KR102132655B1 - 구절초 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 리나린을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 또는 개선용 조성물 및 항산화용 조성물이 개시된다. 본 발명의 조성물은 인체독성이 없어서 안전하고, 우수한 알파-글루코시다아제 억제능, 인슐린 감수성 개선 효과가 있어서, 대사성 질환의 개선 또는 예방에 효과적이고, 활성라디칼 제거능이 우수하여 항산화 효과가 우수하다.
Description
본 명세서에는 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 개선 또는 예방용 조성물 및 항산화 조성물이 개시된다.
구절초는 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 국화과에 속하는 다년생 쌍떡잎식물로, 구절초는 전국 각처의 산지와 고원지에서 자생하고 중국, 러시아, 몽골, 일본 등지에서 자란다. 구절초는 그 줄기와 잎을 말려 예로부터 월경불순, 자궁냉증, 불임증의 부인병과 위장병 등에 효능을 가지는 생약으로 사용되고 있다.
구절초에는 리나린(linarin), 루테올린(luteolin), 아피게닌(apigenin), 아카세틴(acacetin) 등의 플라보노이드가 함유된 것으로 알려져 있는데, 이 중 리나린은 구절초의 대표적인 성분이다. 리나린은 칼슘의 흡수와 미네랄화를 증가시켜 조골세포의 분화를 유도시키고, α-galactosamine와 lipopolysaccharide로 유도된 급성 간손상을 완화시키는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 리나린은 amyloid로 유도된 신경세포사멸을 방지하며, 기억력 감퇴의 원인인 acetylcholinesterase의 활성을 억제하여 알츠하이머병의 치료제로서의 가능성이 보고되어 있다.
한편, 알파-글루코시다아제 (α-glucosidase)는 소장에 존재하는 효소로, 섭취한 탄수화물의 알파-1,4 결합을 분해하여 포도당을 생성하는 소화과정에서 중요한 역할을 한다. 생성된 당은 소장에서 흡수되는데, 알파-글루코시다아제 저해제는 탄수화물의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 상승을 억제하는 역할을 한다. 시판되는 알파-글루코시다아제 저해제로는 miglitol, voglibods 및 acarbose 등이 있으나, 장기적으로 복용할 경우 복부팽만감, 구토, 설사 등의 부작용의 위험이 있으므로 알파-글루코시다아제 저해활성을 가지는 천연 소재 발굴 연구의 필요성이 대두되고 있다.
Archives of pharmacal research : a publication of the Pharmaceutical Society of Korea, v.25 no.2, 2002년, pp.170-177
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 인체 독성이 없는 대사성 질환 개선 및 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 리나린을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은, 알파-글루코시다아제의 활성을 저해하여, 대사성 질환의 개선 또는 예방 효과가 있고, 라디칼 소거능이 있어, 항산화 효과도 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 알파-글루코시다제 억제 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 스트렙토조토신에 의해 당뇨가 유발된 군에서 체중 변화(도 7a), 인슐린 변화(도 7c), 혈당변화(도 7d)를 보이는 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 스트렙토조토신 투여 및 고지방식이에 의해 당뇨가 유발된 군에서 혈당 변화(도 8a), 경구 내당능 변화(도 8b), 인슐린 변화(도 8c), hbA1c 변화(도 8d)를 보이는 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 스트렙토조토신에 의해 당뇨가 유발된 군에서 체중 변화(도 7a), 인슐린 변화(도 7c), 혈당변화(도 7d)를 보이는 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 스트렙토조토신 투여 및 고지방식이에 의해 당뇨가 유발된 군에서 혈당 변화(도 8a), 경구 내당능 변화(도 8b), 인슐린 변화(도 8c), hbA1c 변화(도 8d)를 보이는 도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 조성물이다.
또한, 일 측면에서, 본 발명은 리나린을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물이다.
상기 조성물은, 알파-글루코시다아제 활성 저해; 인슐린 감수성 개선; 및 라디컬 소거능으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 대사성 질환은, 당 대사성 질환을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 대사성 질환은, 당뇨, 고혈압 및 동맥경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 당뇨는, 제2형 당뇨를 포함할 수 있다. 제2형 당뇨는 제1형 당뇨와는 달리 인슐린 저항성에 의한 당뇨를 의미할 수 있다.
상기 리나린은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum)로부터 유래한 것을 포함할 수 있다.
리나린(linarin)은, 플라보노이드의 일종으로서, 화학식 C28H32O14, 분자량이 593g/mol인 물질을 의미한다.
상기 구절초는 구절초 추출물을 포함할 수 있고, 상기 구절초 추출물의 추출용매는, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
구절초 추출물은 구절초의 줄기, 꽃, 뿌리, 잎, 또는 열매에 다양한 용매를 처리하여 얻어질 수 있다. 상기 구절초 추출에 적용될 수 있는 용매로서, 예를 들어, 물, 알코올, 아세트산, DMSO(dimethy sulfoxide), 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 펜탄, 헥산, 클로로포름, 디에틸 에테르, 사염화탄소 등이 있다. 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올 등과 같이 C1-4의 알코올을 적용할 수 있다. 이들이 혼합된 혼합용매를 사용할 수도 있음은 물론이다.
본 명세서 전체에 있어서, "추출물"이란 용어는 상술한 바와 같이 당업계에서 일반적으로 통용되고 있는 조추출물(crude extract)뿐만 아니라, 상기 조추출물을 분획(fraction)한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 구절초 추출물은 기술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 다양한 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다.
본 발명에서 구절초를 언급하면서 사용되는 용어 "추출물"은 구절초에 추출용매를 처리하여 얻은 용매를 포함하는 액상의 추출 결과물, 상기 추출 결과물을 정제한 정제물, 상기 액상의 추출 결과물을 건조시킨 건조물, 및 상기 구절초 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 분말, 과립, 타정 등으로 제형화한 구절초 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
상기 유기용매는 알코올을 포함할 수 있으며, C2~C6의 저급 알코올을 포함할 수 있다.
상기 알코올은 알코올 수용액을 포함할 수 있고, 농도는 10~99%일 수 있다,
상기 추출용매의 온도는 20~100℃일 수 있고, 용매가 물일 경우에는 95℃가 바람직할 수 있고, 용매가 알코올일 경우에는 40~80℃가 바람직할 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
식품 조성물은 식품, 음료 등의 건강보조 또는 건강기능성 식품을 포함할 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있고, 상기 식품은 유효성분인 본 발명에 따른 리나린 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 건강유지 또는 예방적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품에 함유된 리나린의 유효용량은 후술하는 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 리나린 또는 구절초 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초컬릿, 캔디류, 스넥류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 혼합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 보존 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카리이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 일반적으로 약 0.01~0.04 중량부, 바람직하게는 0.02~0.03 중량부이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캡슐제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1 종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘, 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 리나린 을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
상기 리나린을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화 할 수 있다.
본 발명의 리나린을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 리나린 또는 구절초 추출물을 약 0.1~1500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 경구 또는 비경구 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 0.1~1000 ㎎/g/day 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 0.1~300 ㎎/g/day 의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 약 0.001~1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
한편, 리나린의 함량은 구절초 추출물의 생리활성과 관계가 깊으며(구절초의 추출조건에 따른 Linarin 함량과 In Vitro 생리활성 변화, 김양지 등, 한국식품영양과학학회지 45(10), 1414~1421, 2016.8.4.) 구절초 추출물은 리나린의 수율을 높이기 위하여 상기와 같은 방법에 의하여 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물이 식품 조성물일 때, 상기 리나린은, 조성물 총 중량을 기준으로 83%이하로 포함될 수 있으며, 리나린이 구절초 추출물의 형태로 포함될 경우에는, 70℃의 50% 주정으로 추출된 구절초 추출물이 0.000001~50 중량%, 바람직하게 0.0001% ~ 50%, 좀 더 바람직하게 0.001% ~ 50%로 포함될 수 있다.
구절초 추출물은 구절초의 줄기, 꽃, 뿌리, 잎, 또는 열매를 열수, 에탄올, 헥산, 이소프로필알콜, 초산에틸, 아세톤 또는 메틸알콜 등으로 추출하여 얻은 것으로, 2~20배의 추출 용매를 가한 후 추출기에서 2~8 시간씩 1~3 회 추출한 추출물일 수 있다.
상기 추출하는 단계는 3 회 이상 반복될 수 있다.
상기 제조방법은 농축 공정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 건조 공정을 추가로 포함할 수 있으며, 분말화를 위해서 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 구절초 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
및
비교예의
제조 >
실시예
: 구절초 추출물 제조
구절초를 수확 후 건조하고 세절하여 총 무게의 20 배의 증류수 또는 농도별 에탄올 (30% 주정, 50% 주정, 70% 주정)을 가하여 50℃ 또는 70℃에서 4 시간씩 2 회 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 감압 농축기로 농축한 다음, 동결건조하여 본 발명의 생약추출물을 제조하였다.
실험에 사용하기 위하여 증류수에 10~100 mg/ml의 농도로 녹이고 무균 여과지(Millipore membrane, 0.45 ㎛)로 여과하여 무균 상태를 유지하였다.
실시예의 조건을 하기 표 1에 나타내었다.
샘플 | 추출용매 | 추출온도(℃) |
실시예 1 | 열수 (증류수) | 95 |
실시예 2 | 30% 주정 | 50 |
실시예 3 | 30% 주정 | 70 |
실시예 4 | 50% 주정 | 50 |
실시예 5 | 50% 주정 | 70 |
실시예 6 | 70% 주정 | 50 |
실시예 7 | 70% 주정 | 70 |
실시예 8 | 95% 주정 | 50 |
실시예 9 | 95% 주정 | 70 |
실험예 1: 추출수율 측정
구절초 추출물에 대해 고형분의 무게를 수분측정기(MA50C, Satorius Co., Germany)로 측정 후 계산하여, 각 추출물에 대한 추출수율을 하기 표 2에 나타내었다.
샘플 | 추출수율(%) |
실시예 1 | 11.26 |
실시예 2 | 9.46 |
실시예 3 | 7.61 |
실시예 4 | 6.36 |
실시예 5 | 11.60 |
실시예 6 | 6.93 |
실시예 7 | 7.34 |
실시예 8 | 4.30 |
실시예 9 | 4.91 |
추출용매를 95℃ 열수 추출과 에탄올 농도가 50%인 용매를 사용하여 70℃에서 추출했을 때 가장 높은 수율을 보였으며, 95% 에탄올을 사용하여 추출한 추출물은 수율이 가장 낮았다. 상기 결과에서 구절초 추출 시 추출용매는 열수 또는 50% 주정을 70℃로 하여 추출하는 것이 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.
실험예 2 : 구절초 추출물의 리나린 함량 HPLC 분석
본 실험예에서는 상기 실시예의 구절초 추출물을 고성능 액체크로마토그라피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석을 실시하였다.
구절초 추출물의 분석을 위하여 HPLC(LC-20AD, Shimadzu Corp., Japan)를 이용하였으며, 상기 실시예 1의 구절초 추출물을 1~10 mg/mL의 농도로 희석한 뒤 0.45 μm syringe filter(Advantec, Japan)로 여과하여 HPLC에 주입하여 분석하였다. 분석용 컬럼은 COSMOSIL C18 (Cosmosil, Germany)을 사용하였다. 분석에 이용한 이동상 A는 0.1% 포름산 수용액을 이동상 B는 0.1% 포름산 아세토니트릴용액을 사용하였다. 각 시료 분석을 위한 이동용매의 조건은 하기 표 3에 나타내었으며 이동상 유속은 1.0 mL/min 샘플 투입량은 10 μL로 80 분간 컬럼을 통해 나오는 화합물을 331 nm UV 파장에서 분석하였다. 구절초 추출물의 리나린 함량 분석결과는 표 4에 나타내었다.
시간(분) | 이동상 조성비율(%) | |
이동상 A(%) | 이동상 B(%) | |
0 | 85 | 15 |
3 | 85 | 15 |
15 | 77 | 23 |
50 | 77 | 23 |
52 | 70 | 30 |
62 | 70 | 30 |
64 | 0 | 100 |
70 | 0 | 100 |
72 | 85 | 15 |
80 | 85 | 15 |
샘플 | 리나린 함량 (mg/g extract) |
실시예 1 | 29.09 |
실시예 2 | - |
실시예 3 | 67.46 |
실시예 4 | 39.36 |
실시예 5 | 168.13 |
실시예 6 | 89.66 |
실시예 7 | 133.68 |
실시예 8 | 54.3 |
실시예 9 | 11.46 |
구절초 추출물의 리나린 함량은 에탄올의 농도가 50% 또는 70%로 하여 70℃에서 추출한 실시예에서 높았으며, 열수로 추출한 실시예의 경우 리나의 함량이 가장 낮았다.
실험예
3 : 알파-
글루코시다제
억제 활성 측정
알파-글루코시다제 억제 활성은 알파-글루코시다제에 의한 pNPG(pnitrophenyl-α-D-glucoside)의 유리(cleavage)를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하는 방법을 이용하였다.
완충액(0.1M phophate buffer, pH 6.9) 50 ㎕에, 1U/㎖의 α-glucosidase(Sigma-Aldrich corp., USA) 10 ㎕와 1,000 ㎍/㎖ 농도의 상기 실시예를 각각 20 ㎕ 만큼 첨가한 뒤, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 1 mM 농도의 pNPG 20 ㎕를 넣고 37℃에서 15 분간 다시 반응시켰다. 상기 반응을 정지시키기 위해 정지액(0.1M sodium carbonate, Na2CO3)을 50 ㎕ 첨가하였고, 알파-글루코시다제 억제 활성은, 3 회 반복 수행하여 계산하였으며, 상기 결과는 도 1에 나타내었다.
양성 대조군은 당뇨 치료제인 아카보스(acarbose, Sigma Co., USA)를 사용했다.
도 1에서 대체적으로 추출용매로 물을 사용한 실시예보다 에탄올을 사용한 실시예와 50℃ 보다 70℃에서 추출한 실시예에서 알파-글루코시다제 억제 활성이 높았다. 그 중 추출용매로 50% 에탄올 및 70% 에탄올 또는 95% 에탄올을 사용하여 추출한 실시예의 알파-글루코시다제 억제 활성이 다른 실시예보다 뛰어난 것을 확인할 수 있다.
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실험예
5:
ABTS
라디칼 및
DPPH
라디칼 소거활성 확인
실시예의 항산화 활성을 측정하기 위하여 ABTS 라디칼 소거활성 및 DPPH 라디칼 소거활성 평가를 수행하였다.
ABTS 라디칼 소거활성 시험법은 시료에 의해 ABTS 라디칼이 소거되어 시약의 색이 옅어지는 정도를 측정하는 방법이다. 0.1 mg/㎖, 0.25 mg/㎖, 0.5 mg/㎖ 농도의 시료 20 ㎕에 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS, Sigma Co., USA) 시약 180 ㎕을 혼합한 후, 실온에서 7분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3 회 반복 수행하여 도출된 값으로 라디칼 소거능을 계산하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서, 추출용매가 열수인 실시예와 50% 에탄올인 실시예에서 가장 높은 소거활성을 보였다. 또한, 추출온도가 50℃ 보다 70℃인 실시예에서 더 높은 활성을 보였다.
DPPH 라디칼 소거활성를 측정하기 위해 시료 10 μL에 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 시약 90 μL를 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 아스코르브산 (ascorbic acid, Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다. 3 회 반복 수행하여 도출된 값으로 라디칼 소거능을 계산하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서, 추출온도가 50℃ 보다 70℃인 실시예에서 더 높은 활성을 보였고, 50% 에탄올을 사용하여 50℃에서 추출한 실시예가 가장 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보였다.
실험예
6 : 총 폴리페놀 측정
총 폴리페놀 함량 측정을 위해 folin-denis'reagent를 사용하였다. 1 g 농도의 시료 20 ㎕에 folin-denis'reagent(Sigma Co., USA) 100 ㎕를 첨가한 후 40℃에서 1분간 반응시켰다. 반응 후, 7.5% Na2CO3 용액 80 ㎕를 첨가하여 40℃에서 15분간 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구했으며 표준용액은 gallic acid(Sigma Co., USA)와 tannic acid(Sigma Co., USA)를 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중의 ㎎ gallic acid equivalent(GAE, dry basis), ㎎ tannic acid equivalent(TAE, dry basis)로 나타내었고, 그 결과는 3 회 반복 실험 결과의 평균값으로 표시하였으며, 상기 결과는 도 5에 나타내었다.
실험예
7 : 총 플라보노이드 측정
총 플라보노이드 함량의 측정은 디에틸렌 글리콜 비색법을 이용하였다. 1 g 농도의 시료 20 ㎕에 디에틸렌 글리콜(Samchun Co., Korea) 200 ㎕, 1N NaOH 20 ㎕을 첨가한 후, 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하여 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구했으며 표준용액은 루틴 (rutin, Sigma Co., USA)을 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 시료 1 g 중의 ㎎ rutin equivalent(RE, dry basis)로 나타내었으며, 그 결과는 3 회 반복 실험 결과의 평균값으로 표시하였고, 상기 결과는 하기 도 6에 나타내었다.
실험예 8 : 항당뇨 동물실험 결과 - 2형 당뇨 마우스 모델에서의 항당뇨 효능 확인
실험예
8-1: 당뇨 유도 마우스에서의 효능 확인
7주령의 streptozotocin 투여에 의한 당뇨 랫드 모델 수컷 랫드 35마리에 대하여, 구절초 추출물(70℃, 50% 주정 추출물)을 투여하여, 항당뇨 효능을 확인하였다. 비만 유발군은 STZ로 표시하였고, Metformin을 투여한 군은 STZ+Metformin으로 표시하였으며, 구절초 추출물을 투여한 군을 투여된 추출물의 용량별로 STZ+CZE125, STZ+CZE250, STZ+CZE500로 표시하였다. 실험은, 공복혈당, 체중, HbA1c 및 인슐린 농도에 대하여 진행하였고, 실험 방법은 하기 실험예 8-2와 동일하게 진행하였다. 그 결과, 구절초 추출물을 투여한 군은, Metformin을 투여한 군과 동등한 정도의 체중 감소, 인슐린 감소, 혈당감소 효과가 있어, 당뇨 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 7).
실험예 8-2: 당뇨 유도 마우스에서의 효능 확인
8주령의 streptozotocin 투여 및 고지방식이에 의한 2형 당뇨 마우스 모델(Tadenkovic et al.,2016) 수컷 마우스 60마리에 대하여 하기 표 c와 같이 시험군을 나누어 항당뇨 효능을 확인하였다.
<표 c>
시험용 마우스에 대하여, 공복혈당검사, 경구 내당능 검사(oral glucose tolerance test), 인슐린 내성 검사를 실시하였다. 공복 혈당 검사는 시험물질(70℃, 50% 주정 으로 추출한 구절초 추출물) 투여 1주, 3주, 5주차에 혈당측정기(GlucoDrTM, AGM-2200) 이용하여 공복혈당을 측정하였고, 혈당 측정은 동물을 보정시킨 후 23 gauge needle을 사용하여 미정맥을 천자하여 자연스럽게 흘러나오는 전혈을 이용하여 측정하였다. 또한, 경구 내당능 검사는 측정일전 동물을 12시간 절식시킨 후 glucose를 1 g/kg의 용량으로 경구투여하고, Glucose 투여 직전 및 투여 후 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다. 인슐린 내성 검사는 측정일전 동물을 12시간 절식시킨 후 인슐린(1 unit/kg)을 피하주사하고, 인슐린 투여 직전 및 투여 후 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다. 또한, 당화혈색소는 시험물질 투여 후 1, 3 주째 및 부검전 채혈을 실시하여, 혈액생화학분석기를 이용하여, blood urea nitrogen(BUN), creatinine, total cholesterol, low-density lipoproteins(LDL), high-density lipoproteins(HDL), triglycerides (TG), glucose, glycosylated hemoglobin(HbA1c) 함량을 분석하였다.
그 결과, 구절초 추출물을 투여한 군은, Metformin을 투여한 군과 동등한 정도의 체중 감소, 인슐린 분비 촉진, 혈당감소 효과가 있어, 당뇨 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 8).
실험예
9 : 독성 평가 - 유기체 단위에서의 독성 평가(동물실험)
하기 독성평가는 식품의약품안전처 고시 제2014-67호(2014.02.12) '비임상시험관리기준', 식품의약품안전처 고시 제2015-82호(2015.11.11) '의약품 등의 독성 시험기준' 및 OECD Guideline for Testing of Chemicals No.473 'In vitro Mammalian chromosome aberration test'(2014.09.26) 에 의거하여 진행하였다.
7주령의 Sprague-Dawley(SD rat) 계통의 암수 랫드 40마리에 대하여, 저용량군(1,000mg/kg), 중용량군(2,000mg/kg), 고용량군(4,000mg/kg)으로 나누어 구절초추출물(70℃, 50% 주정으로 추출한 구절초 추출물)을 투여하고, 매일 1회 일반증상관찰을 실시하였고, 투여 전 후 및 투여 후 1일, 4일, 7일 및 14일 때 체중 측정을 하였으며, 투여 후 14일 경과후 실험동물들을 부검하였다. 그 결과, 시험기간 동안 사망한 동물이 관찰되지 않았고, 모든 시험동물에서 특이한 일반증상도 관찰되지 않았으며, 통계학적으로 유의한 체중변화도 관찰되지 않았고, 부검시 특이한 육안 소견도 보이지 않아, 구절초 추출물과 리나린이 독성이 없음을 확인할 수 있었다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (10)
- 제2형 당뇨 개선 또는 예방용 식품 조성물로서,
상기 조성물은, 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 구절초 추출물은 50% 에탄올을 이용하여 70℃에서 4시간씩 2회 추출한 것이고,
상기 구절초 추출물은, 리나린을 168.13mg/g으로 함유하며,
상기 구절초 추출물은, 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50 중량%로 포함되고,
상기 조성물은, 알파-글루코시다아제 활성 저해, 인슐린 분비 촉진 및 혈당 감소 효과를 포함하는, 제2형 당뇨 개선 또는 예방용 식품 조성물. - 삭제
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