KR101161622B1

KR101161622B1 - 번역 효율 증진용 ｄｎａ 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터

Info

Publication number: KR101161622B1
Application number: KR1020090081403A
Authority: KR
Inventors: 나윤정; 전은현; 권은혜; 김용우; 손은주; 황인환
Original assignee: 헬릭스 주식회사
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2012-07-04
Also published as: IN2012DN02373A; WO2011025242A2; WO2011025242A3; CN102762729A; EP2474614A4; KR20110023485A; EP2474614A9; US20120255069A1; EP2474614A2

Abstract

본 발명은 번역 효율 증진용 ＤＮＡ 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13~14 및 서열번호 16으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 단편으로서 그 하류에 위치한 목적 단백질의 번역을 증진시키는 DNA 단편 및 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 번역 효율 증진용 DNA 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터는 형질전환된 식물체 내에서 목적 단백질의 번역을 향상시킬 수 있는 효과가 있고, 식물체의 특정 소기관으로 타겟팅을 유도하는 표지 유전자를 상기 재조합 벡터에 작동 가능하게 추가 연결할 경우, 목적 단백질이 특정 소기관으로 타겟팅 될 뿐만 아니라 안정하게 축적될 수 있어 식물체로부터 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 효과가 있다.

단백질, 번역, 재조합 벡터, 형질전환, 소기관, 타겟팅, 식물

Description

번역 효율 증진용 ＤＮＡ 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터{DNA fragment to promote translation efficiency and recombinant vectors containing the same}

본 발명은 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산할 수 있도록 단백질의 합성을 번역(translation) 단계에서 효과적으로 향상시킬 수 있는 DNA 단편 및 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

일반적으로 식물은 형질전환이 쉽고 단백질 재료로써 경제적으로 저렴하기 때문에 생물약제로 사용가능한 단백질(biopharmceutical protein) 및 펩타이드(peptide)의 생산에 많은 잠재력을 가지고 있다. 한편, 현재까지 대부분의 생의약품은 전형적으로 배양된 포유류 세포, 박테리아, 곰팡이 등을 형질 전환시켜 이로부터 생산되어 왔다(Ganz PR 외, 1996; Ma JK 외, 1999; Pen J, 1996). 그러나 이러한 포유류 세포, 박테리아, 곰팡이들에 비해 식물에서 치료 단백질을 생산하는 것은 병원균의 오염에 의한 위험의 감소 및 높은 생산 수율을 가져올 수 있으며, 씨앗이나 다른 저장 기관에서의 생산과 같이 경제적 측면과 함께 질적인 측면에서 여러 가지 잇점을 가진다. 또한, 식물은 잠재적으로 재조합 생산물을 생산할 수 있는 저렴한 대상이 될 수 있고, 형질 전환한 곡류의 경작, 수확, 저장, 처리 또한 현재의 기반구조를 사용할 수 있으며, 비교적 적은 자본의 투자만을 필요로 하기 때문에 생의약품의 상업적인 생산에서 매우 큰 전망을 갖게 해준다.

따라서 식물 세포를 형질전환시켜 목적하는 유용단백질을 고효율로 얻기 위한 식물 발현 시스템들의 개발이 각광을 받고 있으며, 이러한 식물 발현 시스템들은 재조합 단백질의 발현 수준이 식물이 숙주 단백질들을 기관으로 표적화하는데 사용하는 선척적 분류 및 표적화 기작을 이용함으로써 향상될 수 있다는 점에서 매력적이고, 식물 파생적 생물약제들을 쉽게 대량으로 생산할 수 있다는 장점이 있다.

그러나 식물체를 이용하여 목적 유용단백질을 생산하는 것은 식물의 종 선별, 조직 선택, 발현 및 회복 전략과 번역 후 프로세싱 등이 식물 기반의 생산 가능성을 결정하는 중요 인자로 작용할 수 있다.

최근에는 식물세포를 이용하여 유용단백질을 생산하는 방법에 있어서 핵을 형질전환시키는 방법이 많이 연구되어왔다. 그러나 핵에 도입되는 유전자들은 대개 한 개 내지는 소수의 유전자가 도입되기 때문에 유용한 단백질을 대량생산 하는 데는 한계가 있다. 또한 염색체 상의 헤테로크로마틴(heterochromatin) 부위에 외래 유전자가 삽입되었을 경우 비록 형질전환이 되었다 하더라도 발현이 일어나지 않고 도입되는 부위에 따라 형질전환의 정도가 달라지는 문제점이 있다. 따라서 근래에는 미토콘드리아나 엽록체 또는 색소체 등에 유전자를 도입하여 대량 발현을 유도하고자 하는 노력이 많이 시도되고 있다.

한편, 진핵 생물의 단백질 발현 조절에는 일차적으로 전령(messenger) RNA 수준에서는 전사의 개시(transcriptional initiation), DNA로부터 전령 RNA에 전사 (transcript)된 유전 정보의 안정, 전사과정(transcript processing)과 변형 (modification), 이차적으로 단백질 수준에서의 번역개시(translational initiation) 및 단백질의 안정성 조절 등이 관여하게 된다.

이에 많은 연구자들은 목적 유전자를 세포에 형질전환 시킨 후 목적 단백질의 발현을 조절함으로써 유용단백질의 생산을 증진시키고자 하였으며, 특히 단백질합성 프로세싱 중, 초기 과정인 전사(transcription) 단계에서의 발현을 증진시키기 위해 강력한 프로모터들이 개발되었다. 그러나 목적하는 유전자를 형질전환 식물체 내에서 효과적으로 발현시키기 위해서는 유전자 발현벡터 제작에 앞서 유전자의 프로모터, 인트론의 선택, 코돈 변형 등의 요소를 고려해야 하는데, 전사 단계에서의 조절을 통해 유전자 전사량을 너무 높여주었을 때 오히려 형질전환 식물체 시스템에 해가 될 수 있고, 또한 전사량을 높여주는 것에 한계가 있다는 문제점이 발생하였으며, 무엇보다도 전사를 통해 생산된 많은 양의 mRNA가 모두 번역되어 단백질로 합성되지 않는다는 사실이 보고되었다.

따라서 유전자로부터 최종적으로 합성되어지는 단백질의 양은 전사 단계 보다는 번역 단계에서의 조절이 더 중요한 작용을 하고 있다는 사실이 밝혀짐에 따라 효과적인 유용 단백질의 대량생산을 위해서는 전사 단계가 아닌 번역 단계에서의 단백질 발현 조절 및 특정 세포 소기관으로의 단백질 이동을 통한 새로운 단백질의 발현 조절 기술이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 번역 단계에서 단백질의 합성을 증진시켜 유용단백질을 식물체에로부터 대량생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 애기장대의 게놈 DNA로부터 번역 효율 매우 우수한 DNA 단편을 발견하였으며, 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터에 식물체의 소포체 또는 엽록체로 타겟팅을 유도하는 표지 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물체를 형질전환 시켰을 경우, 목적 단백질의 번역 효율이 증진되고, 소포체 또는 엽록체로 목적 단백질이 타겟팅 됨으로써 안정하게 축적될 수 있어 식물체로부터 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 DNA 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포 또는 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13~14 및 서열번호 16으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 단편으로서, 그 하류에 위치한 목적 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 번역 효율 증진용 DNA 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 번역 효율 증진용 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터, 상기 본 발명에 따른 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하 게 연결될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 및 유지(retention)할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)하는 염기서열은 Bip(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 서열번호 18로 표시되는 염기서열이고, 상기 목적 단백질을 유지(retention)하는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 셀룰로오스-결합 도메인(cellulose-binding domain:CBD)을 코딩하는 서열번호 21의 염기서열이 추가적으로 작동 가능하게 연결될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터의 식물체로의 도입은 아그로박테리움(Agrobacterium sp .)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG 침전법(Polyethylen glycol) 으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 번역 효율 증진용 DNA 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터는 형질전환된 식물체 내에서 목적 단백질의 번역을 향상시킬 수 있는 효과가 있고, 식물체의 특정 소기관으로 타겟팅을 유도하는 표지 유전자를 상기 재조합 벡터에 작동 가능하게 추가 연결할 경우, 목적 단백질이 식물체의 특정 소기관으로 타겟팅 될 뿐만 아니라 안정하게 축적될 수 있어 식물체로부터 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 효과가 있다.

본 발명자들은 유용단백질의 생산을 극대화하기 위한 방법으로 단백질의 발현 조절을 번역(translation) 단계에서 조절하기 위해 5‘비번역 부위(5’UTR:5’untranslated region)의 염기서열을 사용하였다.

일반적으로 mRNA의 5‘비번역 부위(5' untranslated region, UTR)은 유전자 발현의 전사 후 조절, 핵 밖으로의 mRNA 수송의 조절, 단백질 번역의 효율 및 mRNA 의 안정성 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 바 있다. 특히, 5' UTR은 리더 시퀀스로도 알려져 있으며, 박테리아에서는 샤인-달가노 시퀀스(Shine-Delarno sequence, AGGAGGU)라고 알려져 있는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함한다. 이러한 5’UTR의 길이는 백 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 되어 있고, 3’UTR의 길이는 그보다 더 긴 몇 킬로베이스로 이루어져 있다. 또한, 원핵생물에 5’UTR에 위치한 리보솜 결합 부위 시퀀스로 알려진 샤인-달가노 시퀀스 (Shine-Dalgarno sequence)와 같이 정해진 위치는 아니지만 진핵생물에서도 리보솜 결합 부위 시퀀스라 할 수 있는 5’UTR에 속한 시퀀스들에 관한 연구 결과가 보고된 바 있다(Kozak M, 1987, Hamilton 외 1987, Yamauchi 외 1991, Joshi 외 1997).

또한, mRNA의 번역(translation)은 그 효율에 따라 단백질 생산량이 변화될 수 있는데, 이것은 유전자 조절에 있어 매우 중요하다고 할 수 있다. 5’UTR의 특징은 주로 mRNA 번역을 조절하는데 있으며, 5’UTR의 일부인 번역 개시코돈 주변 시퀀스의 성분(context)이 번역 효율 조절에 이용되는데(Xiong W 외, 2001; Rogozin IB 외, 2001; Gallie DR 외, 1989; Mignone F 외, 2002; Kawaguchi R 외, 2002,2005), 그 대표적인 예로는 리불로스 비스포스페이트 카복시라아제/옥시게나아제(RUBISCO)의 작은 서브유니트(subunit; RbcS) 유전자의 5’UTR이 사용되고 있다.

이에 본 발명자들은 목적 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 방법으로 단백 질의 번역을 증진시킬 수 있는 새로운 기술을 찾기 위해 애기장대의 전체 게놈에 코딩된 5‘UTR의 서열을 대상으로 번역 효율이 우수한 것으로 알려진 리불로스 비스포스페이트 카복시라아제/옥시게나아제(RUBISCO)의 작은 서브유니트(RbcS) 유전자의 5’UTR 서열과 서열 유사성이 높은 50개의 서열들을 스크리닝 하였고, 스크리닝된 서열들 각각의 번역 효율을 확인하기 위해 5’UTR::GFP 구조물을 각각 제조한 뒤, 각 5’UTR에 의한 GFP의 번역 효율을 측정한 결과, 50개의 스크리닝된 서열 들 중, 6개의 5’UTR 서열이 우수한 번역 효율을 가진다는 사실을 확인하였으며, 이들 서열을 각각 서열번호 1 내지 6으로 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 단백질의 번역 효율에 있어서, 5’UTR 서열의 염기가 특별히 중요한 작용을 하는지 확인하기 위해 서열번호 1의 5’UTR 서열의 일부 염기가 치환된 돌연변이(base substitution mutagenesis) UTR을 제작하였는데, 즉, 1번 5’UTR 서열의 3’-말단의 3개 뉴클레오티드를 각각 티민(T: thymine), 아데닌(A: adenine), 구아닌(G: guanine) 및 시토신(C: cytosine)의 연속된 염기로 치환하였고, 또한, 1번 5’ UTR 서열의 3’-말단의 마지막에 위치하는 1개의 뉴클레오티드를 티민으로 치환시킨 돌연변이 서열을 제작하였으며, 또한, 서열번호 1의 5’UTR 서열의 3’-말단 부위이자 목적 단백질의 개시코돈으로부터 네 번째 및 다섯 번째의 염기를 티민(T), 구아닌(G) 및 시토신(C)의 각각 두 개의 연속된 염기로 치환된 돌연변이 서열을 제작하였고, 서열번호 1의 5’ UTR 서열의 3’-말단으로부터 세 번째 염기를 티민으로 치환한 돌연변이 서열을 제작하였다. 이후 상기 제조된 돌연변이 UTR 서열들을 대상으로 이들에 의한 단백질의 번역 효율을 측정하였다.

그 결과, 서열번호 1에 따른 5’UTR 서열의 3’-말단의 3개 뉴클레오티드를 티민의 연속된 염기로 치환한 경우, 3’-말단의 마지막에 위치하는 1개의 뉴클레오티드를 티민으로 치환한 경우, 3’-말단으로부터 세 번째 염기를 티민으로 치환한 경우 및 3’-말단 부위이자 목적 단백질의 개시코돈으로부터 네 번째 및 다섯 번째의 염기를 티민으로 치환한 경우를 제외하고는 모두 단백질의 번역 효율이 Rbc의 5’UTR 보다 더 우수한 것으로 나타났다.

나아가 본 발명자들은 상기 결과를 토대로, 단백질의 번역 효율이 우수한 서열들의 공통점을 확인한 결과, AAG 또는 이와 유사한 서열이 많이 관찰된다는 사실을 통해 서열번호 1에 따른 5’UTR 서열의 3’-말단의 3개의 염기가 AAG가 반복되는 인위적인 서열을 제조하였고, 이에 대한 단백질의 번역 효율을 측정한 결과 대조군으로 사용한 Rbc의 5’UTR 보다 더 우수한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 50개의 스크리닝된 5’UTR 서열 중 번역 효율이 우수한 6개의 서열 및 번역 효율이 우수한 상기 돌연변이 5’UTR 서열들에 대해 하기 표에 기재된 바와 같이 각각의 서열번호를 부여하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13~14 및 서열번호 16으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 단편으로서, 그 하류에 위치한 목적 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 DNA 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13~14 및 서열번호 16으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 프로모터, 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터일 수 있다.

본 발명에서 상기 "발현 벡터"라는 용어는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분 야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한 식물 세포 내로 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 발 명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 목적 단백질을 고효율로 번역할 수 있는 상기 본 발명에 따른 DNA 단편을 이용하여 높은 수준의 단백질 발현을 식물체에서 유도함과 동시에 적절한 소기관으로 목적 단백질의 타겟팅을 유도하기 위한 발현 벡터를 제조하였다.

일반적으로 형질전환 식물체 또는 세포내에서 목적 단백질을 과발현시키는 경우, 단백질이 분해(proteolytic degradation)되는 현상들이 종종 발생한다. 그러나 다양한 세포내 소기관으로 외래 단백질을 타겟팅시킬 경우에는 이들 단백질을 보다 안정적으로 저장할 수 있으며, 특히, 목적 단백질을 소포체로 타겟팅 할 경우, 세포질에 존재하는 것 보다 단백질의 분해를 최소화 할 수 있으며, 이러한 예로 담배에서 인간 상피 성장 인자를 소포체로 타겟팅 시켰을 때 단백질의 수율이 약 10⁴배나 증가된다는 것이 알려져 있다(Wirth, S. et al., 2004). 또한, KDEL 또는 HDEL과 같은 소포체 저장 신호 펩타이드(ER retention signal peptide)를 이용하면 목적 단백질을 소포체내에 머물도록 함으로써 분자 샤페론에 의한 폴딩(folding)과 조합(assembly)이 증가되어 결과적으로 단백질의 분해를 최소화 할 수 있다(Nuttall, J. etal.,2002). 이러한 예로서, 목적 단백질을 분비 경로로 보 냈을 때보다 소포체에 유지(retention) 시킨 경우, 목적 단백질의 수율이 10~100배 정도 증가된다고 알려진 바 있다(Hellwig, S. etal .,2004).

또한, 식물의 엽록체는 총 수용성 단백질의 40% 이상을 함유하고 있는 거대한 단백질 저장소일 뿐만 아니라 그 수가 많기 때문에 목적 단백질의 저장소로서 좋은 타겟이 되고 있다. 식물의 엽록체 내에는 단백질 프로세싱에 필요한 최소한의 프로테아제(protease)만을 포함하고 있는데, 이것은 목적 단백질을 프로테아제에 의해 분해되는 것을 막음으로써 엽록체 내에 고농도로 저장할 수 있음을 의미한다.

따라서 본 발명자들은 프로모터, 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터에 식물체의 특정 소기관, 즉, 소포체 또는 엽록체로 목적 단백질을 타겟팅 할 수 있는 표지 서열을 추가적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하였다.

이때, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 할 경우에는 Bip(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 염기서열을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 번역 효율을 증진시키기 위해 Bip의 cDNA 대신 인트론을 포함하는 Bip의 게놈 DNA인 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 사용할 수 있다. 상기 목적 단백질을 유지(retention)시키기 위한 염기서열로는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 사용할 수 있다.

상기 BiP는 루미날 결합 단백질(luminal binding protein)로서, 면역글로불 린 중사슬 결합 단백질(immunoglobulin heavy chain binding protein)과 글루코스 조절 단백질(glucose regulated protein)로 동정되었으며, 소포체에 위치해 있는 HSP70 샤페론 패밀리의 한 종류이며 소포체에서 새로이 합성된 단백질에 일시적으로 결합한다. 또한, BiP 단백질의 N-말단에는 소포체로의 타겟팅을 결정하는 신호 서열을 함유하고 있어 목적 단백질들을 소포체로 타겟팅 시키는 역할을 한다.

또한, 상기 식물 세포에서 엽록체로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)할 경우에는 Cab(엽록소 a/b 결합 단백질)을 코팅하는 염기서열을 사용할 수 있다.

상기 Cab(엽록소 a/b 결합 단백질)은 N-말단에 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드(transit peptide)를 가지고 있어서, 이 펩타이드를 이용할 경우, 목적 단백질을 정상적으로 엽록체로 타겟팅 할 수 있다(kavanagh TA. etal.,1988). 따라서 이러한 BiP의 신호 서열, 소포체 유지 신호 서열 또는 Cab의 트랜지트 펩타이드 등을 이용한 발현 벡터를 사용할 경우, 목적 단백질을 소포체 또는 엽록체로 타겟팅 시킬 수 있는 효과 뿐만 아니라 목적 단백질을 높은 수준으로 축적시켜 대량 생산할 수 있는 효과가 있다.

나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터를 당분야에 공지된 방법을 사용하여 식물체 내로 도입시킴으로써 형질전환된 식물을 제공한다.

상기 본 발명의 재조합 벡터를 식물체 내로 도입하는 방법은 이에 제한되지는 않으나, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 애기장대를 형질전환 하였다.

또한, 상기 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 즉, 식물체내에서 목적 단백질이 고효율로 번역되고 특정 소기관에 축적되어 있어서 상기 목적 단백질을 고효율로 생산할 수 있는 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환된 식물은 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 상기 쌍자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추,감자, 터마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당 근 및 샐러리일 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파일 수 있다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 특별히 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상업적 용도, 즉, 농업적 또는 의약학적으로 유용하게 이용될 수 있어 대량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이 포함될 수 있으며, 이러한 단백질로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 혈청 단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액 인자), 면역글로불린, 사이토카인(예, 인터루킨), α-, β- 및 γ-인터페론, 콜로니 자극 인자(G-CSF 및 GM-CSF 포함), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 성장 인자(예, TCFα 또는 TGFβ와 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자), 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유도체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide; CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF) 등이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적 단백질은 효소를 포함할 수 있으며, 이러한 예로는 탄 수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제가 포함될 수 있다. 또한, 상기 목적 단백질로서 리포터 단백질들이 포함될 수 있는데, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 목적 단백질로 녹색 형광 단백질(GFP)를 사용하였다.

상기 형질전환된 식물체로부터 목적 단백질을 생산하는 방법은 본 발명에 따른 단백질 번역 증진 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 염기서열이 프로모터와 작동 가능하게 연결된 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 도입하거나 또는 상기 재조합 발현 벡터로 세포를 형질전환 시킨 다음, 목적 단백질이 발현되도록 적당한 시간동안 배양한 후, 형질전환된 식물 또는 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용가능하다. 또한 형질전환된 식물 또는 세포에서 고발현된 목적 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위하여 상기 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토 그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 목적 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

또한, 본 발명에서는 상기 형질전환된 식물체로부터 목적 단백질을 보다 간편하고 빠르게 분리 및 정제하기 위해 앞서 기술한 본 발명의 재조합 벡터에 셀룰라제의 셀룰로오스-결합 도메인(cellulose-binding domain:CBD)을 코딩하는 염기서열, 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 추가적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하였다.

따라서 본 발명에서는 셀룰로오스-결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터를 사용함에 따라 발현된 목적 단백질이 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 형태일 수 있으며, 따라서 셀룰로오스 담체를 컬럼으로 이용하는 크로마토그래피를 통하여 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

또한, 이렇게 생산된 융합된 형태의 목적 단백질은 적절한 효소 등을 이용하여 셀룰로오스 결합 도메인을 절단한 다음 추가적인 분리 정제 과정을 거쳐서 비융합된 형태의 목적 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 프로모터, 단백질의 번역을 증진시키는 본 발명에 따른 DNA 단편 및 목적 단백질(GFP)을 코딩하는 염기서열이 포함된 벡터에 셀룰로 오스-결합 도메인(cellulose-binding domain:CBD)이 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 식물체에 도입하였을 경우, 형질전환된 식물체로부터 고발현된 목적 단백질을 셀룰로오스-결합 도메인을 이용하여 거의 90%에 가까운 수율로 분리 및 정제할 수 있음을 확인하였다. 또한, CBD 서열이 연결된 상기 재조합 벡터에 TEV 프로테아제 사이트를 추가 연결한 벡터를 사용하였을 경우, TEV 프로테아제에 의해 CBD가 절단되어 비융합된 목적 단백질만을 정제할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

5' UTR 서열의 스크리닝

본 발명자들은 목적하는 유전자의 발현을 증가시키기 위해 애기장대의 전체 게놈을 대상으로 번역 효율이 높은 5'UTR 서열을 스크리닝 하였다. 상기 스크리닝은 생물정보학 프로그램을 사용하여 애기장대 전체 게놈에서 유전자의 N-말단 부위에 위치하는 비번역 부위(untranslated region: UTR) 시퀀스를 수집한 뒤, 코딩 시퀀스(coding sequence)의 개시코돈 바로 앞에 위치하는 21개의 시퀀스만을 선별하여 리스트를 만들었다. 이후, 유전자의 번역효율이 높은 것으로 알려져 있는 리불로스 비스포스페이트 카복시라아제/옥시게나아제(RUBISCO)의 작은 서브유니트 (small subunit; RbcS) 유전자의 5’ UTR 시퀀스를 기준으로 전체 애기장대 게놈에 코팅된 유전자들의 5’ UTR의 21개 염기서열을 RbcS 5’UTR과 서열 유사성을 비교하였다. 이후, RbcS 5’UTR과 서열 유사성이 높은 것부터 낮은 것에 이르기까지 범위를 두어 시퀀스를 선정하였다.

그 결과, 상기 표 1에 기재된 바와 같이, RbcS 5’UTR과 서열 유사성이 비교적 높다고 판단되는 총 50개의 애기장대 UTR 서열을 선정하였고, 이들 각각의 서열에 대해 1번부터 50번까지의 번호를 부여하였다.

<실시예 2>

번역 효율이 높은 5'UTR 서열의 선정

<2-1> 5' UTR 서열의 번역효율을 확인하기 위한 재조합 벡터 제작

상기 실시예 1에서 스크리닝한 총 50개의 5’UTR 서열에 대하여 이들 중 가장 번역효율이 우수한 서열을 애기장대의 원형질체에서 확인하기 위해 상기 50개의 5’UTR 서열 각각에 대하여 5’UTR::GFP 구조를 PCR 방법을 이용하여 구축하였다. 즉 선정된 각각의 5’ UTR의 21개 염기서열과 녹색 형광단백질(GFP)의 단백질 번역 개시코돈인 AUG를 포함한 N-말단 부위의 시퀀스를 업스트림 프라이머로 사용하였고, nos 종결자(nos terminator)를 다운 스트림 프라이머로 사용하였으며, 플라스미드 326-GFP (Arabidopsis Biological Resource center, Ohio State University, Ohio, USA)를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 증폭 DNA는 XcmI-선형화된 pBluescript로 접합시켰으며 5’UTR과 GFP 접합부위를 염기서열 분석으로 확인한 후, 5’UTR-GFP를 포함하는 DNA를 XbaI/XhoI으로 절단하고, XbaI/XhoI-선형화된 326-GFP3G(nos 종결자 앞 부분에 SmaI/HindIII/ClaI/SalI/XhoI 제한효소가 더해진 326-GFP벡터)에 접합시켜 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터 (35Sp)에 UTR::GFP 및 nos 종결자로 이루어지는 플라스미드를 얻었다(도 1a 참조). 이때, 하기 수행되는 실험들의 대조군으로는 본 발명에서 스크리닝한 5’UTR 서열 대신 RbcS 5’UTR로 제조된 벡터를 사용하였다.

<2-2> 현광현미경 및 면역 블럿팅 분석을 통한 번역효율이 높은 5'UTR 서열의 선정

상기 실시예 <2-1>에서 제작한 각 50개의 5’UTR 서열을 포함하여 제작한 플라스미드 35Sp-UTR::GFP를 당업계에 잘 알려진 PEG-매개성 형질전환 방법(PEG-mediated transformation)으로 애기장대의 원형질체 내로 도입하였고(Jin et al., Plant Cell 13: 1511-1526, 2001), 형광 현미경을 통해 각 5’UTR 서열에 의한 GFP의 발현을 세포질에서 관찰하였다. 또한, 5’UTR 서열의 번역 효율을 면역 블럿팅 방법으로 확인하였는데, 즉, 상기 35Sp-UTR::GFP 플라스미드로 형질전환된 애기장대 잎을 23℃의 인공 환경실에서 24시간 보관한 다음, 보관용액인 W5 용액 (154mM NaCl, 125mM CaCl₂,5mM KCl,5mM Glucose,1.5mM MES, pH 5.6)을 제거한 뒤, 단백질 추출을 위해 변성 완충용액(denaturation buffer ; 10% SDS, β-mercaptoethanol)을 넣고 원형질체를 깨뜨린 후 끓는 물에서 중탕하고 4 ℃, 13,000 rpm 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액을 SDS-PAGE 전기영동 시킨 후, 단일클론성 항-GFP 항체(monoclonal anti-GFP antibody, Clontech cat no. 632381)를 이용하여 면역블럿팅을 수행함으로써 35Sp-UTR(NO.1~50)::GFP의 단백질 발현량을 분석하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 형광현미경 분석을 통해 본 발명의 5’ UTR이 GFP 본래의 성질에 영향을 주지 않으면서 5’UTR에 따라서 다양한 발현 효율을 보인다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 면역블럿팅 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 스크리닝한 50개의 5’ UTR 중에 하기 표 2에 기재된 1, 2, 6, 7, 24 및 36번의 5’ UTR의 경우, 대조군으로 사용된 RbcS 5’UTR 보다 GFP의 발현량이 약 1배 내지 약 2배 더 증가한 것으로 나타났다.

번역효율이 우수한 5개의 5'UTR 서열

5’UTR 번호	염기서열	서열번호
1	AGAGAAGACGAAACACAAAAG	1
2	GAGAGAAGAAAGAAGAAGACG	2
6	AAAACTTTGGATCAATCAACA	3
7	CTCTAATCACCAGGAGTAAAA	4
24	AGAAAAGCTTTGAGCAGAAAC	5
35	AACACTAAAAGTAGAAGAAAA	6

< 실시예 3>

본 발명에 따른 5’UTR의 염기 치환에 따른 번역효율 분석

<3-1> 돌연변이 5’UTR의 번역효율 분석

본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 50개의 스크리닝된 5’ UTR 중에서 1, 2, 6, 7, 24 및 36번의 5’ UTR이 높은 번역효율이 있다는 것을 확인하였고, 이러한 5’ UTR의 번역효율에 5’ UTR의 염기가 중요한 역할을 하는 것인지를 확인하기 위하여 다음과 같이 5’ UTR의 일부 염기를 치환한 후, 치환된 염기서열을 갖는 5’UTR의 번역효율을 확인하는 실험을 수행하였다. 먼저, 이를 위해 번역효율이 우수한 것으로 확인된 1번 UTR(서열번호 1)을 대상으로 일부 염기가 치환된 돌연변이(base substitution mutagenesis) UTR을 제작하였는데, 즉, 1번 5’UTR 서열의 3’-말단의 3개 뉴클레오티드를 각각 티민(T: thymine), 아데닌(A: adenine), 구아닌(G: guanine) 및 시토신(C: cytosine)의 연속된 염기로 치환하였고, 또한, 1번 5’ UTR 서열의 3’-말단의 마지막에 위치하는 1개의 뉴클레오티드를 티민으로 치환하는 플라스미드를 제작하였다.

또한, 본 발명자들은 1번 5’ UTR 서열의 3’-말단 부위이자 GFP의 개시코돈으로부터 네 번째 및 다섯 번째의 염기를 티민, 구아닌 및 시토신 각각 두 개의 연속된 시퀀스로 치환된 변이체를 제작하였고, 1번 5’ UTR 서열의 3’-말단으로부터 세 번째 염기를 티민으로 치환한 변이체를 제작하였다. 상기와 같이 1번 5’ UTR 서열의 염기를 일부 치환한 돌연변이 UTR 서열들은 하기 표 3에 기재하였다. 이후, 이들 돌연변이 UTR들은 GFP에 융합함으로써 5’ UTR 변이체::GFP의 플라즈미드를 제작하였는데, 플라스미드 제작은 상기 실시예 <2-1>에 기술한 벡터 제작방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 만들어진 플라스미드는 PEG-매개성 형질전환 방법 (PEG-mediated transformation)에 의해 애기장대 원형질체 내로 도입하였다. 단백질 추출과정 또한 상기 실시예 <2-2>의 방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 이로부터 분리된 상등액을 SDS-PAGE로 전기영동한 후, 단일클론성 항-GFP 항체 (monoclonal anti-GFP antibody, Clontech cat no. 632381)를 이용하여 면역 블럿팅으로 35S-UTR(돌연변이체)::GFP의 단백질 발현량을 분석하였다. 이때 대조군으로는 5’UTR 서열 대신 RbcS 5’UTR(서열번호 17: 5‘-CACAAAGAGTAAAGAAGAACA-3’)을 사용하였다.

서열번호 1의 UTR을 대상으로 염기 치환된 돌연변이 5'UTR 서열들

5’UTR	염기서열	서열번호
5’UTR 1번	AGAGAAGACGAAACACAAAAG	1
U1 TTT	AGAGAAGACGAAACACAATTT	7
U1 AAA	AGAGAAGACGAAACACAAAAA	8
U1 CCC	AGAGAAGACGAAACACAACCC	9
U1 GGG	AGAGAAGACGAAACACAAGGG	10
U1(-1T)	AGAGAAGACGAAACACAAAAT	11
U1(-4,5T)	AGAGAAGACGAAACACTTAAG	12
U1(-4,5G)	AGAGAAGACGAAACACGGAAG	13
U1(-4,5C)	AGAGAAGACGAAACACCCAAG	14
U1(-3T)	AGAGAAGACGAAACACAATAG	15
UAAG	AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG	16

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, RbcS 5’UTR을 사용한 대조군에서 보여지는 발현 정도의 시그날을 1로 하였을 경우, 서열번호 7 및 서열번호 11의 돌연변이, 즉 35Sp-U1TTT::GFP와 35Sp-U1(-1T)::GFP는 거의 발현되지 않았으나. 35Sp-U1AAA::GFP(서열번호 8)는 대조군에 비해 0.91배 및 35Sp-U1CCC::GFP(서열번호 9)는 0.96배 더 높은 발현량을 보였으며, 35Sp-U1GGG::GFP(서열번호 10)의 경우도 대조군에 비해 약 1.6배 정도 더 높은 발현량을 보였다.

또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 서열번호 12 및 15의 UTR 변이체들은 GFP가 거의 발현되지 않거나 또는 미량 발현되는 것으로 확인되었고, 반면 서열번호 13 및 14의 UTR 변이체들은 대조군에 비해 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

<3-2> AAG 가 반복되는 5’ UTR 의 번역효율 분석

상기 <3-1>의 결과를 통해 전반적으로 번역효율이 높은 5’UTR의 서열들을 비교한 결과, 특히 AAG 또는 이와 유사한 서열이 자주 관찰되었다. 이에 본 발명자들은 이들 AAG 서열이 번역효율에 미치는 영향을 확인하기 위해서 인위적으로 AAG가 반복되는 5’UTR를 상기 표 4의 서열번호 16으로 표시되는 서열을 가지도록 제작하였다. 이후, 상기 <3-1>과 동일한 방법으로 애기장대에 형질전환 시킨 후 발현된 GFP의 양을 면역 블럿팅을 수행하여 확인하였다.

그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, AAG 서열이 반복되도록 제작한 5’UTR의 경우, 대조군에 비해 GFP의 발현이 약 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4>

본 발명의 5’UTR에 대한 단자엽 식물에서의 번역효율 분석

상기 실시예 3을 통해 본 발명에서 확인된 서열번호 1 내지 17의 염기서열을 가지는 5’UTR 서열이 쌍자엽 식물인 애기장대에서 단백질의 번역을 증진시킨다는 것을 확인함에 따라 본 발명에 따른 상기 5’UTR 서열이 단자엽 식물에서도 동일하게 단백질의 번역을 증진시킬 수 있는지를 확인하기 위해 서열번호 1의 5’UTR을 대상으로 밀 배아 추출물 시스템(wheat germ extract system, Promega, TNTT7 Coupled Wheat Germ Extract System, cat no. L4140)을 사용하여 in vitro 번역 실험을 수행하였다. 이를 위해 326-GFP3G에 들어있는 35Sp-RbcUTR::GFP(대조군)와 35Sp-UTR1::GFP를 각각 제한효소 XbaI/XhoI으로 잘라내어 XbaI/XhoI으로 선형화된 pBluescript에 접합시켰으며 이를 다시 제한효소 XmnI으로 선형화하여 T7 프로모터 (T7p)를 이용하는 T7p-RbcUTR::GFP, T7p-UTR1::GFP 플라스미드를 완성하였다. 이후, 단백질 추출 및 면역 블럿팅은 앞서 수행한 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 발현된 GFP의 양은 대조군에 비해 본 발명에 따른 UTR1의 경우, 약 2배 더 높게 발현된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 UTR 서열, 즉 서열번호 1~6, 서열번호 8~10, 서열번호 13~14 및 서열번호 16의 염기서열을 가지는 UTR은 in vivo 및 in vitro 모두에서 단백질의 번역을 증진시킬 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 애기장대가 속하는 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라 외떡잎 식물(minocots)에서도 모두 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 통해 UTR을 매개하는 단백질 번역 메카니즘은 쌍떡잎 및 외떡잎 식물 상호간에 보전성(conservation)이 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

본 발명의 5’UTR 서열을 포함하는 소포체 타겟팅용 발현벡터 제작

본 발명자들은 목적하는 단백질이 식물체의 소포체에 타겟팅되고 높은 수준으로 발현되는 벡터를 제작하기 위해 서열번호 18로 표시되는 BiP(chaperone binding protein)의 리더 서열을 사용하였는데, 상기 서열번호 18의 BiP 서열은 단백질의 번역효율을 높이기 위해 cDNA 대신에 인트론을 포함한 게놈 DNA를 이용하여 14개의 아미노산을 갖는 서열이다. 또한 외래 단백질을 소포체내에 오래 머물게 하는 작용을 하는 공지된 HDEL 펩티드 서열을 상기 벡터 제작에 사용하였고, UTR 서열로는 단백질의 번역 효율이 우수한 서열번호 6의 UTR을 사용하였다. 즉, 본 발명자들은 소포체에 타겟팅을 위한 발현 벡터로서 도 4에 나타낸 바와 같이, 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 및 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL의 벡터를 제작하였는데, 상기 제작은 플라스미드 326-GFP(Arabidopsis biological Resource center, ohio State university, Ohio,USA)를 기본 벡터로 사용하였고, 상기 기본 벡터의 35S 프로모터 뒤에 서열번호 6의 UTR 서열을 삽입하였으며, 녹색형광 단백질로 알려진 GFP(sGFP, Clontech, USA)에 HA tagging된 것을 기초로 키메릭 구조를 제조하였다. 이후, 샤페론 결합 단백질(BiP)의 신호 서열을 포함하는 N-말단 부분(서열번호 18의 BiP 서열)을 GFP-코딩영역의 N-말단에 융합시켜 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA를 제작하였고, 또한, 상기 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA의 HA tag c-말단에 HDEL의 4개의 아미노산 서열을 추가하여 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL를 제작하였다. 이때, 상기 BiP의 삽입은 서열번호 18의 서열을 주형으로 하고 하기 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭한 후 35Sp-UTR35::GFP:HA 또는 35Sp-UTR35::GFP:HA:HDEL의 기본벡터의 GFP 코딩 영역의 N-말단에 연결하여 제작하였다.

서열번호 19(BIP-F): 5'-ATGGCTCGCTCGTTTGGAGCT-3'

서열번호 20(BIP-R): 5'-TAACTTCGTAGCCTCTTCTATTG-3'

<실시예 6>

소포체 타겟팅용 발현벡터에 의한 소포체 내에서의 단백질 위치확인

상기 실시예 5에서 제조한 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 및 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL 벡터를 상기 실시예 <2-2>의 PEG-매개성 형질전환 방법을 사용하여 애기장대 원형질체 내로 도입하여 상기 벡터로 형질전환된 애기장대를 제조하였다. 이후, 형질전환된 애기장대의 잎을 대상으로 상기 실시예 <2-2>에서 수행한 형광 현미경 관찰 방법을 통해 발현된 GFP의 세포내 위치를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 및 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL 벡터로 형질전환된 애기장대의 경우, GFP 단백질이 모두 소포체에 우치하고 있음을 알 수 있었다. 따라서 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 벡터의 경우 목적하는 단백질을 소포체로 타켓팅 시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 7>

식물체에서 발현된 단백질의 분리 및 정제용 벡터 제작

상기 실시예 6의 결과를 통해 본 발명자들은 식물체 내에서 고발현 및 고번역된 단백질을 분리 및 정제하여 생산할 수 있는 벡터를 제조하였다. 이를 위해 단백질 순수 정제용 표지로써 셀룰로즈 결합 도메인(CBD)을 사용하였고, 이를 제거하기 위해 TEV 프로테아제의 절단 사이트를 사용하였다. 즉, 상기 실시예 5에서 제조한 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 및 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL을 기본 벡터로 하여 HA 표지의 C-말단에 TEV 단백질 분해효소의 기질 사이트와 셀룰로오즈 결합 도메인(CBD)을 융합하여 도 6의 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 및 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터를 제작하였다. 이때 상기 벡터의 제작은 당업계에 공지된 TEV 단백질 분해효소의 기질 사이트와 서열번호 21의 셀룰로오즈 결합 도메인을 암호화하는 염기서열을 주형으로 하고, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭 후, 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 및 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL 플라스미드의 HA 표지의 C-말단에 클로닝하여 각각 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 벡터 및 326-35Sp-UTR 35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터를 제조하였다.

서열번호 22(CBD F 프라이머): 5'-TTACACATGGCATGGATGAACT-3'

서열번호 23(CBD R 프라이머): 5'-CTAAGTTCTTGATTTGAGAATAC-3'

<실시예 8>

본 발명에 따른 단백질 분리 및 정제용 벡터를 식물체에 도입시 단백질의 발현 및 축적 분석

상기 실시예 7에서 제조한 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 벡터 및 326-35Sp-UTR 35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터에 의해 식물체의 세포 소기관에서 목적하는 단백질이 어느 정도 발현 및 축적되었는지를 조사하였다. 이때 대조군으로는 35Sp-UTR22::GFP를 사용하였다. 상기 벡터들은 애기장대 잎으로부터 분리된 원형질체에 형질 전환하여 23℃의 인공 환경실에서 24시간과 48시간 보관 후 이들 원형질체로부터 단백질 추출용액(10 mM HEPES pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 5mM EDTA, 5mM EGTA 0.2 % Triton X-100, 프로테아제 억제 칵테일)을 첨가하여 4 ℃ 에서 1시간 동안 둔 후 추출액을 4 ℃, 13,000 rpm 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하여 단백질 추출물을 분리하였다. 이후 상기 상등액의 단백질 추출물은 SDS-PAGE 후 단클론성 항-GFP 항체 (monoclonal anti-GFP antibody, Clontech cat no. 632381)를 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 발현된 단백질의 양을 분석하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 본 발명에서 제조된 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD, 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL이 처리된 실험군에서 훨씬 강한 시그날이 검출되었다. 또한, 24시간 및 48시간에서의 관찰 결과, 대조군의 시그날을 각각 1로 하였을 경우, 동일 시간대의 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD, 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL이 처리된 실험군에서는 24시간일 때, 각각 6.5배 및 12.8배의 단백질 발현 정도를 나타내었고, 48시간일 때에는 각각 4.5배 및 19.15배의 단백질 발현 정도를 나타내었다.

따라서 상기 결과를 통해, 본 발명에 제조한 단백질 분리 및 정제용 벡터의 경우, 목적하는 단백질의 발현을 증진시키면서 오랜 시간 동안 안정하게 축적할 수 있도록 유도함을 알 수 있었다.

< 실시예 9>

형질전환 식물체의 제조

단백질의 발현을 전사단계가 아닌 번역단계에서 증가시키는 본 발명에 따른 UTR 서열과 특정 세포로 단백질을 타겟팅할 수 있는 서열을 단백질의 생산량을 높이는 효과와 단백질의 이동에 영향을 주지 않고 UTR에 의한 고발현 효과가 입증된 CBD 표지를 그대로 사용하여 단백질의 분리정제 효과도 함께 검증하기 위한 형질전환 식물체를 제조하였다. 식물체 형질전환용 플라스미드는 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA, 326-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL, 326-35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 및 326-35Sp-UTR35:BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL의 플라스미드에서 35S 프로모터와 nos 종결자를 포함하는 영역을 잘라 각각 pCAMBIA1300 및 pCAMBIA2300 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 PstI 과 EcoRI 제한효소를 이용하여 pCAMBIA1300-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA, pCAMBIA2300-35Sp-UTR35:BiP:GFP:HA:HDEL, pCAMBIA1300-35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD, pCAMBIA2300-35Sp-UTR35:BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL의 형질전환용 재조합 벡터를 각각 제조하였다. 이후, 상기 제조된 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 식물체를 제조하였다. 이때, 제조된 형질전환용 벡터의 기본 벡타인 pCABIA1300은 식물에서 하이그로마이신에 대한 선택 마커로 사용하였고, pCABIA2300은 카나마이신 내성 검사를 이용하여 본 발명의 방법으로 제조된 상기 벡터로 형질 전환된 식물체들을 선별하였다. 또한, 항생제 내성검사로 선별된 식물체는 웨스턴 블럿을 통해 단백질이 잘 발현되는 라인을 찾아 형질전환 1세대를 확보하였고, 형질전환 2세대에서는 선택 마커를 이용하여 죽는개체:살아남은 개체가 1:3의 비율로 깨끗하게 나오는 라인을 1 카피로 선정하였으며, 이들 라인은 이후 형질전환 3세대로 정한 뒤, 형질전환 3세대에서는 모두 살아남는 개체에 대해 단백질이 모두 발현되는 라인을 호모(homo)로 선정하여 라인을 유지함으로써 형질전환된 식물체 라인을 확보하였다.

< 실시예 10>

본 발명에 따른 벡터를 이용하여 식물체로부터 목적 단백질의 분리 및 정제

<10-1> 형질전환된 애기장대의 원형질체로부터 단백질의 분리 및 정제

본 발명자들은 본 발명에서 제조된 벡터들을 이용하여 식물체에서 고발현된 단백질을 분리 및 정제하였다. 즉, 앞서 기술한 실시예들에서 제조한 벡터들 중에서 326-35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 플라스미드를 애기장대 원형질체 내로 PEG-매개성 형질전환 방법(PEG-mediated transformation)에 의해 도입하였다(Jin etal .,PlantCell13:1511-1526,2001). 이후 애기장대의 원형질체 내에서 Bip:GFP:HA:TEV:CBD가 발현된 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿팅으로 정제된 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD의 정제 유-무 및 TEV 프로테아제 처리를 통해 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA와 CBD가 분리되는지를 분석하였다. 구체적으로, 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD의 애기장대 원형질체에 형질전환된 단백질 추출은 단백질 추출용액(10 mM HEPES pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 5mM EDTA, 5mMEGTA 0.2 % Triton X-100, protease inhibitor cocktail)을 첨가하여 추출액을 4 ℃, 13,000 rpm 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 이로부터 분리된 상등액에 전처리 된 0.3~0.5% 셀룰로즈비드(cellulose bead, Sigma S3504 Cellulose Type 20)를 첨가하여 4℃에서 3~4 시간 동안 인큐베이션 후 Poly-Prep chromatography column(Bio-Rad, USA)에 통과시켜 셀룰로즈 비드를 팩킹 (packing)시켰고, 단백질 추출에 사용된 추출액 5 ml을 통과시켜 셀룰로즈 비드에 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거 후 셀루로즈 비드는 새로운 튜브로 옮겨 1.6%의 cellobios가 들어있는 일루션 버퍼 (elution buffer)를 넣고 10~30 분간 인큐베이션 후 4℃, 13,000 rpm에서 원심분리를 통해서 셀루로즈 비드를 침전시키고, 순수 정제된 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 단백질이 포함된 상등액 만을 취하여 다음 실험에 사용하였다. 35Sp-UTR35::Bip::GFP:HA:TEV:CBD 단백질내에는 TEV 프로테아제에 의해 잘려지는 아미노산 서열을 포함하고 있기 때문에 실제로 TEV 프로테아제에 의해 잘려지는지를 분석하였다. 상기 분석은 순수 정제된 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 단백질에 TEV 프로테아제를 4℃에서 6시간동안 처리한 후 SDS-PAGE 후 단클론성 Anti-GFP 항체(monoclonal anti-GFP antibody, Clontech cat no. 632381)를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 발현된 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 단백질은 TEV 프로테아제에 의해 잘려지는 것을 확인할 수 있었다. 반면, TEV 프로테아제를 처리하지 않은 군에서는 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA:TEV:CBD 단백질의 원래 크기에서 검출되는 반면, TEV 프로테아제가 처리된 군에서는 CBD가 제거된 35Sp-UTR35::Bip:GFP:HA의 크기에서 단백질 밴드가 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

<10-2> 형질전환 식물체로부터 단백질의 분리 및 정제

원형질체를 이용한 상기 <10-1>의 실험을 통해 CBD를 이용하여 제조한 본 발명의 벡터를 통해 목적하는 단백질의 분리정제가 가능하고 TEV 효소가 제 위치를 바르게 절단하는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 CBD를 포함하는 벡터를 이용하여 형질전환 식물체에서도 CBD로 단백질의 분리 및 정제가 가능한지를 확인해 보았다. 이를 위해 35Sp-UTR35::BiP:GFP:CBD:HDEL의 형질전환 3세대 식물체로부터 원형질체를 이용한 실험과 동일한 버퍼조건에서 실험을 수행하였다. 즉, 순수 정제된 35Sp-UTR35::BiP:GFP:CBD:HDEL 단백질이 포함된 상등액만을 취하여 Coomassie 염색법으로 단백질을 확인하였고 GFP 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하여 단백질의 정제도를 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 형질전환 식물체에서 발현된 35Sp-UTR35::BiP:GFP:CBD:HDEL 단백질은 CBD를 이용한 정제를 통해 거의 90%에 가까운 분리 정제율을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해, UTR을 이용하여 목적하는 단백질을 식물체의 소기관에서 높은 효율로 번역을 유도한 후, CBD를 이용하여 간단하고 편리하게 높은 효율로 단백질을 분리할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 11>

전사 및 번역 단계에서 본 발명의 UTR 서열에 의한 유전자의 발현수준 측정

앞서 수행한 실시예들을 통해 본 발명에서 선정한 UTR 서열들이 단백질의 발현량을 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 UTR 서열차이로 인한 단백질의 발현량 증가가 각각의 DNA로부터 전령 RNA(mRNA)에 전사된 유전정보 (transcript) 양의 차이로 인한 것인지 또는 전사된 유전정보는 동일하나 단백질의 번역 (translation) 단계에서의 발현량을 다르게 조절하는 것인지 확인해 보고자 35Sp-UTR::GFP의 전사 단계와 번역 단계에서의 유전자 발현수준을 분석하였다. 이를 위해 35Sp-RbcUTR::GFP, 35Sp-UTR1::GFP, 35Sp-UTR35::GFP 플라스미드 외에 UTR 1번과 35번 서열의 3’-말단 부위 3개의 시퀀스를 티민으로 치환한 플라스미드를 제조하였는데, U1TTT::GFP와 U35TTT::GFP의 플라스미드 제작 방법은 앞서 기술한 벡터 제작방법과 동일한 방법으로 제작하였으며 만들어진 플라스미드는 PEG-매개성 형질전환 방법에 의해 애기장대 원형질체 내로 도입하였다. 이후 23℃의 인공 환경실에서 24시간 보관 후 전사와 번역 단계 관찰에 필요한 샘플 채취를 각각에 해당하는 방법으로 수행하였으며, 단백질 추출과정은 상기 실시예 <2-2>의 방법과 동일한 방법으로 추출한 뒤, SDS-PAGE 전기영동 후 단일클론성 항-GFP 항체 (monoclonal anti-GFP antibody, Clontech cat no. 632381)를 이용하여 면역 블럿팅으로 UTR::GFP의 단백질 발현량의 번역단계에서 분석하였다.

또한, UTR::GFP의 단백질 발현량의 전사단계에서 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였는데, 먼저 TRIZOL Reagent(Invitrogen, Cat no. 15596-026) 방법을 사용하여 상기 벡터들로 형질전환된 식물체의 원형질체로부터 RNA를 추출하였고, 이때 대조군으로는 18S 리보솜 RNA와 GUS를 사용하였다. 상기 추출한 RNA를 주형으로 역전사 반응에는 분리된 총 RNA 2ug과 Superscript^TMII ReverseTranscriptase(Invitrogen,Cat.No.18064-022)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 중합 효소 연쇄 반응(PCR) Ex Taq(TaKaRa, Cat no.RR001A)으로 수행하였으며, 이때 GFP의 전사량 확인을 위한 프라이머로 서열번호 24 (5’-AGTTGTCCCAATTCTTGTTG-3’) 및 서열번호 25(5’-CTGCCATGATGTATACGTTG-3’) 프라이머를 사용하였으며, 18S 리보솜 RNA의 확인을 위해서는 서열번호 26 (5’-ATGATAACTCGACGGATCGC-3’) 및 서열번호 27(5’-CCTCCAATGGATCCTCGTTA-3’)의 프라이머를 사용하였고, GUS 확인을 위해서는 서열번호 28(5’-AGTGTGGGTCAATAATCAGG-3’) 및 서열번호 29(5’-CTGTGACGCACAGTTCATAG-3’)의 프라이머를 사용하였다. PCR 조건은 어닐링 온도를 GFP의 경우 50℃, 18S 리보솜 RNA는 48℃, GUS는 55℃으로 하여 수행하였다.

그 결과, 도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같이, 35Sp-RbcUTR::GFP를 비롯한 35Sp-UTR1::GFP, 35Sp-UTR1TTT::GFP, 35Sp-UTR35::GFP 및 35Sp-UTR35TTT::GFP의 전사량의 차이는 보이지 않았다. 반면, 단백질 발현에 있어서는 각기 다른 발현 정도를 나타내었는데, 본 발명에 따른 5' UTR 1번 및 35번은 단백질의 번역이 대조군에 비해 월등이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 상기 UTR의 3‘말단에 티민으로 치환한 경우에는 단백질의 번역이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 5' UTR 서열에 의한 단백질의 발현량의 차이는 DNA로부터 전령 RNA에 전사된 유전정보의 양의 차이로 인한 것이 아니라 전사된 유전정보의 양은 동일하나 단백질의 번역단계에서 발현량을 다르게 조절하는 것임을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1a는 애기장대의 원형질체에서 융합단백질 GFP 발현을 위한 플라스미드 35Sp-UTR(스크링된 1번~50 서열)::GFP의 재조합 벡터 모식도를 나타낸 것이다.

도 1b는 플라스미드 35Sp-UTR(스크링된 1번~50 서열)::GFP을 PEG-매개 형질전환 방법으로 애기장대를 형질전환 시킨 후 애기장대 잎에서 발현된 GFP의 발현을 형광현미경으로 관찰한 그림이다.

도 1c는 35Sp-UTR(서열번호 1~6의 UTR)::GFP으로 형질전환된 애기장대의 잎으로부터 GFP의 발현을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 사진이며, 각 레인이 나타내는 것은 다음과 같다. 즉, 레인 1: 대조군인 RbcUTR, 레인 2: 서열번호 1 UTR, 레인 3: 서열번호 2 UTR, 레인 4: 서열번호 3 UTR, 레인 5: 서열번호 4 UTR, 레인 6: 서열번호 5 UTR, 레인 7: 서열번호 6 UTR을 나타낸 것임.

도 2a는 35Sp-UTR(서열번호 7~11의 UTR)::GFP으로 형질전환된 애기장대의 잎으로부터 GFP의 발현을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이며, 각 레인이 나타내는 것은 다음과 같다. 즉, 레인 1: 대조군인 RbcUTR, 레인 2: 서열번호 1 UTR, 레인 3: 서열번호 7 UTR, 레인 4: 서열번호 8 UTR, 레인 5: 서열번호 9 UTR, 레인 6: 서열번호 10 UTR, 레인 7: 서열번호 11 UTR을 나타낸 것임.

도 2b는 35Sp-UTR(서열번호 12~15의 UTR)::GFP으로 형질전환된 애기장대의 잎으로부터 GFP의 발현을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이며, 각 레인이 나타내는 것은 다음과 같다. 즉, 레인 1: 대조군인 RbcUTR, 레인 2: 서열번호 1 UTR, 레인 3: 서열번호 12 UTR, 레인 4: 서열번호 13 UTR, 레인 5: 서열번호 14 UTR, 레인 6: 서열번호 15 UTR을 나타낸 것임.

도 2c는 35Sp-UTR(서열번호 16 UTR)::GFP으로 형질전환된 애기장대의 잎으로부터 GFP의 발현을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이며, 레인 1은 대조군인 RbcUTR을 나타낸 것이고, 레인 2는 서열번호 16 UTR을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 번역효율 증진용 DNA 단편이 외떡잎에서도 단백질의 번역을 증진시키는 효과가 있는지 확인하기 위해 밀 배아 추출물 시스템 상에서 GFP의 발현을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 번역효율 증진용 DNA 단편과 소포체로 타켓팅 할 수 있는 신호서열(Bip) 또는 Bip 서열과 HDEL 서열이 작동가능하게 연결된 재조합 벡터의 모식도를 나타낸 것이다(35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 재조합 벡터 및 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL 재조합 벡터).

도 5는 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA 재조합 벡터(상단 도면) 및 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL 재조합 벡터(하단 도면)로 애기장대를 형질전환 시킨 후, 소포체에서의 GFP 발현을 형광 현미경을 통해 관찰한 사진이다.

도 6은 목적 단백질을 소포체로 타겟팅하여 발현시킨 후, 식물체로부터 목적 단백질을 용이하게 분리하기 위하여 셀룰로오스-결합 도메인(CBD) 및 TEV 사이트를 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터(35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 벡터 및 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터)의 모식도를 나타낸 것이다.

도 7은 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 벡터 및 35Sp- UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터로 애기장대의 원형질체로 형질전환 시킨 뒤, 시간별로 발현된 GFP의 발현양을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이다.

도 8은 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 벡터로 형질전환된 애기장대의 원형질체로부터 발현된 GFP 단백질을 CBD 및 TEV 프로테아제 처리에 의해 분리 및 정제한 것을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이다.

도 9는 35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 벡터로 형질전환된 애기장대로부터 발현된 GFP 단백질을 CBD를 이용하여 분리 및 정제한 것을 전기영동한 후, Coomassie 용액으로 염색한 것을 나타낸 것이다.

도 10a는 본 발명에 따른 번역효율 증진용 DNA 단편이 전사 단계에서 유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 형질전환된 애기장대의 원형질체로부터 RNA를 추출한 뒤 GFP를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 10b는 본 발명에 따른 번역효율 증진용 DNA 단편이 번역 단계에서 유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 형질전환된 애기장대의 원형질체로부터 발현된 GFP의 단백질 양을 GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅한 결과를 나타낸 사진이다.

<110> helix.co.limited <120> DNA fragment to promote translation efficiency and recombinant vectors containing the same <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR1 <400> 1 agagaagacg aaacacaaaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR2 <400> 2 gagagaagaa agaagaagac g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR6 <400> 3 aaaactttgg atcaatcaac a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR7 <400> 4 ctctaatcac caggagtaaa a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR24 <400> 5 agaaaagctt tgagcagaaa c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR35 <400> 6 aacactaaaa gtagaagaaa a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 TTT <400> 7 agagaagacg aaacacaatt t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 AAA <400> 8 agagaagacg aaacacaaaa a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 CCC <400> 9 agagaagacg aaacacaacc c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 GGG <400> 10 agagaagacg aaacacaagg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 (-1T) <400> 11 agagaagacg aaacacaaaa t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 (-4,5T) <400> 12 agagaagacg aaacacttaa g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 (-4,5G) <400> 13 agagaagacg aaacacggaa g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 (-4,5C) <400> 14 agagaagacg aaacacccaa g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U1 (-3T) <400> 15 agagaagacg aaacacaata g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UAAG <400> 16 aagaagaaga agaagaagaa g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RbcS 5'UTR <400> 17 cacaaagagt aaagaagaac a 21 <210> 18 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP DNA Seq <400> 18 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP F-primer <400> 19 atggctcgct cgtttggagc t 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP F-primer <400> 20 taacttcgta gcctcttcta ttg 23 <210> 21 <211> 502 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD DNA Seq <400> 21 ttacacatgg catggatgaa ctatacaaat taggaggtgg aggtggaccc cgggcacacc 60 accaccacca ccactttcga agttcaccag tgcctgcacc tggtgataac acaagagacg 120 catattctat cattcaggcc gaggattatg acagcagtta tggtcccaac cttcaaatct 180 ttagcttacc aggtggtggc agcgccattg gctatattga aaatggttat tccactacct 240 ataaaaatat tgattttggt gacggcgcaa cgtccgtaac agcaagagta gctacccaga 300 atgctactac cattcaggta agattgggaa gtccatcggg tacattactt ggaacaattt 360 acgtggggtc cacaggaagc tttgatactt atagggatgt atccgctacc attagtaata 420 ctgcgggtgt aaaagatatt gttcttgtat tctcaggtcc tgttaatgtt gactggtttg 480 tattctcaaa tcaagaactt ag 502 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD F-primer <400> 22 ttacacatgg catggatgaa ct 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBD R-primer <400> 23 ctaagttctt gatttgagaa tac 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP F-primer <400> 24 agttgtccca attcttgttg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-R-primer <400> 25 ctgccatgat gtatacgttg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA F-primer <400> 26 atgataactc gacggatcgc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA-R-primer <400> 27 cctccaatgg atcctcgtta 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUF F-primer <400> 28 agtgtgggtc aataatcagg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS-R-primer <400> 29 ctgtgacgca cagttcatag 20

Claims

식물세포 내에서 목적 단백질의 번역효율을 증진시키는 서열번호 1로 이루어진 DNA 단편으로서, 그 하류에 위치한 목적 단백질의 번역(translation)을 증진시키는 번역 효율 증진용 DNA 단편.
제1항에 있어서,

상기 번역 효율 증진용 DNA 단편은 서열번호 1로 이루어진 DNA 염기서열에서,

3‘ 말단의 3개 염기가 아데닌(A)으로 치환된 서열번호 8로 이루어진 DNA 단편;

3‘ 말단의 3개 염기가 시토신(C)으로 치환된 서열번호 9로 이루어진 DNA 단편;

3‘ 말단의 3개 염기가 구아닌(G)으로 치환된 서열번호 10으로 이루어진 DNA 단편;

3‘ 말단으로부터 네 번째와 다섯 번째의 염기가 구아닌(G)으로 치환된 서열번호 13으로 이루어진 DNA 단편;

3‘ 말단으로부터 네 번째와 다섯 번째의 염기가 시토신(C)으로 치환된 서열번호 14로 이루어진 DNA 단편; 및

서열번호 1로 이루어진 DNA 염기서열에서 3‘ 말단의 3개의 염기인 AAG가 반복되는 서열번호 16으로 이루어진 DNA 단편;으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 번역 효율 증진용 DNA 단편.
제1항의 번역 효율 증진용 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터, 제1항의 번역 효율 증진용 DNA 단편 및 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 및 유지(retention)할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)하는 염기서열은 Bip(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 서열번호 18로 표시되는 염기서열이고, 상기 목적 단백질을 유지(retention)하는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 셀룰로오스-결합 도메인(cellulose-binding domain:CBD)을 코딩하는 서열번호 21의 염기서열이 추가적으로 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제3항의 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 재조합 벡터의 식물체로의 도입은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG 침전법(Polyethylen glycol)으로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 사용하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.