CN105246505A

CN105246505A - PCV2a亚型(PCV2a)的ORF2蛋白用于交叉保护中的用途

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Publication number: CN105246505A
Application number: CN201480024535.0A
Authority: CN
Inventors: G·海威克; L·赫尔南德斯; W·S·约翰逊; C·M·米伦塞勒; E·M·沃恩
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2016-01-13
Also published as: EP2991676A1; WO2014179200A1; US20160206727A1; US20140322267A1

Abstract

公开了控制不同PCV2亚型的PCV2感染的疫苗接种方法。具体而言，在用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染，减少、预防或治疗由不同亚型的PCV2感染引起的临床征象，或预防或治疗由不同亚型的PCV2感染引起的疾病的方法中使用PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白或包含PCV2a？ORF2蛋白的免疫原性组合物。

Description

PCV2a亚型(PCV2a)的ORF2蛋白用于交叉保护中的用途

序列表

依照37C.F.R.1.821-1.825，本申请包括序列表。在此通过述及完整收录伴随本申请的序列表。

发明背景

2型猪环状病毒(PCV2)为小型(直径为17-22nm)二十面体无包膜DNA病毒，其含有单链圆形基因组。PCV2与1型猪环状病毒(PCV-1)具有约80％序列同一性。然而，与通常无毒力的PCV-1相比，感染有PCV2的猪展现通常称为断乳后多系统消耗性综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征为消瘦、皮肤苍白、身体憔悴、呼吸窘迫、腹泻及黄疸(icterus/jaundice)。在一些受感染的猪中，所有症状的组合将显而易见而其它猪将仅仅具有此等症状中之一或两者。在尸检期间，显微镜可见及肉眼可见的病损亦出现于多个组织及器官上，淋巴器官为最常见的病损部位。已观测到PCV2核酸或抗原的量与显微镜可见淋巴病损的严重性之间强相关。感染有PCV2的猪的死亡率可达80％。除PMWS外，PCV2与包括以下的若干其它感染相关：假性狂犬病、猪生殖及呼吸综合征(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser’sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝障碍及化脓性支气管肺炎。

目前，有三种已知的PCV2亚型(PCV2a、PCV2b和PCV2c)，其根据用于PCV2基因型的同意命名法进行分类(Segales,J.etal.,2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8)。也提议了另外两种亚型(PCV2d和PCV2e)(Wangetal.VirusRes.2009145(1):151-6)但随后证明它们属于PCV2a和PCV2b簇(Corteyetal.VetMicrobiol.2011149(3-4):522-32011)。根据该用于PCV2基因型的统一命名法，ORF2基因用于进行PCV2的基因分型，其中所述基因分型基于被比较的两个序列中不同的核苷酸位点的比例(p距离)。该值通过核苷酸差异的数目除以所比较的核苷酸总数获得(Kumaretal.2001Bioinformatics17,1244-1245)，且随后构建p距离/频率直方图使得可以确定区分不同基因型的可能截断值(RogersandHarpending1992MolecularBiologyandEvolution9,552-569；Biaginietal.1999JournalofGeneralVirology80,419-424)。使用该方法，当它们之间的遗传距离为0·035时将ORF3PCV2序列分配至不同基因型。

Fort等人(Vaccine200826(8):1063-71)公开了使用含有水包油乳剂中的PCV2基因型2株的衣壳蛋白的PCV2亚单位疫苗的初免和加强疫苗接种，其中小猪在四周龄接种并且在两周后再接种。根据Fort等人，获得子受PMWS影响的猪的淋巴组织的四种不同PCV2分离物用作攻击病毒，其中所述毒株中的两种分类为基因型1而两种为基因型2。Fort等人进一步描述了该研究中使用的实验模型并没有成功导致PMWS。然而，显示了以初免和加强疫苗接种方案施用的所述疫苗能够在所有接种的动物中预防病毒血症而不管所用来攻击的病毒。相反，根据Fort等人，没有完全预防鼻脱落(shedding)和粪便脱落，不过在两种情况中，与它们未接种对应物相比，两次接种的猪中阳性猪的百分比和鼻腔和粪便涂片中的病毒载荷均显著降低。

因此，需要新的和增强的疫苗接种方法来控制不同PCV2亚型的PCV2感染。

发明概述

通过说明书和权利要求中所述的实施方式解决了上述技术问题。

因此，根据权利要求实现本发明的不同方面。

本发明基于意想不到的发现，即施用仅一剂的PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白，特别是如果其包含于免疫原性组合物中，其中优选地所述免疫原性组合物的杀病毒活性已经被降低，足以降低和预防由除了2a亚型之外的PCV2亚型感染导致的临床征象。

在一方面，本发明因此涉及PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其用于在治疗或预防不同亚型的PCV2感染，减少、预防或治疗由不同亚型的PCV2感染导致的临床征象，或预防或治疗由不同亚型的PCV2感染导致的疾病的方法中应用。

发明详述

因此理解术语“不同亚型的PCV2”，如本文所述，涉及除2a亚型外的亚型的PCV2。

如本文所用，术语“除2a亚型外的亚型的PCV2”和“不同亚型的PCV2”因此是等同的。

术语“PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白”，如本文所描述，涉及由通过用于PCV2基因型定义的标准命名法所定义的PCV-2a的ORF2基因所编码的蛋白(Segales,J.etal.,2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8，其通过引用并入本文)。

优选地，不同亚型的PCV2感染或除2a亚型外的亚型的PCV2的感染分别是PCV2b亚型(PCV2b)和/或PCV2c亚型(PCV2c)的感染。

更优选地，不同亚型的PCV2感染或除2a亚型外的亚型的PCV2的感染分别是PCV2b的感染。

根据特别优选的方面，不同亚型的PCV2感染或除2a亚型外的亚型的PCV2的感染分别是(i)不同亚型的PCV2或除2a亚型外的亚型的PCV2，分别地和(ii)PCV2a的合并感染。

根据更具体的实施方式，不同亚型的PCV2感染或除2a亚型外的亚型的PCV2的感染分别是PCV2a和PCV2b的合并感染。

术语“PCV2a”、“PCV2b”和“PCV2c”，如本文所描述，分别地涉及PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c，分别地根据用于PCV2基因型定义的标准命名法(Segales,J.etal.,2008,PCV-2genotypedefinitionandnomenclature,VetRec162:867-8，其通过引用并入本文)。

具体而言，所述和PCV2a的合并感染是如下的感染：(i)包含与SEQIDNO:1的序列至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，仍更优选至少97％，仍更优选至少98％，及最优选至少99％相同的多肽的PCV2或(ii)包含含有如下序列的多核苷酸的PCV2，所述序列编码与SEQIDNO:1的序列至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，仍更优选至少97％，仍更优选至少98％，及最优选至少99％相同的多肽。

如本文所用，尤其理解术语“与SEQIDNO:X相同”等同于术语“在SEQIDNO:X的长度上与SEQIDNO:X相同”或等同于术语“在SEQIDNO:X的全长上与SEQIDNO:X相同”。在该上下文，“X”是选自1至2的任意整数，从而“SEQIDNO:X”代表本文提及的SEQIDNO中的任一。

优选地，PCV2b感染，如本文所描述，是如下的感染：(i)包含与SEQIDNO:2的序列至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，仍更优选至少97％，仍更优选至少98％，及最优选至少99％相同的多肽的PCV2或(ii)包含含有如下序列的多核苷酸的PCV2，所述序列编码与SEQIDNO:2的序列至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，仍更优选至少97％，仍更优选至少98％，及最优选至少99％相同的多肽。

具体地，在本发明上下文中，PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物是优选的，其中所述PCV2aORF2蛋白是重组PCV2aORF2蛋白，更优选重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白。

具体而言，出于本发明的目的，PCV2aORF2或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物是优选的，其中所述PCV2aORF2蛋白包括或由这样的序列组成，所述序列与SEQIDNo:1的序列至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，仍更优选至少97％，仍更优选至少98％，及最优选至少99％相同。

优选地，在本发明的上下文中，

-不同亚型的PCV2感染的治疗或预防是基于或包含或由以下组成：诱导针对所述不同亚型的PCV2的免疫应答或共同诱导针对所述不同亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答，

-所述临床征象，如本文所提及，选自淋巴耗竭(lymphoiddepletion)、淋巴炎症、淋巴定殖(lymphoidcolonization)、淋巴组织PCV2抗原阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、降低的平均日体重增长、肺部炎症、肺组织PCV2抗原阳性IHC、增加的死亡率，和/或

-所述疾病，如本文所提及的，是PMWS。

术语“预防(prevention)”或“减少(reduction)”或“预防(preventing)”或“减少(reducing)”，如本文所用，分别是指(但不限于)这样的过程，其包括给动物施用PCV2抗原，即包含在本发明的组合物中的根据本发明的PCV2aORF2蛋白，其中所述PCV2抗原，当给所述动物施用时在所述动物中引起或能够引起针对PCV2的免疫应答。总言之，这样的治疗导致由PCV2导致的疾病的临床征象或PCV2感染相关的临床征象分别的减少。更具体地，术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”，如本文所用，一般指预防性过程，其中在PCV2引起的疾病过程诱导或发作之前使动物暴露于本发明的免疫原性组合物。

本文中，“PCV2感染相关的临床征象的减少”指的是(但不限于)，与野生型感染相比，减少群体中被感染对象的数目，减少或消除展现感染临床征象的对象的数目，或减少存在于所述对象中的任何临床征象的严重性。例如，其应该指病原体载荷的任何减少，病原体脱落，病原体传播的减少，或PCV2感染的任何临床征象症状的减少。优选地，与未接受组合物且可能被感染的对象相比，这些临床征象在接受本发明的组合物的对象中被减少至少10％。更优选地，临床征象在接受本发明的组合物的对象中被减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，以及甚至更优选至少50％。

术语“病毒血症的减少”指的是(但不限于)，进入动物血流的PCV2病毒的减少，其中与未接受组合物且可能被感染的对象相比，病毒血症水平(即每毫升血清的PCV2RNA拷贝数目或每公升血清的斑形成集落的数目)，在接受本发明的组合物的对象的血清中被减少至少50％。更优选地，所述病毒血症水平在接受本发明的组合物的对象中被减少至少90％，优选至少99.9％，更优选至少99.99％，以及甚至更优选至少99.999％。

如本文所用，术语“病毒血症”具体理解为其中PCV2颗粒在动物血流中复制和循环的病症。

在本发明的上下文，“淋巴定殖”具体理解为在淋巴组织中发现PCV2b抗原的存在。更具体地，所述在淋巴组织中发现PCV2b抗原的存在是基于淋巴组织的PCV2b定殖。因此，如本文所描述，减少、预防或治疗淋巴定殖具体地分别涉及在淋巴组织中发现的PCV2b抗原的减少，以及减少、预防或治疗淋巴组织的PCV2b定殖。

术语“动物”，如本文所用，具体涉及哺乳动物，优选涉及猪(swine)，更优选涉及家猪(pig)，最优选涉及小猪(piglet)。

本发明还提供了一种方法，其用于治疗或预防除a亚型外的亚型的PCV2感染，用于减少、预防或治疗除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的疾病，所述方法包括给动物施用PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物。

并且，本发明提供了PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物用于制备药物的用途，所述药物用于减少、预防或治疗除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的疾病。

并且，在本发明的方法或本发明的用途的上下文中，优选地

-除2a亚型外的亚型的PCV2感染的预防、减少或治疗是基于或包含或由以下组成：诱导针对所述除2a亚型外的亚型的PCV2的免疫应答或共同诱导针对所述除a亚型外的亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答，

-所述疾病，如本文所提及的，是PMWS。

根据本发明特别优选的方面，所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物仅施用一次。

优选地，在本发明上下文，所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物给动物施用，优选给猪(swine)，更优选给家猪(pig)，尤其优选给小猪施用。

最优选地，本文所描述的免疫原性组合物是免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物的杀病毒活性已经被降低。

除非另有所述，否则本发明的实施将采用此项技术技能范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学常规技术。文献中充分解释了该等技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第I，II及III卷，第二版(1989)；DNACloning，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1984)；AnimalCellCulture(R.K.Freshney编，1986)；ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLpress，1986)；Perbal，B.，APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInEnzymology(S.Colowick及N.Kaplan编，AcademicPress，Inc.)；Proteinpurificationmethods-apracticalapproach(E.L.V.Harris及S.Angal编，IRLPressatOxfordUniversityPress)；及HandbookofExperimentalImmunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编，1986，BlackwellScientificPublications)。

在详细描述本发明另外的方面之前，应了解本发明不限于特定DNA、多肽序列或过程参数，其当然可变化。亦应了解本文中所使用的术语仅为了达成描述本发明的特定实施方案的目的且并非意欲限制本发明。应注意，除非文中明确另外指示，否则如本说明书及随附权利要求所用的单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此，举例而言，“一抗原”包括两种或两种以上抗原的混合物，“一赋形剂”包括两种或两种以上赋形剂的混合物，诸如此类。

本发明的本方面解决先前技术中所固有的问题且相对于当前技术有明显进步。一般而言，本发明的本方面提供一种制备用于本发明的目的的PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，并ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。如本文所用，特别地理解术语“抗原性组合物”等同于术语“免疫原性组合物”。

出于本发明的本方面的目的，“第一液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等等组合使用的液体、水性或流体培养基。第一液体优选包含抗原性组合物的培养基；第一液体更优选包含用于在培养宿主细胞中产生重组蛋白的细胞培养基或优选由其组成。该等培养宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞及哺乳动物细胞，以昆虫及哺乳动物细胞尤佳。因此，第一流体可包含用于培养细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的培养基或由其组成。当使用昆虫细胞时，细胞培养基优选为不含血清的细胞培养基，且该培养基最优选为EX-CELL420不含血清培养基。EX-CELL420是一种完全培养基，其不含蛋白质且含有L-谷氨酰胺，而且是为Sf9和Sf21昆虫细胞系的无血清生长而开发并优化的。

出于本发明的本方面的目的，“第二液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等等组合使用的任何液体，其不同于第一液体。第二液体优选为水溶液，甚至更优选为医药学上可接受的溶液，且甚至更优选为缓冲液，诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等。最优选，第二流体的特征在于当活病毒或活细菌在该流体中培养或储存时，其不对任何活病毒或任何活细菌有杀病毒作用(在本文中，除非明确说明或根据上下位显而易见，术语“杀病毒”包括杀细菌活性)。

出于本发明的本方面的目的，“部分”系指不包涵完整量的任何量。举例而言，一部分液体将为小于100％液体的体积，诸如90％液体、80％液体、70％液体的任何物且所有量均介于超过0％与小于100％之间。

“PCV-2抗原”系指包含至少一种当施用动物(优选猪)时可诱导、刺激或增强针对PCV-2感染的免疫反应的PCV2a抗原的任何物质组合物。因此，如本文所用，术语“PCV-2”尤其涉及PCV2a。该PCV-2抗原优选为全PCV-2病毒(优选呈灭活形式)、经修饰或减毒的PCV-2活病毒、包含至少一个PCV-2免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、包含至少一个PCV-2免疫原性氨基酸序列(优选ORF2)的任何其它多肽或组份。如本文中所用的术语“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”系指引发宿主中针对PCV-2的免疫反应的任何PCV-2氨基酸序列。该PCV-2免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸优选为国际专利申请案WO2006/072065(其教示内容以引用的方式并入本文中)中所揭示或提供的任一者，或为在此项技术中已知的任何其它PCV-2多肽。举例而言，PCV-2ORF2DNA的代表性序列包含核苷酸序列Genbank寄存编号AF086834(SEQIDNO：3)及SEQIDNO：4。

然而，熟习此项技术者应了解此序列在序列同源性方面可变化高达1％-10％且仍保持使其适用于免疫原性组合物中的抗原特征。免疫学组合物的抗原特征可例如藉由WO06/072065的实施例4所提供的攻毒实验来评估。此外，当经修饰抗原与由如WO06/072065中提供的SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的多核苷酸序列编码的PCV-2ORF2蛋白相比赋予至少70％，优选80％，更优选90％或更多的保护性免疫力时，仍保留经修饰抗原的抗原特征。其它优选PCV-2ORF2抗原为下文描述者：

i)包含WO06/07065的SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11序列的多肽；

ii)与i)的多肽有至少80％同源性及/或同一性的任何多肽；

iii)i)及/或ii)的多肽的任何免疫原性部分；

iv)iii)的免疫原性部分，包含至少5个，优选8个，更优选10个于WO06/072065的SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11序列任一中的邻接氨基酸；

v)由包含WO06/072065的SEQIDNO：3或SEQIDNO：4序列的DNA编码的多肽；

vi)由与v)的多核苷酸有至少80％同源性及/或同一性的多核苷酸编码的任何多肽；

vii)由v)及/或vi)的多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分；

viii)vii)的免疫原性部分，其中编码该免疫原性部分的多核苷酸包含至少30个包括于WO06/072065的SEQIDNO：3或SEQIDNO：4序列中的邻接核苷酸。

上述任一免疫原性部分优选具有由WO06/07065的SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的序列编码的PCV-2ORF2抗原的抗原特征。

如此项技术中已知，“序列同一性”系指两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列(亦即参考序列与有待与参考序列比较的指定序列)之间的关系。序列同一性系藉由在指定序列与参考序列经最佳比对以产生最高序列相似度后，将其比较而测定，如由此等序列串之间的匹配度所测定。在此比对后，逐个位置测定序列同一性，例如，若在一特定位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则该等序列在彼位置处“相同”。随后，此等位置同一性的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数得到序列同一性百分比。举例而言，核苷酸序列与参考核苷酸序列的“序列同一性”为至少(例如)85％，优选90％，甚至更优选95％的多核苷酸意谓除参考核苷酸序列的每100个核苷酸，指定多核苷酸序列可能包括至多15个，优选至多10个，甚至更优选至多5个点突变外，指定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言的，在核苷酸序列相对于参考核苷酸序列具有至少85％，优选90％，甚至更优选95％的同一性的多核苷酸中，参考序列中至多15％，优选10％，甚至更优选5％的核苷酸可删除或经另一核苷酸替代，或可将参考序列中数目为至多15％，优选10％，甚至更优选5％核苷酸总数的核苷酸插入参考序列中。参考序列的此等突变可发生在参考核苷酸序列的5′末端位置或3′末端位置处或彼等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列中的核苷酸间或参考序列内的一或多个邻接组中。类似地，指定氨基酸序列具有与参考氨基酸序列的至少(例如)85％，优选90％，甚至更优选95％序列同一性的多肽意谓除参考氨基酸序列的每100个氨基酸，指定多肽序列可能包括至多15个，优选至多10个，甚至更优选至多5个氨基酸改变外，该多肽的指定氨基酸序列与参考序列相同。换言的，为获得具有与参考氨基酸序列的至少85％，优选90％，甚至更优选95％序列同一性的指定多肽序列，参考序列中至多15％，优选至多10％，甚至更优选至多5％的氨基酸残基可删除或经另一氨基酸替代，或可将参考序列中数目为至多15％，优选至多10％，甚至更优选至多5％氨基酸残基总数的氨基酸插入参考序列中。参考序列的此等改变可发生于参考氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位置处或彼等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列的残基间或参考序列内的一或多个邻接组中。优选地，不相同的残基位置的不同的处为保守性氨基酸替代。然而，测定序列同一性时不包括保守替代作为匹配。

出于本发明的本方面的目的，“活”病毒或细菌系指能够在宿主中复制的病毒或细菌。本发明的本方面的优选活病毒及优选活细菌分别为PRRS病毒及猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumonia)细菌。然而，术语活病毒或活细菌分别不限于PRRS病毒及猪肺炎支原体。

可藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体(参见第二流体的定义)。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换该部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分该第一液体，且其中该第二液体不同于该第一液体。优选地，以该第二液体交换部分该第一液体的操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)藉由以第二液体交换至少一部分第一液体自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

可使用过滤器藉由过滤步骤自PCV-2抗原移除部分第一液体。然而，可使用熟习此项技术者已知的任何其它方法自PCV-2抗原移除部分任何流体，包括第一流体及(当适用时)一部分第二流体。举例而言，该方法包括(但不限于)离心及/或层析。然而，过滤最优选。移除该部分第一流体或(当适用时)任何其它流体的优选过滤方法包含超滤及/或透滤。超滤及透滤为熟习此项技术者已知的标准方法，例如在以下文献中有详细描述：ProteinPurificationMethods-APracticalApproach-编者：E.L.V.Harris及S.Angel，OxfordUniversityPress1995(其内容及教示以引用的方式并入本文中)。详言的，在彼教科书的第3章中，描述若干方法及设备类型，一般技术者可出于本发明的本方面的目的以例示性方式使用所有该等方法及设备。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由过滤(优选藉由透滤或超滤)自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选地，藉由以第二液体交换至少一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分该第一液体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

如上所定义，欲用于所述任一方法中的优选第二液体为缓冲液，优选为生理学上可接受的缓冲液且以盐水尤佳。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)藉由用缓冲液，优选生理学上可接受的缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)交换自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。优选地，藉由过滤，优选藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除该部分第一液体。更优选地，以缓冲液，优选生理学上可接受的缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)交换至少一部分第一液体的操作包含以下步骤：a)将该缓冲液，优选该生理学上可接受的缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)优选藉由过滤，甚至更优选藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除一部分该第一液体及该流体来浓缩PCV-2抗原，该流体为缓冲液，优选生理学上可接受的缓冲液，诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等。

如本文所述的方法的浓缩步骤及液体添加步骤可实质上同时执行，或者该浓缩步骤与该液体添加步骤依次执行。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)藉由以第二液体交换一部分第一液体自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中实质上同时或依次执行液体添加步骤。优选地，藉由过滤，优选藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除该部分第一液体且在添加第二液体的情况下移除第一流体与第二流体的混合物。

当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。举例而言，在另一方面中，在该浓缩步骤之前进行该液体添加步骤且在一替代方面中，在该液体添加步骤之前进行该浓缩步骤。可多次执行该液体添加步骤及该浓缩步骤，不管执行该等步骤的顺序如何。举例而言，此等各别步骤的每一者可执行至少两次，至少三次，至少四次，至少五次，至少十次，直至所需的多次。在一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少两次。在另一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少三次。因此，根据本发明的本方面的另一方面，提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其中该方法一般包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)藉由以第二液体交换至少一部分该第一液体自该PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中多次执行该交换操作。优选地，以一部分第二流体交换部分第一流体的操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。优选地，两次，最优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。如上所述，过滤为自PCV-2抗原移除一部分该第一液体或在如上所述多个移除步骤的情况下，移除一部分第一与第二流体的混合物的优选方法。

过滤器可为此项技术中的任何常规过滤器。优选地，该过滤器包括半透膜。在另一优选形式中，该半透膜具有小于PCV-2抗原的平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且由过滤器截留PCV-2抗原。在另一方面中，该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质通过的平均孔径，更优选地，该过滤器具有防止至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质通过的平均孔径，且最优选地，该过滤器具有防止至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过的平均孔径。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。在另一方面中，该半透膜包括选自由聚砜、聚醚砜及再生纤维素组成的群的材料。然而，可使用能够自PCV-2抗原移除一部分第一流体且在多个方法步骤的情况下移除第一与第二流体的混合物的任何其它材料。该过滤器可选自由中空纤维膜超滤筒、平板或过滤盒(cassette)组成的群，以中空纤维膜超滤筒尤佳。因此，根据本发明的本方面的另一方面，如上所述提供制备PCV-2抗原性组合物的方法。该方法一般包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)藉由过滤步骤自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该过滤器优选为半透膜或包含半透膜。优选地，该半透膜具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。优选地，半透膜的平均孔径防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质通过，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质通过，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。如上所述，移除步骤一般包括以一部分第二流体交换部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。优选两次，最优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。

执行本文中所提供的方法的浓缩步骤，以便使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩3倍至50倍。更优选地，进行该浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩4倍至20倍。最优选地，进行浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩7倍至10倍。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中自PCV-2抗原移除部分该第一液体，且其中该PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩了3倍至50倍，优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩3倍至50倍，优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。优选地，半透膜的平均孔径防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

在另一方面中，藉由本文的方法制备的PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该液体相比降低至少10％。更优选地，PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该第一液体相比降低至少50％。更优选地，PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该第一液体相比降低至少70％。

出于本发明的本方面的目的，术语“杀病毒活性”意谓当流体、溶液或组合物与活病毒或活细菌混合时，该流体、溶液或组合物在某种程度上灭活或杀灭该活病毒或活细菌。因此，流体、溶液或组合物的杀病毒活性降低至少10％意谓活病毒或活细菌在经历本文所述的任一方法的流体、溶液或组合物中的存活率比在未经历本文所述的任一方法的流体、溶液或组合物中的存活率高90％。根据本发明的本方面，PRRS病毒(优选具有ATCC寄存编号VR2332的PRRS病毒)为用于测定杀病毒活性的参考病毒。为测定对于细菌的杀病毒活性，建议使用猪肺炎支原体细菌，优选猪肺炎支原体的J株。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性(优选对于PRRS病毒)与第一液体的杀病毒活性相比降低至少10％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％。优选地，藉由以第二液体交换一部分具有杀病毒活性的第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

在另一方面中，该方法进一步包含收获在自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后所获得的PCV-2抗原的步骤。

如本文中所用，“收获(harvesting/harvest)”系指收集或回收PCV-2抗原。当制备为本发明的本方面的方法及组合物使用的抗原时，或当PCV-2抗原经历本文所述的方法时，可使用此项技术中已知的任何常规方法来回收PCV-2抗原。在一尤佳收获方式中，经由过滤步骤自该PCV-2抗原移除部分该第一液体且自过滤器阻滞物回收或收获PCV-2抗原。在一更优选形式中，自具有本文所述的孔径的半透膜的阻滞物收获或收集或回收PCV-2抗原。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中收获在该步骤ii)之后获得的PCV-2抗原。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

将在经历本文所提供的方法之后(优选在自过滤器阻滞物收获之后)剩余的PCV-2抗原与选自由医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的另一组份混合。优选地，该另一组份为佐剂，甚至更优选其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且更优选其中该佐剂为卡波姆(Carbomer)(合成的高分子量的丙烯酸聚合物的通称)。

如本文中所用的“医药学上可接受的载剂”及“兽医学上可接受的载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等等。

如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)的皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。该乳液可尤其基于轻液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(尤其异丁烯或癸烯)的低聚合产生的油；含有直链烃基/烷基的酸或醇的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子表面活性剂，尤其为视情况经乙氧基化的山梨聚糖酯、Mannide(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羟基硬脂酸酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其为Pluronic产物，特别为L121)。参见Hunter等人，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull，D.E.S.编)。JohnWileyandSons，NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine15：564-570(1997)。举例而言，可使用由M.Powell及M.Newman所编的“VaccineDesign，TheSubunitandAdjuvantApproach”，PlenumPress，1995的第147页所述的SPT乳液及同一本书中第183页所述的乳液MF59。其他合适的佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其他方式)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰基二肽等。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，包括共聚物EMA(Monsanto)，其为马来酸酐与乙烯的共聚物。此等聚合物在水中溶解产生酸性溶液，将其中和，优选中和至生理pH值以产生佐剂溶液，将向该佐剂溶液中并入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身。

佐剂的另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物为尤其与糖类或多元醇类的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。此等化合物以术语卡波姆来指称(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基，优选不超过8个羟基的多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子经具有至少2个碳原子的不饱和脂族根置换。优选根为彼等含有2至4个碳原子的根，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和根。该等不饱和基团本身可含有诸如甲基的其它取代基。以名称卡波莫(Carbopol)出售的产品(BFGoodrich，Ohio，USA)特别适合。它们是与聚烯基醚或联乙烯基二醇交联或与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联的丙烯酸聚合物。其中，可提及卡波莫974P、934P及971P。最优选使用卡波莫971P。

优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约500μg至约5mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的量添加佐剂。最优选地，以每剂量约1mg的量添加佐剂。

“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂包括清蛋白及乙二胺四乙酸的碱盐等。

如本文中所用的“防腐剂”系指抗微生物活性剂，诸如例如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)等等。详言的，添加防腐剂对于制备多剂量组合物而言最优选。以有效防止相关组合物受任何微生物污染或抑制相关组合物内的任何微生物生长的浓度添加彼等抗微生物活性剂。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，进一步包含以下步骤：将在步骤ii)之后剩余的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。优选地，其中该另一组份为佐剂，甚至更优选其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且更优选其中该佐剂为卡波姆。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

上述方法中所用的PCV-2抗原可为本文中所定义的任何PCV-2抗原。PCV-2抗原优选包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选包含PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选包含ORF-2蛋白的病毒样粒子，且甚至更优选包含INGELVACCIRCOFLEX中所包括的抗原。因此，根据本申请案的另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。

优选地，执行液体添加步骤及浓缩步骤多次，优选两次，甚至更优选三次。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原，且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备PCV-2抗原呈全病毒或病毒样粒子时，此孔径优选。

所用含有PCV-2抗原的第一液体可由此项技术中已知的任何方法获得。优选地，含有PCV-2抗原的该第一液体以及PCV-2抗原可由国际专利申请案WO2006/072065(其内容及教示以引用的方式并入本文中)中所述的任何方法获得。特别地，当PCV-2抗原于宿主细胞中于活体外重组表达时，PCV-2抗原可经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体，优选重组杆状病毒的病毒载体获得。

用于表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的载体及制造及/或使用该等载体(或重组体)的方法可藉由或类似于以下所揭示的方法实现：美国专利第4,603,112号；第4,769,330号；第5,174,993号；第5,505,941号；第5,338,683号；第5,494,807号；第4,722,848号；第5,942,235号；第5,364,773号；第5,762,938号；第5,770,212号；第5,942,235号；第382,425号；PCT公开案WO94/16716；WO96/39491；WO95/30018；Paoletti，“Applicationsofpoxvirusvectorstovaccination：Anupdate”，PNASUSA93：11349-11353，1996年10月；Moss，“Geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression，vaccination，andsafety”，PNASUSA93：11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编者)，MethodsinMolecularBiology39，“BaculovirusExpressionProtocols”(1995，HumanaPressInc.)；Smith等人，“ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCellsInfectedwithaBaculovirusExpressionVector”，MolecularandCellularBiology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“StrongandRegulatedExpressionofEscherichiacoliB-GalactosidaseinInfectCellswithaBaculovirusvector”，MolecularandCellularBiology，1984年3月，第4卷，第3期，第399-406页；EPA0370573；1986年10月16日申请的美国申请案第920,197号；EP专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman，“Thefunctionofherpessimplexvirusgenes：Aprimerforgeneticengineeringofnovelvectors”，PNASUSA93：11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“Theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplexvirusestothetreatmentofexperimentalbraintumors”，PNASUSA93：11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-BarrvirusvectorsforgenedeliverytoBlymphocytes”，PNASUSA93：11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-basedexpressionvectors：Strategiesandapplications”，PNASUSA93：11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利第5,591,439号；第5,552,143号；WO98/00166；已核准的美国申请案流水第08/675,556号及第08/675,566号，均申请于1996年7月3日(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，“Adenovirusascloningvectors”，SeminarsinVirology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页，Graham，Tibtech8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70，42434；PCTWO91/11525；Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259：1745-49，1993及McClements等人，“ImmunizationwithDNAvaccinesencodingglycoproteinDorglycoproteinB，aloneorincombination，inducesprotectiveimmunityinanimalmodelsofherpessimplexvirus-2disease”，PNASUSA93：11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号；第5,589,466号及第5,580,859号；以及WO90/11092；WO93/19183；WO94/21797；WO95/11307；WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，AnalyticalBiochemistry，涉及DNA表达载体，等等。亦参见WO98/33510；Ju等人，Diabetologia，41：736-739，1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)，WO90/01543；Robinson等人，seminarsinImmunology，第9卷，第271-283页(1997)，(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第____________号(将DNA插入活细胞中的的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的用途)；及美国专利第5,928,913号(用于基因投递的载体)以及本文中所引用的其它文献。PCV-2ORF2抗原在昆虫细胞中的表达描述于例如WO06/072065中。本发明的本方面的纯化PCV-2ORF2抗原可藉由此项技术中已知的若干方法获得。优选方法为本文所述的彼等方法。PCV-2ORF2抗原可藉由包含以下步骤的方法活体外重组制得：i)允许用含有PCV-2ORF2编码序列的重组病毒载体感染于培养物中的易感细胞，其中由重组病毒载体表达PCV-2ORF2蛋白，及ii)此后自细胞培养物回收PCV-2ORF2抗原。藉由收获表达PCV-2ORF2抗原的全(亦即完整)SF+细胞来回收PCV-2ORF2抗原。

因此，根据本申请案的另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。当使用含有及表达该PCV-2抗原的病毒载体(尤其重组杆状病毒)制备/获得PCV-2抗原时，上述方法进一步包含优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)的步骤。优选在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更优选在收获PCV-2抗原之后执行灭活步骤。甚至更优选地，在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除部分第一液体之后执行灭活步骤。当藉由包含以下步骤的方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍，在该浓缩之后进行灭活步骤。当多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活步骤。当使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在优选使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

出于本发明的本方面的目的，“DNA灭活剂”系指灭活DNA(优选病原体的DNA)使得病原体不能引起主动感染或具有传染性或复制但仍能诱导受试者的免疫反应的任何化学试剂。DNA灭活剂优选为福尔马林(formalin)。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，其中该方法进一步包含优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)的步骤，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更优选在收获PCV-2抗原之后执行灭活步骤。甚至更优选在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除部分第一液体之后执行灭活步骤。当藉由包含以下步骤的方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，甚至更优选7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活步骤。当多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活步骤。当使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在优选使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

在本发明的本方面方法中使用DNA灭活剂的情况下，该方法进一步包含添加一定量的中和该DNA灭活剂的试剂的步骤，该量等于该DNA灭活剂的量，其中中和DNA灭活剂的试剂包含浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠且其中该DNA灭活剂为BEI。优选地，在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后执行该灭活步骤。

如本文中所用“中和灭活剂的试剂”或“中和剂”系指能中和上列灭活剂使得灭活剂不能灭活DNA的任何试剂。中和灭活剂的试剂优选为硫代硫酸钠。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂优选包含BEI。优选在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更优选在收获PCV-2抗原之后执行灭活及中和步骤。甚至更优选在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体之后执行灭活及中和步骤。当藉由包含以下步骤的方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活及中和步骤。当多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活及中和步骤。当使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在优选使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活及中和步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

在本发明的本方面的另一方面中，上述方法进一步包含将在该灭活及中和步骤之后获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合的步骤：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量优选等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂优选包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。优选该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选在步骤ii)中，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

根据另一方面，获得具有降低杀病毒活性的PCV-2抗原的上述任何方法可包括进一步纯化步骤以获得纯化PCV-2抗原。意外地发现包含纯化PCV-2抗原(优选与佐剂组合)的抗原性或免疫原性组合物不仅展示如本文所述的降低杀病毒活性，而且展示与不包含纯化PCV-2抗原(意谓其包含非纯化或粗PCV-2抗原)的免疫原性组合物相比，提高的免疫原性。

术语“纯化PCV-2抗原”意谓PCV-2抗原在制剂中纯化至以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过50％(w/w)，优选超过60％(w/w)，优选超过70％(w/w)，优选超过80％(w/w)，优选超过85％(w/w)，更优选超过90％(w/w)，甚至更优选超过95％(w/w)的程度。换言的，若制剂包含具有80％(w/w)纯度等级的PCV-2抗原，则该制剂包含以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计不超过20％(w/w)的非PCV-2蛋白。优选地，在制剂中，亦即在与佐剂或任何其它赋形剂或灭活剂混合之前的免疫原性组合物中测量纯度等级。然而，若用于最终免疫原性组合物中的佐剂为非蛋白基佐剂，则添加佐剂对纯度值无任何影响。可藉由熟习此项技术者已知的标准方法评估PCV-2抗原的纯度等级，例如藉由在SDS-PAGE分离之后的ImperialProteinStain(Pierce)、气相层析、HPLC分析等。评估制剂(亦即免疫原性组合物)中的PCV-2抗原的纯度或纯度等级的本发明的本方面的优选方法为ImperialProteinStain(Pierce)染色，其如下进行：使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)分离包含PCV-2抗原的制剂。在变性(所有缓冲液中均含有SDS)及还原条件(载入缓冲液含有2-巯基乙醇)下跑胶。在将样品载入凝胶之后，在200伏特恒定电压下跑胶55分钟。在跑胶完成之后，使用ImperialProteinStain(Pierce)根据制造商说明书对凝胶进行染色且脱色。

相比而言，术语“非纯化”或“粗”PCV-2抗原系指包含PCV-2抗原的粗制剂。通常在细胞培养物中活体外制备PCV-2抗原。因此，粗PCV-2抗原系指PCV-2抗原与用于制备PCV-2抗原的细胞培养物或细胞培养材料的混合物。此外，非纯化PCV-2抗原亦意谓部分纯化的PCV-2抗原，其优选具有以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计小于50％(w/w)，更优选小于40％(w/w)，甚至更优选小于30％(w/w)，甚至更优选小于20％(w/w)的纯度等级。

此外，如本文中所用术语“提高免疫原性或改良免疫原性”意谓与包含不同抗原或不同纯度等级的抗原的参考免疫原性组合物相比，由包含相关抗原的免疫原性组合物所引起的免疫反应增强，不管此免疫反应为细胞介导及/或抗体介导的免疫反应。根据一优选实施方案，术语提高免疫原性或改良免疫原性意谓与包含不同抗原或不同纯度等级的抗原的参考免疫原性组合物相比，由包含相关抗原的免疫原性组合物所引发的抗体介导的免疫反应增强。就此而言，抗体介导的免疫反应意谓与由包含不同抗原或不同纯度等级的抗原的参考免疫原性组合物引发的抗体产生相比，对相关抗原有特异性的抗体产生增加。

术语“增强”意谓与由包含不同抗原或不同纯度等级的抗原的参考免疫原性组合物所引发的细胞及/或抗体介导的免疫反应相比，细胞及/或抗体介导的免疫反应增强至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少100％。

熟习此项技术者一般知晓如何测量细胞及/或抗体介导的免疫反应。详言的，熟习此项技术者很清楚要比较相关免疫原性组合物的细胞介导的免疫反应与参考组合物的细胞介导的免疫反应，或比较相关免疫原性组合物的抗体介导的免疫反应与参考组合物的抗体介导的免疫反应，而不比较相关免疫原性组合物的细胞介导的免疫反应与参考组合物的抗体介导的免疫反应或相关免疫原性组合物的抗体介导的免疫反应与参考组合物的细胞介导的免疫反应。此外，可例如藉由测量相关免疫原性组合物/抗原对细胞毒性T细胞的活化来测量细胞介导的免疫反应。可例如藉由测量由于向动物施用包含该抗原的免疫原性组合物而产生的抗原特异性抗体的量来测量抗体介导的免疫反应。可例如藉由使用小鼠模型来测量细胞及/或抗体介导的免疫反应。根据本发明的本方面，小鼠模型用作参考方法。

术语“免疫原性组合物”意谓(但不限于)包含至少一种在宿主中引发针对相关抗原的细胞及/或抗体介导的免疫反应的抗原的物质组合物。通常，“免疫反应”包括(但不限于)一或多种以下效应：产生或活化特异性针对在相关组合物或疫苗中所包括的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞及/或细胞毒性T细胞及/或γ-δT细胞。宿主优选将展现治疗或保护性免疫反应以便增强对新感染的抵抗力及/或降低疾病的临床严重性。在该情况下，免疫原性组合物为“疫苗”。该种保护将由通常受感染宿主所呈现的症状减轻或缺失、受感染宿主的恢复时间缩短及/或病毒滴度降低来证明。

可藉由层析程序(优选两步层析程序)实现PCV-2抗原的进一步纯化。若PCV-2抗原装配至病毒样粒子(VLP)中，则一步(优选第一步骤)优选为大小排阻(凝胶过滤)层析，其可例如藉由使用SephacrylS300基质进行。在实验室规模下，最优选使用HiPrep26/60SephacrylS300HR管柱。然而，可使用熟习此项技术者已知的任何其它大小排阻层析基质，其能够自培养滤液或上清液中分离出PCV-2ORF2VLP。合适的基质描述于例如E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Proteinpurificationmethods-apracticalapproach，IRLPressOxford1995)中。可例如藉由以1.0mL/min的流动速率用包含PCV-2抗原的粗制剂装载管柱且以1.5个管柱体积的包含20mMTris(pH6.5)、5mMDTT的缓冲液洗脱管柱来进行凝胶过滤层析。然而，亦可藉由使用亲和性层析，例如，经由选择性结合至已固定PCV-2ORF2特异性抗体或熟习此项技术者已知的任何其它方法纯化PCV-2ORF2抗原。

因此，根据一优选实施方案，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由层析程序纯化包含PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2)的步骤ii)收获物。优选如本文所述，优选如实施例3中所述执行大小排阻层析。优选地，大小排阻产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，优选超过90％(w/w)纯度等级的免疫原性组合物。可在使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDSPAGE之后，藉由ImperialProteinStain(Pierce)染色来评估纯度等级。

因此，根据一优选实施方案，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)纯化包含PCV-2抗原的步骤ii)收获物。

为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一层析步骤的第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。优选地，若纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，优选阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的优选阴离子交换层析基质为QSepharose。在约50ml的小规模中，最优选使用5mlHiTrapQSepharoseHP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言的，可将来自大小排阻层析步骤的约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min的流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mMTris(pH6.5)、5mMDTT移除未结合材料的洗涤步骤之后，可以8个管柱体积的下列缓冲液(20mMTris(pH6.5)、5mMDTT、1.0MNaCl)的单一步骤来洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱的流过物装载回QSepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继的以阴离子交换层析)将PCV-2ORF2抗原与培养收获物的大部分其它蛋白组份有效地分离。

因此，根据一优选实施方案，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由两步层析纯化包含PCV-2抗原的步骤ii)收获物。第一层析步骤优选不同于第二步骤。若第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，优选阴离子交换层析(AIEX)。优选地，在包括一或多个进一步纯化步骤以获得纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2蛋白)的上述任何方法中，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。在优选形式中，上述制备PCV-2抗原性组合物的方法进一步包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂优选包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。进一步纯化(优选包括预过滤步骤的两步纯化策略)产生具有以在与任何佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，优选超过85％(w/w)，甚至更优选超过90％(w/w)，最优选超过95％(w/w)的纯度等级的免疫原性组合物。

当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，藉由本文所述的方法制备的PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID50活病毒或小于1logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，藉由本文所述的方法制备的PCV-2抗原性组合物更优选造成小于0.9logTCID50/毫升活病毒或小于0.9logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，藉由本文所述的方法制备的PCV-2抗原性组合物甚至更优选造成小于0.7logTCID50/毫升活病毒或小于0.7logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，藉由本文所述的方法按步骤制备的PCV-2抗原性组合物更优选造成小于0.5logTCID50/毫升活病毒或小于0.5logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，藉由本文所述的方法制备的PCV-2抗原性组合物甚至更优选造成小于0.3logTCID50/毫升活病毒或小于0.3logCFU/毫升活细菌的损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒优选为PRRS病毒，优选具有ATCC寄存编号VR2332的PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但优选为猪肺炎支原体细菌，优选猪肺炎支原体的J株。可藉由能够评估活病毒的量的标准活体外滴定检定评估TCID50/毫升。亦可藉由能够评估活细菌的量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”优选系指1毫升流体。该纯化PCV-2抗原不仅显示如本文所定义的降低杀病毒活性，而且亦显示与如本文所定义的非纯化PCV-2抗原相比提高的免疫原性，优选该纯化PCV-2抗原使细胞及/或抗体介导的免疫反应与由包含非纯化PCV-2抗原的参考免疫原性组合物引发的细胞及/或抗体介导的免疫反应相比增强至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少100％。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中当活病毒(优选PRRSV)或活细菌(优选猪肺炎支原体)与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，最优选2年以上时，在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID50(优选/毫升)，优选小于0.9logTCID50(优选/毫升)，甚至更优选小于0.7logTCID50(优选/毫升)，甚至更优选小于0.5logTCID50(优选/毫升)，最优选小于0.3logTCID50(优选/毫升)活病毒(优选活PRRSV)或小于1logCFU(优选/毫升)，优选小于0.9logCFU(优选/毫升)，甚至更优选小于0.7logCFU(优选/毫升)，甚至更优选小于0.5logCFU(优选/毫升)，最优选小于0.3logCFU(优选/毫升)活细菌(优选猪肺炎支原体)的损失。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。当该PCV-2抗原经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得时，该方法进一步包含iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂优选包含BEI。优选在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更优选在收获PCV-2抗原之后执行灭活及中和步骤。甚至更优选在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体之后执行灭活及中和步骤。当藉由包含以下步骤的方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，甚至更优选7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活及中和步骤。当多次，优选两次且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活及中和步骤。当使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在优选使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活及中和步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。优选地，获得如本文所定义的纯化PCV-2抗原的进一步纯化可藉由执行包含以下步骤的进一步纯化步骤来实现：iii)藉由层析步骤纯化在移除一部分第一液体之后获得的包含PCV-2抗原的步骤ii)收获物。为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤的第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。优选地，若纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，优选阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的优选阴离子交换层析基质为QSepharose。在约50ml的小规模中，最优选使用5mlHiTrapQSepharoseHP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言的，可将来自大小排阻层析步骤的约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min的流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mMTris(pH6.5)、5mMDTT移除未结合材料的洗涤步骤之后，可以8个管柱体积的下列缓冲液(20mMTris(pH6.5)、5mMDTT、1.0MNaCl)的单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱的流过物装载回QSepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继的以阴离子交换层析)将PCV-2ORF2抗原与培养收获物的大部分其它蛋白组份有效地分离。

根据上述方法获得的PCV-2抗原性组合物或上述方法的步骤i)中所用的PCV-2抗原可与至少一种另外抗原(优选病毒或细菌抗原，且甚至更优选来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原)组合。另外抗原可为国际专利申请案WO2007/094893(其内容及教示以引用的方式并入本文中)中所揭示的任何彼等抗原。简言的，该另外抗原可为猪的任何其它致病有机体的抗原。猪的“另一致病有机体”优选选自由以下组成的群：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)(1)；腺病毒(2)；α病毒，诸如东方马脑脊髓炎病毒(3)；支气管败血性博德氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)(4)；短螺旋体属(Brachyspiraspp.)(5)，优选猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)(6)；结肠菌毛样短螺旋体(B.piosicoli)(7)；猪布氏杆菌(Brucellasuis)，优选生物变种1、2及3(8)；经典猪瘟病毒(9)；芽胞梭菌属(Clostridiumspp.)(10)，优选难养芽胞梭菌(Cl.difficile)(11)，A型、B型及C型产气荚膜芽胞梭菌(Cl.perfringens)(12)，诺维氏芽胞梭菌(Cl.Novyi)(13)；败血芽胞梭菌(Cl.septicum)(14)，破伤风梭菌(Cl.tetani)(15)；冠状病毒(16)，优选猪呼吸道冠状病毒(17)或猪流行性腹泻病毒(18)；猪附红血球体(Eperythrozoonosissuis)(19)；猪丹毒杆菌(Erysipelothrixrhsiopathiae)(20)；大肠杆菌(Escherichiacoli)(21)；猪副嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)，优选亚型1、7及14(22)；血球凝集性脑脊髓炎(Hemagglutinatingencephalomyelitis)病毒(23)；日本脑炎病毒(24)；胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)(25)；钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)(26)，优选澳洲钩端螺旋体(Leptospiraaustralis)(27)；犬钩端螺旋体(Leptospiracanicola)(28)；感冒伤寒性钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)(29)；出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae)(30)；及问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)(31)；波莫那钩端螺旋体(Leptospirapomona)(32)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospiratarassovi)(33)；分枝杆菌属(Mycobacteriumspp.)(34)，优选鸟分枝杆菌(M.avium)(35)，细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(36)及牛分枝杆菌(M.bovis)(37)；猪肺炎支原体(38)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)(39)；猪细胞巨大病毒(40)；猪小病毒(41)；猪生殖及呼吸综合征病毒(42)；假性狂犬病病毒(43)；轮状病毒(44)；沙门杆菌属(Salmonellaspp.)(45)，优选鼠伤寒沙门杆菌(S.thyhimurium)(46)及猪霍乱沙门杆菌(S.choleraesuis)(47)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)(48)；葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)(49)；优选，链球菌属(Streptococcusspp.)(50)，优选猪链球菌(51)；猪疱疹病毒(52)；猪流感病毒(53)；猪痘病毒(54)；猪痘病毒(55)；水泡性口炎病毒(56)；猪水疱疹病毒(57)；哈德焦钩端螺旋体(LeptospiraHardjo)(58)；及/或猪关节滑膜支原体(59)。

因此，根据本发明的本方面的另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；及将该PCV-2抗原与至少一种另外抗原(优选病毒或细菌抗原，且更优选来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原)组合。优选该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在优选形式中，上述制备PCV-2抗原性组合物的方法进一步包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂优选包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

在该方法的另一方面中，该至少一种另外抗原为病毒抗原，优选来自猪生殖及呼吸综合征病毒的抗原。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原甚至更优选包含活病毒，且更优选经修饰的活病毒，甚至更优选经修饰的减毒活病毒。该经修饰的猪生殖及呼吸综合征活病毒抗原更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与来自猪生殖及呼吸综合征病毒的抗原组合。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原优选包含活病毒，更优选经修饰的活病毒，且甚至更优选经修饰的减毒活病毒。该经修饰的猪生殖及呼吸综合征活病毒抗原更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。该PCV-2抗原优选包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在本申请案的另一方面中，该至少一种另外抗原为细菌抗原，优选为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与细菌抗原(优选猪肺炎支原体)组合。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。该PCV-2抗原优选包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在本申请案的另一方面中，该至少一种另外抗原包括病毒抗原，优选如上所述的猪生殖及呼吸综合征病毒抗原；及细菌抗原，优选如上所述的猪肺炎支原体抗原。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原优选包含活病毒，更优选经修饰的活病毒，且更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物的方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与病毒抗原(优选如上所述的猪生殖及呼吸综合征病毒抗原)及细菌抗原(优选如上所述的猪肺炎支原体抗原)组合。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原优选包含活病毒，更优选经修饰的活病毒，且更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。该PCV-2抗原优选包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩，优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，且甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行该液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

本发明的本方面不仅提供制备PCV-2抗原性组合物的方法，而且系关于PCV-2抗原性组合物。因此，根据另一方面，本专利申请案进一步提供一种PCV-2抗原性组合物，其特征在于当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID50/毫升活病毒或小于1logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物更优选造成小于0.9logTCID50/毫升活病毒或小于0.9logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物甚至更优选造成小于0.7logTCID50/毫升活病毒或小于0.7logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物更优选造成小于0.5logTCID50/毫升活病毒或小于0.5logCFU/毫升活细菌的损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物甚至更优选造成小于0.3logTCID50/毫升活病毒或小于0.3logCFU/毫升活细菌的损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒优选为PRRS病毒，优选具有ATCC寄存编号VR2332的PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但优选为猪肺炎支原体细菌，优选猪肺炎支原体的J株。可藉由活病毒的量的估计评估TCID50/毫升。亦可藉由能够评估活细菌的量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”优选系指1毫升流体。

在另一方面中，上述PCV-2抗原性组合物包含选自由以下组成的群的另一组份：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份优选为佐剂，甚至更优选其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且更优选其中该佐剂为卡波姆。优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。甚至更优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约500μg至约5mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的量添加佐剂。最优选以每剂量约1mg的量添加佐剂。

本发明的本方面不仅提供制备PCV-2抗原性组合物的方法及/或如上文所定义的PCV-2抗原性组合物，其亦系关于可藉由本文所述的任何方法获得的PCV-2抗原性组合物。因此，在另一方面中，本发明的本方面系关于藉由包含以下步骤的方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。该PCV-2抗原优选用作PCV-2抗原性组合物或用于该PCV-2抗原性组合物中。术语“藉由本文所提供的方法获得的PCV-2抗原性组合物”亦意谓该PCV-2抗原性组合物可藉由本文中所提供的方法获得。根据另一方面，本发明的本方面亦系关于藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体获得的PCV-2抗原性组合物，其中该第二液体不同于该第一液体。因此，根据另一方面，本申请案系关于藉由包含以下步骤的方法获得的PCV-2抗原性组合物，i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体。优选地，以该第二液体交换部分该第一液体的操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

根据另一方面，优选藉由以下方法获得PCV-2抗原性组合物：其中使用过滤器藉由过滤步骤自PCV-2抗原移除部分该第一液体。然而，可使用熟习此项技术者已知的任何其它方法(例如，离心及/或层析)自PCV-2抗原移除部分第一及第二流体。然而，最优选为过滤。移除该部分第一流体的优选过滤方法包含超滤及/或透滤。如本文所述的方法的浓缩步骤及液体添加步骤可实质上同时或另外执行，依次执行该浓缩步骤与该液体添加步骤。因此，根据另一方面，本发明的本方面系关于藉由包含以下步骤的方法获得的PCV-2抗原性组合物，i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除部分该第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体。优选地，以该第二液体交换部分该第一液体的操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中实质上同时或依次执行液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。举例而言，在另一方面中，该液体添加步骤在该浓缩步骤之前进行且在一替代方面中，该浓缩步骤在该液体添加步骤之前进行。

在另一方面中，本发明的本方面系关于可使用本文所述的方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中可多次执行该液体添加步骤及该浓缩步骤，不管执行该等步骤的顺序如何。举例而言，此等各别步骤的每一者可执行至少两次，至少三次，至少四次，至少五次，至少十次，直至所需的多次。在一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少两次。在另一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少三次。

在本发明的本方面的另一方面中，如上所述获得本发明的PCV-2抗原性组合物，其中过滤为自PCV-2抗原移除一部分该第一液体或在如上所述多个移除步骤的情况下，移除一部分第一流体与第二流体的混合物的优选方法。过滤器可为此项技术中的任何常规过滤器。该过滤器优选包括半透膜。在另一优选形式中，该半透膜具有小于PCV-2抗原的平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且由过滤器截留PCV-2抗原。在另一方面中，该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质通过的平均孔径，更优选地，该过滤器具有防止至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质通过的平均孔径，且最优选地，该过滤器具有防止至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过的平均孔径。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。在另一方面中，该半透膜包括选自由聚砜、聚醚砜及再生纤维素组成的群的材料。然而，可使用能够自PCV-2抗原移除一部分第一流体且在多个方法步骤的情况下移除第一流体与第二流体的混合物的任何其它材料。在另一方面中，该过滤器系选自由中空纤维膜超滤滤筒、平板或过滤片组成的群，以中空纤维膜超滤滤筒尤佳。

因此，根据另一方面，本发明的本方面系关于使用如上所述的方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中过滤器优选为半透膜或包含半透膜。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。半透膜的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。如上所述，移除步骤一般包括以一部分第二流体交换部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。优选地，两次，最优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。

执行本文所提供的获得PCV-2抗原性组合物的方法的浓缩步骤，以便使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩3倍至50倍。更优选地，进行该浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩4倍至20倍。最优选地，进行浓缩步骤以便使PCV-2抗原与第一液体的体积相比浓缩7倍至10倍。因此，根据另一方面，本发明的本方面系关于藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中与该第一液体的体积相比，该PCV-2抗原浓缩了3倍至50倍，优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩3倍至50倍，优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。液体添加步骤优选与浓缩步骤实质上同时或依次执行。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。半透膜的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

优选地，获得如本文中所定义的包含纯化PCV-2抗原的PCV-2抗原性组合物的进一步纯化可藉由执行包含以下步骤的进一步纯化步骤来实现：iii)藉由层析步骤纯化在移除一部分第一液体之后获得的包含PCV-2抗原的步骤ii)收获物(本文所述任何方法)。为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤的第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二纯化步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。优选地，若纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，优选阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的优选阴离子交换层析基质为QSepharose。在约50ml的小规模中，最优选使用5mlHiTrapQSepharoseHP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言的，可将来自大小排阻层析步骤的约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min的流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mMTris(pH6.5)、5mMDTT移除未结合材料的洗涤步骤之后，可以8个管柱体积的下列缓冲液(20mMTris(pH6.5)、5mMDTT、1.0MNaCl)的单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱的流过物装载回QSepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继的以阴离子交换层析)将PCV-2ORF2抗原与培养收获物的大部分其它蛋白组份有效地分离。

在另一方面中，由本文所述方法制备的PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该液体相比降低至少10％。更优选地，该PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该第一液体相比降低至少50％。更优选地，该PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性与未经历该方法的该第一液体相比降低至少70％。

因此，根据另一方面，本发明的本方面系关于藉由一种包含以下步骤的方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物的杀病毒活性(优选针对PRRS病毒)与第一液体的杀病毒活性相比降低至少10％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％。优选地，藉由以第二液体交换第一液体的一部分而自PCV-2抗原移除具有杀病毒活性的第一液体部分。优选以包含以下的步骤进行交换：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，甚至更优选7倍至10倍。如上所述，液体添加步骤优选与浓缩步骤实质上同时或依次执行。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备PCV-2抗原呈全病毒或病毒样粒子时，此孔径优选。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化的PCV-2抗原。

根据另一方面，本发明的本方面系关于藉由本文所述的方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中当活病毒(优选PRRSV)或活细菌(优选猪肺炎支原体)与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，优选4小时以上，甚至更优选12小时以上，甚至更优选24小时以上，甚至更优选2天以上，甚至更优选4天以上，甚至更优选7天以上，甚至更优选2周以上，甚至更优选4周以上，甚至更优选2个月以上，甚至更优选3个月以上，甚至更优选4个月以上，甚至更优选6个月以上，甚至更优选9个月以上，甚至更优选12个月以上，甚至更优选18个月以上，且最优选2年以上时，该PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID50(优选/毫升)，优选小于0.9logTCID50(优选/毫升)，甚至更优选小于0.7logTCID50(优选/毫升)，甚至更优选小于0.5logTCID50(优选/毫升)，最优选小于0.3logTCID50(优选/毫升)活病毒(优选活PRRSV)或小于1logCFU(优选/毫升)，优选小于0.9logCFU(优选/毫升)，甚至更优选小于0.7logCFU(优选/毫升)，甚至更优选小于0.5logCFU(优选/毫升)，最优选小于0.3logCFU(优选/毫升)活细菌(优选猪肺炎支原体)的损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒优选为PRRS病毒，优选具有ATCC寄存编号VR2332的PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但优选为猪肺炎支原体细菌，优选猪肺炎支原体的J-菌株。可藉由能够评估活病毒的量的标准活体外滴定检定评估TCID50/毫升。亦可藉由能够评估活细菌的量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”或“/毫升”优选系指1毫升流体。

在另一方面中，本发明的本方面系关于藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，上述方法进一步包含收获步骤ii)之后剩余的PCV-2抗原的步骤。可以任何常规方式进行此收获操作。在一尤佳收获方式中，经由过滤步骤自该PCV-2抗原移除部分该第一液体且自过滤器阻滞物回收或收获PCV-2抗原。

在另一方面中，将藉由本文所述的任何方法获得的PCV-2抗原性组合物与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份优选为佐剂，甚至更优选其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且更优选其中该佐剂为卡波姆。

因此，根据另一方面，本发明的本方面提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，该方法进一步包含以下步骤：将藉由本文所述的方法获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份优选为佐剂，甚至更优选其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且更优选其中该佐剂为卡波姆。优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。甚至更优选以每剂量约100μg至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约500μg至约5mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约750μg至约2.5mg的量添加佐剂。最优选以每剂量约1mg的量添加佐剂。

在另一方面中，上述PCV-2抗原性组合物包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。因此，根据本申请案的另一方面，本发明的本方面提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。

如上所述，本文所述的方法中使用的PCV-2抗原可藉由此项技术中已知的任何方法获得。优选地，PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得。在优选形式中，该PCV-2抗原系根据WO2006/072065(其教示及内容先前以引用的方式并入)中所述的程序获得。因此，根据本发明的本方面的另一方面，本申请案提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(优选PCV-2ORF-2)的病毒载体(优选重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。

在本发明的本方面的另一方面中，PCV-2抗原性组合物系藉由上述方法获得且该方法进一步包含优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该重组杆状病毒病毒载体的步骤。在优选形式中，该方法进一步包含添加一定量的中和该DNA灭活剂的试剂，该量等于该DNA灭活剂的量，其中中和DNA灭活剂的试剂包含浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中该DNA灭活剂为BEI。优选在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后执行该灭活步骤。

在本发明的本方面的另一方面中，PCV-2抗原性组合物系藉由上述方法获得，该方法进一步包含混合在灭活及中和步骤之后获得的PCV-2抗原的步骤。因此，根据另一方面，本发明的本方面提供藉由包含以下步骤的上述方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)优选在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量的中和该灭活剂的中和剂，该中和剂量等于灭活剂的量，其中中和剂优选包含优选浓缩至约1至约20mM的最终浓度的硫代硫酸钠溶液且其中灭活剂优选包含BEI；及(优选)步骤v)，包含将步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成的群的另一组份混合：医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

在本申请案的另一方面中，优选藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含至少一种另外抗原，优选病毒或细菌抗原，且更优选来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原。在另一方面中，该至少一种另外抗原为猪生殖及呼吸综合征病毒。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原甚至更优选包含活病毒，且更优选包含经修饰的活病毒。该经修饰的猪生殖及呼吸综合征活病毒抗原更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。在本申请案的另一方面中，该至少一种另外抗原为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。在本发明的本方面的另一方面中，优选藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含猪生殖及呼吸综合征病毒抗原，优选经修饰的猪生殖及呼吸综合征活病毒，更优选具有ATCC寄存编号VR2332的猪生殖及呼吸综合征病毒，或在INGELVACPRRSMLV或INGELVACPRRSATP中所包括的猪生殖及呼吸综合征病毒。在本发明的本方面的另一方面中，优选藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含猪肺炎支原体，优选猪肺炎支原体菌苗，且更优选INGELVACMYCOFLEX或INGELVACMYCOFLEX中所包括的猪肺炎支原体菌苗。在另一方面中，本文所述的PCV-2抗原性组合物包含猪生殖及呼吸综合征病毒，优选上述彼等任一者；及猪肺炎支原体，优选上述彼等任一者。

当包含至少一种来自如上所述猪中至少一种其它致病有机体的另外抗原(优选猪生殖及呼吸综合征病毒及/或猪肺炎支原体抗原)的PCV-2抗原性组合物藉由本文所述的方法获得时，该方法包含以下步骤：i)获得在第一液体中的PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；及将该PCV-2抗原与至少一种另外抗原，优选病毒或细菌抗原，且更优选来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原混合。优选该PCV-2抗原包含PCV-2的ORF-2蛋白，更优选PCV-2的重组ORF-2蛋白，且更优选ORF-2蛋白的病毒样粒子。优选地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。优选以包含以下步骤的方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原的该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体的体积相比浓缩优选3倍至50倍，甚至更优选4倍至20倍，且甚至更优选7倍至10倍。优选地，多次，优选两次，甚至更优选三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体的混合物。优选地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤的顺序无关紧要。此外，优选使用过滤器(其优选含有半透膜)，藉由过滤(优选藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜优选具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器的平均孔径优选防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白质，更优选至少90％大小为75kDa至400kDa的蛋白质，且最优选至少90％大小为100kDa至300kDa的蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子的PCV-2抗原时，此孔径优选。

如上文所定义的本发明的本方面提供制备PCV-2抗原及包含PCV-2抗原的免疫原性组合物的新方法，其中PCV-2抗原展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定义)，其中该方法包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原的第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。此外，本发明的本方面亦提供PCV-2抗原以及包含该PCV-2抗原的免疫原性组合物，该PCV-2抗原展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定义)。根据另一方面，PCV-2抗原以及包含展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性的纯化PCV-2抗原的免疫原性组合物可另外藉由下列方法(II)获得。本发明的本方面的纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)可藉由纯化PCV-2病毒制剂，尤其藉由纯化全病毒获得。全病毒制剂描述于例如WO99/18214或WO03/049703中。此外，纯化PCV-2抗原亦可藉由纯化重组表达的PCV-2抗原，优选藉由纯化重组PCV-2ORF2抗原获得。制备重组PCV-2抗原(优选制备重组PCV-2ORF2抗原)的表达系统在此项技术中熟知且包括(但不限于)细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞或哺乳动物表达系统。表达PCV-2抗原的载体及制造及/或使用该等载体(或重组体)的方法在本申请案中别处描述。

优选细胞为彼等易受含有PCV-2ORF2DNA且表达PCV-2ORF2蛋白的适当重组病毒载体感染的细胞。细胞优选为昆虫细胞，且其更优选包括以商标SF+昆虫细胞(ProteinSciencesCorporation，Meriden，CT)出售的昆虫细胞。优选细胞培养物具有介于约0.3-2.0×10⁶个细胞/毫升，更优选约0.35-1.9×10⁶个细胞/毫升，更优选约0.4-1.8×10⁶个细胞/毫升，甚至更优选约0.45-1.7×10⁶个细胞/毫升，且最优选约0.5-1.5×10⁶个细胞/毫升之间的细胞计数。

优选的病毒载体包括杆状病毒，诸如BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)，尤其只要该等生产细胞为昆虫细胞。虽然杆状病毒表达系统优选，但熟习此项技术者应了解其它表达系统(包括上述彼等)将用于本发明的本方面的目的，亦即用于表达PCV-2ORF2抗原。

适当生长培养基亦将由熟习此项技术者确定，优选的生长培养基为不含血清的昆虫细胞培养基，诸如Excell420(JRHBiosciences，Inc.，Lenexa，KS)等等。

含有PCV-2ORF2DNA序列的重组病毒载体当用于感染易感细胞时具有介于约0.03-1.5，更优选约0.05-1.3，更优选约0.09-1.1，且最优选约0.1-1.0之间的优选感染倍率(MOI)。上述MOI优选系指1毫升细胞培养流体。本文所述的方法优选包含以含有PCV-2ORF2DNA且表达PCV-2ORF2抗原蛋白的重组病毒载体感染0.35-1.9×10⁶个细胞/毫升，更优选约0.4-1.8×10⁶个细胞/毫升，甚至更优选约0.45-1.7×10⁶个细胞/毫升且最优选约0.5-1.5×10⁶个细胞/毫升，该重组病毒载体的MOI(感染倍率)介于约0.03-1.5，更优选约0.05-1.3，更优选约0.09-1.1，且最优选约0.1-1.0之间。

接着培育受感染细胞至多10天时间，更优选约2天至约10天，更优选约4天至约9天，且最优选约5天至约8天。优选培育条件包括约22-32℃，更优选约24-30℃，更优选约25-29℃，甚至更优选约26-28℃，且最优选约27℃的温度。优选地，在接种之后观察SF+细胞的特征性杆状病毒诱导的变化。该观察可包括监测感染后期间细胞密度趋势及生存率降低。发现在感染之后3-5天观察到病毒滴度峰值且在感染后5至8天及/或当细胞生存率降低至小于10％时细胞中PCV-2ORF2抗原产生达到峰值。

可藉由熟习此项技术者已知的标准方法，例如藉由Proteinpurificationmethods-apracticalapproach(E.L.V.Harris及S.Angal，编者，IRLPressatOxfordUniversityPress)中所述的彼等方法由收获物纯化PCV-2ORF2抗原。彼等方法包括(但不限于)藉由离心及/或过滤进行分离、沉淀、大小排阻(凝胶过滤)层析、亲和性层析、金属螯合物层析、离子交换层析、共价层析、疏水性相互作用层析等。

PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的回收方法优选以经由分离步骤将细胞碎片与已表达的PCV-2ORF2抗原分离开始。优选分离步骤包括过滤、在至多约20,000×g的速度下离心、连续流动离心、使用离子交换或凝胶过滤进行层析分离及常规免疫亲和方法。熟习此项技术者由例如(E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Proteinpurificationmethods-apracticalapproach，IRLPressOxford1995)已知彼等方法。最优选分离方法包括在至多约20,000×g的速度下离心及过滤。优选过滤方法包括死端型微过滤及切向流动(或交叉流动)过滤，包括中空纤维过滤死端型微过滤。在此等过滤方法中，死端型微过滤优选。死端型微过滤的优选孔径介于约0.30-1.35μm之间，更优选介于约0.35-1.25μm之间，更优选介于约0.40-1.1μm之间，且最优选介于约0.45-1.0μm之间。咸信任何常规滤膜将用于本发明的本方面的目的且聚醚砜膜优选。在过滤步骤期间移除任何低分子量核酸物质。

PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的进一步纯化可藉由层析程序(优选两步层析程序)实现。然而，若装载材料不包含细胞碎片，则亦可以层析程序起始。

若PCV-2抗原装配至病毒样粒子(VLP)中，则第一步骤优选为大小排阻(凝胶过滤)层析，其可例如藉由使用SephacrylS300基质进行。在实验室规模下，最优选使用HiPrep26/60SephacrylS300HR管柱。然而，可使用熟习此项技术者已知的任何其它大小排阻层析基质，其能够自培养滤液或上清液中分离出PCV-2ORF2VLP。合适的基质描述于例如E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Proteinpurificationmethods-apracticalapproach，IRLPressOxford1995)中。可例如藉由以1.0mL/min的流动速率用包含PCV-2抗原的粗制剂装载管柱且以1.5个管柱体积的包含20mMTris(pH6.5)、5mMDTT的缓冲液洗脱管柱来进行凝胶过滤层析。然而，亦可藉由使用亲和性层析，例如，经由选择性结合至已固定化PCV-2ORF2特异性抗体或熟习此项技术者已知的任何其它方法纯化PCV-2ORF2抗原。

因此，根据一优选实施方案，包含纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)及佐剂的免疫原性组合物可藉由包含以下步骤的方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，优选PCV-2ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的细胞培养物；

c)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)纯化包含PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的收获物；

d)将纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一优选实施方案，如本文所述，优选如实施例3中所述执行大小排阻层析。优选地，大小排阻产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，优选超过90％(w/w)纯度等级的免疫原性组合物。可在使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDSPAGE之后，藉由ImperialProteinStain(Pierce)染色来评估纯度等级。

为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤的第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。

优选地，若纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，优选阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的优选阴离子交换层析基质为QSepharose。在约50ml的小规模中，最优选使用5mlHiTrapQSepharoseHP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言的，可将来自大小排阻层析步骤的约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min的流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mMTris(pH6.5)、5mMDTT移除未结合材料的洗涤步骤之后，可以8个管柱体积的下列缓冲液(20mMTris(pH6.5)、5mMDTT、1.0MNaCl)的单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱的流过物装载回QSepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继的以阴离子交换层析)将PCV-2ORF2抗原与培养收获物的大部分其它蛋白组份有效地分离。

因此，根据一优选实施方案，包含纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)及佐剂的免疫原性组合物可藉由包含以下步骤的方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，优选PCV-2ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的细胞培养物；

c)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)，继的以阴离子交换层析纯化包含PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的收获物；

d)将纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一优选实施方案，如本文所述，优选如实施例3中所述执行大小排阻层析及阴离子交换层析。优选地，两步纯化策略产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过90％(w/w)，优选超过95％(w/w)纯度等级的免疫原性组合物。可在使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDSPAGE之后，藉由ImperialProteinStain(Pierce)染色来评估纯度等级。

如上所述，PCV-2抗原(优选PCVORF2抗原)的回收方法以经由分离步骤将细胞碎片与已表达的PCV-2ORF2抗原分离开始。优选分离步骤包括经由具有约0.6μm至约2μm的孔径，优选具有约0.8mm至约1.2μm的孔径的过滤器进行微过滤。

因此，包含纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)及佐剂的免疫原性组合物可藉由包含以下步骤的方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，优选PCV-2ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的细胞培养物；

c)经由具有0.6至2.0μm的孔径的过滤器过滤在步骤b)获得的收获物；

d)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)，视情况继的以阴离子交换层析纯化包含PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)且在步骤c)获得的滤液；并

e)将纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一优选实施方案，如本文所述，优选如实施例3中所述执行微过滤、大小排阻层析及阴离子交换层析。优选地，包括预过滤步骤的两步纯化策略产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过90％(w/w)，优选超过95％(w/w)纯度等级的免疫原性组合物。可在使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDSPAGE之后，藉由ImperialProteinStain(Pierce)染色来评估纯度等级。

包含纯化PCV-2抗原(优选本文所述的纯化PCV-2ORF2抗原)的免疫原性组合物(优选可藉由本文所述的方法获得者)的特征在于与不包含该纯化PCV-2抗原或纯化PCV-2ORF2抗原的免疫原性组合物相比提高的免疫原性。

若使用诸如重组痘病毒、腺病毒或杆状病毒的病毒载体制备PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)，则建议藉由适当灭活处理来灭活病毒核酸。该灭活可在纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)期间的任何时间进行。因此，灭活可在收获包含PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的细胞培养流体之后，或在微过滤PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)之后(若进行微过滤)，在纯化步骤之前或之后，例如在凝胶过滤之前或之后，且在阴离子交换层析之前或之后(若进行此操作)进行。

任何常规灭活方法可用于本发明的本方面的目的。因此，可藉由化学及/或物理处理执行灭活。在优选形式中，测定收获流体的体积且使温度介于约32℃-42℃，更优选约34℃-40℃，且最优选约35℃-39℃之间。优选灭活方法包括添加优选浓度为约1至约20mM，优选约2至约10mM，更优选约2至约8mM，更优选约3至约7mM，最优选约5mM的环化二元乙撑亚胺(BEI)。举例而言，灭活包括向流体中添加优选约0.4M的2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(其已环化为0.2M二元乙撑亚胺(BEI))于0.3NNaOH中的溶液以得到约5mMBEI的最终浓度。优选接着连续搅拌流体2-96小时且可将灭活收获流体冷冻储存于-40℃或-40℃以下或约1℃-7℃之间。在完成灭活之后，添加优选1.0M的硫代硫酸钠溶液以中和任何剩余BEI。优选添加与在灭活之前添加的BEI相比等量的硫代硫酸钠。举例而言，若添加BEI至5mM的最终浓度，则添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到5mM的最终最小浓度，以中和任何剩余BEI。

在将纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)与佐剂混合之前，亦建议使纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)相对于磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)或任何其它生理缓冲液透析。

上述方法产生具有如本文中所定义的降低杀病毒活性以及改良免疫原性的PCV-2抗原，倘若该PCV-2抗原具有以在与任何佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过50％(w/w)，优选超过70％(w/w)，甚至更优选超过80％(w/w)，甚至更优选超过85％(w/w)，甚至更优选超过90％(w/w)，最优选超过95％(w/w)的纯度等级。然而，可根据方法II获得的纯化PCV-2抗原亦可与佐剂(优选与本文所述的任何佐剂)混合且一起使用。优选佐剂为卡波莫，其优选浓度为约0.1至10mg/mL，更优选浓度为0.5至5mg/mL，最优选为约1mg/mL最终免疫原性组合物。

再者，本发明的本方面不仅提供本文所述的任何方法(包括替代性方法II)，其亦提供可藉由本文所述的任何方法(包括替代性方法II)获得的PCV-2抗原，优选纯化PCV-2抗原，最优选纯化PCV-2ORF-2蛋白。此外，本发明亦提供可藉由本文所述的任何方法(包括替代性方法II)获得的包含PCV-2抗原(优选纯化PCV-2抗原，最优选纯化PCV-2ORF-2蛋白)的PCV-2抗原性组合物。在最终免疫原性组合物中的PCV-2抗原(详言的纯化PCV-2ORF2抗原)的量以最终免疫原性组合物计应在每剂量约0.25至约400μg的范围内。优选地，最终免疫原性组合物应包括含量在每剂量约2至约200μg，甚至更优选每剂量约3至约150μg，更优选每剂量约4至约100μg，更优选每剂量约5至约80μg，更优选每剂量约6至约60μg，甚至更优选每剂量约7至约50μg，甚至更优选每剂量约8至约40μg，更优选每剂量约8至约32μg，甚至更优选每剂量约8至约24μg且最优选每剂量约8至约16μg范围内的PCV-2抗原，优选PCV-2ORF2抗原。

本文所提供的免疫原性组合物(包括彼等可藉由方法II获得者)包含一或多种来自另一致病有机体的另外抗原。上文定义彼等“另一致病有机体”。该另外抗原优选为猪生殖及呼吸综合征病毒。该猪生殖及呼吸综合征病毒抗原甚至更优选包含活病毒，且更优选包含经修饰的活病毒。该经修饰的猪生殖及呼吸综合征活病毒抗原更优选包含ATCC寄存编号VR2332的经修饰的活病毒株，且更优选包含INGELVACPRRSMLV。在本申请案的另一方面中，该另外抗原为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原优选为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更优选为INGELVACMYCOFLEX。最佳为猪生殖及呼吸综合征病毒与猪肺炎支原体两种抗原的组合。

由于包括本文所提供的纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的免疫原性组合物的免疫原性提高，所以与不接受该免疫原性组合物的动物相比，该免疫原性组合物可用于降低或减轻由PCV-2感染所引起或与PCV-2感染相关的临床征象的发生率或严重程度。

术语“临床征象的发生率降低或严重程度减轻”应意谓接受疫苗投药的动物与动物“对照组”相比，该等征象中的任一者的发生率降低或严重程度减轻，两种动物均已受产生免疫活性组份的病原体感染或攻毒且其中对照组并未接受疫苗或免疫原性组合物的投药。在此情况下，术语“减轻”或“降低”意谓与不接种疫苗的对照组相比，已接种疫苗组有至少10％，优选25％，甚至更优选50％，最佳超过100％的降低。

如本文中所用，“临床症状”或“临床征象”系指可由活动物直接观察到的病原体感染的征象，诸如症状。代表性实例将视所选病原体而定，可包括诸如流涕、嗜睡、咳嗽、发烧、体重增加或减轻、脱水、腹泻、肿胀、跛行等等。PCV-2临床征象可包括消瘦、皮肤苍白、身体憔悴、呼吸窘迫、腹泻、黄疸及脓病。

动物由PCV-2感染引起或与PCV-2感染相关的临床征象的发生率降低或严重程度减轻可藉由向需要该处理的动物仅施用单剂量的该免疫原性组合物而实现。然而，本文所提供的免疫原性组合物亦可以两个或两个以上剂量施用，首次剂量与任何后续剂量的施用间隔时间为2至4周。因此，根据另一实施方案，可向有需要的动物以一个、两个或两个以上剂量施用本文所提供的包括纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF2抗原)的免疫原性组合物。

详言的，在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物当向动物施用时使动物的淋巴流失及炎症与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻至少80％或至少75％。因此，在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物且该免疫原性组合物使已接受该免疫原性组合物投药的动物的淋巴流失及炎症与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻至少80％或至少75％。

在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物当向动物施用时使动物的肺病变与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻至少80％。因此，在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物且该免疫原性组合物使已接受该免疫原性组合物投药的动物的肺病变与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻至少80％。

在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PCV-2的保护性免疫反应。包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物可为任何体积，包括1ml、2ml、3ml、4ml、5ml及5ml以上。在优选形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该PCV-2抗原。因此，在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，包含PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物诱导针对PCV-2的保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该PCV-2抗原。

如本文中所用，“保护性免疫反应”系指相关病原体感染的临床、病理学或组织病理学征象或症状的发生率降低或严重程度减轻，直至且包括完全预防该等征象或症状。

术语“病理学”征象系指在显微镜或分子层面上经由生物化学试验，或尸检时肉眼可观察的感染征象。对于PCV-2而言，病理学征象将包括多个组织及器官上显微镜及肉眼可见的病变，淋巴器官为最常见的病变部位。

术语“病理组织学”征象系指由感染引起的组织变化的征象。

术语“临床症状”或“临床征象”由上文定义。

在本发明的本方面的另一方面中，提供如上所述的包含PCV-2抗原性组合物及PRRRS抗原(优选本文所述的任一PRRS抗原)的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫反应。再者，可制备任何剂量体积，但在优选形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该PRRS抗原及一个剂量的该PCV-2抗原。因此，在本发明的另一方面中，提供如上所述的包含PRRSV及如本文所述的PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS的保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该PRRS抗原及一个剂量的该PCV-2抗原。

在本发明的另一方面中，提供包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如上所述的猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对猪肺炎支原体的保护性免疫反应。再者，可制备任何剂量体积，但在优选形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该猪肺炎支原体抗原及一个剂量的PCV-2抗原。因此，在本发明的另一方面中，提供如上所述的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对猪肺炎支原体的保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量的该猪肺炎支原体抗原。

在本发明的本方面的另一方面中，如上所述的免疫原性组合物制备成每剂量施用2毫升。

在本发明的本方面的另一方面中，提供一种使动物PCV-2感染的一或多种临床症状与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一包含如上所述的PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物的步骤。优选地，在施用单剂量的该免疫原性组合物之后PCV-2感染的一或多种临床症状减轻。因此，根据本发明的本方面的另一方面，提供一种使动物PCV-2感染的一或多种临床症状与不接受包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一包含上述PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物的步骤，其中优选在施用单剂量的包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物之后PCV-2感染的一或多种临床症状减轻。

在本发明的本方面的另一方面中，提供一种使动物PRRS感染的一或多种临床症状与不接受该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法，所述PRRS感染尤其是(i)PRRS病毒和(ii)除2a外的亚型的PCV2的合并感染。一般而言，该方法包含向动物施用任一上述包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的PRRS病毒的该免疫原性组合物的步骤。优选地，在施用单剂量的包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的PRRS病毒的该免疫原性组合物之后PRRS感染的一或多种临床症状减轻。因此，根据本发明的本方面的另一方面，提供一种使动物PRRS感染的一或多种临床症状与不接受包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的PRRS病毒的该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法。猪生殖及呼吸综合征病毒(PRRSV)的临床征象包括(但不限于)食欲不振、发热、流产、短暂变色、乏情期延长、咳嗽、呼吸征象、乳房炎、无乳、嗜睡、木乃伊化仔猪、死产、新生仔猪虚弱、母猪产仔率减少、早产、腹泻、消瘦、打喷嚏、眼分泌物、皮肤苍白、死亡及其组合。

在本发明的本方面的另一方面中，提供一种使动物猪肺炎支原体感染的一或多种临床症状与不接受包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法，所述猪肺炎支原体感染尤其是(i)猪肺炎支原体病毒和(ii)除2a外的亚型的PCV2的合并感染。一般而言，该方法包含向动物施用任一上述该免疫原性组合物的步骤。优选地，在施用单剂量的包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物之后猪肺炎支原体感染的一或多种临床症状减轻。因此，根据本发明的本方面的另一方面，提供一种使动物猪肺炎支原体感染的一或多种临床症状与不接受包含如本文所述的PCV-2抗原性组合物及如本文所述的猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物的动物相比减轻的方法，所述猪肺炎支原体感染尤其是(i)猪肺炎支原体病毒和(ii)除2a外的亚型的PCV2的合并感染。猪肺炎支原体(M.hyo)感染的临床症状包括(但不限于)干咳、动作障碍(impairedperformance)及肺病变。

包含如本文所提供的纯化PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)的免疫原性组合物具有改良免疫原性。因此，本文所提供的免疫原性组合物适用于改良接受该免疫原性组合物的动物的免疫反应。因此，根据另一实施方案，本发明的本方面提供一种改良动物针对PCV-2的免疫反应的方法，其包含以下步骤：向有需要的动物施用如本文所述具有本文所提供的纯化PCV-2抗原(优选纯化PCV-2ORF-2蛋白)的免疫原性组合物。根据一优选方面，将用于该方法中的PCV-2抗原(优选PCV-2ORF2抗原)纯化至以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过60％(w/w)，优选超过60％(w/w)，甚至更优选超过70％(w/w)，甚至更优选超过80％(w/w)，甚至更优选超过90％(w/w)，最优选超过95％(w/w)的程度。可在使用NuPAGEMOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDSPAGE之后，藉由ImperialProteinStain(Pierce)染色来评估纯度等级。可使用熟习此项技术者所熟知的常规方法纯化PCV-2，且优选PCV-2ORF2。

实施例

实施例1

本研究是实验性猪环状病毒疫苗，2型，灭活杆状病毒载体(包括重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白)针对毒性PCV2-ORF2b(PCV2b)攻击的效力评估。

30只七周龄的剖腹产夺初乳(CDCD)小猪用于本研究并被分成两组；1)15只猪用实验性猪环状病毒疫苗，2型，灭活杆状病毒载体接种，和2)15只不接种的攻击对照猪。在第0天，组1的PCV2a猪用含相对效价(RP)1.5的疫苗肌肉内(IM)施用1ml的疫苗，而组2，不接种的攻击对照猪不接受任何处理。

在第28天，全部猪用毒性PCV2-ORF2b(PCV2b)1mL鼻内(IN)攻击以及用大约剂量为3.0Log10TCID50/mL的活病毒1mLIM攻击。在第25天和31天，全部猪接受2.0mL乳化于不完全弗氏佐剂的钥孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)IM。每日监测猪的临床征象，并定期抽取血液进行血清学测试。在第56天，对全部猪进行尸检并收集选择的组织且进行大体病理学观察。

就整体而言，在所测试的全部参数，PCV-PCV2a接种的动物表现优于攻击对照组。在第56天，15只中的1只(6.67％)接种的动物是病毒血的，相比于攻击对照组15只中有15只(100％)。并且，来自一个PCV2-ORF2a接种的动物的一个扁桃体组织(6.67％)是免疫组化(IHC)阳性，而攻击对照猪结果如下：扁桃体67％阳性，髂淋巴结64％阳性，气管支气管淋巴结40％阳性，和肠系膜淋巴结73％阳性。

从该研究获得的结果表明PCV2-ORF2a疫苗交叉保护暴露于毒性PCV2-ORF2b攻击的小猪。

实施例2

本研究评估猪环状病毒2型(包括重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白)在三周龄给予时针对PCV2ORF2b(PCV2b)攻击的效力。

四十二只健康CDCD猪(来自2窝的各11只猪和来自2窝的各10只猪)被分隔并圈养于6个禽舍中。在一个禽舍中的猪被均等地随机化进3个处理组之一：组1(严格阴性对照)由6只猪组成且不接受处理，组2(攻击对照，n＝18)不接受处理，和组3(实验性PCV2a疫苗系列420-19aB，n＝18)。处理组的概述提供于表1。

表1：

在第0天，猪为24天大且组3猪肌肉内(IM)施用1mL剂量的疫苗。在第11天和第17天，全部猪接受2.0mL剂量的KLH/ICFA，肌肉内(IM)。在攻击前从组2中移除一只猪(状况差)。在第14天全部猪用5.25log10TCID50/mL的活毒性PCV2b攻击，1.0mL在右颈IM以及1.0mL鼻内。每天检查猪的整体健康。在第4天、第14天、第21天、第28天、第33天和第42天收集血样，除第4天外在所有日子通过定量实时聚合酶链反应对血清测试PCV2病毒血症。对照组猪的18％(3/17)在研究结束前死亡，相比下疫苗接种组仅仅5.5％(1/18只猪)。在对照组，两只猪在第39天及一只猪在第40天垂死或发现死亡，相比下疫苗接种组仅仅在第27天由一只猪。在第42天全部存活的猪被安乐死；扁桃体样品、气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、和髂淋巴结被收集进福尔马林。病理学针对淋巴耗竭、炎症和定殖(免疫组化)将各组织划分为阴性或阳性(严重性得分为1至3)。

基于组织学结果，减轻分数(和置信区间下限)对淋巴耗竭是0.627(0.4259)，对淋巴炎症是0.617(0.4545)及对淋巴定殖是0.686(0.4375)。因此，观察到与攻击对照相比，在疫苗接种的猪中淋巴耗竭、淋巴炎症和淋巴定殖的减轻是显著的。而且，定量rt-PCR病毒血症数据的分析显示与攻击对照相比，疫苗接种的猪中病毒载荷的减少。

Claims

1.PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其在用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染，减少、预防或治疗由不同亚型的PCV2感染引起的临床征象，或预防或治疗由不同亚型的PCV2感染引起的疾病的方法中使用。

2.根据权利要求1的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述不同亚型的PCV2感染是PCV2b亚型(PCV2b)和/或PCV2c亚型(PCV2c)感染。

3.根据权利要求1或2的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述不同亚型的PCV2感染是PCV2b感染。

4.根据权利要求1-3中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述不同亚型的PCV2感染是不同亚型的PCV2和PCV2a的合并感染。

5.根据权利要求1-4中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述不同亚型的PCV2感染是PCV2a和PCV2b的合并感染。

6.根据权利要求4或5的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2a合并感染是这样的PCV2感染，所述PCV2包含与SEQIDNO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽，或所述PCV2包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。

7.根据权利要求2-6中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2b感染是这样的PCV2感染，所述PCV2包含与SEQIDNO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽，或所述PCV2包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。

8.根据权利要求1-7中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2aORF2蛋白是重组PCV2aORF2蛋白，优选重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白。

9.根据权利要求1-8中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述PCV2aORF2蛋白包含与SEQIDNo:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列，或由与SEQIDNo:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列组成。

10.根据权利要求1-9中任一项的用于所述用途的PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中

-所述临床征象选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴定殖、淋巴组织PCV2抗原阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、降低的平均日体重增长、肺部炎症、肺组织PCV2抗原阳性IHC、增加的死亡率，或

-所述疾病是PMWS。

11.一种用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染，用于减少、预防或治疗除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的疾病的方法，所述方法包括给动物施用PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述除2a亚型外的亚型的PCV2感染优选是权利要求1-7任一项所述的不同亚型的PCV2感染和/或其中所述PCV2aORF2蛋白优选是权利要求8或9所述的PCV2aORF2蛋白。

12.PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物用于制备药物的用途，所述药物用于减少、预防或治疗除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的疾病，其中所述不同亚型的PCV2感染优选是权利要求1-7任一项所述的不同亚型的PCV2感染和/或其中所述PCV2aORF2蛋白优选是权利要求8或9所述的PCV2aORF2蛋白。

13.权利要求11的方法或权利要求12的用途，其中

-所述除2a亚型外的亚型的PCV2感染的预防、减少或治疗是基于或包含或由以下组成：诱导针对所述除2a亚型外的亚型的PCV2的免疫应答或共同诱导针对所述不同亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答，

-所述疾病是PMWS。

14.根据前述权利要求中任一项的所述PCV2aORF2蛋白或免疫原性组合物或所述方法或所述用途，其中所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物仅施用一次。

15.根据前述权利要求中任一项的所述PCV2aORF2蛋白或免疫原性组合物或所述方法或所述用途，其中所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物给动物施用，优选给猪，更优选给家猪，尤其优选给小猪或母猪施用。

16.一种用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染，用于减少、预防或治疗不同亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染引起的疾病的方法，所述方法包括使用PCV2a亚型(PCV2a)ORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物。

17.权利要求16的方法，其中所述不同亚型的PCV2感染是PCV2b亚型(PCV2b)和/或PCV2c亚型(PCV2c)的感染。

18.权利要求16或17的方法，其中所述不同亚型的PCV2感染是PCV2b感染。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述不同亚型的PCV2感染是不同亚型的PCV2和PCV2a的合并感染。

20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述不同亚型的PCV2感染是是PCV2a和PCV2b的合并感染。

21.权利要求19或20的方法，其中所述PCV2a合并感染是这样的PCV2感染，所述PCV2包含与SEQIDNO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽，或所述PCV2包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO:1的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。

22.权利要求17-21中任一项的方法，其中所述PCV2b感染是这样的PCV2感染，所述PCV2包含与SEQIDNO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽，或所述PCV2包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与SEQIDNO:2的序列至少94％或优选至少95％相同的多肽的序列。

23.权利要求16-22中任一项的方法，其中所述PCV2aORF2蛋白是重组PCV2aORF2蛋白，优选重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白。

24.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述PCV2aORF2蛋白包含与SEQIDNo:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列，或由与SEQIDNo:1的序列至少94％或优选至少95％相同的序列组成。

25.一种诱导针对不同亚型的PCV2的免疫应答或共同诱导针对所述不同亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答的方法，包括：

-施用PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述动物具有选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴定殖、淋巴组织PCV2抗原阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、降低的平均日体重增长、肺部炎症、肺组织PCV2抗原阳性IHC、增加的死亡率的疾病的临床征象，或所述疾病是PMWS。

26.一种用于治疗或预防不同亚型的PCV2感染，用于减少、预防或治疗除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的临床征象，或用于治疗或预防除2a亚型外的亚型的PCV2感染引起的疾病的方法，包括：

-给动物施用PCV2aORF2蛋白或包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，其中所述除2a亚型外的亚型的PCV2感染优选是根据权利要求1所述的不同亚型的PCV2感染，且其中所述PCV2aORF2蛋白优选是重组杆状病毒表达的PCV2aORF2蛋白。

27.权利要求26的方法，其中所述除2a亚型外的亚型的PCV2感染的预防、减少或治疗包含诱导针对所述除2a亚型外的亚型的PCV2的免疫应答或共同诱导针对所述不同亚型的PCV2和PCV2a的免疫应答，其中所述临床征象选自淋巴耗竭、淋巴炎症、淋巴定殖、淋巴组织PCV2抗原阳性IHC、病毒血症、鼻脱落、发热、降低的平均日体重增长、肺部炎症、肺组织PCV2抗原阳性IHC、增加的死亡率，或所述疾病是PMWS。

28.权利要求16-27中任一项的方法，其中所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物仅施用一次。

29.权利要求16-28中任一项的方法，其中所述PCV2aORF2蛋白或所述免疫原性组合物给动物施用，优选给猪，更优选给家猪，尤其优选给小猪或母猪施用。

30.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中所述包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物可以通过这样的方法获得，所述方法产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物，所述方法包含按以下顺序的步骤：

a.获得含有分离的PCV-2a亚型(PCV2a)ORF2抗原的第一液体；

b.通过以第二液体交换部分第一液体，从所述PCV-2aORF2抗原去除至少部分第一液体，其中第二液体不同于第一液体且是非杀病毒的，且以第二液体交换部分第一液体包括步骤i)将第二液体添加至第一液体；和ii)通过去除部分第一和第二液体浓缩所述PCV-2aORF2抗原，由此产生与第一液体的分离的PCV-2aORF2抗原相比具有降低的杀病毒活性的PCV-2a抗原性组合物；和

c.其中步骤b)的具有降低的杀病毒活性的PCV-2免疫原性组合优选地在活病毒或活细菌与所述PCV-2免疫原性组合物混合2小时或更多小时的时候引起少于0.7logTCID50每毫升的活病毒损失或少于1logCFU每毫升的活细菌损失。

31.权利要求30的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，利用过滤器通过过滤步骤从所述分离的PCV-2aORF2抗原去除部分第一液体。

32.权利要求30或31免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，浓缩步骤ii)和添加步骤i)基本上同时进行。

33.权利要求30-32中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，浓缩步骤ii)和添加步骤i)进行至少两次。

34.权利要求31-33中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述过滤器包括半透膜。

35.权利要求34的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述半透膜具有小于所述分离的PCV-2aORF2抗原的平均孔径并防止至少90％的所述分离的PCV-2aORF2抗原通过所述半透膜孔并将所述分离的PCV-2aORF2抗原保留在所述过滤器内。

36.权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa的蛋白通过的平均孔径。

37.权利要求30-36中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，与第一液体相比，所述浓缩步骤ii)将所述PCV-2a抗原浓缩3倍至50倍。

38.权利要求30-37中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，与第一液体的分离的PCV-2aORF2抗原相比，所述PCV-2a免疫原性组合物的杀病毒活性被降低至少10％。

39.权利要求30-38中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法还包括收获步骤ii)之后剩余的分离的PCV-2aORF2抗原。

40.权利要求39的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法还包括通过层析程序纯化所收获的PCV-2aORF2抗原。

41.权利要求40的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述分离的PCV-2aORF2抗原被纯化至以蛋白总量计超过50％(w/w)的纯度等级。

42.权利要求30-41中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法还包括将步骤ii)之后剩余的分离的PCV-2aORF2抗原与选自医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合的另外的组分混合。

43.权利要求42的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述另外的组分是佐剂。

44.权利要求43的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述佐剂是卡波姆。

45.权利要求30-44中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述分离的PCV-2ORF2a抗原包含PCV2a的开放读框2(ORF-2)蛋白。

46.权利要求45的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述分离的PCV-2aORF2a抗原包含所述ORF-2a蛋白的病毒样颗粒。

47.权利要求30-46中任一项的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，还包括将所述PCV-2a抗原性组合物和至少一种额外的抗原组合。

48.权利要求47的免疫原性组合物，或方法，或用途，其中在所述产生具有降低的杀病毒活性的包含PCV2aORF2蛋白的免疫原性组合物的方法中，所述至少一种额外的抗原选自以下的抗原：胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；α病毒，优选东方马脑脊髓炎病毒；支气管败血性博德氏杆菌；短螺旋体属，优选猪痢疾短螺旋体；结肠菌毛样短螺旋体；猪布氏杆菌，优选生物变种1、2及3；经典猪瘟病毒；芽胞梭菌属，优选难养芽胞梭菌；A型、B型及C型产气荚膜芽胞梭菌，诺维氏芽胞梭菌，败血芽胞梭菌，破伤风梭菌；冠状病毒，优选猪呼吸道冠状病毒和猪流行性腹泻病毒；猪附红血球体；猪丹毒杆菌；大肠杆菌；猪副嗜血杆菌，优选亚型1、7及14(22)；血球凝集性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒；胞内劳森菌；钩端螺旋体属，优选澳洲钩端螺旋体，犬钩端螺旋体，感冒伤寒性钩端螺旋体，出血性黄疸钩端螺旋体，问号钩端螺旋体，波莫那钩端螺旋体，和塔拉索夫钩端螺旋体；分枝杆菌属，优选鸟分枝杆菌，细胞内分枝杆菌及牛分枝杆菌；猪肺炎支原体；多杀性巴氏杆菌；猪细胞巨大病毒；猪小病毒；猪生殖及呼吸综合征病毒；假性狂犬病病毒；轮状病毒；沙门杆菌属，优选鼠伤寒沙门杆菌及猪霍乱沙门杆菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属，优选链球菌属，优选猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水泡性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体；和/或猪关节滑膜支原体。

49.权利要求48的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的抗原是猪肺炎支原体的抗原和/或猪生殖及呼吸综合征病毒的抗原。

50.权利要求48或49的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的抗原是减毒的猪生殖及呼吸综合征病毒。

51.权利要求48或49的免疫原性组合物，其中所述至少一种额外的抗原猪肺炎支原体菌苗。