KR102288367B1

KR102288367B1 - 식물체에서 바이러스-유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 써코바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR102288367B1
Application number: KR1020190127987A
Authority: KR
Inventors: 손은주; 이용직; 이상민
Original assignee: 주식회사 바이오앱
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2021-08-11
Also published as: EP3882351A4; CN113039275A; EP3882351A1; KR20200056913A; JP7212968B2; JP2022513056A; US20210330780A1; CA3119964A1

Abstract

본 발명은 엽록체로 표적화되는 식물체 발현용 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 식물체에서 분리된 PCV2를 백신 조성물로 제작하는 기술과 관련된 것으로, 엽록체 표적화 단백질과 PCV2 캡시드 단백질이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체로부터 목적 단백질을 분리정제 방법, 이를 이용하여 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법 및 상기 제조방법에 의한 백신 조성물 등이 제공된다.

Description

식물체에서 바이러스-유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 써코바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법 {Recombinant vector expressing virus-like particles in plants and methods of preparing vaccine compositions comprising circovirus-like particles using the same}

본 발명은 식물체를 이용하여 생산한 바이러스-유사 입자(virus-like particles; VLPs)를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 식물체에서 고효율의 발현 벡터(expression vector)를 이용하여 백신 조성물로 사용 가능한 PCV2(porcine circovirus type 2) 캡시드(Capsid) 단백질의 생산성을 높임과 동시에, 생산된 PCV2 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제작하여, 이를 백신 조성물로 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 형질전환 식물체를 이용한 유용 생리활성 물질의 생산은, 동물 세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 생산하는 방법에서 발생할 수 있는 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 해당 유용물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물 세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점으로 인해 최근 기초과학 연구와 백신 개발 및 치료제개발 등 각종 연구 분야에 널리 사용되고 있다.

그러나 상기 제시한 장점에도 불구하고 식물세포에서 단백질을 생산하는 것은 동물 세포 및 미생물을 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현 수준과 최적화되지 않은 분리정제 방법이 가장 큰 걸림돌이 되고 있다. 이에 많은 연구가 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질의 고발현 및 생산성을 높이기 위한 시도가 진행되고 있다. 예를 들면, 외래 유전자를 식물체 내로 효율적으로 전달하거나 목적 단백질의 발현량을 높이기 위한 벡터제작 기술, 목적 단백질을 식물이 합성할 수 있게 만드는 형질전환 기술, 형질전환체로부터 목적 단백질을 생산할 수 있게 하는 단백질 분리정제 기술 등이 있다.

여기서, 상기와 같은 외래 유전자를 식물체로 내로 효율적으로 전달하거나 목적 단백질의 발현을 높이는 벡터제작 기술의 예로, 한국 등록특허공보 제10-1449155호에 따르면, DNA 단편은 목적 단백질의 상류에 첨가되어 재조합 벡터로 제작됨으로써, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체는 목적 단백질의 번역을 향상할 수 있고, 식물체 내의 특정 장소로 이동을 유도하여 목적 단백질이 안정적으로 축적될 수 있도록 하며, 이로 인해 식물체로부터 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 만드는 효과가 있음이 제시된바 있다.

또한, 단백질의 발현을 높이는 벡터제작 기술에 대한 종래기술의 다른 예로, 한국 공개특허공보 제10-2018-0084680호에 따르면, 식물세포에서 목적 단백질을 생산할 때 번역 단계에서 목적 단백질의 발현 수준을 높이는 방법으로 당화(N-glycosylation)를 일으키는 작은 도메인을 목적 단백질에 융합하면 단백질의 발현 수준이 높아지도록 하며, 이로 인해 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높이는 방법이 제시된 바 있다.

아울러, 형질전환체로부터 목적 단백질을 생산할 수 있게 하는 단백질 분리정제 기술의 예로, 한국 등록특허공보 제10-1848082호에 따르면, 셀룰로스 결합 도메인 3을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체에서 합성된 단백질들을 셀룰로스에 결합해 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 분리하는 것이 가능하며, 융합 단백질에 엔테로키나아제를 처리하여 목적 단백질과 셀룰로스 결합 도메인을 효율적으로 분리할 수 있다고 제시된 바 있다.

더욱이, 목적 단백질을 생산할 수 있게 하는 단백질 분리정제 기술의 또 다른 예로, 한국 공개특허공보 제10-2015-0113934호에 따르면, 생리활성 단백질 또는 펩타이드를 면역글로불린 Fc 단편과 결합시킨 경우, 면역글로불린 Fc 단편이 결합되지 않은 생리활성 단백질 또는 펩타이드보다 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 용해도를 개선하는 효과가 있음이 제시된 바 있다.

따라서 상기와 같은 종래기술들을 바탕으로 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산할 경우 기존에 사용되고 있는 방법인 동물 세포나 미생물을 이용한 생산 방법을 대체할 수 있는 효과가 있다. 첫째, 유용 생리활성 물질의 생산에 필요한 기간을 단축할 수 있으며 생산 단가 또한, 획기적으로 줄일 수 있다. 둘째, 동물 세포나 미생물에서 합성된 단백질을 분리정제하는 과정에서 생길 수 있는 세포독성과 같은 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 셋째, 상품화되었을 경우 종자의 형태로 장기간 보관이 가능하여 저장 및 보관비용을 절감할 수 있다. 넷째, 안전한 종자의 형태로 운송할 수 있어 긴급을 요구하는 문제가 발생 시 필요한 지역 및 나라에 빠르게 공급할 수 있다. 다섯째, 생리 활성 물질에 대한 수요가 급증할 경우, 대량생산에 필요한 생산설비 및 시스템구축에 많은 기술이 요구되지 않아 쉽게 대량화할 수 있으며, 동물 세포 시스템을 이용한 생산 시스템과 비교 시 설치 비용과 제품생산 비용을 획기적으로 낮출 수 있는 장점이 있어 최단 시간에 대량생산이 가능하게 해 수요에 따른 충분한 공급이 가능하다.

이외에도, 식물 시스템은 포유동물에서 필수적인 번역 후 변형(Post-translational modification) 과정이 일어나는 합성 경로를 가지고 있어 동물 세포를 이용하여 생산한 단백질과 거의 유사한 형태의 단백질 생산이 가능한 장점이 있다. 따라서 상기한 바와 같은 이러한 형질 전환된 식물체를 이용하여 유용 생리활성 물질인 단백질을 생산하는 방법이 동물 세포나 미생물을 이용하여 생산하는 방법을 대체할 수 있는 잠재적인 가능성이 있어 최근에 큰 주목을 받고 있다.

전술한 바와 같이, 의학적으로 적용 가능한 단백질과 백신 그리고 산업적으로 유용한 가치가 있는 효소를 포함하는 유용 생리활성 물질들을 식물체로부터 효과적으로 합성 및 분리정제하는 다양한 기술들이 제공되고 있음에도 불구하고 단백질마다 가지고 있는 고유한 특성이 서로 달라 특정 방법을 일괄적으로 적용하는 것은 바람직하지 않으므로 개별적인 연구가 필요한 실정이다.

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10-1449155

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10-2018-0084680

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10-1848082

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10-2015-0113934

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본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 형질전환 식물체에서 목적 단백질인 바이러스-유사 입자를 형성하는 PCV2(porcine circovirus type 2)를 생산함에 있어서, 번역 단계에서 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 목적 단백질에 융합하고 분리정제를 위해 폴리히스티딘을 부착한 경우 단백질의 발현 수준과 분리정제 효율이 높아지는 것을 확인하고, 이를 이용하여 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높일 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기와 같이 분리정제된 PCV2를 포함하는 용액의 pH를 적절하게 조절해주면 바이러스-유사 입자가 형성됨을 다양한 실험적인 방법으로 확인하였으며, 이러한 바이러스-유사 입자가 바이러스를 중화시키는 중화항체의 형성을 높일 수 있다는 점을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공하는 것이다:

(S1) 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;

(S2) 상기 (S1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;

(S3) 상기 (S2) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여 PCV2 캡시드 단백질에 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;

(S4) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및

(S5) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계.

또한, 본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다:

(S2) 상기 (S1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 PCV2 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;

(S3) 상기 (S2) 단계에서 수득한 PCV2 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계; 및

(S4) 상기 (S3) 단계에서 수득한 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 단계.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물에 포함되어 있는 PCV2 바이러스-유사 입자를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(Polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 재조합 벡터는 프로모터와 종결자 (terminator) 사이에, 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는 것일 수 있으나, 연결 순서에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:

(S4) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및

본 발명의 일 구체예로, 상기 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 300mM 염화나트륨(NaCl), 0.01 내지 0.5% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 아가로스는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 아가로스일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으며, 상기 박테리아는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:

본 발명의 일 구체예로, 상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 애주번트에는 알럼(alum)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예로, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 양배추, 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으며, 상기 박테리아는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (S3) 단계는 PCV2 캡시드 단백질이 포함된 완충용액의 pH를 변화시킴으로써 바이러스-유사 입자를 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 완충용액은 50 내지 100mM 트리스(Tris), 300 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl), 및 10 내지 100mM 아르기닌(Arginine) 을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5 인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 완충용액의 pH는 바람직하게는 7.2 인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 백신 조성물은 애주번트를 더 포함할 수 있다. 상기 애주번트는 알럼(alum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되어 있는 PCV2 바이러스-유사 입자를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 PCV2 바이러스-유사 입자는 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에서 분자량이 약 2,000kDa, Native-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에서 분자량이 669kDa 이상으로 나타나고, 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰하였을 때 지름 10nm 이상, 40nm 이하, 바람직하게는 지름 20nm 이상, 30nm 이하의 구형 또는 고리형인 것일 수 있다.

본 발명은 엽록체로 표적화되는 식물발현 벡터를 이용하여 제조한 바이러스-유사 입자를 포함하는 PCV2 백신 조성물에 관한 것으로, 생산 비용을 파격적으로 줄일 수 있고, 종래 널리 알려진 방법(동물 세포나 미생물에서 단백질을 생산한 후 분리정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암 유전자, 장독소 등)을 원천 차단할 수 있다. 또한, 동물 세포가 필수적으로 포함하는 번역 후 변형 과정이 일어나는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 포함하고 있어 생리활성을 유지하고 있는 단백질 생산이 가능하며, 상품화 단계에서도 동물 세포나 박테리아와는 달리 종자(seed stock)로서 관리가 가능하다는 점에서 유리하다. 나아가 해당 물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물 세포 또는 박테리아를 이용한 생산 시스템과 비교하였을 때, 더 효율적이고 경제적이기 때문에 수요의 발생에 발맞추어 단기간에 대량생산 및 공급이 가능하다는 장점도 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현을 위한 두 가지 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현 카세트(expression cassette)를 나타낸 도면이다. (Rbc-TP, 루비스코 트랜짓 펩타이드; 6XHis, 폴리히스티딘-태그; BiP-SP, chaperone binding protein 신호 펩타이드)
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 두 가지 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 친화성 크로마토그래피를 이용한 분리정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에서 분리정제된 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 및 Native-PAGE와 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에서 분리정제된 재조합 PCV2 캡시드 단백질로 형성된 바이러스-유사 입자를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에서 분리정제된 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 항체 형성 여부를 확인하기 위한 기니피그 실험 방법을 도표 및 개략도로 나타낸 도면(상단) 및, ELISA kit로 확인한 결과를 막대그래프로 나타낸 도면(하단)이다.

본 발명자들은 형질전환 식물체에서 목적 단백질인 바이러스-유사 입자를 형성하는 PCV2(Porcine circovirus type 2)를 생산함에 있어서, 번역 단계에서 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 목적 단백질에 융합하고 분리정제를 위해 폴리히스티딘을 부착한 경우 단백질의 발현 수준과 분리정제 효율이 높아지는 것을 확인하고, 이를 이용하여 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높일 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 일 실시예에서는, 폴리히스티딘-태그와 엽록체로 표적화시키는 루비스코 트랜짓 펩타이드가 PCV2 캡시드 단백질에 융합된 재조합 단백질을 발현하는 식물발현 벡터 및 폴리히스티딘-태그와 소포체로 표적화시키는 BiP(chaperone binding protein) 신호 펩타이드(signal peptide)가 PCV2 캡시드 단백질에 융합된 재조합 단백질을 발현하는 식물발현 벡터를 제작하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 식물발현 벡터를 아그로박테리아에 형질전환시킨 후, 이를 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하여 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 식물체에서 발현시켰다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 발현되는 니코티아나 벤타미아나 잎으로부터 Ni-NTA 아가로스 레진이 충전된 컬럼을 이용하여 재조합 단백질을 분리정제하고, 이를 바이러스-유사 입자를 만들기 위한 완충용액을 이용하여 PCV2 캡시드 단백질의 자가조립을 유도하였다(실시예 3 내지 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기에서 얻은 PCV2 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물을 기니피그에 투여하여, PCV2에 대한 항체가 형성됨을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 두 가지 유전자형(genotype)의 PCV2 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물을 기니피그에 투여하여, PCV2a 및 PCV2b 두 유전자형 모두에서 바이러스 중화항체 형성능력 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).

이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 PCV2(Porcine circovirus type 2) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCo transit peptide)"는, 루비스코(Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase) 스몰 서브유닛(small subunit)의 N-말단 트랜짓 펩타이드(N-terminal transit peptide)를 지칭하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드는 형질전환 식물체에서 발현된 재조합 단백질을 엽록체 내로 이동시키기 위해 사용되는 것으로, 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 루비스코 트랜짓 펩타이드가 융합된 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 식물체에서 발현시키는 경우, 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드의 앞쪽 54개 아미노산이 잘려서 없어지고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열만 남을 수 있다. 또한, 이러한 경우 DNA frame을 맞추기 위하여 루비스코 트랜짓 펩타이드 서열과 폴리히스티딘 서열 사이에 추가적인 아미노산이 삽입될 수 있으며, 바람직하게는 글리신(Glycine), 또는 아이소루신(Isoleucine)이 추가로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "BiP(chaperone binding protein)"은 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 가장 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 유전자이나, 서열번호 10의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 BiP 유전자는 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "트랜짓 펩타이드(transit peptide)" 또는 "신호 펩타이드(signal peptide)"는, 특정 세포소기관, 세포 구획, 세포외 외수송부로의 단백질의 수송 또는 국지화를 유도할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 이 용어는 트랜짓 펩타이드 및 트랜짓 펩타이드를 암호화하는 염기서열 모두를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "PCV2"는, 돼지 서코바이러스 2형을 지칭하는 것으로서, 작은(17 내지 22nm의 직경) 20면체의 외피 비보유(non-enveloped) DNA 바이러스이고, 일본쇄 원형 게놈을 함유한다. PCV2는 돼지 서코바이러스 1형(PCV1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 하지만, 일반적으로 비병독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 통상적으로 이유후 전신성 소모성 증후군(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS)이라고 하는 증상을 나타낸다. PCV2는 2개의 주요 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)이 있다. ORF1은 바이러스 복제 단백질(Rep)을 만들며, ORF2는 "캡시드 단백질(capsid protein)"을 만들어 낸다. PCV2의 ORF2가 전사되어 만들어진 캡시드 단백질은 3개씩 모여 1개의 면을 이루며 20면이 모인 정20면체(icosahedral) 구조를 취하여 바이러스-유사 입자(virus-like particles; VLPs) 구조가 완성된다. PCV2는 상기 캡시드 단백질을 코딩하는 ORF2의 유전형에 따라 PCV2a, PCV2b, PCV2c 등의 유전자형(genotype)으로 나눌 수 있다. 그러나, 이러한 유전자형 간의 병원성은 아직 확실치 않으며, 인공감염을 통한 결과에서도 병원성의 차이에 대한 결론을 내리지 못하고 있다.

본 명세서에서는 PCV2a 및 PCV2b를 "PCV2"로 통칭하였으나, 바람직하게는 PCV2a를 의미한다. 또한 필요에 따라, 유전자형 간의 비교가 필요한 경우에는 PCV2를 각각 PCV2a 및 PCV2b로 나누어 지칭하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터(vector)"란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 유전체(genome) 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명의 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 또한 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(Polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.

상기 폴리히스티딘-태그는 본 발명의 목적 단백질인 PCV2 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 프로모터와 종결자(terminator) 사이에, 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는 것일 수 있으나, 연결 순서에 제한되는 것은 아니다.

상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 종결자는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 종결자, 파세올린 종결자, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 종결자, 대장균의 rrnB1/B2 종결자 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환 식물체(transgenic plant)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 식물체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 식물체이며, 상기 식물체는 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것이라면 제한이 없다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation), 또는 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:

(S4) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및

본 발명에 따른 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 300mM 염화나트륨(NaCl), 0.01 내지 0.5% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 아가로스는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 아가로스일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으며, 상기 박테리아는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 하기의 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:

본 발명의 용어 "백신(vaccine)"은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.

본 발명에서, 상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(Adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "애주번트(Adjuvant)"는 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "애주번트"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다.

또한 본 발명에서, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 양배추, 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "식물체"는, 본 발명의 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 상기 열거한 식물체 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 니코티아나 벤타미아나 L.(Nicotiana benthamiana L.) 또는 니코티아나 타바쿰 cv. 잔티(Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 등의 품종을 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서, 상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으며, 상기 박테리아는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 전술한 바와 같이 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서, 상기 (S3) 단계는 PCV2 캡시드 단백질이 포함된 완충용액의 pH를 변화시킴으로써 바이러스-유사 입자를 제조하는 것일 수 있다.

상기 바이러스-유사 입자를 제조하는 것은, 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 자가조립에 의해 바이러스-유사 입자를 형성할 수 있도록 필터를 사용하여 완충용액의 교체 및 농축 과정을 거칠 수 있다.

상기 완충용액은 50 내지 100mM 트리스(Tris), 300 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl), 10 내지 100mM 아르기닌(Arginine)을 포함할 수 있고, pH는 6.9 내지 7.5, 바람직하게는 7.2 인 것일 수 있다. 또한, 자가조립된 재조합 PCV2 바이러스-유사 입자를 정제하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물에는 애주번트가 더 포함될 수 있다. 또한, 상기 애주번트는 알럼(alum)일 수 있으나, 애주번트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트(aluminium salt)라도 본 발명에 사용될 수 있다. 알루미늄 솔트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)₃), 알루미늄 포스페이트(AlPO₄), 알루미늄 하이드로클로라이드, 알루미늄 설페이트, 암모늄 알럼, 포타슘 알럼 또는 알루미늄 실리케이트 등이 포함된다. 바람직하게는, 알루미늄 솔트 애주번트로서 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물에 포함되어 있는 PCV2 바이러스-유사 입자를 제공한다. 상기 PCV2 바이러스-유사 입자는 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에서 분자량이 약 2,000kDa, Native-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에서 분자량이 669kDa 이상으로 나타나고, 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰하였을 때 지름 10nm 이상, 40nm 이하, 바람직하게는 20nm 이상, 30nm 이하의 구형 또는 고리형인 것일 수 있다. 여기서 상기 용어 "약"은 ±10%를 의미한다. 따라서 분자량 약 2,000kDa은 1,800kDa 내지 2,200kDa을 의미한다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예 및 도면에서는 특별히 PCV2b라고 언급하지 않는 한 PCV2는 PCV2a를 의미한다.

[실시예]

실시예 1: 재조합 PCV2 캡시드 단백질 발현용 식물발현 벡터 제작

도 1의 개열지도에 나타낸 바와 같이, 식물체에서 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물체 발현용 벡터를 제작하였다.

보다 구체적으로, PCV2 캡시드 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자(서열번호 4 또는 서열번호 6)를 합성하였다. 엽록체로 표적화되는 재조합 PCV2 캡시드 단백질 식물발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2), 6개의 연속된 히스티딘 (Histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8), PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4 또는 서열번호 6)를 순차적으로 연결하여 제작하였다. 엽록체로 표적화되는 재조합 PCV2 캡시드 단백질 식물발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 10), PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4 또는 서열번호 6), 6개의 연속된 히스티딘 (Histidin)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 12)를 순서대로 연결하여 제작하였다.

실시예 2: 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현 확인

2.1. 식물발현 벡터 일과성 발현(transient expression)

상기 실시예 1에서 준비한 식물발현 벡터를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g, 카나마이신 50mg/L, 리팜피신 25mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10mM MES (pH 5.7), 10mM MgCl₂, 200μM 아세토시링곤]에 현탁 시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.

2.2. 식물체에서 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현 확인

상기 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펫릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드를 융합한 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 높은 효율로 발현되었음을 확인하였고, 발현된 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 70% 이상이 수용성 분획에서 확인되었으며, 약 30%의 PCV2 캡시드 단백질이 펠릿 분획에서 관찰되었다(도 2의 좌측 사진). 이와 비교하여, 소포체로 표적화되도록 BiP 시그널 펩타이드를 융합한 재조합 PCV2 캡시드 단백질은 발현 효율이 매우 낮았다(도 2의 우측 사진). 이에 따라, 하기 실시예는 엽록체로 표적화되는 루비스코 트랜짓 펩타이드를 융합한 재조합 PCV2 캡시드 단백질만을 이용하여 진행하였다.

실시예 3: 식물에서 발현된 재조합 PCV2 캡시드 단백질 분리정제

상기 실시예 2.1에서 준비된 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 발현되는 니코티아나 벤타미아 잎 50g에 단백질 추출 용액[50mM Tris-HCl(pH 8.2), 300mM NaCl, 10mM imidazole, 0.5% Triton X-100] 100mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 상기 단백질 추출액으로부터 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 분리정제를 위해 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 아가로스 레진(agarose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10mL 충진한 후 100mL의 세척용액[50mM Tris-HCl(pH 8.2), 300M NaCl, 10mM Imidazole]으로 평형화시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척 용액 100mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액[50mM Tris-HCl(pH 8.2), 300mM NaCl, 250mM Imidazole]으로 재조합 PCV2 캡시드 단백질을 용출하였다. 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 포함된 용출용액은 30kDa 크기의 필터를 사용하여 바이러스-유사 입자를 만들기 위한 완충용액[50mM Tris-HCl(pH 7.4), 300mM NaCl, 100mM Arginine, 최종 pH는 7.2로 조절함]으로 버퍼 교체 및 농축을 실시하였다. 분리정제된 재조합 PCV2 캡시드 단백질은 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 확인하였다(도 3 참조).

실시예 4: 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 정제

재조합 PCV2 캡시드 단백질은 자기조립을 통해 재조합 PCV2 바이러스-유사 입자를 형성한다. 따라서 재조합 PCV2 바이러스-유사 입자를 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피(HiLoad 16/600 SuperdexTM 200pg)는 용출용액[50mM Tris-Cl(pH 7.4), 300mM NaCl, 0.5mM EDTA]을 이용하여 평형화하였다. 실시예 3에서 얻은 분리정제된 재조합 PCV2 캡시드 단백질이 포함된 완충용액 5mg을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고 크기별로 분리를 하여 첫 번째 피크 분획을 획득하였다. 바이러스-유사 입자의 형성 여부를 확인하기 위하여 획득한 분획은 Native-PAGE 전기영동을 수행했다. 또한, 분리정제한 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 정제도를 확인하기 위해 SDS-PAGE 전기영동을 수행했다. 상기 크기 배제 크로마토그래피로 분리한 결과와 Native-PAGE 및 SDS-PAGE 전기영동 결과는 도 4에 나타내었다.

실시예 5: 재조합 PCV2 바이러스-유사 입자 확인

크기 배제 크로마토그래피로 분리한 첫 번째와 두 번째 분획에 포함된 재조합 PCV2a 캡시드 단백질을 최종 농도가 100nM이 되도록 용출용액[50mM Tris-Cl(pH 7.4), 300mM NaCl, 0.5mM EDTA]에 희석하여 음성염색(Negative-staining)을 수행하였다. 5μL의 단백질 용액을 카본이 코팅된 구리 그리드에서 1분간 반응시킨 후 거름종이를 이용하여 단백질 용액을 제거하고 3차 증류수로 3번 세척하였다. 이때 카본이 코팅된 구리 그리드는 플라즈마(Plasma)와 함께 1분간 반응하여 소수성(hydrophobic)의 특성을 친수성(hydrophilic) 특성으로 변환하여 단백질이 카본에 잘 부착되도록 한다. 최종적으로 1% 아세트산우라닐(uranyl acetate)로 1분간 반응시켜 음성염색한 후 거름종이로 염색용액을 제거하고 상온에서 12시간 건조하였다. 준비된 그리드는 투과전자현미경(Tecnai T10, Philips, 일본)을 사용하여 20,000배의 배율로 이미지를 획득하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 첫 번째 분획에서 재조합 PCV2 캡시드 단백질로 구성된 바이러스-유사 입자를 관찰할 수 있었다.

실시예 6: 재조합 PCV2 캡시드 단백질 항체 형성 확인

상기 실시예 5에서 확인된 재조합 PCV2 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물의 항체 형성 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였으며, 동물용 의약품 국가 출하승인검증 기준[1-2-04-03 돼지 써코바이러스 type2 유전자재조합 불활화 백신(PCV2 항체 역가시험)]에 따라 진행하였다. 체중 300~350g의 기니피크 9마리를 준비하여 3마리는 대조군으로, 6마리는 실험군으로 하여 근육으로 1/2두분을 접종하고 2주 후에 2차 접종을 실시하였다. 여기서 상기 대조군은 항원 없이 PBS만 1ml 투여한 군을 의미하고, 실험군은 각각 50ug 및 100ug의 PCV2 항원에 50% 알루미늄 하이드록사이드 겔(Aluminum hydroxide gel)을 첨가한 군을 의미한다. 2차 접종 2주 후에 3마리의 대조군과 같이 채혈하여 ELISA kit으로 항체가를 측정하였다. 흡광도 ELISA 측정은 제조회사의 시험방법에 따라 수행하였다. 항체 형성 결과는 도 6에 나타내었다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, PCV2 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물을 투여함에 따라 기니피그의 체내에서 항체가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 조성물의 투여량이 증가함에 따라 형성되는 항체의 양도 증가하는 경향을 나타냈다.

실시예 7: 재조합 PCV2a 캡시드 단백질 중화항체 형성 확인

상기 실시예 5에서 확인된 PCV2 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물에 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)₃) 애주번트를 첨가한 백신 조성물을 이용하여 PCV2 중화항체 형성유무를 확인하였다. 실험은 동물용 의약품 국가 출하승인검증 기준(1-2-04-03 돼지 써코바이러스 2형 유전자재조합 불활화 백신)에 따라 진행하였다. 체중 300~350g의 기니피크 6마리를 준비하여 2마리는 대조군으로, 4마리는 실험군으로 하여, 실험군에는 근육으로 1/2두분을 접종하고 2주 후에 2차 접종을 실시하였다. 2차 접종 2주 후에 2마리의 대조군과 같이 채혈하여 간접 형광 항체검사법(Immuno-fluorescence assay)으로 확인하였다. 바이러스 중화실험 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

개체 번호	그룹 번호	애주번트	PCV2의 유전자형 별 중화항체가
			PCV2a	PCV2b
1	PBS	PBS	0	4
2			0	4
3	1	50μg Alum	>256	64
4			>256	64
5	2	100μg Alum	>256	>256
6			>256	128

그 결과 상기 표 1에서 나타난 바와 같이, PCV2의 두 유전자형 PCV2a 및 PCV2b 모두 바이러스 중화능이 있음을 확인하였다. 또한, 전반적으로 PCV2b 보다 PCV2a의 바이러스 중화능이 더 우수하였으며, alum 애주번트(adjuvant)를 100μg 첨가한 경우 중화항체가가 가장 높은 것으로 나타났다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioApplications Inc. <120> Recombinant vector expressing virus-like particles in plants and methods of preparing vaccine compositions comprising circovirus-like particles using the same <130> MP19-210 <150> KR 10-2018-0141184 <151> 2018-11-15 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of RuBisCO transit peptide <400> 1 Cys Met Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe Glu Thr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser 20 25 <210> 2 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RuBisCO transit peptide <400> 2 atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60 gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120 aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180 ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattcc 237 <210> 3 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of PCV2 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<400> 4 aatggcattt tcaatacacg cctcagtcga acttttggat atactgtcaa gcgtactaca 60 gtcaccacgc catcttgggc tgtggatatg atgagattta agttggatga ctttgttcct 120 cctggagggg gaaccaacaa aatttctata ccgtttgagt actatagaat cagaaaagtt 180 aaggttgagt tctggccgtg ttcccccata actcagggtg ataggggtgt gggttcaact 240 gctgttattc tagatgataa cttcgtacct aaggccaacg cattgactta tgacccctat 300 gtaaactact catctagaca tacaatccca caacctttct cctaccactc gcgttatttt 360 acaccaaagc ctgttttaga ttctaccatt gattatttcc aaccaaataa caagaggaat 420 cagctttggt tgagattaca aacctcacgg aacgtggatc atgtcggatt gggtactgca 480 tttgaaaata gtaagtatga tcaggactac aatatccgtg tgacaatgta cgttcaattt 540 agggaattta atcttaaaga cccaccactt aatccatag 579 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of PCV2b <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 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Sequence <220> <223> DNA sequence of polyhistidine-tag <400> 8 caccaccatc accaccat 18 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of BiP signal peptide <400> 9 Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala Ile Glu Glu Ala Thr 20 25 30 Lys Leu Gly Ser Val Ile Gly Ile Asp 35 40 <210> 10 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of BiP signal peptide <400> 10 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggatgt 60 ttatttgcgt tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taggatcagt gatagggata 120 gat 123 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HDEL <400> 11 His Asp Glu Leu 1 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of HDEL <400> 12 catgatgagc tc 12

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(RuBisCO transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 PCV2(Porcine circovirus type 2) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 담배 속(Nicotiana genus) 식물체 발현용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물체 발현용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(Polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물체 발현용 재조합 벡터.
제3항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 프로모터와 종결자(terminator) 사이에, 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PCV2 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 식물체 발현용 재조합 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 담배 속(Nicotiana genus) 식물체.
하기의 단계를 포함하는, 재조합 PCV2 캡시드 단백질의 분리정제 방법:
(S1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 담배 속(Nicotiana genus) 식물체를 형질전환시키는 단계;
(S2) 상기 (S1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(S3) 상기 (S2) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여 PCV2 캡시드 단백질에 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(S4) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및
(S5) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계.
제6항에 있어서,
상기 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 300mM 염화나트륨(NaCl), 0.01 내지 0.5% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리정제 방법.
제6항에 있어서,
상기 아가로스는 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 아가로스인 것을 특징으로 하는, 분리정제 방법.
제6항에 있어서,
상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 담배 속(Nicotiana genus) 식물체를 형질전환시키는 것인, 분리정제 방법.
제9항에 있어서,
상기 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는, 분리정제 방법.
하기의 단계를 포함하는, 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법:
(S1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 담배 속(Nicotiana genus) 식물체를 형질전환시키는 단계;
(S2) 상기 (S1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 PCV2 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
(S3) 상기 (S2) 단계에서 수득한 PCV2 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계; 및
(S4) 상기 (S3) 단계에서 수득한 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 단계.
제11항에 있어서,
상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
삭제
제11항에 있어서,
상기 (S1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 담배 속(Nicotiana genus) 식물체를 형질전환시키는 것인, 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 (S3) 단계는 PCV2 캡시드 단백질이 포함된 완충용액의 pH를 변화시킴으로써 바이러스-유사 입자를 제조하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제16항에 있어서,
상기 완충용액은 50 내지 100mM 트리스(Tris), 300 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl), 및 10 내지 100mM 아르기닌(Arginine)을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5 인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 pH는 7.2 인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제11항에 따른 제조방법에 의해 제조된, 백신 조성물.
제19항에 있어서,
상기 백신 조성물은 애주번트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제20항에 있어서,
상기 애주번트는 알럼(alum)인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 제조된 PCV2 바이러스-유사 입자로서,
상기 입자는 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에서 분자량이 1,800kDa 이상, 2,200kDa 이하이며, Native-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에서 분자량이 669 kDa 이상으로 나타나고, 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰하였을 때 지름 20 내지 30nm 사이의 구형 또는 고리형인 것을 특징으로 하는, PCV2 바이러스-유사 입자.