (en) | 1991-03-07 | 1994-11-15 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
US4452747A (en) | 1982-03-22 | 1984-06-05 | Klaus Gersonde | Method of and arrangement for producing lipid vesicles |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US4468346A (en) | 1983-10-27 | 1984-08-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins |
DE3405100A1 (de) | 1984-02-14 | 1985-08-14 | Drägerwerk AG, 2400 Lübeck | Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel |
US4744933A (en) | 1984-02-15 | 1988-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for encapsulation and encapsulated active material system |
US5008050A (en) | 1984-06-20 | 1991-04-16 | The Liposome Company, Inc. | Extrusion technique for producing unilamellar vesicles |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
US4921706A (en) | 1984-11-20 | 1990-05-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Unilamellar lipid vesicles and method for their formation |
US4606940A (en) | 1984-12-21 | 1986-08-19 | The Ohio State University Research Foundation | Small particle formation and encapsulation |
US5206163A (en) | 1985-07-08 | 1993-04-27 | Chiron Corporation | DNA encoding bovine diarrhea virus protein |
EP0208672B1 (en) | 1985-07-08 | 1993-02-17 | REGION WALLONNE représentée par le Ministre des Technologies pour la Région wallonne dans ses attributions | Vaccines and diagnostics derived from bovine diarrhea virus |
US4753884A (en) | 1986-01-28 | 1988-06-28 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
JPS62198626A (ja) | 1986-02-26 | 1987-09-02 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 血球凝集性脳脊髄炎ウイルス感染症予防ワクチン |
FR2602791B1 (fr) | 1986-08-18 | 1988-11-10 | Ministere Agri Direction Quali | Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu |
IL84154A0 (en) | 1986-10-16 | 1988-03-31 | Microgenesys Inc | Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same |
NZ222465A (en) | 1986-11-07 | 1992-11-25 | Pasteur Institut | Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen |
US5009956A (en) | 1987-02-24 | 1991-04-23 | Univ Minnesota | Phospholipase A2-resistant liposomes |
GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
US5069901A (en) | 1988-02-03 | 1991-12-03 | Jones Elaine V | Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection |
DE3833925A1 (de) | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
US5213759A (en) | 1988-05-05 | 1993-05-25 | Elopak Systems A.G. | Sterilization |
WO1990001543A1 (fr) | 1988-07-29 | 1990-02-22 | Intracel Corporation | Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo |
CA2003300A1 (en) | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Franklin Volvovitz | Skin test and test kit for aids |
US4927637A (en) | 1989-01-17 | 1990-05-22 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
DK0454735T3 (da) | 1989-01-23 | 1996-10-07 | Auspharm Int Ltd | Vaccine sammensætning |
US4944948A (en) | 1989-02-24 | 1990-07-31 | Liposome Technology, Inc. | EGF/Liposome gel composition and method |
ES2200016T3 (es) | 1989-03-21 | 2004-03-01 | Vical Incorporated | Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado. |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5591439A (en) | 1989-03-24 | 1997-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
US5552143A (en) | 1989-03-24 | 1996-09-03 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
US5202130A (en) * | 1989-08-31 | 1993-04-13 | The Johns Hopkins University | Suppression of eczematous dermatitis by calcium transport inhibition |
US5132117A (en) | 1990-01-11 | 1992-07-21 | Temple University | Aqueous core microcapsules and method for their preparation |
US5202430A (en) | 1990-01-16 | 1993-04-13 | University Of Tennessee | Transmissible gastroenteritis virus genes |
GB9001766D0 (en) | 1990-01-25 | 1990-03-28 | Univ Court Of The University O | Vaccines |
AU7007491A (en) | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
ATE160699T1 (de) | 1990-05-29 | 1997-12-15 | American Cyanamid Co | Impfstoff gegen die pneumonie bei schweinen und verfahren zu seiner herstellung |
US5565205A (en) | 1990-08-16 | 1996-10-15 | Solvay Animal Health, Inc. | Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof |
GB9023111D0 (en) | 1990-10-24 | 1990-12-05 | Wellcome Found | Expression system |
WO1992007934A1 (en) | 1990-11-01 | 1992-05-14 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Bacterial attenuation method and vaccine |
US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
EP0575491B1 (en) | 1991-03-07 | 2003-08-13 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
UA27788C2 (uk) | 1991-06-06 | 2000-10-16 | Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют | Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла |
MX9204885A (es) | 1991-08-26 | 1994-05-31 | Boehringer Animal Health Inc | Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos. |
ES2065303T5 (es) | 1991-08-26 | 2001-05-01 | Univ Minnesota | Procedimiento de diagnosis y vacuna especifica. |
US5846805A (en) | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
US6080570A (en) | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome |
US6042830A (en) | 1992-08-05 | 2000-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Viral agent associated with mystery swine disease |
US6982160B2 (en) | 1991-08-26 | 2006-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions that include SIRS virus |
WO1993006211A1 (en) | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Collins James E | Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof |
US5580557A (en) | 1991-10-09 | 1996-12-03 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Live, avirulent salmonella choleraesuis vaccine used for inducing an immune response in animals |
AU2684792A (en) | 1991-10-14 | 1993-05-21 | Akzo Nobel N.V. | Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic |
US5382425A (en) | 1992-01-13 | 1995-01-17 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
FR2686097B1 (fr) | 1992-01-14 | 1994-12-30 | Rhone Merieux | Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie. |
US5338543A (en) | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
US5643578A (en) | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
TW289731B (zh) | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
US6251397B1 (en) | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
US6380376B1 (en) | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US5419907A (en) | 1992-11-10 | 1995-05-30 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Pathogenic porcine respiratory coronavirus |
KR100374295B1 (ko) | 1993-02-08 | 2003-12-24 | 바이엘 코포레이션 | 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도 |
US5801029A (en) | 1993-02-16 | 1998-09-01 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia |
IL108915A0 (en) | 1993-03-18 | 1994-06-24 | Merck & Co Inc | Polynucleotide vaccine against influenza virus |
ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
EP0659885A1 (en) | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
EP0740704A1 (en) | 1994-01-27 | 1996-11-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of dna transcription unit |
DE4407489A1 (de) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bayer Ag | Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines |
HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
DE69522984T2 (de) | 1994-04-11 | 2002-04-25 | Akzo Nobel Nv | Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins |
DE69530227T2 (de) | 1994-04-15 | 2004-04-01 | Temple University | Methode zum einkapseln mittels eines wässrigen lösungsmittels und mikrokapseln |
WO1995030018A2 (en) | 1994-04-29 | 1995-11-09 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
AU711350B2 (en) | 1994-05-10 | 1999-10-14 | Zoetis Services Llc | Improved modified live BRSV vaccine |
DK53595A (da) | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
MX9700817A (es) | 1994-08-05 | 1997-05-31 | Univ Minnesota | Secuencia viral de nucleotidos de "vr-2332" y metodos de uso. |
DE69632658T2 (de) | 1995-03-14 | 2005-06-09 | Akzo Nobel N.V. | Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom |
AU711702B2 (en) | 1995-03-23 | 1999-10-21 | Cambridge University Technical Services Limited | Vectors for gene delivery |
US5885823A (en) | 1995-06-05 | 1999-03-23 | Nobl Laboratories, Inc. | Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents |
US5690940A (en) | 1995-06-21 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof |
CA2228128C (fr) | 1995-08-01 | 2011-03-29 | Pasteur Merieux Serums & Vaccins | Procede de production industrielle d'un vaccin contre l'encephalite japonaise et vaccin obtenu |
ES2102971B1 (es) | 1996-01-25 | 1998-03-01 | Hipra Lab Sa | Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion. |
US6015663A (en) | 1996-03-01 | 2000-01-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains |
US5866401A (en) | 1996-03-01 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
CO4600644A1 (es) | 1996-03-01 | 1998-05-08 | Schering Corp | Vacuna contra el sindrome reproductivo y respiratorio porcino |
US5976537A (en) | 1996-07-02 | 1999-11-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
EP0979101B1 (en) | 1996-07-03 | 2010-10-27 | Merial, Inc. | Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna |
DE69704011T2 (de) | 1996-10-09 | 2001-06-07 | Akzo Nobel Nv | Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Sweins (PRRSV) |
EP0839912A1 (en) | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
US20040224327A1 (en) | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
US6183752B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
WO1998035023A1 (en) | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Origen, Inc. | Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays |
SK286063B6 (sk) | 1997-05-06 | 2008-02-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Peptid vyvolávajúci tvorbu protilátok, protilátkareaktívna s týmto peptidom a diagnostická súpravaobsahujúca peptid a protilátku |
EP1003869A1 (en) | 1997-06-04 | 2000-05-31 | Calgene LLC | Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants |
WO1998055626A2 (en) | 1997-06-05 | 1998-12-10 | Origen, Inc. | Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine |
US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
FR2781159B1 (fr) | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
US7211379B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
US20060029617A1 (en) | 1997-10-03 | 2006-02-09 | Charreyre Catherine E | Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use |
FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
US20040062775A1 (en) | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
PT2363488E (pt) | 1997-12-11 | 2015-01-13 | Univ Belfast | Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos |
WO1999045956A1 (en) | 1998-03-13 | 1999-09-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Vaccines against circovirus infections |
US6294176B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-09-25 | Schering-Plough Veterinary Corp. | Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species |
US6472193B1 (en) | 1998-11-19 | 2002-10-29 | Azwell Inc. | Recombinant lysophosphatidic acid phosphatase |
US7132106B2 (en) | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7618797B2 (en) | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
NZ501264A (en) | 1998-12-22 | 2001-09-28 | Pfizer Prod Inc | Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS |
FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
AU3198200A (en) | 1999-03-08 | 2000-09-28 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
ATE474041T1 (de) | 1999-04-22 | 2010-07-15 | Us Agriculture | Auf dem isolat ja-142 basierender impfstoff gegen das reproduktive-und-respiratorische syndrom beim schwein |
US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
WO2001017556A1 (fr) | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Shionogi & Co., Ltd. | Préparations vaccinales administrables par les muqueuses |
GB9921146D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Smithkline Beecham Biolog | Novel composition |
GB9921147D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Smithkline Beecham Biolog | Novel composition |
US20040213805A1 (en) | 1999-10-12 | 2004-10-28 | Verheije Monique Helene | Deletions in arterivirus replicons |
US6656478B1 (en) | 1999-11-12 | 2003-12-02 | Samuel D. Charles | Cross-protective salmonella vaccines |
US20020086031A1 (en) | 1999-12-21 | 2002-07-04 | Jean-Christophe Audonnet | Compositions and vaccines containing antigen(s) of cryptosporidium parvum and of another pathogen |
US20020012670A1 (en) | 2000-01-26 | 2002-01-31 | Knut Elbers | Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) |
US7041443B2 (en) | 2000-02-08 | 2006-05-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use |
EP1156111A1 (en) | 2000-05-19 | 2001-11-21 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Chimeric arterivirus-like particles |
US6808900B2 (en) | 2000-06-15 | 2004-10-26 | Manitoba, University Of | Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof |
EP1290016A2 (en) | 2000-06-15 | 2003-03-12 | Purdue Research Foundation | Vaccine for congenital tremors in pigs |
US7388087B2 (en) | 2000-11-09 | 2008-06-17 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Enhancement of immune response to vaccine by interferon alpha |
US7018638B2 (en) | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
MY129765A (en) | 2000-12-19 | 2007-04-30 | Wyeth Corp | Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
JP2002247979A (ja) | 2001-02-23 | 2002-09-03 | Nippon Biologicals Inc | マレック病ワクチンおよびその製造方法 |
EP1379671B1 (en) * | 2001-03-27 | 2009-05-06 | University of Saskatchewan | Methods to culture circovirus |
EP1397498A1 (en) | 2001-05-21 | 2004-03-17 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | Delections in arterivirus replicons |
US20030096377A1 (en) | 2001-06-28 | 2003-05-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2 |
DK1474067T4 (en) | 2001-07-02 | 2017-10-16 | Zoetis Services Llc | One-dose vaccination with I Mycoplasma Hyopneumoniae / I |
US7361352B2 (en) | 2001-08-15 | 2008-04-22 | Acambis, Inc. | Influenza immunogen and vaccine |
US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US6841364B2 (en) | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
US20030199581A1 (en) | 2002-03-13 | 2003-10-23 | Seligson Allen L. | Boswellin compositions enhanced with 3-beta-acetyl-11-keto-beta-boswellic acid ("AKBA") industrial manufacture and uses |
EP1350840B1 (en) | 2002-04-05 | 2012-05-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Adaptation sites of PRRSV |
US20030215455A1 (en) | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Bailey Reynolds | Vaccine stabilizer and method of use |
AU2002951692A0 (en) | 2002-09-23 | 2002-10-17 | Vital Biotech (Hong Kong) Limited | Improvements in or relating to vaccines |
DK1599164T3 (en) | 2003-02-03 | 2015-04-27 | Cerebus Biolog Inc | METHODS OF TREATMENT, PREVENTION AND DETECTION OF HELICOBACTER INFECTION |
US7563449B2 (en) | 2003-04-21 | 2009-07-21 | Pfizer Inc, | Methods for reducing cattle reproductive diseases |
CN1458167A (zh) | 2003-06-02 | 2003-11-26 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 截短表达的猪圆环病毒ⅱ型衣壳蛋白抗原及其应用 |
US7335361B2 (en) | 2003-06-09 | 2008-02-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine |
EP1651265B1 (en) | 2003-07-24 | 2008-04-23 | Merial Limited | Vaccine formulations comprising an oil-in-water emulsion |
AU2004260657B2 (en) | 2003-07-25 | 2012-06-07 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Lawsonia intracellularis of European origin and vaccines, diagnostic agents and methods of use thereof |
FR2861731B1 (fr) | 2003-10-30 | 2006-02-24 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelle proteine de fixation du phosphate, compositions pharmaceutiques la contenant et ses utilisations |
CN1942204A (zh) | 2004-04-26 | 2007-04-04 | 株式会社中央疫苗研究所 | 用于猪呼吸病的灭活混合疫苗及其制备方法 |
CN1579553A (zh) | 2004-05-18 | 2005-02-16 | 浙江大学 | Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用 |
US7722878B2 (en) | 2004-06-17 | 2010-05-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PRRSV subunit vaccines |
KR20070028547A (ko) | 2004-06-18 | 2007-03-12 | 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 | 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정 |
US20060286124A1 (en) | 2004-06-30 | 2006-12-21 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine compositions and methods of treating coronavirus infection |
US20060063151A1 (en) | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Michael Roof | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
US7700285B1 (en) * | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
KR20070096019A (ko) | 2005-01-13 | 2007-10-01 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 향상된 prrs 백신 |
US7300785B2 (en) | 2005-02-03 | 2007-11-27 | Universiteit Ghent | Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines |
US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
ES2589928T3 (es) | 2005-04-13 | 2016-11-17 | Merial, Inc. | Procedimiento para la producción de circovirus porcino |
US7691368B2 (en) | 2005-04-15 | 2010-04-06 | Merial Limited | Vaccine formulations |
CA2894069C (en) | 2005-06-24 | 2019-02-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use |
KR101347503B1 (ko) | 2005-09-09 | 2014-01-02 | 인터벳 인터내셔널 비.브이. | Pcv-2 백신 |
CN101495138B (zh) | 2005-11-29 | 2014-01-08 | 衣阿华州立大学研究基金公司 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的保护性抗原决定子的鉴定及其用途 |
DK2371385T3 (en) | 2005-12-29 | 2015-11-30 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Use of a PV2 immunogen composition for reduction of clinical symptoms in pigs |
EP2099927A4 (en) | 2006-11-22 | 2010-05-05 | Boehringer Ingelheim Vetmed | METHODS FOR REDUCING FLAMBEES OF DISEASES ASSOCIATED WITH PORCINIC CIRCOVIRUS |
EP2859900A1 (en) | 2006-12-11 | 2015-04-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
WO2008073490A1 (en) | 2006-12-12 | 2008-06-19 | Carrington Laboratories Inc., | Purification of influenza viral antigens |
AU2007333857B2 (en) | 2006-12-15 | 2014-05-15 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Treatment of pigs with PCV2 antigen |
EP1941903A1 (en) | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
US8563313B2 (en) | 2007-02-13 | 2013-10-22 | Washington State University Research Foundation | Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
WO2008121958A1 (en) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia |
GB0712160D0 (en) * | 2007-06-22 | 2007-08-01 | Univ Ghent | Methods and compositions in the treatment of procine circoviral infection |
US20090017064A1 (en) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
US7829274B2 (en) | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
US20090162398A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
CA2712006A1 (en) | 2008-01-23 | 2009-10-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
WO2009103037A1 (en) | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases |
US20110027312A1 (en) | 2008-04-16 | 2011-02-03 | Juhan Nicole M | CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF |
US8444989B1 (en) | 2008-04-18 | 2013-05-21 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs |
TWI449533B (zh) | 2008-04-18 | 2014-08-21 | Intervet Int Bv | 防備胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)及豬環狀病毒(Porcine circo virus)用疫苗 |
US20100003278A1 (en) | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof |
RU2561595C2 (ru) | 2008-08-25 | 2015-08-27 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) |
US20100129398A1 (en) | 2008-11-26 | 2010-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome |
TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 |
WO2011128415A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Universiteit Gent | Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
US8728487B2 (en) | 2011-01-20 | 2014-05-20 | Hua Wu | Attenuated live vaccine for prevention of porcine reproductive and respiratory syndrome |
US8906385B2 (en) | 2011-12-01 | 2014-12-09 | University Of Maryland, College Park | Interferon-inducing porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate |
-
2010
- 2010-09-01 TW TW099129539A patent/TWI627281B/zh active
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2012
- 2012-03-01 CL CL2012000562A patent/CL2012000562A1/es unknown
- 2012-03-09 CO CO12041859A patent/CO6511229A2/es unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
CN101180406A (zh) * | 2004-12-30 | 2008-05-14 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法 |
WO2007076520A2 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2010289431A1 (en) | 2012-03-08 |
CL2012000562A1 (es) | 2012-10-12 |
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EP2473189B1 (en) | 2017-11-15 |
SG10201405406VA (en) | 2014-10-30 |
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US20110059126A1 (en) | 2011-03-10 |
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CA2772928A1 (en) | 2011-03-10 |
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RU2012112636A (ru) | 2013-10-27 |
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---|---|---|
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