KR102138272B1 - BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 - Google Patents

BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 BiP 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질의 제조 시, 목적 단백질에 남아있는 이종 펩타이드 서열을 최소화하여 사용 안정성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 목적 단백질의 생산량 또한 증가시킬 수 있다.

Description

BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법{Recombinant vector comprising BiP fragment and preparation method of recombinant proteins using thereof}
본 발명은 신규한 BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 등에 관한 것이다.
바이오의약품(biopharmaceutical)이란 생체 내에 존재하는 물질을 의약품으로 사용하는 것을 지칭하며, 보다 넓은 의미로는 첨단 바이오 기술인 유전자 재조합, 세포 융합, 세포 배양 등 생물공학기술을 기반으로 하여 생산된 의약품으로 정의할 수 있다. 이러한 바이오의약품은 단백질 의약품, 치료용 항체, 백신, 유전자 치료제, 세포 치료제 등으로 분류된다. 이 중 단백질 의약품, 치료용 항체 등은 일반적으로 효모, 박테리아, 동물 세포, 곤충 세포 등의 숙주를 이용하여 생산되고 있으며, 최근에는 이러한 의약품들의 이용도가 증가되고 있는 추세이다. 따라서, 효율적인 생산을 위해서는 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 동시에 분리가 용이하며, 재조합 단백질의 안정성은 증가시킬 수 있는 방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법(동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물 세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘(seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.
따라서, 식물체에서도 사용 가능하며, 재조합 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 재조합 단백질 제조 시 추가되는 이종 펩타이드 서열을 최소화하여 재조합 단백질의 사용 안정성을 증가시킬 수 있는 재조합 단백질의 생산 시스템이 개발된다면, 다양한 분야에서 필요로 하는 재조합 단백질의 고효율 생산이 가능할 것으로 기대된다.
국내등록특허 10-1848082
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 신규한 BiP 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 6으로 표시되는 BiP 유전자 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 순차적으로 연결된 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공한다. 상기 순차적으로 연결된다는 것은 BiP 유전자 단편의 N 말단 또는/및 C 말단에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결된 형태일 수 있으나, BiP 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결된 형태라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 프로모터 유전자, 서열번호 6으로 표시되는 BiP 유전자 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 순차적으로 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 목적 단백질의 생산에 있어서 추가되는 이종 펩타이드(foreign peptide)를 최소화하거나, 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 재조합 벡터에 사용 가능하다고 알려져 있는 프로모터라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소의 단편, 효소 저해제, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등일 수 있으나, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 제조될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자, M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자, 목적 단백질의 고발현을 위한 태그 유전자, 목적 단백질의 용이한 분리를 위한 태그 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 단백질을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 목적 단백질을 분리하는 단계는 바람직하게는 Triton X-100, Imidazole 및 NaCl(염화나트륨)이 첨가된 Sodium phosphate 용액을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 Triton X-100은 0.05 내지 0.5 중량%, Imidazole은 10 내지 100 mM, NaCl은 100 내지 500 mM이 첨가된 10 내지 100 mM의 Sodium phosphate 용액(pH 7.1 내지 7.5)이나, 일반적으로 단백질을 분리하는데 사용되는 추출용 완충용액(extraction buffer)라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 BiP 단편, 링커 서열 및 목적 단백질이 순차적으로 연결된 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터는 다양한 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 BiP 단편에 연결시킴으로써, 목적 단백질을 제조할 때 추가되는 이종 펩타이드 서열을 최소화하여 재조합 단백질의 사용 안정성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 목적 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있기 때문에 다양한 활성을 가지는 목적 단백질에 폭넓게 적용하여 다양한 분야의 재조합 단백질의 고효율 생산을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 서열 분석기를 이용하여 재조합 단백질의 아미노산 서열을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 BiP 단편이 결합된 RVGe 단백질의 생산량 및 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서는 기존에 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위하여 사용되던 BiP 서열 중 재조합 단백질을 생산 후에 재조합 단백질에 남아있는(융합되어 있는) 잔기 서열을 확인하고, 상기 잔기 서열 중 일부 서열을 제거하여 재조합 단백질에 남아있는 잔기 서열, 즉 이종의 펩타이드 서열을 최소화하여 재조합 단백질의 사용 안정성을 증가시켰을 뿐만 아니라, 재조합 단백질의 발현량이 증가되는 것을 확인하고, 상기 신규한 BiP 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에 있어서, “신규 BiP(chaperone binding protein) 유전자 단편(fragment)”이란 기존에 재조합 단백질의 제조 시, 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되었던 BiP 서열 중 일부로서, 가장 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 유전자이나, 바람직하게는 서열번호 6의 염기서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “이종 펩타이드(foreign peptide)”란 재조합 단백질의 제조 시에 추가된 또는 융합된 목적 단백질의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열로서, 상기 이종 펩타이드의 종류는 목적 단백질 이외의 펩타이드라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “목적 단백질(target protein)”이란 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있는 대량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이며, 더욱 바람직하게는 항원, 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소의 단편, 효소 저해제, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등이나, 본 발명의 재조합 벡터로 제조될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “사용 안정성”이란 목적 단백질을 재조합 벡터를 이용하여 제조할 때 추가되는 이종의 펩타이드로 인하여, 목적 단백질의 사용 시 예측하지 못했던 부작용, 위험성, 효과의 상이함 등을 감소시켜 목적 단백질을 사용하는데 있어서 본래의 효과를 최대한 유지하게 하는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 신규 BiP 유전자 단편을 포함하도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질의 분해를 최소화하기 위한 HDEL 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 재조합 단백질의 생산량을 증가시키기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질의 구조적 안정성을 유지하기 위한 태그용 유전자, 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 용이한 분리를 위한 태그로는 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 추가되는 유전자의 종류는 기존에 재조합 단백질의 제조에 사용되고 있는 종류라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “용해성(solubility)"이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 재조합 단백질 제조 시 BiP 펩타이드의 잔기 확인
재조합 단백질의 제조 시, 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되고 있는 BiP 펩타이드 서열은 소포체로 이동되면, 신호 펩티드 가수분해효소(signal peptidase)에 의하여 제거되는 것으로 예측되고 있으나, 이에 대한 연구는 진행된 바가 없다. 본 발명자들은 제조된 재조합 단백질에 BiP 펩타이드의 잔기(residue)가 존재하는지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
1.1. 셀룰로오즈 결합 도메인이 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질 제조
BiP 펩타이드의 잔기를 확인하기 위하여, 일차적으로 셀룰로오스 결합 도메인(Cellulose binding domain; CBD)이 융합된 돼지 열병 항원 E2 단백질을 제조하기 위한 재조합 벡터를 제조하였다. 보다 자세하게는, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 1), BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 돼지 열병 항원 E2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3); 셀룰로오즈 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4); 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순서대로 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 그리고 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법(Agrobacterium-mediated transformation)으로 애기장대에 형질전환 시키고, 카나마이신(Kanamycin)에 대한 내성을 가지는 애기장대를 선별하고, 세대진전을 통해 셀룰로오즈 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 단백질의 발현이 안정된 호모 종자를 최종 확보하여, 형질전환 식물체를 제조하였다. 그리고 단백질 추출에 보편적으로 사용되는 단백질 추출 버퍼와 비결정 셀룰로오스(amorphous cellulose; AMC)를 사용하여 형질전환 식물체 5 g으로부터 재조합 단백질을 분리하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질은 인산화완충용액(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 투석 후에 원심 필터 튜브(Centrifugal filter tube)를 사용하여 농축하였다.
1.2. BiP 펩타이드의 잔기 확인
BiP 펩타이드의 잔기를 확인하기 위하여, 한국기초과학지원연구원(KBSI)의 단백질 서열 분석 시스템(Prociose491/PPSQ)을 이용하여 재조합 단백질의 N-말단 서열을 분석하였다. 서열 분석을 위하여, 실시예 1.1과 동일한 방법으로 준비된 셀룰로오즈 결합 도메인이 융합된 E2 단백질을 0.4 mg/mL의 농도가 되도록 1 % 셀로비오스(cellobiose)가 첨가된 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)에 첨가하고, 서열 분석 시스템의 프로토콜에 따라 아미노산 서열 분석을 실시하였다.
그 결과, E2 단백질 서열을 제외하고 “IEEATKL”의 BiP의 추가 서열과 클로닝 과정 중에 추가된 아미노산 “RIQ” 링커(linker) 서열이 있는 것을 확인하였다.
실시예 2: 신규 BiP 서열을 이용한 NS1 재조합 단백질 제조
재조합 단백질의 생산에 있어서 중요한 요소 중의 하나인 목적 단백질 이외의 이종 펩타이드를 최소화하여 재조합 단백질의 사용 안정성을 증가시키기 위하여, 재조합 단백질에 남아있는 BiP 잔기의 일부를 제거하여 신규 BiP(New BiP; NB) 유전자 단편을 제조하고자, 실시예 1을 통하여 확인된 BiP 잔기 중에서, 목적 단백질의 N 말단 부위에 융합되어 있는 7 개의 아미노산이 제거된 신규 BiP 서열(서열번호 7)을 제조하기 위하여 실험을 진행하였다.
2.1. 신규 BiP 서열을 포함하는 재조합 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조
서열번호 6으로 표시되는 신규 BiP 유전자 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위하여, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 1), 신규 BiP 유전자 단편(서열번호 6), 및 지카 바이러스의 NS1 단백질(Zika NS1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8)를 순서대로 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 NS1 재조합 단백질을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리하였다. 그리고 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 IMAC(immobilized metal affinity chromatography)을 실시하여 히스티딘 태그(Histidine-tag) 결합된 재조합 단백질을 분리하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질은 인산화완충용액(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 투석 후에 원심 필터 튜브(Centrifugal filter tube)를 사용하여 농축하였다.
2.2. 신규 BiP 펩타이드의 잔기 확인
신규 BiP 펩타이드의 잔기를 확인하기 위하여, 실시예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 단백질의 N-말단 서열을 분석하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, NS1 단백질 서열을 제외하고 BiP 잔기 서열은 존재하지 않았으며, 클로닝 과정 중에서 추가된 아미노산 “GS”링커 서열이 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 신규 BiP 펩타이드 서열 만으로도 소포체로 정상적으로 이동되며, 재조합 단백질도 정상적으로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 3: 신규 BiP 서열을 이용한 RVGe 재조합 단백질 제조
3.1. 신규 BiP 서열을 포함하는 재조합 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조
서열번호 7로 표시되는 신규 BiP 펩타이드 및 광견병바이러스(Rabies virus)의 주요 항원인 당화단백질(glycoprotein)을 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위하여, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 1), 신규 BiP 유전자 단편(서열번호 6), 및 광견병바이러스 당화단백질(RVGe)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 9)를 순서대로 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 대조군으로는 신규 BiP 유전자 대신 기존의 BiP 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 NS1 재조합 단백질을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리하였다. 단백질 추출 시에는 0.1 % Triton X-100, 20 mM의 Imidazole(pH 7.5) 및 300 mM의 NaCl이 첨가된 20 mM Sodium phosphate(pH 7.3) 용액을 사용하였다.
3.2. 재조합 단백질 발현량 확인 실험
실시예 3.1과 동일한 방법으로 발현된 재조합 단백질을 포함하고 있는 전체 단백질 추출액을 대상으로 anti-His antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 기존의 BiP 펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용한 경우(BiP)와 비교하여, 신규 BiP 펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용한 경우(NB) 약 두 배 이상 단백질의 양이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 신규 BiP 펩타이드 서열을 이용하여 재조합 단백질을 제조하면 재조합 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 신규 BiP 서열을 재조합 단백질의 제조에 사용할 경우, 다양한 목적 단백질을 이용하여 재조합 단백질을 제조할 수 있을 뿐만 아니라 재조합 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 목적 단백질 이외의 이종 서열의 추가를 최소화하여 재조합 단백질의 사용 안정성을 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 신규 BiP 서열을 이용한다면 다양한 재조합 단백질의 효율적 생산에 크게 도움이 되는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> BioApplications Inc. <120> Recombinant vector comprising BiP fragment and preparation method of recombinant proteins using thereof <130> MP18-198 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'UTR of M17 gene <400> 1 ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21 <210> 2 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of chapherone binding protein(BiP) <400> 2 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 3 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of E2 <400> 3 aacggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcaatatc atcaaccaat gagatagggc 60 tactcggggc cggaggtctc accaccacct ggaaagaata caaccacgat ttgcaactga 120 atgacgggac cgttaaggcc 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sequence of new BiP <400> 6 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc a 251 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of new BiP residue <400> 7 Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala 20 25 <210> 8 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Zika NS1 <400> 8 gatgtgggtt gctcagttga tttttctaaa aaagaaactc ggtgtgggac tggcgttttc 60 gtttacaatg atgttgaggc ttggagggat agatataaat accatccaga ttcacctaga 120 agacttgctg cagccgttaa gcaagcttgg gaggatggaa tttgtggtat aagcagtgtt 180 agtagaatgg agaatatcat gtggagatcg gtagaaggag aattgaatgc tattttggaa 240 gaaaatggtg tgcagctcac agtggttgtg ggatctgtta agaacccgat gtggcgaggt 300 ccacaacgtc ttcctgtacc tgtcaatgaa ctaccccacg gttggaaggc gtggggaaag 360 tcatatttcg ttagggcagc aaagacaaac aattcttttg ttgtagatgg cgatactctt 420 aaagagtgtc cattgaaaca tagagcttgg aactcttttt tagtcgagga tcatggattc 480 ggggtctttc acacctccgt atggctgaag gttagggagg actattcact tgaatgcgac 540 ccagcagtaa tcggcacagc tgttaaagga aaggaggctg tgcattctga cttaggttat 600 tggattgaat ctgaaaagaa tgatacttgg agactaaaga gagcccattt aatagagatg 660 aagacttgtg aatggcctaa atcacatacc ttgtggactg atgggatcga agaaagtgat 720 cttataattc ccaaatcctt ggcaggccca ctgagtcacc acaatactcg ggaagggtat 780 agaacacaaa tgaaaggtcc gtggcattct gaagaactcg aaattcgatt tgaggaatgc 840 cctggaacca aagtccatgt ggaggaaacc tgtggtacaa gaggaccttc acttagatcg 900 actacagctt caggacgtgt tattgaagaa tggtgttgca gagaatgtac gatgcctcca 960 ttgtcattcc aggctaagga tggttgctgg tacggtatgg aaattaggcc aagaaaggag 1020 cctgaaagca accttgttag gtctatggtt acagca 1056 <210> 9 <211> 1314 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RVGe <400> 9 aaattcccca tctacacgat accggataaa cttggtcctt ggtctccaat tgatattcat 60 catctcagct gtccaaataa tctggttgtc gaggatgaag ggtgtaccaa cttgtcaggt 120 ttttcctata tggaacttaa agtgggatac atttcggcca taaaagtgaa cggctttacg 180 tgcacaggtg tggtgacaga ggcggaaacg tatactaatt tcgttgggta tgtgactact 240 accttcaaaa gaaagcattt tcgcccgaca ccggacgcct gtcgggcggc ttataattgg 300 aaaatggccg gtgacccgcg ttatgaggaa tctctgcata atccgtaccc agattatcac 360 tggttacgaa ctgtgaagac cacgaaagaa agtctggtta tcatctcccc aagtgtagcg 420 gacctggacc catatgataa atctcttcac agccgcgtct ttcctaacgg aaagtgcagc 480 ggcataacga tttcttctac ctactgccct accaaccatg attacacaat ctggctgccc 540 gagaatccgc gcctgggcac atcttgcgat atttttacca acagtagagg taaacgggca 600 tctaaaggga gcaagacctg tgggtttgtt gatgaacgtg gtctgtacaa atcattgaaa 660 ggagcatgca aattaaaatt atgcggggtc cttgggcttc gtctgatgga tggtacgtgg 720 gtagcgatgc aggcgtcgga cgaaaccaaa tggtgccctc cagatcagct ggtaaatcta 780 cacgactttc gcagtgacga gatagaacat ctcgttgtgg aggaacttgt caaaaagcga 840 gaagaatgtt tagacgcatt agagtccatc atgactacta agtcagtgag tttccggcgt 900 ctgagccact tgcgtaaatt ggtccccggc tttggaaaag catacacaat cttcaacaag 960 acattaatgg aagctgacgc tcactataag agtgttcgca cctggaatga aataatcccc 1020 tccaaagggt gtctgcgtgt gggcgggagg tgtcatcctc atgtaaacgg cgtatttttc 1080 aatggcatta tcctgggtcc tgatggccat gttctaatcc cggaaatgca atcaagcctc 1140 cttcagcaac acatggagtt gttggaatcc tcagtcatcc ccctgatgca tccgctggcc 1200 gatccgtcta cagttttcaa agatggcgat gaagcagaga actttgtgga ggttcacctt 1260 ccggatgtac ataaacagat ctcgggagtt gatctgggtc tccctaactg gggg 1314

Claims (11)

  1. 서열번호 6으로 표시되는 BiP(chaperone binding protein) 유전자 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 순차적으로 연결된, 유전자 컨스트럭트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트는 목적 단백질의 생산에 있어서 추가되는 BiP 단편을 최소화하거나, 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트.
  3. 프로모터 유전자, 서열번호 6으로 표시되는 BiP 유전자 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 순차적으로 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 재조합 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 목적 단백질의 생산에 있어서 추가되는 BiP 단편을 최소화하거나, 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 및 EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  9. (a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 목적 단백질을 분리하는 단계는 Triton X-100, Imidazole 및 NaCl이 첨가된 Sodium phosphate 용액을 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 삭제
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