KR102209198B1 - 식물에서의 발현이 최적화된 재조합 이리신 유전자 및 이를 이용한 재조합 이리신 단백질의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물에서의 발현이 최적화되며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 이리신 유전자, 이리신 단백질의 생산방법 및 이를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

Description

식물에서의 발현이 최적화된 재조합 이리신 유전자 및 이를 이용한 재조합 이리신 단백질의 생산 방법{Recombinant Irisin gene optimized for plant expression and method for producing recombinant Irisin protein therefrom}

본 발명은 식물에서의 발현이 최적화되며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 이리신 유전자, 이리신 단백질의 생산방법 및 이를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환으로, 과잉 열량으로 지방 조직이 비정상적으로 증가한 상태를 말한다. 비만의 원인은 유전적 영향, 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 스트레스에 의한 심리적인 영향 등 다양한 요인이 있으나, 정확한 발생과 진행의 기작에 대해서는 명확히 밝혀지지는 않았다. 우리나라에서도 지방 섭취 비율이 빠르게 증가하면서 비만 발생률이 지속적으로 높아지고 있다. 국민건강영양조사에 따르면 우리나라 식단에서의 지방 섭취 비율은 1990년 9.6％에서 2007년 19.5％로 두 배 이상 증가하였는데, 동물성 지방 섭취의 증가가 이러한 지방섭취 증가의 주된 원인으로 밝혀졌다. 2010년 국내 성인 비만 인구는 3명 가운데 1명 꼴인 1200만 명에 이르고 있으며 특히 체질량 지수가 30 이상인 고도비만 인구는 161만 명으로, 불과 십 여년 만에 2배 이상 급증한 상황이다.

비만은 그 자체의 문제점 뿐만 아니라, 비만 상태가 지속되면서 고혈압, 고인슐린혈증, 고지혈증, 지방간, 동맥경화증, 심장 혈관 질환, 폐쇄성 수면무호흡증, 특정 암, 관절염 등과 같은 다양한 질병과 합병증이 발생하여 종국적으로 생명을 단축시키기 때문에 더욱 위험하다. 또한 비만과 비만으로 인한 합병증으로 발생하는 사회경제적 비용도 막대하기 때문에 전 세계적으로 비만 치료에 많은 관심이 있지만, 아직까지 효과적인 비만 또는 과다 지방 축적으로 인한 대사성 질환의 치료제는 미비한 상황이다.

UCP1(Uncoupling protein-1)은 열의 생산을 담당하는 유전자로 갈색지방조직에서 열 발생의 역할을 담당한다. 미토콘드리아막에 존재하는 UCP1은 이 수소이온을 ATP를 합성하는 데 사용되지 못하게 하고, 열을 생산하는 데 이용되도록 하여 에너지를 열로 낭비되게 하는 물질이다. 동물에서는 갈색 지방세포에서 발현되며, 체온을 유지시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. UCP의 열 생산은 자연적으로 에너지 소비를 촉진한다.

지방 세포에서 분비되는 아디포넥틴(adiponectin)은 항당뇨 작용을 비롯하여 다양한 효능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 즉, 특히 당뇨병에 있어서 아디포넥틴은 인슐린 감수성을 증가시켜 혈당을 낮춤으로써 당뇨병을 예방하는 효능을 나타낸다. 이러한 아디포넥틴은 지방세포가 분화되면서 발현이 증가하는 단백질로 보고되어 있다. 따라서 지방 세포 분화 과정 중 아디포넥틴의 발현을 증가시키는 물질은 비만, 당뇨를 포함한 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용한 효과를 나타낼 수 있다.

글리코실화된 112개 아미노산의 단백질 호르몬인 이리신(Irisin)은 FNDC5의 단백질 분해 절단(proteolytic cleavage)에 의해 형성된다. FNDC5의 생성은 근육에서의 운동에 의해 촉진되며, 이는 전사보조활성제인 PGC1a에 의해 이리신으로 전환 될 수 있다. 이리신은 근육에 의해 분비되고 지방 조직을 순환하며 에너지 대사를 조절한다. 이리신은 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 갈변하는 과정을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이리신은 근육 조직에서 합성되어 소뇌의 Purkinje 세포와 세포간 신경 말단에 존재한다.

한편, 이러한 질병을 예방하기 위한 단백질들을 생산/개발하고 있지만 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물 세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물 세포를 이용한 단백질의 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 백신의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물 세포를 이용하여 제조된 단백질들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 식물의 경우에는 동물 세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 단백질의 생산이 가능할 것으로 기대된다.

J. Clin. Med. 2018, 7, 407

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 생리활성 효과를 나타내는 재조합 이리신 유전자, 그를 이용한 재조합 이리신 단백질의 제조 방법, 상기 단백질의 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 식물에서의 발현이 최적화되며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 이리신 유전자를 제공한다. 상기 재조합 이리신 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 기능성 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 염기의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 염기서열과 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 유전자를 의미하며, 식물체를 이용하여 안정적으로 생산될 수 있는 재조합 이리신 단백질의 유전자 서열이라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 재조합 이리신 유전자를 포함하는 단백질 발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 순서로 작동가능하도록 순차적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 6개의 히스티딘으로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 이리신 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 이리신 단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 식물체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 단백질을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 재조합 이리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 재조합 이리신 단백질을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 재조합 이리신 단백질을 개체에 투여함으로써 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 재조합 이리신 단백질의 대사성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 대사성 질환은 바람직하게는 비만, 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤증, 지방간 또는 동맥경화증 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 이리신 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, UCP1 및 아디포넥틴의 발현증가 효과를 나타내므로 대사성질환의 치료에 유용하게 이용가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 이리신(Irisin)의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 이리신의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물유래 재조합 이리신의 분리 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 엔도 H 글라이코시데이즈 처리를 통한 재조합 이리신의 당화여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 3T3-L1 지방세포에 재조합 이리신 단백질 자극 후 세포 내 UCP-1 단백질의 변화를 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 3T3-L1 지방세포에 재조합 이리신 단백질 자극 후 세포 내 아디포넥틴 단백질의 변화를 웨스턴 블롯팅한 결과이다.(*p<0.05 vs control)

본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 이리신 유전자를 이용하면, 식물체에서도 높은 생리활성을 가지는 이리신 단백질을 효율적으로 생산 및 분리가 가능할 뿐만 아니라, 기존 이리신 단백질의 생리활성을 유지하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 이리신 단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 이리신 단백질을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에 있어서, "재조합 이리신 유전자"는 서열번호 1로 표시되는 유전자 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 명세서에 있어서, "발현용 벡터(expression vector)"란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 재조합 이리신 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 목적 단백질을 소포체로 이동시키기 위한 BiP 유전자, 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 "BiP 유전자"는 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되었던 BiP 서열 중 일부로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 유전자이나, 서열번호 2의 염기서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 "BIP 유전자"는 발현 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되는 것으로, 식물세포에서 발현된 후 잘려나가게 된다.

상기, "태그용 유전자"는 바람직하게는 1개 내지 10개의 히스티딘(Histidine)으로 이루어진 펩타이드 단편 즉, His-태그를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게 6개의 히스티딘으로 이루어진 펩타이드 단편이 부착되는 것일 수 있으며, 서열번호 3의 염기서열로 표시된다. 상기에서 히스티딘 잔기는 재조합 단백질을 발현시킨 후 정제시 필요한 꼬리표(tag)로 가장 많이 이용되는 tag 중나로, 특이성(specificity)이 높아야 하고 원하는 단백질의 구조에 영향을 최대한 적게 주어야 한다. 바람직하게는 Histidine이 1개 내지는 10개가 연속으로 오는 peptide로 구성될 수 있는데, size가 작고 원래의 protein 구조에 영향도 별로 주지 않기 때문에 재조합 단백질을 만든 후 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성이 있다. tag은 vector의 종류에 따라 target protein의 N-terminus(앞쪽), C-terminus(뒤쪽) 어느 쪽에도 만들 수 있고, 단백질의 구조의 영향을 주는 것에 따라 앞 또는 뒤쪽을 결정할 수 있다.

상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 상기 "벡터"는 도 1에 개시된 개열지도를 포함할수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 상기 "벡터"는 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 8으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지나, 서열번호 8의 서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 벡터의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되는 유전자 서열로 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 7의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환체(transgenic organism)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "식물"은 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L.나 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.

상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, "용해성(solubility)"이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.

본 발명의 "재조합 이리신 단백질"은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 재조합 이리신 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물에서 생산된 재조합 이리신 단백질은 바람직하게는 당화된 재조합 이리신 단백질 및 비당화된 재조합 이리신 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 당화된 재조합 이리신 단백질 및 비당화된 재조합 이리신 단백질을 모두 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어 "당화(glycosylation)"는 세포(진핵생물)의 단백질 번역 후 과정으로써 N-당화와 O-당화로 나뉘는데 이는 붙는 작용기에 따라 다르며 세포에서 생성된 단백질에 락토스(lactose) 등의 당이 붙는 과정을 통틀어 "당화"라고 한다. 당화 과정으로 당사슬이 단백질에 연결되면 단백질이 "폴딩"과정을 거쳐 입체적인 구조물을 형성하며 이는 단백질이 풀어지지 않고 오랫동안 유지될 수 있는 안정성을 부여한다. 또한 단백질에 붙어진 당사슬을 세포막으로 가서 세포막 단백질이 되어 항원과 같은 효과를 내기도 한다. 상기와 같이 당화된 단백질을 당단백질이라고 하는데 대표적인 당단백질에는 면역반응에서 중요한 역할을 하는 항체 등이 있다. 본 발명에 사용된 서열번호 8의 벡터의 아미노산 서열을 이용하여 당화여부 예측 프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)을 작동시켜 본 결과 16번째 또는 61번째 Asparagine(N)에서 N-당화가 일어날 것으로 예측되었다.

따라서, 본 발명에 사용된 재조합 이리신 단백질은 당화된 재조합 이리신 단백질 및 비당화된 재조합 이리신 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으며, 상기 당화된 재조합 이리신 단백질은 서열번호 4로 표시되는 재조합 이리신 단백질의 8번째 및/또는 53번째 Asparagine(N)에서 N-당화가 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 본 발명과 동등한 효과를 갖는 범위 내에서 변형이 가능하다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 재조합 이리신 단백질을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서 ‘대사성 질환’은 에너지 과잉 섭취 또는 호르몬 불균형 등 다양한 원인으로 체내 에너지 대사가 비정상적으로 일어나 지방이 과다하게 합성되거나 축적되어 발생하는 질환을 의미한다. 상기 대사성 질환은 구체적으로는 비만, 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤증, 지방간 또는 동맥경화증일 수 있다.

본 발명의 목적상 용어 ‘예방’은 본 발명의 조성물의 투여로 대사성 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, ‘치료’는 대사성 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명의 용어, '개선'이란, 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 재조합 이리신 단백질이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.

본 발명에서 상기 재조합 이리신 단백질은 세포 내 UCP1(Uncoupling protein 1)의 발현을 증가시킴으로써, 이리신의 기능으로 알려진 백색지방세포를 갈색지방세포로 바꾸어 비만, 당뇨 등 대사성 질환을 치료하는데 효과가 있다.

본 발명에서 상기 재조합 이리신 단백질은 세포 내 아디포넥틴(adiponectin)의 발현을 증가시킴으로써, 인슐린 저항성을 개선하는 등 대사성질환을 치료하는데 효과가 있다.

본 발명에 따른 조성물의 이리신은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 "약학적 조성물"은 약학적으로 유효한 양의 이리신을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 이리신이 0.01 내지 99.99% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다.

본 발명에 따른 이리신의 약학적으로 유효한 양으로는 0.001 내지 300mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.01 내지 200mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.

상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton,Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 건강기능식품 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 이리신을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 이리신을 대사성 질환에 대하여 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 식품 조성물은 이리신 성분 이외에 미량 의 미네랄, 비타민, 지질, 당류 및 공지의 대사성 질환에 대한 치료 효과를 가진 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 미네랄로는 칼슘, 철 등 성장기에 필요한 영양성분이 함유될 수 있으며 비타민으로는 비타민 C, 비타민 E, 비타민B1, 비타민 B2, 비타민 B6 등이 함유될 수 있다. 지질로는 알콕시글리세롤 또는 레시틴 등이 함유될 수 있으며 당류로는 프락토올리고당 등이 함유될 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 이리신을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 이리신을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 이리신의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 식품의 전체 중량을 기준으로 0.01∼100%, 바람직하게는 0.1∼50%의 비율로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 식물 발현용 이리신 ( Irisin ) 재조합 벡터 제조

도 1과 같이 식물체에서 이리신을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 인간 이리신 호르몬에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자를 합성하였다(서열번호 1). pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein) 신호 펩타이드 (signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 6개의 연속된 히스티딘 (Histidin)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3) 및 이리신을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순서대로 연결하여 이리신 식물 발현 벡터를 제작하였다.

실시예 2: 재조합 이리신 단백질의 발현 획인

2.1. 식물 발현 벡터 일과성 발현(transient expression)

상기의 실시예 1에서 준비한 식물 발현 벡터를 아그로박테리아 균주 LBA4404에 전기충격법 (Electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질 전환된 아그로박테리아를 5ml의 YEP(Yeast Extract Peptone) 액체 배지 (효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28 ℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양 한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28 ℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리 (7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 인필트레이션 (Infiltration) 버퍼 (10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl₂, 200 μM 아세토시링곤)에 600 nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 다시 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션 (Agro-infiltration)을 수행하였다.

2.2. 식물체에서 재조합 이리신의 발현 획인

상기의 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 수용성 분획(S)에 있는 단백질과 펠릿(pellet; P) 분획에 있는 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10 % SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5 % 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 6개의 His와 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 이리신의 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 식물에서 발현된 재조합 이리신은 수용성 분획에 존재함을 확인했으며 서로 다른 크기를 가진 이리신 세 종류가 동시에 만들어지는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, 본 발명의 이리신 발현용 벡터는 식물체에서 재조합 이리신 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있으며, 상기 벡터를 이용하여 제조된 이리신은 높은 용해성(solubility)을 가지고 있기 때문에, 분리정제가 용이하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 재조합 이리신의 분리 정제

상기의 실시예 2.1에서 준비한 니코티아나 벤타미아 40g에 단백질 추출 용액 (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.1 % Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제 (protease inhibitor)) 200 mL을 첨가하고 블랜더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm에서 20분간 4 ℃에서 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다.

발현된 이리신의 분리 정제를 위해 Ni-NTA 아가로스 레진이 충진된 컬럼으로 친화크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼에 레진을 5 mL 충진한 후 세척 용액 (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole) 50 mL로 평형화 시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용한 후 세척 용액 100 mL을 흘려 보내 레진을 세척하고 용출 용액 (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, 300 mM Imidazole)으로 재조합 단백질을 용출하였다. 재조합 단백질이 포함된 용출 용액은 10 kD 크기의 필터를 사용하여 생리식염수 (PBS) 용액으로 교체 및 농축을 실시하여 분리 정제된 재조합 이리신을 획득하였다. 분리 정제된 단백질은 단백질 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법 (coomassie staining)을 통해 확인하였다. (도 3)

도 3에 나타난 바와 같이, 약 13 kD 내지 그 이상의 크기를 가진 3가지 재조합 이리신 단백질들이 정제된 것을 확인하였다.

본 발명의 재조합 단백질은 기존의 단백질과의 큰 차이 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 단백질이 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.

실시예 4: 엔도 H ( Endo H) 글라이코시데이즈 처리를 통한 재조합 이리신 당화 여부 확인

식물에서 분리 정제한 이리신의 당화 여부를 확인하기 위해 엔도 H 글라이코시데이즈 N-당화 제거 에세이를 수행하였다. 보다 자세하게는 상기의 실시예 3에서 준비한 재조합 이리신 1 μg에 10X 디네츄레이팅 버퍼 (5 % SDS, 0.4 M DTT)를 가한 후 100 ℃에서 10 분간 가열하였다. 여기에 최종 농도가 50 mM이 되도록 sodium citrate (pH 5.5) 버퍼를 넣어준 후 50 U의 엔도 H 글라이코시데이즈를 첨가하고 37℃ 에서 1시간 동안 반응을 진행하였다. 엔도 H 글라이코시데이즈를 포함하지 않은 대조군 반응을 위해서는 엔도 H 글라이코시데이즈 대신 같은 부피의 물을 가하였다. 반응 종료 후 단백질 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법 (coomassie staining)을 통해 재조합 이리신의 N-당화 제거에 따른 분자량 변화를 관찰하였다. (도 4)

도 4에 나타난 바와 같이, Endo-H를 처리했을 경우 이리신의 글리칸(Glycan)들이 절단되어 한가지 크기의 이리신이 관찰되었고, 이를 통해 식물에서 발현된 이리신의 당화여부를 확인할 수 있었다.

실시예 5: 식물 유래 이리신 단백질의 생리 활성 확인

3T3-L1 지방전구세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에 10% FBS, 100 units/mL 페니실린(penicillin)과 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 세포 배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ incubator (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 지방세포의 분화는 세포가 100% 찬 이틀 후 (post-confluence, day 0) 5 μg/ml 인슐린(insulin), 0.25 mM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 1-메틸-3-이소부틸잔틴이 첨가된 10% FBS DMEM으로 교체하고, 이틀 후 5 μg/ml insulin가 첨가된 10% FBS DMEM으로 교체하며, 이틀 후 다시 10% FBS DMEM으로 교체하여 총 10일 동안 분화시킨 후 실험에 사용하였다. 지방분화에 대한 영향을 실험하기 위해 실시예 3에서 제조된 식물유래 이리신은 분화유도가 시작된 날부터 4일간 이틀 간격으로 처리하였다.

실시예 3에서 제조된 재조합 이리신 단백질은 분화된 지방세포에 10 mg/mL의 농도로 처리하였으며, 48시간 후 세포에서 발현 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 시행하였다.

3T3-L1 세포의 단백질 분석을 위해 RIPA lysis buffer를 처리 후 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 Laemmli sample buffer를 섞은 뒤 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동으로 분리한 후 PVDF(Polyvinylidene difluoride) membrane으로 전이시켰다. 전이된 PVDF membrane은 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고 1차 항체를 4℃에서 밤새 배양한 후 2차 항체를 상온에서 1시간 배양시켜 최종 ECL solution 처리 후 LAS-4000에서 단백질 발현 양을 분석하였다. 사용된 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, UA)에서 구입하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 이리신 처리 후 세포 내 UCP1(Uncoupling protein 1)의 발현 증가를 관찰하였다. UCP 1은 백색지방의 갈색지방으로의 전환에 기준이 되는 바이오마커로써 이 결과는 식물유래 이리신이 adipocyte brownin 활성을 그대로 가지고 있음을 의미한다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 이리신 처리 후 세포에서 분비되는 adiponectin의 증가를 관찰하였다. Adiponectin은 지방세포에서 분비되는 대표적인 adipokine의 일종으로, 인슐린 저항성을 개선하는 등의 전산 대사 개선을 통한 항당뇨, 항비만 효과를 가진 것으로 잘 알려져있다. 따라서 식물에서 유래한 irisin이 adipokine 조절을 통해 전신 대사 조절 기능을 지님을 의미한다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 재조합 이리신 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, UCP1 및 아디포넥틴의 발현증가 효과를 나타내므로 대사성질환의 치료에 유용하게 이용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1.1. 산제의 제조

재조합 이리신 단백질 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2. 정제의 제조

재조합 이리신 단백질 20 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1.3. 캡슐제의 제조

재조합 이리신 단백질 20 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1.4. 주사제의 제조

재조합 이리신 단백질 20 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2,974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.5. 액제의 제조

재조합 이리신 단백질 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음, 정제수를 가하여 전체를 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 건강 식품의 제조

재조합 이리신 단백질 100 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 2. 건강 음료의 제조

재조합 이리신 단백질 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioApplications Inc INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Recombinant Irisin gene optimized for plant expression and method for producing recombinant Irisin protein therefrom <130> MP19-073 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Irisin <400> 1 gattctcctt cggcaccggt taacgttact gtcaggcatc tgaaggctaa ttcagccgtt 60 gtaagctggg atgttttgga ggatgaagtt gtgattggat tcgcgatctc tcaacagaag 120 aaagatgtga gaatgttaag atttattcag gaggtcaaca caactaccag gtcatgtgct 180 ctttgggatc ttgaggagga cacagaatat atagtgcacg tgcaagcaat cagtattcag 240 ggtcaatctc cagcttccga accagtactc tttaagacgc ctcgtgaggc agagaaaatg 300 gctagtaaga ataaggacga agttactatg aaagaatag 339 <210> 2 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chapherone binding protein(BiP) <400> 2 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc a 251 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 His <400> 3 caccaccatc accaccat 18 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Irisin <400> 4 Asp Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala 1 5 10 15 Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val Ile 20 25 30 Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe 35 40 45 Ile Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu Trp Asp Leu 50 55 60 Glu Glu Asp Thr Glu Tyr Ile Val His Val Gln Ala Ile Ser Ile Gln 65 70 75 80 Gly Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu 100 105 110 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chapherone binding protein(BiP) <400> 5 Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala 20 25 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 His <400> 6 His His His His His His 1 5 <210> 7 <211> 614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of full vector <400> 7 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aggatcccac caccatcacc accatgattc tccttcggca ccggttaacg 300 ttactgtcag gcatctgaag gctaattcag ccgttgtaag ctgggatgtt ttggaggatg 360 aagttgtgat tggattcgcg atctctcaac agaagaaaga tgtgagaatg ttaagattta 420 ttcaggaggt caacacaact accaggtcat gtgctctttg ggatcttgag gaggacacag 480 aatatatagt gcacgtgcaa gcaatcagta ttcagggtca atctccagct tccgaaccag 540 tactctttaa gacgcctcgt gaggcagaga aaatggctag taagaataag gacgaagtta 600 ctatgaaaga atag 614 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of full vector <400> 8 Gly Ser His His His His His His Asp Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn 1 5 10 15 Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp 20 25 30 Val Leu Glu Asp Glu Val Val Ile Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys 35 40 45 Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe Ile Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr 50 55 60 Arg Ser Cys Ala Leu Trp Asp Leu Glu Glu Asp Thr Glu Tyr Ile Val 65 70 75 80 His Val Gln Ala Ile Ser Ile Gln Gly Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro 85 90 95 Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn 100 105 110 Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu 115 120

Claims (16)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 재조합 이리신 유전자로,
   상기 재조합 이리신 유전자는 니코티아나 속 담배에서의 발현이 최적화되는 것을 특징으로 하는, 유전자.
   
2. 제1항의 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 벡터는 도 1에 기재된 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 벡터는 BiP(Chaperone binding protein) 유전자 및 태그용 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
   
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된, 형질전환체로서,
   상기 형질전환체는 니코티아나 속 담배인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
   
6. 삭제
7. (a) 제5항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 이리신 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 이리신 단백질의 생산 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제하는 것을 특징으로 하는, 재조합 이리신 단백질의 생산 방법.
   
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제

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