KR102034313B1 - 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물 또는 운동능력 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 판람근 추출물이 근육세포의 크기를 증가시키고, 운동 수행능력을 개선시키는 효과가 있기 때문에, 이를 이용하여 부작용 없이 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 판람근 추출물이 근육세포의 크기를 증가시키고, 운동 수행능력을 개선시키는 효과가 있기 때문에, 이를 이용하여 부작용 없이 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물 또는 운동능력 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.
근육(Muscle)은 인체에서 가장 구성량이 많은 조직으로서 인체의 기능적 능력(functional capacity)을 유지하고, 대사성 질환을 예방하기 위해서는 적정 근육량의 확보가 필수적으로 요구된다. 근육 크기(muscle size)는 근육 내에서 일어나는 동화작용(anabolism)이나 이화작용(catabolism)을 유도하는 세포 내 신호전달 과정(signalling pathways)에 의해 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 많이 일어날 경우 근육 단백질 합성이 증가되며, 결과적으로 근육의 크기가 증가하는 근 비대(hypertrophy)나 근섬유 수의 증가(hyperplasia)가 발생한다(The Korea Journal of Sports Science, 20(3): 1551-1561, 2011).
근육은 칼슘 유입을 촉진시켜 골 밀도를 높여 주기도 한다. 그러나 신체는 노화하면서 구성성분의 변화로써 체지방과 체단백질의 재분포가 일어나며, 약 50세가 되면 근세포 내 단백질의 합성속도가 분해속도보다 느려져 근육이 급격하게 퇴화를 시작하게 되며, 근육 감소 질환에 노출될 수 있다.
근육 감소 질환의 하나인 근육 감소증은 평소 자기 체질량의 약 13~24%가 감소한 상태를 말하는 것으로, 단백질 함량, 섬유 직경, 근력 생산 및 피로 저항(fatigueresistance)의 감소를 나타낸다. 근육 감소증은 패혈증, 암, 신부전증, 글루코코르티코이드의 과다, 신경제거, 근육의 미사용 그리고 노화과정 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 주로, 노화가 진행됨에 따라 일어나는 골격근의 양과 질의 점진적 감소 및 부적절한 식이에너지 섭취에 따른 지방과 체지방성분을 포함하는 체중감소 등을 원인으로 꼽을 수 있으며, 흔히 노화에 따른 것으로 연령과의 상관관계가 깊다.
근육 감소증은 단백질 합성 및 분해 사이의 불평형으로부터 발생한다. 근육 감소증이 있으면 행동량이 현격하게 줄어 정신건강을 해칠뿐만 아니라 생활의 만족도도 떨어지며, 용이한 일상생활에서도 쉽게 부상을 입고 심각한 중상에 이러기도 한다.
또한, 과도한 운동은 근육의 피로와 손상을 가져오고 운동 능력을 떨어뜨린다. 근육 손상에는 타박상(멍), 열상, 국소 빈혈, 좌상(strain) 및 골격근에 대한 심각한 손상이 포함된다. 이러한 손상은 굉장한 통증을 유발할 뿐 아니라, 손상을 입은 사람은 운동 및 작업을 지속할 수 없으며 정상적인 일상 활동조차 할 수 없도록 하여, 그를 무능력하게 만들 수 있다. 골격근에 심각한 손상이 있는 경우, 좌상이 가장 흔한데, 근육 좌상 손상은 근육-건 유닛의 파괴를 특징으로 한다. 이러한 근육-건 유닛의 파괴는 근육 어느 부위에서나 발생할 수 있다. 좌상은 직업적으로 또는 스포츠 의학 전문가에 의해 처치되는 모든 손상의 30% 이상을 차지한다.
근육 손상을 감소시키거나 또는 근육 조직 회복을 빠르게 할 수 있는 처치는 운동 후 근력 발생 회복을 빠르게 할 가능성이 있다. 이는 또한 질병 후 근육 회복을 도울 수도 있다.
그러나 최근 외모와 다이어트에 관한 관심이 높아지면서 연령에 상관없이 급격한 체중감소로 근육 감소증이 유발될 수도 있고, 격한 운동으로 근육이 손상될 수 있다.
이에, 일반적인 근육 감소 질환으로 인한 근육 감소를 치료하거나 근육을 증가시키기 위한 연구와 노력이 집중되고 있으며, 여전히 근육 감소 질환의 치료와 근육강화에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 근 기능 강화 및 근육 감소 억제 활성을 가지며 안전하게 적용될 수 있는 천연물질을 탐색한 결과, 판람근 추출물이 근감소증 예방 및 치료, 근육량 증가, 근육 감소 억제 또는 근 지구력 증가 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기‘판람근(Isatis indigotica Fortune)’은 배추과 식물인 대청의 뿌리를 말린 것으로, 맛은 쓰고 찬 성질을 가지고 있다. 열을 내리고 해독 작용이 있고, 혈을 맑게하는 효능이 있다고 알려져 있다. 유행성 감기, 유행성 뇌막염, B형 뇌염, 폐렴, 단독(丹毒), 열독발진, 인후종, 유행성 이하선염, 급성 결막염 등을 치료할 때 사용된다.
본 발명의 상기 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있다.당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 판람근 추출물은 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매, 아임계 유체, 초임계 유체 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 ‘근육 질환’은 점진적인 근력감소로 인한 보행능력의 상실과 호흡 근력의 약화, 심장 기능의 약화 등을 특징으로 하는 진행성 질환으로, 결국에는 신체의 장애를 가져와서 모든 일상생활을 남에게 의지하게 되는 만성적인 질환이다. 또한 근육 질환은 선천성 질환과 후천성 질환으로 나눌 수 있고, 이에 제한되지는 않으나, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 또는 근육감소증(sarcopenia)일 수 있다.
본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 ‘근육강화’는 근육의 근력 및/또는 크기를 증가시키는 효과를 의미하며, 근육의 종류를 제한하지 않는다. 바람직하게는 근육량을 증가시키는 효과를 나타내고, 근육 감소를 억제시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 근육량의 증가는 근육의 성능을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고, 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 근육 감소는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 하며, 유전적 요인, 후천적 요인. 노화 등이 원인일 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 판람근 추출물을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 ‘운동능력’은 일상생활이나 스포츠에서 볼 수 있는 신체동작을 외형적으로 달리기, 뛰기, 던지기, 헤엄치기 등으로 구분할 때, 상기 동작을 빠르게, 강하게, 정확하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 정도를 나타내는 것으로, 운동수행능력은 근력, 민첩성 및 지구력 등의 인자로 규정된다.
용어 '운동능력 증진'은 운동능력을 개선하거나 향상시키는 것을 말한다. 바람직하게는 상기 식품 조성물은 근력을 증가시키는 효과를 나타내고, 근 지구력을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한 이에 제한되지는 않으나, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환, 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 또는 우울증 등의 증상을 예방 또는 개선시키는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 판람근 추출물을 이용한 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 모발 성장 촉진 및 항염증의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 식품용 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 총 중량 중 0.01 내지 50 중량% 이다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 판람근 추출물을 근육세포에 처리한 뒤, MHC(myosin heavy chain)의 결합지수(fusion index)를 측정한 결과, 판람근을 처리하지 않은 근육세포보다 판람근 추출물을 처리한 경우에 농도에 따라 MHC의 결합지수가 높은 것을 확인하였다(실시예 1, 도 1 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 판람근 추출물을 근육세포에 처리한 뒤, RNA를 추출하여, MHC의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 판람근 추출물을 처리한 경우가 처리하지 않은 경우보다 MHC mRNA 발현량이 증가하는 것을 확인하였고, 농도에 따라 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2, 도 2 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 근육세포에 TNF-α와 판람근 추출물을 처리한 뒤, 현미경으로 세포의 크기를 관찰한 결과, TNF-α를 처리한 경우에 근육세포의 크기가 감소한 반면, 판람근 추출물을 처리한 경우에 근육세포의 크기가 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3, 도 3 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 마우스에 고지방식이와 고지방식이에 판람근 추출물을 함유한 식이를 급여한 다음, 트레드밀(treadmill) 운동법으로 최대 운동 수행능력을 측정한 결과. 정상식이 마우스에 비해 고지방식이 마우스의 운동 수행능이 감소하였고, 판람근 추출물을 투여한 고지방식이 마우스는 판람근 추출물 농도에 따라 최대 운동 수행능이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 4, 도 4 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 마우스에 고지방식이와 고지방식이에 판람근 추출물을 함유한 식이를 급여한 다음, 마우스를 희생시켜 근육 조직을 취한 다음 근육 조직에서 RNA를 추출하여, MyHC2b 및 Tropol의 발현량을 측정한 결과, 고지방식이 마우스에 판람근 추출물을 투여한 경우에 MyHC2b의 발현량이 대조군(고지방식이군, HFD)에 비해 감소하는 것을 확인하였고, Tropol의 발현량이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다(실시예 5, 도 5 참조)
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 마우스에 고지방식이와 고지방식이에 판람근 추출물을 함유한 식이를 급여한 다음, 마우스를 희생시켜 근육 조직을 취한 다음 단백질을 추출하여 근육의 운동 마커인 근글리코겐(muscle gylcogen)과 근육 젖산염(muscle lactate)의 효소활성을 측정한 결과, 고지방식이에 판람근 추출물을 함유한 식이를 섭취한 경우에, 근글리코겐의 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 근육 젖산염의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 6, 도 6 참조).
따라서, 본 발명은 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 판람근 추출물이 근육세포의 크기를 증가시키고, 운동 수행능력을 개선시키는 효과가 있기 때문에, 이를 이용하여 부작용 없이 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 근육세포에 판람근 추출물을 처리하였을 때 농도에 따른 MHC(myosin heavy chain)의 결합 지수(fusion index)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 근육세포에 판람근 추출물을 처리하였을 때 농도에 따른 MHC(myosin heavy chain)의 mRNA의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 근육세포에 TNF-α를 처리하고, 판람근 추출물을 처리하였을 때 농도에 따른 세포의 직경을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 최대 운동 수행능력을 평가한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
도 5는 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 근육타입 mRNA의 발현량(A: Tropol, B: MyHC2b)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
도 6은 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 근육의 운동마커인 근육 젖산염(A)과 근육 글리코겐(B)의 효소활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
모든 연구결과는 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., SanDiego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 통계적 유의성은 Boneferroni multiple comparison post test로 검증하였으며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표기하였다.
도 2는 근육세포에 판람근 추출물을 처리하였을 때 농도에 따른 MHC(myosin heavy chain)의 mRNA의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 근육세포에 TNF-α를 처리하고, 판람근 추출물을 처리하였을 때 농도에 따른 세포의 직경을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 최대 운동 수행능력을 평가한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
도 5는 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 근육타입 mRNA의 발현량(A: Tropol, B: MyHC2b)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
도 6은 고지방 식이 비만 유도 모델에서 판람근 추출물을 섭취하였을 때 근육의 운동마커인 근육 젖산염(A)과 근육 글리코겐(B)의 효소활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다(NOR: 정상식이군, HFD: 고지방식이군, IL: 고지방식이+판람근 추출물(2.5%), IH: 고지방식이+판람근 추출물(5%)).
모든 연구결과는 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., SanDiego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 통계적 유의성은 Boneferroni multiple comparison post test로 검증하였으며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 표기하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
판람근 추출물이 근육세포의 MHC 결합에 미치는 영향
판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물은 한국식물추출물은행에서 구입하여 시료로 사용하였으며, 각 시료는 95% 에탄올 또는 물로 추출한 추출물이다.
먼저, 마우스 유래 근아세포인 C2C12(CRL1772 ATCC, USA) 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 배양하였고, 분화 초기에 분화배지(2% HS를 포함하는 DMEM 배지)와 판람근 추출물을 1, 5, 10μg/mL를 처리하였다. 그 다음 세포에 4% 포름알데하이드 (formaldehyde)로 실온에서 15분 동안 고정시킨 후, 0.05% 사포닌 용액으로 실온에서 30분간 투과(permeabilization) 후 1% BSA 용액으로 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체 (Total MyHC)로 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBS로 세척하여 2차 형광항체를 동일한 방법으로 반응시킨 뒤 DAPI 염색을 실시하였고, 형광현미경으로 근관과 핵(nucleus)을 확인한 후 Image J로 근관 내 nucleus의 수를 측정하여 핵(nucleus)과 근육 다발(muscle bundle)의 결합 지수(fusion index)를 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 판람근 추출물을 처리하지 않은 대조군(control)에 비해 판람근 추출물을 처리하였을 때, 핵(nucleus)과 근육 다발(muscle bundle)의 결합 지수가 높은 것으로 나타났고, 추출물에 농도에 따라 결합 지수가 증가하는 것으로 나타났다.
<실시예 2>
판람근 추출물이 근육세포의 MHC 발현에 미치는 영향
근육세포를 배양한 다음, 판람근 추출물을 1, 5, 10μg/mL를 처리하고 24시간 동안 배양한 다음, PBS를 이용하여 세포를 세척한 뒤, 세포를 수득하였고, 제조사의 지침에 따라 NucleoSpin RNA kit (Nacherey-Nagel, Duren, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 그 다음, Synthesize cDNA for real-time PCR kit(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, FSQ-201, TOYOBO)을 이용하여 cDNA를 합성한 뒤, SYBR Green Master Mix(TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan)로 PCR을 실시하여 MHC(myosin heavy chain)의 mRNA 발현량을 측정하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 판람근 추출물을 처리하지 않은 대조군(control)에 비해 판람근 추출물을 처리하였을 때, MHC mRNA의 발현량이 증가하는 것으로 나타났고, 추출물의 농도에 따라 mRNA의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다.
| 염기서열 | 서열번호 | ||
| MyHC1 | Sense | CCA AGG GCC TGA ATG AGG AG | 1 |
| Anti-sense | GTC CTG CAG CCT CAG CAC GTT | 2 | |
| 18s RNA | Sense | GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT | 3 |
| Anti-sense | CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG | 4 | |
<
실시예
3>
판람근 추출물이 근육세포의 크기에 미치는 영향
근육세포를 배양한 다음, TNF-α를 25ng/mL을 처리하였고, 판람근 추출물을 1, 5, 10μg/mL를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 현미경으로 세포의 크기를 관찰하였고, Image J 프로그램을 이용하여 세포의 직경을 측정하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, TNF-α를 처리한 경우에, 세포의 직경이 감소하였으나. 판람근 추출물을 처리하였을 때, 세포의 직경이 증가하는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
판람근 추출물이 운동 수행 능력에 미치는 영향
생후 8주령 된 수컷 C57BL/6를 동물사의 일정한 조건(온도: 20±2℃, 습도: 40～60%, 명암: 12시간 light/dark cycle)하에서 충분하게 적응시킨 후에 본 연구에 이용하였다. 마우스를 고지방 식이로 비만을 유도하면서, 판람근 추출물을 2.5%와 5%의 농도로 포함한 실험식이를 8주 동안 자율급여 하였으며, 모든 식이는 AIN 76 식이 조성에 의하여 제조하였다.
그 다음 마우스의 운동 수행능력을 개선을 확인하기 위하여, 7주 차에 트레드밀(treadmill) 운동을 실시하였다. 최대 운동 수행능력은 15℃의 경사의 트레드밀에서 마우스가 탈진할 때까지 운동한 거리(distance, m)로 측정하였다. 트레드밀 운동 훈련을 위해 첫째 날에는 5 m/min의 속도로 10 분간, 10 m/min으로 10분간, 둘째 날에는 5 m/min으로 5분간, 10 m/min으로 15분간 훈련시켰다. 시험 당일인 셋째 날에는 10 m/min으로 20분간 운동 후 2분마다 2 m/min으로 속도를 증가시켰다. 최대 운동 수행능력은 운동을 멈춘 후 그리드(grid)에서 10초 이상 머무를 때까지의 달린 거리로 환산하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 정상식이를 한 마우스(normal, NOR)에 비해 고지방식이를 급여한 마우스(high fat diet, HFD)의 경우 최대 운동 수행능이 감소하는 것으로 나타났으며, 고지방식이를 한 마우스에 판람근 추출물을 투여한 경우(IL; 고지방식이+2.5% 판람근 추출물, IH; 고지방식이+5% 판람근 추출물)에 투여 농도에 따라 최대 운동 수행능이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 고농도의 판람근 추출물을 투여한 경우(IH)에는 정상식이 마우스의 최대 운동 수행능과 거의 유사한 것으로 나타났다.
<실시예 5>
판람근 추출물이 근육타입 mRNA 발현에 미치는 영향
생후 8주령 된 수컷 C57BL/6를 동물사의 일정한 조건(온도: 20±2℃, 습도: 40～60%, 명암: 12시간 light/dark cycle)하에서 충분하게 적응시킨 후에 본 연구에 이용하였다. 마우스를 고지방 식이로 비만을 유도하면서, 판람근 추출물을 2.5%와 5%의 농도로 포함한 실험식이를 8주 동안 자율급여 하였으며, 모든 식이는 AIN 76 식이 조성에 의하여 제조하였다.
그 다음, 마우스의 근육조직(비복근 및 삼두근)을 일정량 취하여 제조사의 지시에 따라 RNA 추출 키트를 이용하여 total RNA를 추출하였고, Synthesize cDNA for real-time PCR kit를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤, SYBR Green Master Mix (TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan)을 이용하여 Applied Biosystems 7900 HT thermal cycler(Applied Biosystems)로 Real-time PCR 분석을 실시하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 정상식이군(NOR)에 비해 고지방식이군(HFD)에서 MyHC2b의 발현량이 증가하였으나, 고지방식이와 판람근 추출물 급여군(IL(2,5%), IH(5%))의 경우 MyHC2b의 발현량이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(도 5A), 또한, 정상식이군(NOR)에 비해 고지방식이군(HFD)에서 Tropol의 발현량이 감소하였으나, 고지방식이와 판람근 추출물 급여군(IL(2,5%), IH(5%))의 경우 Tropol의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다(도 5B).
| 염기서열 | 서열번호 | ||
| MyHC2b | Sense | CAC CTG GAG CGG ATG AAG AAG AAC | 5 |
| Anti-sense | GTC CTG CAG CCT CAG CAC GTT | 6 | |
| Tropol | Sense | ATG CCG GAA GTT GAG AGG AAA | 7 |
| Anti-sense | TCC GAG AGG TAA CGC ACC TT | 8 | |
| 18s RNA | Sense | GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT | 3 |
| Anti-sense | CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG | 4 | |
<실시예 6>
판람근 추출물이 근육의 운동 마커에 미치는 영향
생후 8주령 된 수컷 C57BL/6를 동물사의 일정한 조건(온도: 20±2℃, 습도: 40～60%, 명암: 12시간 light/dark cycle)하에서 충분하게 적응시킨 후에 본 연구에 이용하였다. 마우스를 고지방식이로 비만을 유도하면서, 판람근 추출물을 2.5%와 5%의 농도로 포함한 실험식이를 8주 동안 자율급여 하였으며, 모든 식이는 AIN 76 식이 조성에 의하여 제조하였다.
그 다음 제조사의 지침에 따라 효소활성 kit(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 근육 내 글리코겐과 젖산의 활성을 측정하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 정상식이군(NOR)에 비해 고지방식이군(HFD)에서 근글리코겐(muscle gylcogen, A) 및 근육 젖산염(muscle lactate, B)의 활성이 증가하였고, 판람근 추출물 급여군(IL(2,5%), IH(5%))에서 근글리코겐 및 근육 젖산염의 효소활성이 농도에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 판람근 추출물이 근육세포의 크기를 증가시키고, 운동 수행능력을 개선시키는 효과가 있기 때문에, 이를 이용하여 부작용 없이 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE
<120> Composition for Preventing, Improving or Treating of muscular
disease containing Isatis indigotica Fortune extract
<130> NP17-0115
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyHC1 sense
<400> 1
ccaagggcct gaatgaggag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyHC1 anti-sense
<400> 2
gtcctgcagc ctcagcacgt t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18s RNA sense
<400> 3
gtaacccgtt gaaccccatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18s RNA anti-sense
<400> 4
ccatccaatc ggtagtagcg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyHC2b sense
<400> 5
cacctggagc ggatgaagaa gaac 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyHC2b anti-sense
<400> 6
gtcctgcagc ctcagcacgt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tropol sense
<400> 7
atgccggaag ttgagaggaa a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tropol anti-sense
<400> 8
tccgagaggt aacgcacctt 20
Claims (11)
- 판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매, 아임계 유체, 초임계 유체 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 판람근(Isatis indigotica Fortune) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근디스트로피, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 근육 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 근육량을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 근육 감소를 억제시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 식품 조성물은 근력을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 식품 조성물은 근 지구력을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 운동능력 증진은 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환, 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 및 우울증 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 증상을 예방 또는 개선시키는 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
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| KR1020180020066A KR102034313B1 (ko) | 2018-02-20 | 2018-02-20 | 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020180020066A KR102034313B1 (ko) | 2018-02-20 | 2018-02-20 | 판람근 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| KR102487438B1 (ko) * | 2020-01-21 | 2023-01-11 | 한국식품연구원 | 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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