KR101848082B1

KR101848082B1 - 셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법

Info

Publication number: KR101848082B1
Application number: KR1020170058882A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 손은주; 이용직
Original assignee: 주식회사 바이오앱; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2018-04-12
Also published as: WO2018208099A2; CN110709518A; US20200270624A1; JP2020519264A; CN110709518B; EP3623477A2; EP3623477A4; US10934558B2; JP6945883B2; WO2018208099A3

Abstract

본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인 3을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합벡터를 이용하여 목적 단백질을 분리하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 단백질 분리 방법은 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체를 셀룰로오스에 결합시켜 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 용이하게 분리하는 것이 가능하며, 융합 단백질에 엔테로키나제를 처리하여 목적 단백질과 셀룰로오스 결합 도메인을 효율적으로 분리할 수 있으므로, 산업적으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법 {Recombinant vector containing cellulose binding domain and Purification method for a protein using thereof}

본 발명은 셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

셀룰로오스(Cellulose)는 식물의 세포막 및 목질부를 구성하는 기본성분으로 식물체의 약 30% 이상을 차지하는 유기화합물의 일종이다. 다당류에 속하며, 화학구조는 D-글루코스(glucose)가 베타-1,4 글루코시드(beta-1,4 glucoside) 결합으로 다수 중합되어, 천연상태의 분자량이 수만 내지 수십만에 이른다. 셀룰로오스는 무취의 흰색 고체로 물, 에탄올, 및 에테르에는 녹지 않으며 알칼리에 상당히 강한 내성을 가지고 있으나, 산(acid)이나 구리암모니아용액(cuprammonium solution) 내에서는 가수분해 되어 중간산물로 셀로비오스(cellobiose)를 다량 생성하고, 최종적으로는 글루코스(glucose)로 변환된다. 셀룰로오스는 자연계에서 가장 풍부한 천연자원의 한 종류인 만큼 이를 이용하고자 하는 많은 연구들이 진행 중이다.

한편, 셀룰로오스를 분해하는 셀룰라아제(cellulase)는 셀룰로오스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD)을 가지고 있어, 셀룰로오스에 특이적으로 결합하여 셀룰로오스를 효과적으로 분해한다. 상기와 같은 셀룰로오스 결합 도메인을 필요로 하는 목적 단백질에 결합시켜 셀룰로오스에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질을 제조하고자 하는 시도들이 활발히 이루어지고 있다(대한민국 등록특허 제10-0618563호). 그러나 이러한 시도는 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법들에 국한되어 있으며, 식물을 이용한 예는 아직 알려진 바 없다.

그러나 최근 식물 유래 재조합 단백질, 백신 등의 생산과 관련하여 관심이 집중되고 있는 만큼, 식물체를 이용하여 대량의 재조합 단백질을 생산하고, 고순도의 재조합 단백질을 대량으로 신속하고 저렴하게 분리하는 방법에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 식물체 내에서 목적 단백질을 생성한 후, 생성된 목적 단백질을 대량으로 신속하고 간단하게 분리하기 위하여, 셀룰로오스 결합 도메인 3(Cellulose binding module 3, CBM3)을 포함하는 재조합벡터와, 상기 재조합벡터를 이용하여 목적 단백질을 분리정제하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인 3을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것으로, 상기 재조합 벡터의 구성은 도 1에 나타낸 것과 같다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 재조합벡터는 셀룰로오스 결합 도메인 3, 연결 펩타이드, 엔테로키나제 절단 부위, 및 목적 단백질 암호화 유전자가 순차적으로 연결되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 목적 단백질 암호화 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 연결 펩타이드는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것일 수있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엔테로키나제 절단부위는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 목적 단백질을 소포체로 타켓팅할 수 있는 BiP(Binding immunoglobulin protein) 단백질을 암호화하는 유전자가 추가적으로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 BiP 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합벡터는 상기 목적 단백질 암호화 유전자를 유지할 수 있는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 암호화하는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 목적 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:

상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체 및 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계(S1);

상기 S1 단계의 혼합액을 셀룰로오스(cellulose)가 채워진 컬럼에 주입하여 셀룰로오스 결합 도메인 3 및 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 셀룰로오스에 흡착시키는 단계(S2); 및

상기 S2 단계에서 상기 융합단백질이 흡착된 셀룰로오스를 원심분리하여 침전시킨 후, 엔테로키나제에 현탁시켜 현탁액을 수득하는 단계(S3).

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 S3 단계 후, 세파로스 컬럼(STI-sepharose)에 상기 현탁액을 주입하여 엔테로키나제를 제거하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM의 트리스(Tris) 완충액, 100 내지 200mM의 염화나트륨(NaCl) 용액, 0.01 내지 0.5%의 트리톤 X-100(Triton X-100), 및 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 형질전환 식물체는,

a) 상기 재조합 벡터를 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계; 및

b) 상기 형질전환 균주를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 균주는 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefaciens)인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 셀룰로오스는 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose)인 것일 수 있다.

본 발명의 재조합벡터를 이용한 단백질의 분리방법은 셀룰로오스에 대한 높은 친화도를 가지는 셀룰로오스 결합 도메인 3을 사용함으로써, 비특이적인 단백질들이 결합하는 것을 방지하여 다양한 단백질이 혼합되어 있는 식물체의 총 추출물(total extract)로부터도 목적하는 단백질을 고순도로 신속하게 분리할 수 있으며, 낮은 농도의 단백질이라도 분리가 가능하다. 또한, 목적하는 단백질과 상기 단백질을 표지(tagging)하는 셀룰로오스 결합 도메인을 엔테로키나제를 처리하여 신속하게 분리해낼 수 있다. 따라서 본 발명의 단백질 분리 방법은 식물체로부터 대량의 목적 단백질을 고순도로 신속하고 저렴하게 효율적으로 분리 가능하게 하기 때문에, 산업적으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에서 사용한 재조합벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 미세결정셀룰로오스에 CBM3 융합 단백질(CBM3::Ag85A)의 흡착을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 엔테로키나제를 사용하여 CBM3 융합 단백질로부터 목적 단백질(Ag85A)이 분리되는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 친화 크로마토그래피로 엔테로키나제 제거한 후, 목적 단백질(Ag85A) 분리 정제된 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding module 3, CBM3)을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 고순도의 목적 단백질을 식물체로부터 대량으로 신속하고 저렴하게 분리하는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었는데, 즉, 본 발명의 일실시예에서는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단 방향으로 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 셀룰로오스 결합 도메인 3(cellulose binding domain 3, CBD 3)을 결합시켜 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 형질전환된 식물체를 제조한 뒤, 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose cellulose, MCC)를 이용하여 CBM3 융합 단백질을 분리한 후, 엔테로키나제를 처리하여 목적 단백질을 분리할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 내지 4 참조).

상기로부터 본 발명자들은 셀룰로오스 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질이 발현된 식물체로부터 셀룰로오스를 이용하여 용이하게 목적 단백질을 정제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 상기 재조합벡터를 이용하는 목적 단백질의 분리 방법을 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 목적 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:

보다 구체적으로, 본 발명에서 상기 셀룰로오스(cellulose)는 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose cellulose)를 사용하는 것이 바람직하며, 비결정셀룰로오스(amorphous cellulose)도 사용할 수 있으나, 미세결정셀룰로오스를 사용하는 것이 분리 효율 등을 고려할 때 보다 바람직하다.

본 발명에서 상기 재조합벡터는, 셀룰로오스 결합 도메인 3, 연결 펩타이드, 엔테로키나제 절단 부위, 및 목적 단백질 암호화 유전자가 순차적으로 연결되어 구성되고, 상기 셀룰로오스 결합 도메인의 3' 말단에는 식물 세포에서 소포체로 목적 단백질을 타켓팅할 수 있는 BiP(Binding immunoglobulin protein) 단백질의 신호 펩타이드가 연결되며, 상기 목적 단백질 암호화 유전자의 카르복실 말단에는 연결된 벡터가 소포체에 보존(retention)되도록 하는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)이 연결될 수 있다. 상기 셀룰로오스 결합 도메인 3은 서열번호 1의 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터로 생성되는 단백질에서, 셀룰로오스 결합 도메인 3은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "목적 단백질(또는 단백질)"은 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 어느 하나에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있어 다량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이 포함될 수 있다.

본 발명의 일구현예로 상기 목적 단백질 암호화 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 암호화되는 Ag85A일 수 있으나, 상술한 바와 같이 분리하여 생산하고자 목적하는 단백질의 종류에 따라 변경하여 이용할 수 있다. 상기 목적 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로 상기 연결 펩타이드는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것일 수 있고, 상기 엔테로키나제 절단부위는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으며, 상기 BiP 단백질의 신호 펩타이드는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명에서 "융합 단백질"이라는 용어는, 셀룰로오스 결합 도메인과 목적 단백질이 융합된 단백질을 의미하는 것으로, 상기 융합 단백질에서 표지(tag)에 해당하는 셀룰로오스 결합도메인을 목적 단백질로부터 제거하는 것은, 목적 단백질의 분리정제에 있어서 중요한 것이다. 이에 본 발명은 셀룰로오스 결합 도메인을 엔테로키나제를 처리하여 용이하게 분리할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 엔테로키나제를 처리한 후, 친화 크로마토크래피인 세파로스 컬럼(STI-sepharose)에 통과시켜주어, 엔테로키나제를 손쉽게 제거할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 식물체 혼합액을 제조할 때 첨가되는 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM의 트리스(Tris) 완충액, 100 내지 200mM의 염화나트륨(NaCl) 용액, 0.01 내지 0.5%의 트리톤 X-100(Triton X-100), 및 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)를 포함하는 것일 수 있고, 식물체의 중량 1g 당 1 내지 10 mL씩 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 내지 8 mL씩 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 형질전환 식물체는, a) 상기 재조합 벡터를 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계; 및 b) 상기 형질전환 균주를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것일 수 있다.

상기 형질전환 균주는 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 또는 샐러리 등의 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 또는 양파의 단자엽 식물이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. CBM3 융합 단백질 발현되는 형질전환 식물체의 제조

도 1과 같이 식물체에서 CBM3 융합 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물체 형질전환용 벡터를 제작하였다. CBM3 융합 단백질을 소포체로 이동시킬 수 있도록 BiP(chaperone binding protein) 단백질의 신호 펩타이드(signal peptide)에 해당하는 genomic DNA 서열을 이용하여 목적 단백질을 소포체로 이동시킬 수 있도록 하였고, 융합 단백질이 소포체에 축적될 수 있도록 카르복실말단에 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 부여하여 소포체에 보존(retention)시켰다. 목적 단백질 (Ag85A)을 코딩하는 유전자의 앞쪽에 융합 단백질 분리에 필요한 셀룰로오스 결합 도메인 (cellulose binding module 3, CBM3)과 연결 펩타이드 (linker), 그리고 엔테로키나제에 의해 인식되어 절단되는 서열을 결합시켜 식물발현용 벡터인 pCAMBIA 1300에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefaciens) LBA-4404 균주에 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 균주를 이용하여 애기장대를 형질전환시켜, 목적 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 제조하였고, 이후 안정적으로 CBM3 융합 단백질을 생산하는 형질전환 식물체를 선별하였다. 상기 재조합벡터에서 사용된 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

	서열(5'-3')
CBM3 염기서열	gtatcaggtaaccttaaggtggagttttacaactcgaacccttctgatacaactaactcaataaacccacagttcaaagttacaaacacaggcagctctgcgatcgatttgtctaaattaaccctcagatactattatacggttgatggacagaaggaccagactttctggtgtgatcatgcagctatcattggttctaacggtagctacaacggaattacatcaaacgtgaagggcactttcgttaagatgtcctctagcactaacaacgcagacacatatttggagatcagttttacggggggaacccttgaaccaggtgctcacgtccagattcaaggaagattcgctaaaaacgactggtcgaactatacccaaagtaatgattacagttttaaatccgcctcacaatttgttgagtgggatcaggtcactgcttacctgaacggggttctagtgtggggaaaggaacctggt	서열번호 1
CBM3 아미노산 서열	VSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPG	서열번호 2
Ag85A 염기서열	tttagccggcctggcctgcctgtggaatacctgcaggtgcctagccctagcatgggccgggacatcaaagtgcagtttcagagcggcggggctaatagccctgctctgtacctgctcgatggcctgcgggctcaggatgattttagcggctgggacatcaacacccctgcttttgaatggtacgatcagagcggcctgagcgtcgtgatgcctgtgggcgggcagagcagcttctacagcgattggtatcagcctgcttgcggcaaagctggctgccagacctacaagtgggaaacctttctgaccagcgaactgcctggctggctgcaggctaatcggcacgtgaaacctaccggcagcgccgtggtgggcctgagcatggctgctagctccgctctgaccctggctatctaccaccctcagcagtttgtgtacgctggcgctatgagcggcctgctcgatccctcccaggctatgggccctaccctgatcgggctcgctatgggggatgctggggggtacaaagctagcgatatgtggggccctaaagaagatcctgcttggcagcggaatgatcctctgctcaacgtgggcaaactgatcgctaataatacccgagtgtgggtgtactgcggcaatggcaaacctagcgatctgggcgggaacaatctgcctgctaaatttctggaaggcttcgtgcggaccagcaacatcaagtttcaggatgcttacaatgctggcgggggccacaatggcgtatttgattttcctgatagcggcacccacagctgggaatactggggcgctcagctgaatgctatgaaacctgatctgcagcgggctctgggcgctacccctaataccggccctgctcctcagggcgctggctccggatctggtagt	서열번호 3
Ag85A 아미노산 서열	FSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGSGSGS	서열번호 4
Linker 염기 서열	gaggcagccgctaaggaagctgcagcgaaa	서열번호 5
EK 염기서열	gatgacgacgataaa	서열번호 6
BiP 염기서열	atggctcgctcgtttggagctaacagtaccgttgtgttggcgatcatcttcttcggtgag tgattttccgatcttcttctccgatttagatctcctctacattgttgcttaatctcagaa ccttttttcgttgttcctggatctgaatgtgtttgtttgcaatttcacgatcttaaaagg ttagatctcgattggtattgacgattggaatctttacgatttcaggatgtttatttgcg ttgtcctctgcaatagaagaggctacgaagtta	서열번호 7
HDEL 아미노산서열	His-Asp-Glu-Leu	서열번호 8

실시예 2. 미세결정셀룰로오스를 이용한 단백질의 분리

미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose cellulose, MCC)에 CBM3 융합 단백질을 흡착시키기 위해 미세결정셀룰로오스 1g에 증류수에 첨가하여 수화시켰다. 이후 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 토양에 심어 약 3주간 배양한 후에 뿌리부분을 제외한 식물체를 막자사발에 담고 액체질소를 이용하여 분말화시켰다. 상기 분말화된 식물체 1g을 새로운 튜브(tube)에 옮겨 담았고, 단백질 추출 완충용액(50mM Tris (pH 7.2), 150mM NaCl, 0.2 % Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)) 5 mL을 첨가하고 와동(vortexing)시켜 잘 혼합하였다. 필터로 미라클로스(Miracloth)를 사용하여 식물 파쇄물을 제거한 후, 미세결정셀룰로오스 1g을 첨가한 후 1시간 동안 4℃에서 잘 혼합시켜 CBM3 융합 단백질이 미세결정셀룰로오스에 흡착되도록 하였다. 이후 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)를 통해 미세결정셀룰로오스에 결합되지 않은 단백질들을 제거 한 후 5mL의 세척용 완충용액(50mM Tris (pH 7.2), 150mM NaCl)으로 미세결정셀룰로오스를 2회 세척하였다. CBM3 융합 단백질의 미세결정셀룰로오스의 흡착은 CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 식물에서 발현된 CBM3 융합 단백질은 거의 손실없이 미세결정셀룰로오스에 잘 흡착되었으며 세척 단계에서도 미세결정셀룰로오스에 흡착되어 있는 CBM3 융합 단백질이 거의 용출되지 않았다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 엔테로키나제를 사용한 융합 단백질의 절단

Ag85A를 포함한 융합 단백질이 흡착된 셀룰로오스를 원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)를 통해 침전 시킨 후 엔테로키나제 반응 용액 (50mM Tris (pH 7.2), 150mM NaCl, 1mM CaCl₂)에 다시 현탁시켰다. 현탁액에 엔테로키나제를 5 단위만큼 첨가하였고 28 ℃에서 반응시킨 후, 시간대 별로 현탁액을 채취하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 엔테로키나제 처리 시간에 따른 융합단백질의 절단은 Ag85A 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다.

그 결과, 도 3 에서 확인할 수 있는 것과 같이, 엔테로키나제 처리에 의한 융합단백질의 절단 반응은 상당히 효율적으로 일어나서 처리 1시간 후 약 70 %의 융합단백질이 절단되었고, 4시간 후에는 융합 단백질은 완전히 절단되어 CBM3와 Ag85A로 분리되었다.

실시예 4. 친화 크로마토그래피로 엔테로키나제 제거를 통한 Ag85A 분리 정제

원심분리(14,000rpm, 4℃, 10분)를 통해 엔테로키나제와 완전 절단된 Ag85A를 포함하는 반응액을 셀룰로오스로 부터 분리하였다 (도 4 좌측). 반응액에서 엔테로키나제를 제거하기 위하여 친화 크로마토그래피를 실시하였다. 반응액에 STI-Sepharose를 넣어 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 빈 컬럼에 넣어 STI-Sepharose에 결합하지 않는 부분을 수확하였다. 도 4 우측에서 확인할 수 있는 것과 같이, STI-Sepharose 친화 크로마토그래피를 통해 반응액에서 엔테로키나제를 제거하고 순수 분리된 Ag85A를 획득할 수 있음을 알 수 있다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 재조합 벡터를 이용한 단백질 분리방법은 용출 과정 없이 엔테로키나제를 이용하여 용이하게 목적 단백질로 분리시킬 수 있었으며, 이를 통하여 최종적으로는 단백질 분리에 소요되는 시간을 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 이는 대량의 단백질을 분리할 경우에는 사용되는 시료의 감소 및 소요시간 단축으로 인하여 작업효율을 극대화할 수 있다는 것을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> BioApplications Inc. POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Recombinant vector containing cellulose binding domain and Purification method for a protein using thereof <130> MP16-366 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM3 <400> 1 gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60 ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120 accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180 gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240 ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300 gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360 tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420 tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM3 <400> 2 Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp 1 5 10 15 Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile 50 55 60 Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr 65 70 75 80 Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu 85 90 95 Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile 100 105 110 Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val 130 135 140 Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly 145 150 155 <210> 3 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ag85A <400> 3 tttagccggc ctggcctgcc tgtggaatac ctgcaggtgc ctagccctag catgggccgg 60 gacatcaaag tgcagtttca gagcggcggg gctaatagcc ctgctctgta cctgctcgat 120 ggcctgcggg ctcaggatga ttttagcggc tgggacatca acacccctgc ttttgaatgg 180 tacgatcaga gcggcctgag cgtcgtgatg cctgtgggcg ggcagagcag cttctacagc 240 gattggtatc agcctgcttg cggcaaagct ggctgccaga cctacaagtg ggaaaccttt 300 ctgaccagcg aactgcctgg ctggctgcag gctaatcggc acgtgaaacc taccggcagc 360 gccgtggtgg gcctgagcat ggctgctagc tccgctctga ccctggctat ctaccaccct 420 cagcagtttg tgtacgctgg cgctatgagc ggcctgctcg atccctccca ggctatgggc 480 cctaccctga tcgggctcgc tatgggggat gctggggggt acaaagctag cgatatgtgg 540 ggccctaaag aagatcctgc ttggcagcgg aatgatcctc tgctcaacgt gggcaaactg 600 atcgctaata atacccgagt gtgggtgtac tgcggcaatg gcaaacctag cgatctgggc 660 gggaacaatc tgcctgctaa atttctggaa ggcttcgtgc ggaccagcaa catcaagttt 720 caggatgctt acaatgctgg cgggggccac aatggcgtat ttgattttcc tgatagcggc 780 acccacagct gggaatactg gggcgctcag ctgaatgcta tgaaacctga tctgcagcgg 840 gctctgggcg ctacccctaa taccggccct gctcctcagg gcgctggctc cggatctggt 900 agt 903 <210> 4 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ag85A <400> 4 Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn 20 25 30 Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe 35 40 45 Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser 50 55 60 Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser 65 70 75 80 Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys 85 90 95 Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn 100 105 110 Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala 115 120 125 Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val 130 135 140 Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly 145 150 155 160 Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala 165 170 175 Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp 180 185 190 Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp 195 200 205 Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu 210 215 220 Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe 225 230 235 240 Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe 245 250 255 Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn 260 265 270 Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr 275 280 285 Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser 290 295 300 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 5 gaggcagccg ctaaggaagc tgcagcgaaa 30 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EK <400> 6 gatgacgacg ataaa 15 <210> 7 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP <400> 7 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HDEL <400> 8 His Asp Glu Leu 1

Claims

셀룰로오스 결합 도메인 3을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합벡터는 셀룰로오스 결합 도메인 3, 연결 펩타이드, 엔테로키나제 절단 부위, 및 목적 단백질 암호화 유전자가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 목적 단백질 암호화 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 연결 펩타이드는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 엔테로키나제 절단부위는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 목적 단백질을 소포체로 타켓팅할 수 있는 BiP(Binding immunoglobulin protein) 단백질을 암호화하는 유전자가 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제6항에 있어서,
상기 BiP 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 재조합벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 암호화하는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
하기 단계를 포함하는 목적 단백질의 분리정제 방법:
제1항의 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체와 단백질 추출 완충용액을 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계(S1);
상기 S1 단계의 혼합액을 셀룰로오스(cellulose)가 채워진 컬럼에 주입하여 셀룰로오스 결합 도메인 3 및 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 셀룰로오스에 흡착시키는 단계(S2); 및
상기 S2 단계에서 상기 융합단백질이 흡착된 셀룰로오스를 원심분리하여 침전시킨 후, 엔테로키나제에 현탁시켜 현탁액을 수득하는 단계(S3).
제9항에 있어서,
상기 S3 단계 후, 세파로스 컬럼에 상기 현탁액을 주입하여 엔테로키나제를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.
제9항에 있어서,
상기 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM의 트리스(Tris) 완충액, 100 내지 200mM의 염화나트륨(NaCl) 용액, 0.01 내지 0.5%의 트리톤 X-100(Triton X-100), 및 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.
제9항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는,
a) 제1항의 재조합 벡터를 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계; 및
b) 상기 형질전환 균주를 이용하여 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.
제12항에 있어서,
상기 균주는 아그로박테리움 튜머페시언스(Agrobacterium tumefaciens)인 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.
제9항에 있어서,
상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.
제9항에 있어서,
상기 셀룰로오스는 미세결정셀룰로오스(Microcrystalline cellulose)인 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 분리정제 방법.