KR102487438B1

KR102487438B1 - 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102487438B1
Application number: KR1020200140531A
Authority: KR
Inventors: 안지윤; 하태열; 정창화; 서효덕; 이현정; 김영인; 파리다
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2023-01-11
Also published as: KR20210094453A

Abstract

본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 근육강화용 조성물; 또는 운동능력 증진용 식품 조성물에 관한 것으로서, 상기 추출물은 근육세포의 크기를 증가시키고, 운동수행능력을 개선시키는 효과가 있어, 근육 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating of muscular disease comprising Chrysanthemum zawadskii extract}

본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 근육강화용 조성물; 또는 운동능력 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.

근육(muscle)은 인체에서 가장 구성량이 많은 조직으로서 인체의 기능적 능력(functional capacity)을 유지하고, 대사성 질환을 예방하기 위해서는 적정 근육량의 확보가 필수적으로 요구된다. 근육 크기(muscle size)는 근육 내에서 일어나는 동화작용(anabolism)이나 이화작용(catabolism)을 유도하는 세포 내 신호전달 과정(signalling pathways)에 의해 조절된다. 근육 단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 많이 일어날 경우 근육 단백질 합성이 증가되며, 결과적으로 근육의 크기가 증가하는 근 비대(hypertrophy)나 근섬유 수의 증가(hyperplasia)가 발생한다(The Korea Journal of Sports Science, 20(3): 1551-1561, 2011).

신체는 노화하면서 구성성분의 변화로써 체지방과 체단백질의 재분포가 일어나며, 약 50세가 되면 근세포 내 단백질의 합성속도가 분해속도보다 느려져 근육이 급격하게 퇴화를 시작하게 되며, 근육 감소 질환에 노출될 수 있다.

근육 감소 질환의 하나인 근육 감소증은 평소 자기 체질량의 약 13~24%가 감소한 상태를 말하는 것으로, 단백질 함량, 섬유 직경, 근력 생산 및 피로 저항(fatigue resistance)의 감소를 나타낸다. 근육 감소증은 패혈증, 암, 신부전증, 글루코코르티코이드의 과다, 신경제거, 근육의 미사용 그리고 노화과정 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 주로, 노화가 진행됨에 따라 일어나는 골격근의 양과 질의 점진적 감소 및 부적절한 식이에너지 섭취에 따른 지방과 체지방성분을 포함하는 체중감소 등을 원인으로 꼽을 수 있으며, 흔히 노화에 따른 것으로 연령과의 상관관계가 깊다.

근육 감소증은 단백질 합성 및 분해 사이의 불평형으로부터 발생한다. 근육 감소증이 있으면 행동량이 현격하게 줄어 정신건강을 해칠뿐만 아니라 생활의 만족도도 떨어지며, 용이한 일상생활에서도 쉽게 부상을 입고 심각한 중상에 이러기도 한다.

또한, 과도한 운동은 근육의 피로와 손상을 가져오고 운동 능력을 떨어뜨린다. 근육 손상에는 타박상(멍), 열상, 국소 빈혈, 좌상(strain) 및 골격근에 대한 심각한 손상이 포함된다. 이러한 손상은 굉장한 통증을 유발할 뿐 아니라, 손상을 입은 사람은 운동 및 작업을 지속할 수 없으며 정상적인 일상 활동조차 할 수 없도록 하여, 그를 무능력하게 만들 수 있다. 골격근에 심각한 손상이 있는 경우, 좌상이 가장 흔한데, 근육 좌상 손상은 근육-건 유닛의 파괴를 특징으로 한다. 이러한 근육-건 유닛의 파괴는 근육 어느 부위에서나 발생할 수 있다. 좌상은 직업적으로 또는 스포츠 의학 전문가에 의해 처치되는 모든 손상의 30% 이상을 차지한다.

근육 손상을 감소시키거나 또는 근육 조직 회복을 빠르게 할 수 있는 처치는 운동 후 근력 발생 회복을 빠르게 할 가능성이 있다. 이는 또한 질병 후 근육 회복을 도울 수도 있다.

그러나 최근 외모와 다이어트에 관한 관심이 높아지면서 연령에 상관없이 급격한 체중감소로 근육 감소증이 유발될 수도 있고, 격한 운동으로 근육이 손상될 수 있다.

이에, 일반적인 근육 감소 질환으로 인한 근육 감소를 치료하거나 근육을 증가시키기 위한 연구와 노력이 집중되고 있으며, 여전히 근육 감소 질환의 치료와 근육강화에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 근 기능 강화 및 근육 감소 억제 활성을 가지며 안전하게 적용될 수 있는 천연물질을 탐색한 결과, 구절초 추출물이 근감소증 예방 및 치료, 근육량 증가, 근육 감소 억제 또는 근 지구력 증가 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum (MAXIM.) KITAMURA) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명연장용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum (MAXIM.) KITAMURA) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 수명연장용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 근육량, 근 지구력 또는 운동능력을 향상시키는 효과가 있어, 근육강화, 운동능력 증진, 근육질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 사람 유래 골세포 (U-2 OS HTB-96TM)를 이용한 PPAR delta 및 ERR3 발현 세포주에 구절초 추출물을 처리한 후, 루시퍼라아제 활성을 측정한 결과이다.
도 2a는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 구절초 추출물을 처리한 후, 예쁜꼬마선충의 수명(life span)을 분석한 결과이고, 도 2b는 headthrash 빈도를 측정한 결과이며, 도 2c는 근섬유 연결성(myofiber connectivity)을 측정한 결과이고, 도 2d는 Myo3 단백질의 발현량을 분석한 결과이며, 도 2e는 단백질 응집 분석(Protein Aggregation Assay)을 나타낸 결과이다 (N: 대조군; 및 Gc: 구절초 추출물).
도 3은 마우스에 덱사메타손을 급여한 후, 구절초 추출물 처리에 따른 운동거리(running distance), 지방제외체중(lean body mass, 실질체중), 전경골근(Tibialis anterior), 장지신근(Extensor digitorum longus), 비복근(gastrocnemius), 비장근(Soleus), 대퇴사두근(Quadriceps) 및 삼두근(Triceps)의 근육량을 측정한 결과이다.
도 4는 분화된 근육아세포에 덱사메타손을 처리한 후, 구절초 추출물 처리에 따른 근위축 조절인자 및 근육분화 조절인자의 mRNA의 발현량 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 분화된 근육아세포에 덱사메타손을 처리한 후, 구절초 추출물 처리에 따른 MHC 아형의 발현량 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 근육아세포에 덱사메타손을 처리한 후, 구절초 추출물 처리에 따른 세포호흡률 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 악력(Grip Strength) 및 달리기 지구력(Running Endurance)을 측정한 결과이다 (Young: 정상군: Aged+C: 노화 대조군; 및 Aged+GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 8은 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 근섬유의 단면적을 측정한 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 9는 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 근섬유 크기에 따른 분포를 나타낸 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 10은 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, MHC 아형(isoform)의 구성 비율을 분석할 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 11은 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 근육 감소 마커의 유전자(a) 및 단백질(b) 발현량을 분석한 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 12는 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, ATP 함량(content) 및 시트르산 합성효소(Citrate Synthase) 활성을 분석한 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 13은 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 근육 내 OCR (Oxygen Consumption Rate, 산소소비율)을 분석한 결과이다 (N: 노화 마우스; 및 Gc: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 14는 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 근육 내 미토콘드리아 생합성 단백질 양성 조절인자 또는 음성 조절인자의 발현량을 분석한 결과이다 (Young: 정상군: Aged: 노화 대조군; 및 GcL, GcH: 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스).
도 15a는 노화 마우스에 구절초 추출물 처리한 후, 비정상접힘 단백질(misfolded protein) 및 폴리유비귀틴화 단백질(polyubiquitinated protein)의 양을 분석한 결과이고, 도 15b는 오토파지 관련 단백질의 발현량을 분석한 결과이며, 도 15c는 단백질분해 관련 활성(Cathepsin L mRNA) 및 프로테오좀 활성(proteasome activity)을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum (MAXIM.) KITAMURA) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum (MAXIM.) KITAMURA)는 5월 단오에는 줄기가 5마디가 되고, 9월 9일 중양절에 꺾어서 말렸다가 부인병 치료와 예방에 이용한 데서 ‘구절초(九折草)’라고 불렸다고 한다. 우리나라·일본·중국·시베리아 등지의 산기슭에 자생한다. 가을에 피는 국화과의 야생화로는 구절초 외에 개미취·쑥부쟁이·벌개미취 등도 있는데, 생김새가 비슷해 보통 소국(小菊)으로 통한다. 이들은 줄기가 많이 갈라져 그 끝에 모두 꽃이 피는데, 구절초는 꽃이 줄기 끝에 한 송이만 핀다. 생약인 구절초는 줄기와 잎을 말린 것으로, 한방과 민간에서는 꽃이 달린 풀 전체를 치풍·부인병·위장병에 처방한다. 전초는 알칼로이드 반응을 나타낸다. 정유 등이 들어 있다. 효능으로는 한방과 민간에서 줄기와 잎을 채취하여 그늘에 말려 치풍, 생리불순, 생리통, 불임증, 부인냉증, 위장, 온중에 사용한다. 또한 전초와 꽃이삭을 열내림약으로 폐염, 기관지염, 기침, 감기, 목구멍염증,방광질병, 월경이 없을 때, 혈압이 높을 때에도 쓰인다. 보혈 강장제로도 쓰이고 식욕을 촉진시킨는 작용이 있다. 유사종인 산구절초·바위구절초 등도 비슷한 약재로 쓴다. 옛날부터 여인의 손발이 차거나 산후 냉기가 있을 때에 달여 마신다. 또 꽃을 말려서 술에 적당히 넣고 약 1개월이 지난 후에 마시면, 은은한 국향과 더불어 강장제·식욕촉진제가 된다고 알려져 있다.

본 발명의 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있다. 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 구절초 추출물은 추출용매를 이용하여 얻은 것 뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매, 아임계 유체, 초임계 유체 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 한다.

상기 근육 질환은 점진적인 근력감소로 인한 보행능력의 상실과 호흡 근력의 약화, 심장 기능의 약화 등을 특징으로 하는 진행성 질환으로, 결국에는 신체의 장애를 가져와서 모든 일상생활을 남에게 의지하게 되는 만성적인 질환이다. 또한 근육 질환은 선천성 질환과 후천성 질환으로 나눌 수 있고, 이에 제한되지는 않으나, 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육퇴화증, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 또는 근육감소증(sarcopenia)일 수 있다.

본 발명의 용어, "근육강화"는 근육의 근력 및/또는 크기를 증가시키는 효과를 의미하며, 근육의 종류를 제한하지 않는다. 바람직하게는 근육량을 증가시키는 효과를 나타내고, 근육 감소를 억제시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 근육량의 증가는 근육의 성능을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고, 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 근육 감소는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 하며, 유전적 요인, 후천적 요인. 노화 등이 원인일 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 로즈힙 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 구절초 추출물을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 용어, "운동능력"은 일상생활이나 스포츠에서 볼 수 있는 신체동작을 외형적으로 달리기, 뛰기, 던지기, 헤엄치기 등으로 구분할 때, 상기 동작을 빠르게, 강하게, 정확하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 정도를 나타내는 것으로서, 운동수행능력은 근력, 민첩성 및 지구력 등의 인자로 규정된다.

본 발명의 용어, "운동능력 증진"은 운동능력을 개선하거나 향상시키는 것을 말한다. 바람직하게는 상기 식품 조성물은 근력을 증가시키는 효과를 나타내고, 근 지구력을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, 이에 제한되지는 않으나, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환, 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 또는 우울증 등의 증상을 예방 또는 개선시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 구절초 추출물을 이용한 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 모발 성장 촉진 및 항염증의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 식품용 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 총 중량 중 0.01 내지 50 중량% 이다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험방법

1.1. 통계적 분석

모든 연구결과는 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., SanDiego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 통계적 유의성은 Boneferroni multiple comparison post test로 검증하였으며, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001 로 표기하였다.

1.2. 구절초 추출물의 제조

건조 구절초를 구입하여 분쇄하여 파우더로 만들었다. 파우더 중량의 10배 부피의 50% 에탄올 용매를 이용하여 2시간 동안 열수 추출하였다. 추출물을 감압농축 후 -80℃에서 동결 후 동결 건조하여 얻은 최종 산물의 최종 수율은 12.6% 였다. 동결 건조 후 곱게 분쇄하여 실험에 사용하였다.

실시예 2. 세포 내 PPAR delta 및 ERR3 발현량 분석

본 발명자들은 사람 유래 골세포 (U-2 OS HTB-96^TM)에서 구절초 추출물이 근육세포에 중요한 전사인자로 알려진 PPAR delta (peroxisome proliferator-activated receptor-delta) 및 ERR3 (estrogen related receptor gamma)의 활성에 영향을 미치는지 확인하는 실험을 수행하였다. 사람 유래 골세포는 ATCC (American type Cell Collection, USA)로부터 구입하였으며, 10% FBS를 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지로 배양하였다.

pBABE-puro (addgene, Plasmide #1764), pBABE puro PPAR delta (addgene, Plasmide #8891), pSG5-HA-ERR3 (addgene, Plasmide #37850)의 plasmid DNA를 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent(06 365 787 001, Roche, Switzerland)을 사용하여 표적 세포주를 제작하였다.

제작한 세포주에 구절초 추출물을 처리한 후, PPRE X3-TK-luc (addgene, Plasmide #1015), pRL-SV40P (addgene, Plasmide #27163) plasmid DNA와 Dual-Luciferase®Reporter Assay System (Promega, E1910)를 사용하여 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)를 측정하였다.

그 결과, 구절초 추출물을 처리한 그룹에서는 대조군(NC)에 비해 루시퍼라아제 활성이 증가되었음을 확인하였다 (도 1). 즉, 구절초 추출물은 근육세포에서 중요한 전사인자로 알려진 PPAR delta 및 ERR3의 활성을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 전사인자인 PPAR delta 및 ERR3의 활성을 증가시킴으로써, 근육세포 형성 및 분화를 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 예쁜꼬마선충( C. elegans )에서의 실험 결과

3.1. NGM (Nematode Growth Medium) 준비

예쁜꼬마선충(C. elegans)은 NGM (Nematode Growth Medium)에서 배양되었다. NGM는 다음 단계와 같이 준비되었다. 우선, 500 ml의 아가(agar medium)에 0.25% 펩톤(peptone)과 0.3% 염화나트륨(sodium chloride)을 추가하여 121℃에서 오토클레이브(autoclave)로 멸균시켰고, 이후, 1M MgSO4, 0.5% 콜레스테롤(Cholesterol), 인산 버퍼(phosphate buffer), 1M CaCl₂, 100mg/ml의 구절초 추출물 (final 농도: 100μg/ml)을 추가하여 잘 섞은 후, 5cm 플레이트에 5 ml 씩 분주하였고, NGM을 밤새(overnight) 굳혀 준비하였다. OP50 E. Coli는 YT 배지 (Yeast-Tryptone media)에서 밤새(overnight) 배양하였다. 이틀 날, NGM이 완전히 굳으면 OP50 배양물을 각 플레이트에 200 μl 씩 분주하고 건조하였다.

3.2. 예쁜꼬마선충에서의 수명(life span) 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, L4 성장단계의 예쁜꼬마선충(C. elegans, N2 strain)은 하나의 플레이트에 2 마리를 분리하여, 일주일 동안 15℃ 에서 배양하여 성장을 일치시켰다(synchronization). 이후, 성장이 일치된 L4에서 나온 young adult를 200μl의 M9 버퍼로 모으고 20℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. 이후, L1 성장단계를 위해 준비한 NGM 플레이트에 분주하고 2일 동안 배양하였다. 이후, L1 성장단계에서 L4 성장단계로 자라면, 새로운 NGM에 하나의 플레이트에 한 마리의 worm을 옮겼다 (n=3). 이후, 20℃ 인큐베이터에서 worm을 키우면서 매일 살아있는 worm의 수와 죽은 worm의 수를 기록하였다.

그 결과, 구절초 추출물을 처리한 그룹(Gc)에서는 대조군(N2)에 비해 전체적인 수명을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 2a).

3.3. 예쁜꼬마선충( C. elegans )의 운동수행능력 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 예쁜꼬마선충에서 운동수행능력에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, L4 성장단계의 예쁜꼬마선충(C. elegans, N2 strain)은 하나의 플레이트에 2 마리를 분리하여, 일주일 동안 15℃ 에서 배양하여 성장을 일치시켰다(synchronization). 이후, 성장이 일치된 L4에서 나온 young adult를 200μl의 M9 버퍼로 모으고 20℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. 이후, L1 성장단계를 위해 준비한 NGM 플레이트에 분주하고 2일 동안 배양하였다. 이후, 2일 및 8일의 adulthood worm을 M9 버퍼로 모은 후, headthrash movement 빈도를 측정하였다.

그 결과, 8일의 worm(노화 대조군)에서는 2일의 worm(대조군)에 비해 headthrash 빈도가 감소되었고, 구절초 추출물이 처리된 그룹(노화 실험군, 1 mg/ml)은 노화 대조군에 비해 headthrash 빈도가 덜 감소된 것으로 확인되었다 (도 2b).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 노화로 인해 감소된 운동수행능력을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

3.4. 예쁜꼬마선충( C. elegans )의 근섬유 연결성 (myofiber connectivity) 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 예쁜꼬마선충에서 근섬유 연결성 및 Myo3 단백질의 발현에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, L4 성장단계의 예쁜꼬마선충(C. elegans, SJ4103 strain)은 하나의 플레이트에 2 마리를 분리하여, 일주일 동안 15℃ 에서 배양하여 성장을 일치시켰다(synchronization). 이후, 성장이 일치된 L4에서 나온 young adult를 200μl의 M9 버퍼로 모으고 20℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. 이후, L1 성장단계를 위해 준비한 NGM 플레이트에 분주하고 2일 동안 배양하였다. 이후, 2일 및 8일의 adulthood worm을 10 μM 테트라미졸(tetramizole)로 마취하고, 체벽 근섬유 GFP(bodywall myofiber GFP)를 측정하였다.

그 결과, 8일의 worm(노화 대조군, Day 8)에서는 2일의 worm(대조군, Day 2)에 비해 근섬유 연결성이 감소되었고, 구절초 추출물이 처리된 그룹(노화 실험군, 1 mg/ml, Day8+Gc)에서는 노화 대조군에 비해 근섬유 연결성이 덜 감소된 것으로 확인되었다 (도 2c).

또한, 본 발명자들은 2일 및 8일의 adulthood worm에서 Myo3 단백질의 발현량을 분석하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 8일의 worm(노화 대조군, Day 8)에서는 2일의 worm(대조군, Day 2)에 비해 Myo3 단백질의 발현량이 현저히 감소되었고, 구절초 추출물이 처리된 그룹(노화 실험군, 1 mg/ml, Day8+Gc)에서는 노화 대조군에 비해 Myo3 단백질의 발현이 다시 증가되는 효과가 있었다 (도 2d).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 노화로 인해 감소된 근섬유 연결성 및 Myo3 단백질의 발현량을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

3.5. 예쁜꼬마선충( C. elegans )에서 단백질 응집 분석(Protein Aggregation Assay)

본 발명자들은 단백질 응집 분석을 통해 구절초 추출물이 노화로 인해 손상된 단백질 축적을 회복시키는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, worm을 단백질 용해 버퍼(protein lysis buffer)로 모은 후, 액체질소를 사용하여 snap freezing을 세 번 반복하였다. 이후, 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다. Enzo Life Proteostat Protein Aggregation Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출된 단백질의 응집 정도를 측정하였다.

그 결과, 8일의 worm(노화 대조군, Day 8)에서는 2일의 worm(대조군, Day 2)에 비해 단백질 응집 정도가 현저히 증가되었고, 구절초 추출물이 처리된 그룹(노화 실험군, 1 mg/ml, Day8+Gc)에서는 노화 대조군에 비해 단백질 응집 정도가 감소되는 효과가 있었다 (도 2e).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 노화로 인한 손상 단백질(damaged protein)의 축적을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 4. 마우스 동물모델에서 운동수행능력 및 근육량 분석

본 발명자들은 마우스 동물모델에서 구절초 추출물의 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 마우스는 8주령의 C57BL/6 수컷 마우스가 사용되었고, AIN-93G growing Rodent Diet (Research diet, D10012G) 베이스에 0.1% (w/w)의 구절초 추출물을 첨가하여 조제한 사료를 8주 동안 급여하였다.

마우스에는 희생(sacrifice)시키기 18일 전부터 덱사메타손(dexamethasone, 한동제약 덱사손)을 1~6일에 25 mg/kg, 7~18일에 5 mg/kg로 복강 내로 투여하였다. 복강투여 15일차에 골밀도측정기(InAlyzer, 메디코어스)를 이용하여 마우스의 지방제외체중(lean body mass, 실질체중)을 측정하였으며, 복강투여 18일차에 트레드밀(treadmill, Ugo Basile)을 이용하여 마우스의 운동거리(running distance)를 측정하였다. 이때, 0-5분까지는 경사 5도, 10m/min; 5분-20분까지는 경사 10도, 10m/min; 20분 이후는 2분마다 2m/min씩 증가하여 마우스의 운동거리를 측정하였다.

18일의 복강투여가 끝난 후의 다음날에 마우스를 희생시키고, 전경골근(Tibialis anterior), 장지신근(Extensor digitorum longus), 비복근(gastrocnemius), 비장근(Soleus), 대퇴사두근(Quadriceps) 및 삼두근(Triceps)의 6부위 근육에서 근육량(근육 무게, 마우스 체중 당 mg으로 표시, mg/g body weight)을 계측하였다.

그 결과, 덱사메타손이 급여된 마우스는 대조군에 비해 운동거리(running distance) 및 지방제외체중(lean body mass)이 감소한 반면, 구절초 추출물이 급여된 마우스는 대조군 수준으로 운동거리(running distance) 및 지방제외체중(lean body mass)이 회복되는 것을 확인하였다 (도 3). 아울러, 덱사메타손이 급여된 마우스는 대조군에 비해 마우스 체내 근육량이 감소한 반면, 구절초 추출물이 급여된 마우스는 대조군 수준으로 근육량이 회복되었다 (도 3).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 덱사메타손에 의해 감소된 근육량을 회복시켜, 감소된 운동수행능력을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 세포 내 근위축 조절인자 및 근육분화 조절인자의 mRNA 발현량 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 근위축 조절인자 및 근육분화 조절인자의 mRNA 발현량에 변화를 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주 (CRL1772 ATCC, USA)는 10% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였고, 2% HS (horse serum)가 포함된 DMEM 분화 유도 배지를 4 일 동안 처리하였다. 분화 유도가 끝난 후, 1, 2.5 및 5 μg/mL의 구절초 추출물과 5 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하였다.

24시간 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 세포를 수득하였고, 제조사의 지침에 따라 NucleoSpin RNA Kit (Nacherey-Nagel,Duren, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 이후, Synthesize cDNA for real-time PCR Kit (ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, FSQ-201, TOYOBO)을 이용하여 cDNA를 합성한 후, SYBR Green MasterMix (TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japan)로 PCR을 실시하여 Atrogin-1, MurF-1 (Muscle RING-finger protein-1), Myostatin, MyoG (myogenin) 및 MyoD (myoblast determination protein 1)의 mRNA 발현량을 측정하였다. 각 유전자에 특이적인 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

		염기서열 (5' -> 3')	서열번호
Atrogin	Sense	GACTGGACTTCTCGACTGCC	1
Atrogin	Anti-sense	TCAGGGATGTGAGCTGTGAC	2
MurF-1	Sense	GCTGGTGGAAAACATCATTGACAT	3
MurF-1	Anti-sense	CATCGGGTGGCTGCCTTT	4
Myostatin	Sense	ACGCTACCACGGAAACAATC	5
Myostatin	Anti-sense	GGAGTCTTGACGGGTCTGAG	6
MyoG	Sense	GCAGGCTCAAGAAAGTGAATGA	7
MyoG	Anti-sense	TAGGCGCTCAATGTACTGGAT	8
MyoD	Sense	CGGGACATAGACTTGACAGGC	9
MyoD	Anti-sense	TCGAAACACGGGTCATCATAGA	10
18s RNA	Sense	GTAACCCGTTGAACCCCATT	11
18s RNA	Anti-sense	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	12

그 결과, 덱사메타손을 처리한 그룹에서는 대조군(DMSO)에 비해 Atrogin-1 및 MurF-1 mRNA 발현량이 유의적으로 증가하였다 (도 4). 반면, 구절초 추출물을 처리한 군(1, 2.5 및 5 μg/mL)에서는 덱사메타손을 처리한 그룹에 비해 Atrogin-1 및 MurF-1 mRNA의 발현량이 유의적으로 감소하였다 (도 4).

또한, 덱사메타손을 처리한 그룹에서는 대조군(DMSO)에 비해 Myostatin mRNA의 발현량이 유의적으로 증가하고, MyoG 및 MyoD mRNA의 발현량이 유의적으로 감소하였다 (도 4). 반면, 구절초 추출물을 처리한 군(1, 2.5 및 5 μg/mL)에서는 덱사메타손에 의해 증가되거나 감소된 Myostatin, MyoG 및 MyoD mRNA의 발현량이 대조군(DMSO)와 유사하게 회복되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 4).

Atrogin-1 및 MurF-1은 근육 단백질을 파괴하여 근위축(atrophy)을 야기하는 것으로 알려진 유전자로서, 본 발명에서는 구절초 추출물이 덱사메타손에 의해 증가된 근위축 조절 유전자의 발현을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, Myostatin은 근육분화 억제인자로 알려져 있고, MyoG 및 MyoD는 근육분화를 조절하는 것으로 알려진 유전자로서, 본 발명에서는 구절초 추출물이 덱사메타손에 의해 변화된 근육분화 조절 유전자의 발현을 회복시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6. 세포 내 MHC (myosin heavy chain) 단백질의 발현량 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 근섬유 단백질의 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주 (CRL1772 ATCC, USA)는 10% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였고, 2% HS (horse serum)가 포함된 DMEM 분화 유도 배지를 4 일 동안 처리하였다. 분화 유도가 끝난 후, 1, 2.5 및 5 μg/mL의 구절초 추출물과 5 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하였다.

24시간 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 세포를 수득하였고, RIPA 버퍼 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 용해하여 단백질을 추출한 후, SDS-PAGE 겔(gel)을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 이후, 단백질이 옮겨진 멤브레인(membrane)을 5(v/v)% 스킴 밀크(skim milk)로 1 시간 동안 블로킹(blocking)하였고, 1차 항체를 4℃ 에서 오버나잇(overnight)하고, 2차 항체를 상온에서 2 시간 동안 부착한 후, ECL 용액(enhanced chemiluminescence)을 이용하여 단백질의 발현량을 측정하였다.

웨스턴 블로팅에 사용된 1차 항체는 다음과 같다: β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), MHC (myosin heavy chain), MHC의 아형인 MHC I (oxidative, slow type), MHC IIa (oxidative, fast type) 및 MHC IIb (glycolytic, fast type)(Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, Iowa, USA).

그 결과, 덱사메타손을 처리한 그룹에서는 대조군에 비해 T-MHC, MHCⅠ, MHCⅡa 및 MHCⅡb의 단백질 발현량이 유의하게 억제되었다 (도 5). 반면, 구절초 추출물을 처리한 그룹(1, 2.5 및 5 μg/mL)에서는 농도 의존적으로 단백질의 발현량이 유의적으로 회복되는 효과가 있었다 (도 5).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 덱사메타손에 의해 억제된 MHC 단백질의 발현량을 회복시켜, 근섬유의 위축을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 7. 세포 내 세포호흡률 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 세포호흡률에 영향을 주는지 확인하기 위하여, XF analyzer (Seahorse Bioscience, USA)을 이용하여 OCR (Oxygen Consumption Rate, 산소소비율)를 측정하는 실험을 수행하였다.

간단히, 마우스 유래 근아세포인 C2C12 세포주 (CRL1772 ATCC, USA)는 10% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다. XF-24 FluxPak (Seahorse, Agilent, USA)의 지침에 따라 세포를 분주하여 준비하고, 1, 2.5 및 5 μg/mL의 구절초 추출물과 5 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 처리하였다. 24 시간 후, 중탄산염 제외 배지(bicarbonate-free medium)로 교체하고, CO₂ 공급없이 세포배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit (Agilent, USA)를 사용하여 1.5 μM 올리고마이신(oligomycin), 2μM 카보닐 시아나이드-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존(carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)), 1μM 로테논(rotenone)의 호흡사슬 억제제를 순서대로 처리하면서 OCR 변화량을 측정하였다.

그 결과, 덱사메타손을 처리한 그룹에서는 대조군에 비해 세포호흡률이 감소한 반면, 구절초 추출물을 처리한 그룹에서는 감소된 세포호흡률을 유의적으로 회복시키는 효과가 있었다 (도 6).

실시예 8. 노화 마우스 동물모델에서 운동수행능력 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 노화 마우스 동물모델에서 운동수행능력에 변화를 주는지 확인하기 위하여, 마우스의 악력(Grip Strength) 및 달리기 지구력(Running Endurance)를 측정하는 실험을 수행하였다.

간단히, 마우스는 앞다리로 악력을 5회 반복하여 측정하여 평균값을 계산하였다. 골격근 강도는 체중으로 정규화하였다 (g/g). 달리기 지구력(Running Endurance)의 경우 마우스는 실험 전에 2일 동안 트레드밀에서 경사없이 15분 동안 5 m/min의 속도로 적응시켰다. 본 실험에서는 5 m/min으로 시작하여 마우스가 지칠 때까지 3분마다 2 m/min 씩 증가시키면서 최대 주행 거리 및 시간을 측정하였다. 실험에서 경사는 적용하지 않았다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 악력(Grip Strength) 및 달리기 지구력(Running Endurance)이 현저히 감소되는 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군(C)에 비해 악력 및 달리기 지구력이 개선되는 효과를 보였다 (도 7).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 노화에 의해 감소된 운동수행능력을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 9. 노화 마우스 동물모델에서 면역조직화학 분석

9.1. 라미닌 염색을 통한 근섬유의 크기 분석

라미닌(Laminin)은 세포외기질(extracellular matrix)에 존재하는 단백질로서, 세포의 구조 형성에 필수적인 단백질인 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 구절초 추출물이 근섬유의 크기에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 라미닌 염색(laminin staining)을 통해 근섬유의 단면적(cross sectional area)을 관찰하였다.

간단히, 마우스의 비복근(gastrocnemius)을 OCT compound로 -20℃에서 고정한 후, 7 μm 두께로 박절하여 슬라이드에 붙였다. 이후, 박절된 근육조직을 20% 아세톤으로 고정하고, 10% FBS로 블러킹한 후, alexa fluor 488-conjugated laminin으로 4℃에서 16시간 동안 염색하였다. 염색된 조직은 PBS로 세척하였고, 커버 슬라이드를 덮은 후, 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 관찰하였다. 면역조직화학염색에서 라미닌은 녹색을 나타난다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 근섬유의 단면적이 작게 나타났고, 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 농도의존적으로 근섬유의 단면적이 증가하는 것으로 나타났다 (도 8). 또한, 근섬유 크기에 따른 분포 결과로부터, 노화 마우스에서는 500 μm² 이하의 근섬유가 약 65%로서, 정상군(약 20%)에 비해 근섬유의 크기가 현저하게 작아진 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스에서는 정상군과 유사한 수준으로 근섬유의 크기가 증가하였음을 확인하였다 (도 9).

9.2. MHC (myosin heavy chain) 아형(isoform)의 구성 비율 분석

골격근에 존재하는 MHC (myosin heavy chain)는 MHC1, MHC2A, MHC2B 같은 아형(isoform)을 가지고 있으며, 각 아형은 서로 다른 특징을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 특히, MHC1은 slow type, MHC2B는 fast type의 근육으로서, 노화가 진행될수록 fast-to-slow type 변환이 나타난다. 본 발명자들은 구절초 추출물이 MHC 아형의 구성 비율에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 근육에서 MHC 타입의 면역조직화학 염색을 수행하고 MHC 아형의 구성 비율을 분석하는 실험을 수행하였다.

간단히, 마우스의 비복근(gastrocnemius)을 OCT compound로 -20℃에서 고정한 후, 7 μm 두께로 박절하여 슬라이드에 붙였다. 이후, 박절된 근육조직을 20% 아세톤으로 고정하고, 10% FBS로 블러킹한 후, MHC1, MHC2A 및 MHC2B 1차 항체로 4℃에서 16시간 동안 염색하였다. 이후, PBS로 세척하였고, 2차 항체로 상온에서 30분 동안 염색하였다. 염색된 조직은 PBS로 세척하였고, 커버 슬라이드를 덮은 후, 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 관찰하였다. 면역조직화학염색에서 MHC1은 파란색, MHC2A는 녹색, MHC2B는 적색으로 나타난다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 slow type의 MHC1이 증가하고, fast type의 MHC2B가 감소하는 경향을 보였다 (도 10). 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 정상군과 유사하게 MHC1이 현저히 감소하고, MHC2B가 증가하는 것으로 나타났다 (도 10).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 노화로 인해 변화된 근섬유 단백질을 회복시켜, 감소된 운동수행능력을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 10. 노화 마우스 동물모델에서 근육 감소 마커의 발현량 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 근육 감소 마커인 atrogenes (atrogin-1 및 murf1)의 발현량에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 각각 qPCR 및 면역블롯을 통해 유전자 발현량 및 단백질 발현량을 측정하였다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 근육 감소 마커인 atrogin-1 및 murf1 유전자의 발현량이 현저히 증가한 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군에 비해 atrogin-1 및 murf1 유전자의 발현량이 감소되었음을 확인하였다 (도 11a). 또한, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군에 비해 atrogin-1 및 murf1 단백질 발현량이 감소되었음을 확인하였다 (도 11b).

실시예 11. 노화 마우스 동물모델의 근육 내 ATP 함량(content) 및 시트르산 합성효소(Citrate Synthase) 활성 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 근육 내 미토콘드리아 활성에 영향을 주는지 확인하기 위하여, ATP 함량(content) 및 시트르산 합성효소(Citrate Synthase) 활성을 분석하는 실험을 수행하였다.

간단히, ATP 함량은 ATP Synthase Enzyme Activity Microplate Assay Kit (Abcam)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 검출하였다. ATP 함량은 루시페린-루시퍼라제 기반 생물 발광 분석으로 결정되었고, pmol의 농도로 표현하였다. 또한, 시트르산 합성효소 활성은 Citrate Synthase Assay Kit (Sigma Aldrich, CA, USA)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 시트르산 합성효소는 총 단백질의 μmol/min/mg 단위로 표현하였다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 ATP 함량 및 시트르산 합성효소 활성이 현저히 감소하였고, 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 ATP 함량 및 시트르산 합성효소 활성이 증가하는 경향을 보였다 (도 12).

실시예 12. 노화 마우스 동물모델의 근육 내 OCR (Oxygen Consumption Rate, 산소소비율) 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 노화 마우스 동물모델에서 미토콘드리아의 기능에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 노화 마우스의 근육 내 OCR (Oxygen Consumption Rate, 산소소비율)을 분석하는 실험을 수행하였다.

간단히, 마우스의 장지신근(Extensor digitorum longus)을 분리하고, 콜라게네이즈(collagenase)로 소화된 단일 근섬유를 XF24 웰에 분주한 후, Seahorse XF24 Analyzer (Agilent, CA, USA)를 사용하여 OCR을 측정하였다. 기저 OCR을 측정한 후, 미토콘드리아 억제제인 올리고마이신 (oligomycin, 1μM), 미토콘드리아 언커플러(uncoupler)인 FCCP (carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone, 400 nM), 피루브산(pyruvate, 10 mM) 및 미토콘드리아 복합체를 완전히 억제하는 로테논(rotenone)을 주입하였다. 이후, 근육 단백질의 함량을 결정하기 위하여 BCA 분석을 수행하고, 그 결과를 단백질 함량으로 정규화하였다.

그 결과, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(Gc)에서는 노화 대조군(N)에 비해 OCR이 증가하는 경향을 보였다 (도 13).

실시예 13. 노화 마우스 동물모델의 근육 내 미토콘드리아 생합성 단백질(Mitochondria Biogenesis Protein)의 발현량 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 미토콘드리아 생합성 단백질의 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 면역블롯을 통해 미토콘드리아 생합성 양성 조절자(mitochondria biogenesis positive regulator)인 PGC1a (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), PPARd (Peroxisome proliferator-activated receptor delta), ERRa (estrogen-related receptor alpha) 및 음성 조절자(negative regulator)인 NCor1 (Nuclear receptor corepressor 1)의 단백질 발현량을 측정하였다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 미토콘드리아 생합성 양성 조절자인 PGC1a, PPARd 및 ERRa 단백질의 발현량이 감소하였고, 미토콘드리아 생합성 음성 조절자인 NCor1 단백질의 발현량이 증가하였다 (도 14). 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군에 비해 미토콘드리아 생합성 양성 조절자인 PGC1a, PPARd 및 ERRa 단백질의 발현량이 증가하고, 음성 조절자인 NCor1 단백질의 발현량이 현저히 감소한 것을 확인하였다 (도 14).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 구절초 추출물이 미토콘드리아 생합성 양성 조절자인 PGC1a, PPARd 및 ERRa 단백질의 발현량을 증가시키고, 음성 조절자인 NCor1 단백질의 발현량을 감소시킴으로써, 미토콘드리아 기능을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 14. 노화 마우스 동물모델에서 오토파지(autophagy) 및 단백질 간극(protein clearance) 분석

본 발명자들은 구절초 추출물이 오토파지 관련 단백질 및 단백질 분해 관련 단백질의 발현에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 비정상 접힘 단백질(misfolded protein) 및 폴리유비귀틴화 단백질(polyubiquitinated protein)과 같은 손상된 단백질(damaged protein)의 양이 증가한 것으로 확인되었고, 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군에 비해 손상된 단백질(damaged protein)의 양이 감소한 것으로 나타났다 (도 15a).

또한, 노화 마우스(Aged)에서는 정상군(Young)에 비해 오토파지 관련 단백질, 단백질분해 관련 활성(Cathepsin L mRNA) 및 프로테오좀 활성(proteasome activity)이 증가하였고, 반면, 구절초 추출물이 급여된 노화 마우스(GcL, GcH)에서는 노화 대조군에 비해 오토파지 관련 단백질의 발현량, 단백질분해 관련 활성(Cathepsin L mRNA) 및 프로테오좀 활성(proteasome activity)이 감소하는 것으로 확인되었다 (도 15b 및 15c).

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Composition for preventing, improving or treating of muscular disease containing Chrysanthemum zawadskii extract <130> 1068073 <150> KR 10-2020-0008209 <151> 2020-01-21 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin_sense <400> 1 gactggactt ctcgactgcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin_anti sense <400> 2 tcagggatgt gagctgtgac 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MurF-1_sense <400> 3 gctggtggaa aacatcattg acat 24 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MurF-1_anti sense <400> 4 catcgggtgg ctgccttt 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myostatin_sense <400> 5 acgctaccac ggaaacaatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myostatin_anti sense <400> 6 ggagtcttga cgggtctgag 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoG_sense <400> 7 gcaggctcaa gaaagtgaat ga 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoG_anti sense <400> 8 taggcgctca atgtactgga t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_sense <400> 9 cgggacatag acttgacagg c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_anti sense <400> 10 tcgaaacacg ggtcatcata ga 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s RNA_sense <400> 11 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s RNA_anti sense <400> 12 ccatccaatc ggtagtagcg 20

Claims

구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum (MAXIM.) KITAMURA) 추출물을 유효성분으로 포함하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 측삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매, 아임계 유체, 초임계 유체 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의하여 추출된 것인 조성물.
삭제
구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 측삭경화증, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육강화용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 조성물은 근육량을 증가시키는 효과를 나타내는 것인 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 조성물은 근육 감소를 억제시키는 효과를 나타내는 것인 조성물.
구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동능력 증진용 식품 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 조성물은 근력을 증가시키는 효과를 나타내는 것인 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 조성물은 근 지구력을 증가시키는 효과를 나타내는 것인 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 운동능력 증진은 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 및 우울증으로 야기되는 근감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 증상을 예방 또는 개선시키는 것인 조성물.
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