KR20170134237A - 리나린을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 명세서에는 리나린을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 또는 개선용 조성물 및 항산화용 조성물이 개시된다. 본 발명의 조성물은 인체독성이 없어서 안전하고, 우수한 리파아제 활성 억제능, 알파-글루코시다아제 억제능, 인슐린 감수성 개선 효과가 있어서, 대사성 질환의 개선 또는 예방에 효과적이고, 활성라디칼 제거능이 우수하여 항산화 효과가 우수하다.

Description

리나린을 포함하는 조성물 {COMPOSITION CONTAINING LINARIN}

본 명세서에는 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 개선 또는 예방용 조성물 및 항산화 조성물이 개시된다.

구절초는 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 국화과에 속하는 다년생 쌍떡잎식물로, 구절초는 전국 각처의 산지와 고원지에서 자생하고 중국, 러시아, 몽골, 일본 등지에서 자란다. 구절초는 그 줄기와 잎을 말려 예로부터 월경불순, 자궁냉증, 불임증의 부인병과 위장병 등에 효능을 가지는 생약으로 사용되고 있다.

구절초에는 리나린(linarin), 루테올린(luteolin), 아피게닌(apigenin), 아카세틴(acacetin) 등의 플라보노이드가 함유된 것으로 알려져 있는데, 이 중 리나린은 구절초의 대표적인 성분이다. 리나린은 칼슘의 흡수와 미네랄화를 증가시켜 조골세포의 분화를 유도시키고, α-galactosamine와 lipopolysaccharide로 유도된 급성 간손상을 완화시키는 것으로 보고된 바 있다. 또한, 리나린은 amyloid로 유도된 신경세포사멸을 방지하며, 기억력 감퇴의 원인인 acetylcholinesterase의 활성을 억제하여 알츠하이머병의 치료제로서의 가능성이 보고되어 있다.

한편, 알파-글루코시다아제 (α-glucosidase)는 소장에 존재하는 효소로, 섭취한 탄수화물의 알파-1,4 결합을 분해하여 포도당을 생성하는 소화과정에서 중요한 역할을 한다. 생성된 당은 소장에서 흡수되는데, 알파-글루코시다아제 저해제는 탄수화물의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 상승을 억제하는 역할을 한다. 시판되는 알파-글루코시다아제 저해제로는 miglitol, voglibods 및 acarbose 등이 있으나, 장기적으로 복용할 경우 복부팽만감, 구토, 설사 등의 부작용의 위험이 있으므로 알파-글루코시다아제 저해활성을 가지는 천연 소재 발굴 연구의 필요성이 대두되고 있다.

Archives of pharmacal research : a publication of the Pharmaceutical Society of Korea, v.25 no.2, 2002년, pp.170-177

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 인체 독성이 없는 대사성 질환 개선 및 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은, 리나린을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 조성물은, 리파아제의 활성을 저해하고, 알파-글루코시다아제의 활성을 저해하여, 대사성 질환의 개선 또는 예방 효과가 있고, 라디칼 소거능이 있어, 항산화 효과도 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 알파-글루코시다제 억제 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 리파아제 억제 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 체중 변화(도 7a), hbA1c 변화(도 7b), 인슐린 변화(도 7c), 혈당변화(도 7d)를 보이는 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 투여한 후 혈당 변화(도 8a), 경구 내당능 변화(도 8b), 인슐린 변화(도 8c), hbA1c 변화(도 8d)를 보이는 도이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 조성물이다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은 리나린을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물이다.

상기 조성물은, 리파아제 활성 저해; 알파-글루코시다아제 활성 저해; 인슐린 분비 촉진; 인슐린 감수성 개선; 및 라디컬 소거능으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 상기 대사성 질환은, 당 대사성 질환을 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 대사성 질환은, 당뇨, 고혈압, 비만 및 동맥경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당뇨는, 제2형 당뇨를 포함할 수 있다. 제2형 당뇨는 제1형 당뇨와는 달리 인슐린 저항성에 의한 당뇨를 의미할 수 있다.

상기 리나린은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum)로부터 유래한 것을 포함할 수 있다.

리나린(linarin)은, 플라보노이드의 일종으로서, 화학식 C₂₈H₃₂O₁₄, 분자량이 593g/mol인 물질을 의미한다.

상기 구절초는 구절초 추출물을 포함할 수 있고, 상기 구절초 추출물의 추출용매는, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

구절초 추출물은 구절초의 줄기, 꽃, 뿌리, 잎, 또는 열매에 다양한 용매를 처리하여 얻어질 수 있다. 상기 구절초 추출에 적용될 수 있는 용매로서, 예를 들어, 물, 알코올, 아세트산, DMSO(dimethy sulfoxide), 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 펜탄, 헥산, 클로로포름, 디에틸 에테르, 사염화탄소 등이 있다. 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올 등과 같이 C_1-4의 알코올을 적용할 수 있다. 이들이 혼합된 혼합용매를 사용할 수도 있음은 물론이다.

본 명세서 전체에 있어서, "추출물"이란 용어는 상술한 바와 같이 당업계에서 일반적으로 통용되고 있는 조추출물(crude extract)뿐만 아니라, 상기 조추출물을 분획(fraction)한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 구절초 추출물은 기술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 다양한 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다.

본 발명에서 구절초를 언급하면서 사용되는 용어 "추출물"은 구절초에 추출용매를 처리하여 얻은 용매를 포함하는 액상의 추출 결과물, 상기 추출 결과물을 정제한 정제물, 상기 액상의 추출 결과물을 건조시킨 건조물, 및 상기 구절초 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 분말, 과립, 타정 등으로 제형화한 구절초 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

상기 유기용매는 알코올을 포함할 수 있으며, C₂~C₆의 저급 알코올을 포함할 수 있다.

상기 알코올은 알코올 수용액을 포함할 수 있고, 농도는 10~99%일 수 있다,

상기 추출용매의 온도는 20~100℃일 수 있고, 용매가 물일 경우에는 95℃가 바람직할 수 있고, 용매가 알코올일 경우에는 40~80℃가 바람직할 수 있다.

일 측면에서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

식품 조성물은 식품, 음료 등의 건강보조 또는 건강기능성 식품을 포함할 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있고, 상기 식품은 유효성분인 본 발명에 따른 리나린 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 건강유지 또는 예방적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품에 함유된 리나린의 유효용량은 후술하는 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 리나린 또는 구절초 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초컬릿, 캔디류, 스넥류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 혼합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 보존 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카리이드 및 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에르트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 일반적으로 약 0.01~0.04 중량부, 바람직하게는 0.02~0.03 중량부이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캡슐제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1 종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘, 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 리나린 을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 리나린을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화 할 수 있다.

본 발명의 리나린을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 리나린 또는 구절초 추출물을 약 0.1~1500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 경구 또는 비경구 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 0.1~1000 ㎎/g/day 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 0.1~300 ㎎/g/day 의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명에 따른 조성물 100 중량부당 약 0.001~1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

한편, 리나린의 함량은 구절초 추출물의 생리활성과 관계가 깊으며(구절초의 추출조건에 따른 Linarin 함량과 In Vitro 생리활성 변화, 김양지 등, 한국식품영양과학학회지 45(10), 1414~1421, 2016.8.4.) 구절초 추출물은 리나린의 수율을 높이기 위하여 상기와 같은 방법에 의하여 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물이 식품 조성물일 때, 상기 리나린은, 조성물 총 중량을 기준으로 83%이하로 포함될 수 있으며, 리나린이 구절초 추출물의 형태로 포함될 경우에는, 70℃의 50% 주정으로 추출된 구절초 추출물이 0.000001~50 중량%, 바람직하게 0.0001% ~ 50%, 좀 더 바람직하게 0.001% ~ 50%로 포함될 수 있다.

구절초 추출물은 구절초의 줄기, 꽃, 뿌리, 잎, 또는 열매를 열수, 에탄올, 헥산, 이소프로필알콜, 초산에틸, 아세톤 또는 메틸알콜 등으로 추출하여 얻은 것으로, 2~20배의 추출 용매를 가한 후 추출기에서 2~8 시간씩 1~3 회 추출한 추출물일 수 있다.

상기 추출하는 단계는 3 회 이상 반복될 수 있다.

상기 제조방법은 농축 공정을 추가로 포함할 수 있다.

상기 제조방법은 건조 공정을 추가로 포함할 수 있으며, 분말화를 위해서 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 구절초 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 및 비교예의 제조 >

실시예 : 구절초 추출물 제조

구절초를 수확 후 건조하고 세절하여 총 무게의 20 배의 증류수 또는 농도별 에탄올 (30% 주정, 50% 주정, 70% 주정)을 가하여 50℃ 또는 70℃에서 4 시간씩 2 회 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 감압 농축기로 농축한 다음, 동결건조하여 본 발명의 생약추출물을 제조하였다.

실험에 사용하기 위하여 증류수에 10~100 mg/ml의 농도로 녹이고 무균 여과지(Millipore membrane, 0.45 ㎛)로 여과하여 무균 상태를 유지하였다.

실시예의 조건을 하기 표 1에 나타내었다.

샘플	추출용매	추출온도(℃)
실시예 1	열수 (증류수)	95
실시예 2	30% 주정	50
실시예 3	30% 주정	70
실시예 4	50% 주정	50
실시예 5	50% 주정	70
실시예 6	70% 주정	50
실시예 7	70% 주정	70
실시예 8	95% 주정	50
실시예 9	95% 주정	70

실험예 1: 추출수율 측정

구절초 추출물에 대해 고형분의 무게를 수분측정기(MA50C, Satorius Co., Germany)로 측정 후 계산하여, 각 추출물에 대한 추출수율을 하기 표 2에 나타내었다.

샘플	추출수율(%)
실시예 1	11.26
실시예 2	9.46
실시예 3	7.61
실시예 4	6.36
실시예 5	11.60
실시예 6	6.93
실시예 7	7.34
실시예 8	4.30
실시예 9	4.91

추출용매를 95℃ 열수 추출과 에탄올 농도가 50%인 용매를 사용하여 70℃에서 추출했을 때 가장 높은 수율을 보였으며, 95% 에탄올을 사용하여 추출한 추출물은 수율이 가장 낮았다. 상기 결과에서 구절초 추출 시 추출용매는 열수 또는 50% 주정을 70℃로 하여 추출하는 것이 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.

실험예 2 : 구절초 추출물의 리나린 함량 HPLC 분석

본 실험예에서는 상기 실시예의 구절초 추출물을 고성능 액체크로마토그라피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석을 실시하였다.

구절초 추출물의 분석을 위하여 HPLC(LC-20AD, Shimadzu Corp., Japan)를 이용하였으며, 상기 실시예 1의 구절초 추출물을 1~10 mg/mL의 농도로 희석한 뒤 0.45 μm syringe filter(Advantec, Japan)로 여과하여 HPLC에 주입하여 분석하였다. 분석용 컬럼은 COSMOSIL C18 (Cosmosil, Germany)을 사용하였다. 분석에 이용한 이동상 A는 0.1% 포름산 수용액을 이동상 B는 0.1% 포름산 아세토니트릴용액을 사용하였다. 각 시료 분석을 위한 이동용매의 조건은 하기 표 3에 나타내었으며 이동상 유속은 1.0 mL/min 샘플 투입량은 10 μL로 80 분간 컬럼을 통해 나오는 화합물을 331 nm UV 파장에서 분석하였다. 구절초 추출물의 리나린 함량 분석결과는 표 4에 나타내었다.

시간(분)	이동상 조성비율(%)
	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
3	85	15
15	77	23
50	77	23
52	70	30
62	70	30
64	0	100
70	0	100
72	85	15
80	85	15

샘플	리나린 함량 (mg/g extract)
실시예 1	29.09
실시예 2	-
실시예 3	67.46
실시예 4	39.36
실시예 5	168.13
실시예 6	89.66
실시예 7	133.68
실시예 8	54.3
실시예 9	11.46

구절초 추출물의 리나린 함량은 에탄올의 농도가 50% 또는 70%로 하여 70℃에서 추출한 실시예에서 높았으며, 열수로 추출한 실시예의 경우 리나의 함량이 가장 낮았다.

실험예 3 : 알파- 글루코시다제 억제 활성 측정

알파-글루코시다제 억제 활성은 알파-글루코시다제에 의한 pNPG(pnitrophenyl-α-D-glucoside)의 유리(cleavage)를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하는 방법을 이용하였다.

완충액(0.1M phophate buffer, pH 6.9) 50 ㎕에, 1U/㎖의 α-glucosidase(Sigma-Aldrich corp., USA) 10 ㎕와 1,000 ㎍/㎖ 농도의 상기 실시예를 각각 20 ㎕ 만큼 첨가한 뒤, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 1 mM 농도의 pNPG 20 ㎕를 넣고 37℃에서 15 분간 다시 반응시켰다. 상기 반응을 정지시키기 위해 정지액(0.1M sodium carbonate, Na₂CO₃)을 50 ㎕ 첨가하였고, 알파-글루코시다제 억제 활성은, 3 회 반복 수행하여 계산하였으며, 상기 결과는 도 1에 나타내었다.

양성 대조군은 당뇨 치료제인 아카보스(acarbose, Sigma Co., USA)를 사용했다.

도 1에서 대체적으로 추출용매로 물을 사용한 실시예보다 에탄올을 사용한 실시예와 50℃ 보다 70℃에서 추출한 실시예에서 알파-글루코시다제 억제 활성이 높았다. 그 중 추출용매로 50% 에탄올 및 70% 에탄올 또는 95% 에탄올을 사용하여 추출한 실시예의 알파-글루코시다제 억제 활성이 다른 실시예보다 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

실험예 4 : Lipase 억제 활성

지방 흡수 억제 활성 실험은 항비만 소재 스크리닝에 많이 사용되는 pancreatic lipase로 수행하였다. Enzyme buffer(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.8)에 porcine pancreatic lipase(Sigma Co., USA)를 0.5 g/200 ㎖의 농도로 4℃에서 용해하여 4,000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 169 ㎕ Tris buffer(100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.0)와 6 ㎕ enzyme buffer를 혼합하였다. 시료는 1.0 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 사용하였다. 기질로써 p-니트로페닐 부티레이트(p-NPB, Sigma Co., USA)를 10 mM이 되도록 디메틸포름아마이드에 용해한 후, pancreatic lipase와 시료를 먼저 37℃에서 15 분 동안 반응시킨 다음, 기질을 첨가하여 37℃에서 30 분 동안 반응시켰다. ELISA reader(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 pancreatic lipase 저해활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었고, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 양성대조군은 위와 췌장의 지방분해효소 억제제로 사용되는 약물인 오리스타트 (orlistat, Sigma Co., USA)를 100 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.

도 2에서 50℃ 보다 70℃에서 추출한 실시예에서 리파아제 저해활성이 높았다. 그 중 추출용매로 50% 에탄올을 사용하여 추출한 실시예의 리파아제 저해활성이 다른 실시예보다 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: ABTS 라디칼 및 DPPH 라디칼 소거활성 확인

실시예의 항산화 활성을 측정하기 위하여 ABTS 라디칼 소거활성 및 DPPH 라디칼 소거활성 평가를 수행하였다.

ABTS 라디칼 소거활성 시험법은 시료에 의해 ABTS 라디칼이 소거되어 시약의 색이 옅어지는 정도를 측정하는 방법이다. 0.1 mg/㎖, 0.25 mg/㎖, 0.5 mg/㎖ 농도의 시료 20 ㎕에 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS, Sigma Co., USA) 시약 180 ㎕을 혼합한 후, 실온에서 7분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3 회 반복 수행하여 도출된 값으로 라디칼 소거능을 계산하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서, 추출용매가 열수인 실시예와 50% 에탄올인 실시예에서 가장 높은 소거활성을 보였다. 또한, 추출온도가 50℃ 보다 70℃인 실시예에서 더 높은 활성을 보였다.

DPPH 라디칼 소거활성를 측정하기 위해 시료 10 μL에 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 시약 90 μL를 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 아스코르브산 (ascorbic acid, Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다. 3 회 반복 수행하여 도출된 값으로 라디칼 소거능을 계산하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서, 추출온도가 50℃ 보다 70℃인 실시예에서 더 높은 활성을 보였고, 50% 에탄올을 사용하여 50℃에서 추출한 실시예가 가장 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보였다.

실험예 6 : 총 폴리페놀 측정

총 폴리페놀 함량 측정을 위해 folin-denis'reagent를 사용하였다. 1 g 농도의 시료 20 ㎕에 folin-denis'reagent(Sigma Co., USA) 100 ㎕를 첨가한 후 40℃에서 1분간 반응시켰다. 반응 후, 7.5% Na₂CO₃ 용액 80 ㎕를 첨가하여 40℃에서 15분간 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구했으며 표준용액은 gallic acid(Sigma Co., USA)와 tannic acid(Sigma Co., USA)를 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중의 ㎎ gallic acid equivalent(GAE, dry basis), ㎎ tannic acid equivalent(TAE, dry basis)로 나타내었고, 그 결과는 3 회 반복 실험 결과의 평균값으로 표시하였으며, 상기 결과는 도 5에 나타내었다.

실험예 7 : 총 플라보노이드 측정

총 플라보노이드 함량의 측정은 디에틸렌 글리콜 비색법을 이용하였다. 1 g 농도의 시료 20 ㎕에 디에틸렌 글리콜(Samchun Co., Korea) 200 ㎕, 1N NaOH 20 ㎕을 첨가한 후, 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하여 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 그 함량을 구했으며 표준용액은 루틴 (rutin, Sigma Co., USA)을 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 시료 1 g 중의 ㎎ rutin equivalent(RE, dry basis)로 나타내었으며, 그 결과는 3 회 반복 실험 결과의 평균값으로 표시하였고, 상기 결과는 하기 도 6에 나타내었다.

실험예 8 : 항당뇨 동물실험 결과 - 2형 당뇨 마우스 모델에서의 항당뇨 및 항비만 효능 확인

실험예 8-1: 당뇨 유도 마우스에서의 효능 확인

7주령의 streptozotocin 투여에 의한 당뇨 랫드 모델 수컷 랫드 35마리에 대하여, 구절초 추출물(70℃, 50% 주정 추출물)을 투여하여, 항당뇨 및 비만 억제 효능을 확인하였다. 비만 유발군은 STZ로 표시하였고, Metformin을 투여한 군은 STZ+Metformin으로 표시하였으며, 구절초 추출물을 투여한 군을 투여된 추출물의 용량별로 STZ+CZE125, STZ+CZE250, STZ+CZE500로 표시하였다. 실험은, 공복혈당, 체중, HbA1c 및 인슐린 농도에 대하여 진행하였고, 실험 방법은 하기 실험예 8-2와 동일하게 진행하였다. 그 결과, 구절초 추출물을 투여한 군은, Metformin을 투여한 군과 동등한 정도의 체중 감소, HbA1c 정상화, 인슐린 감소, 혈당감소 효과가 있어, 당뇨 및 비만 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 7).

실험예 8-2: 당뇨 및 비만 유도 마우스에서의 효능 확인

8주령의 streptozotocin 투여 및 고지방식이에 의한 2형 당뇨 마우스 모델(Tadenkovic et al.,2016) 수컷 마우스 60마리에 대하여 하기 표 c와 같이 시험군을 나누어 항당뇨 효능을 확인하였다.

<표 c>

시험용 마우스에 대하여, 공복혈당검사, 경구 내당능 검사(oral glucose tolerance test), 인슐린 내성 검사를 실시하였다. 공복 혈당 검사는 시험물질(70℃, 50% 주정 으로 추출한 구절초 추출물) 투여 1주, 3주, 5주차에 혈당측정기(GlucoDrTM, AGM-2200) 이용하여 공복혈당을 측정하였고, 혈당 측정은 동물을 보정시킨 후 23 gauge needle을 사용하여 미정맥을 천자하여 자연스럽게 흘러나오는 전혈을 이용하여 측정하였다. 또한, 경구 내당능 검사는 측정일전 동물을 12시간 절식시킨 후 glucose를 1 g/kg의 용량으로 경구투여하고, Glucose 투여 직전 및 투여 후 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다. 인슐린 내성 검사는 측정일전 동물을 12시간 절식시킨 후 인슐린(1 unit/kg)을 피하주사하고, 인슐린 투여 직전 및 투여 후 15, 30, 45, 60, 90, 120분에 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다. 또한, 당화혈색소는 시험물질 투여 후 1, 3 주째 및 부검전 채혈을 실시하여, 혈액생화학분석기를 이용하여, blood urea nitrogen(BUN), creatinine, total cholesterol, low-density lipoproteins(LDL), high-density lipoproteins(HDL), triglycerides (TG), glucose, glycosylated hemoglobin(HbA1c) 함량을 분석하였다.

그 결과, 구절초 추출물을 투여한 군은, Metformin을 투여한 군과 동등한 정도의 체중 감소, 인슐린 감소, 혈당감소 효과가 있어, 당뇨 및 비만 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 8).

실험예 9 : 독성 평가 - 유기체 단위에서의 독성 평가(동물실험)

하기 독성평가는 식품의약품안전처 고시 제2014-67호(2014.02.12) '비임상시험관리기준', 식품의약품안전처 고시 제2015-82호(2015.11.11) '의약품 등의 독성 시험기준' 및 OECD Guideline for Testing of Chemicals No.473 'In vitro Mammalian chromosome aberration test'(2014.09.26) 에 의거하여 진행하였다.

7주령의 Sprague-Dawley(SD rat) 계통의 암수 랫드 40마리에 대하여, 저용량군(1,000mg/kg), 중용량군(2,000mg/kg), 고용량군(4,000mg/kg)으로 나누어 구절초추출물(70℃, 50% 주정으로 추출한 구절초 추출물)을 투여하고, 매일 1회 일반증상관찰을 실시하였고, 투여 전 후 및 투여 후 1일, 4일, 7일 및 14일 때 체중 측정을 하였으며, 투여 후 14일 경과후 실험동물들을 부검하였다. 그 결과, 시험기간 동안 사망한 동물이 관찰되지 않았고, 모든 시험동물에서 특이한 일반증상도 관찰되지 않았으며, 통계학적으로 유의한 체중변화도 관찰되지 않았고, 부검시 특이한 육안 소견도 보이지 않아, 구절초 추출물과 리나린이 독성이 없음을 확인할 수 있었다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 리나린을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 개선 또는 예방용 조성물.
2. 리나린을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 리파아제 활성 저해;
   알파-글루코시다아제 활성 저해;
   인슐린 분비 촉진;
   인슐린 감수성 개선; 및
   라디컬 소거능으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 포함하는, 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 대사성 질환은, 당뇨, 고혈압, 비만 및 동맥경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 당뇨는 제2형 당뇨를 포함하는, 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 리나린은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum)로부터 유래한 것을 포함하는, 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 구절초는 구절초 추출물을 포함하며,
   상기 구절초 추출물의 추출용매는, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 유기용매는, 알코올을 포함하는, 조성물.
9. 제7항에 있어서,
   상기 추출용매의 온도는 20~100℃인, 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은, 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함하는, 조성물.

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