KR20150012926A - 구절초 추출물을 포함하는 항비만 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구절초 추출물을 포함하는 항비만 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 구절초 추출물을 포함하는 조성물은 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고 췌장 리파아제 효소 활성을 억제시키는 능력을 가지므로 항비만 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 구체적으로 지방세포 생성을 억제하므로 지방간, 또는 지질관련 심혈관 질환과 같은 불필요한 지방의 축적으로 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Description

구절초 추출물을 포함하는 항비만 조성물{A composition comprising Chrysanthemum zawadskii extracts having anti-obesity activity}
본 발명은 구절초 추출물을 포함하는 항비만 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
비만 (obesity) 또는 비만증은 사람의 몸무게가 지나치게 많이 나가는 것을 통틀어 부르는 말로서 병리학적으로는 세계보건기구 (WHO)에서 정한 이른바 표준 몸무게 기준치 (body mass index; BMI)가 30 이상인 경우를 일컫지만 한국에서는 25 이상이면 비만으로 진단한다. 대부분의 경우 체중이 정상치보다 많이 나가는 것을 뜻하지만 체중이 그다지 많이 나가지 않더라도 몸의 구성성분 중 지방의 비율이 높은 경우 비만이라고 한다. 비만은 그 자체로서는 문제가 되지 않을 수도 있으나, 이로 인해 야기되는 사회적 장애 및 과다한 지방으로 유발되는 2차 합병증이 심각하다. 예를 들어 비만은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병, 지방간, 관절이상 등의 발생비율을 현저하게 증가시킬 수 있다.
이와 같이 비만은 각종 성인병의 원인이 된다. 체중이 늘면 혈당처리 능력이 떨어져 당뇨병을 일으키기 쉬우며 고혈압도 발생할 수 있다. 체중이 정상체중보다 20% 증가되면 당뇨병 발병 가능성은 정상인의 10배로 증가한다. 또한 심장 및 폐기능이 약해져서 수명이 단축될 수도 있다. 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증 등의 복합적인 요인들이 심장기능에 압박을 주어 심부전증에 빠지고 돌발사를 유발하기도 한다. 여성의 경우는 여기에 더해 자궁내막암의 발병률이 높아지며 담석증이 생길 가능성도 높아진다. 남성에게는 대장암과 전립선암의 발병확률이 높아진다. 뿐만 아니라, 체중이 증가하면 남들이 자신을 바라보는 시선을 의식하지 않을 수 없고 이에 대한 강박관념이 심해지면 사람들을 기피하고 혼자만 지내려는 증상이 생긴다. 또 신체에서 오는 열등감이 자신의 삶에 대한 자신감을 잃게 하여 자아에까지 영향을 미친다.
이러한 비만을 예방하고 건강 체중을 유지하기 위해서는 균형 잡힌 식사와 규칙적인 운동으로 평생 동안 꾸준히 관리해야 한다. 특히 지방세포는 한번 만들어지면 크기는 줄일 수 있지만 자연적으로 제거하는 것은 불가능하여 영구적으로 인체에 남아있게 되므로 처음부터 비만이 되지 않도록 예방하는 것이 중요하다. 따라서 일차적으로는 섭취하는 칼로리의 양을 줄이고 활동 및 운동량을 증가시키는 방법으로 체중을 줄일 수 있다.
그러나 상기한 바와 같이 일단 형성된 지방세포는 제거가 불가능하므로, 다이어트식이 섭취와 더불어 지방흡수를 감소시키는 등의 약물을 복용하는 경우가 있다. 그러나 이러한 다이어트 약은 고혈압 등의 심혈관계질환 및 뇌졸중과 같은 부작용을 유발할 수 있으며, 복용을 중단할 경우 다시 체중이 증가하는 경우가 빈번하다. 중증 비만의 경우 수술요법을 시행할 수 있으며, 이러한 수술요법으로는 지방을 제거하는 수술이나 몸이 소화할 수 있는 음식량을 제한하기 위한 위성형술 또는 위밴드삽입술 등이 시행되고 있다.
이에 본 발명자들은 항비만 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 예의 연구 노력한 결과, 한약재 구절초 추출물이 지방세포로의 분화를 억제하여 중성지방 생성율을 감소시킬 뿐만 아니라, 췌장 리파아제 효소 활성을 억제시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "비만 (obesity)"은 체지방이 과도한 상태를 말하는 것으로, 임상적으로 체질량지수가 한국의 경우 25, 세계보건기구 (WHO)에 의하면 30 이상인 경우를 의미한다. 이때 체질량지수 (body mass index; BMI)는 신장의 제곱에 대한 체중 (㎏/m2)으로 계산된다. 일반적으로 체중이 정상치보다 높은 경우를 의미하지만 체중이 많이 나가지 않더라도 몸의 구성성분 중 체지방의 비율이 높은 경우 비만이라고 진단하며, 성인과 어린이 모두에서 발병하는 질환이다. 비만은 생명을 단축시키며, 고혈압, 당뇨, 심장질환 및 일부 암과 같은 질환에 걸릴 위험에 처하게 할 수 있다. 비만인 경우 건강에 문제가 생길 확률이 높으며 비만의 정도가 증가할수록 위험성 또한 높아진다. 비만이 생기는 이유는 매우 다양하며 여러 가지 원인이 복합적으로 작용하는 경우가 많다. 이 중 가장 빈번한 원인은 유전적 영향, 생리적 영향, 음식섭취 및 섭식장애, 생활방식, 체중력, 임신 또는 약물 등이다. 비만의 첫 번째 징후는 평균을 웃도는 체중 이상이며 증상은 하기와 같다: 수면문제, 수면무호흡, 호흡 짧아짐, 정맥류, 피부문제, 담석 또는 체중부하로 인한 골관절염 등. 비만은 또한 고혈압을 비롯한 고혈당 (당뇨), 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 등의 질환과 관련이 있다. 한번 과체중이 되면 그 상태를 벗어나기가 쉽지 않으므로 비만은 대부분 평생 겪게 된다. 하지만 비만에 의해 생긴 질병이나 문제는 체중이 감소되면 호전될 수 있다.
이하 본 발명에서는 "항비만 (anti-obesity)" 이라는 용어를 비만 예방, 치료 또는 개선을 모두 포함하는 의미로 사용한다. 이에 따라, 본 발명에서 사용되는 "항비만 조성물"이라는 용어는 상기 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비만의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 비만의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 "구절초 (Chrysanthemum zawadskii)"는 국화과에 속하는 다년생 초본식물이며, 구절초 (Chrysanthemum zawadskii var . latilobum), 바위구절초 (Chrysanthemum zawadskii var . alipinum), 가는구절초 (Chrysanthemum zawadskii Herbich subsp . acutilobum), 한라구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp . coreanum), 포천구절초 (Chrysanthemum zawadskii var . tenuisectum), 낙동구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp . Naktongense)의 지상부이다. 구일초, 선모초, 고뽕이라고도 하며, 본 발명에서 사용하는 생약인 구절초는 한국의 전 지역, 중국 북부, 몽고, 시베리아, 일본 규슈에 분포하는 야생식물로 산기슭 풀밭에서 자란다. 키는 50-100 ㎝이고 뿌리를 옆으로 길게 뻗으며 번식하고 뿌리에서 나온 잎은 달걀형이며 밑이 수평이거나 심장형이고 가장자리는 얕게 갈라지고 끝이 둔하며 줄기에 달린 잎은 아주 작고 약간 깊게 갈라지고 꽃은 흰색 또는 분홍빛이 도는 흰색으로 8-10월에 핀다. 흔히 말하는 생약 구절초는 줄기와 잎을 말린 것으로 한방과 민간에서는 꽃이 달린 풀 전체를 치풍, 부인병, 위장병에 처방한 기록이 있다. 한방 부인과에서 자궁이 허약하고 차서 발병한 생리불순, 생리통, 불임증에 쓴다. 민간에서는 전초와 꽃을 환약 또는 엿을 고아서 장기간 복용하면 생리가 정상으로 유지되고 임신하게 된다고 하여 널리 활용되며, 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 방광질환, 냉증, 위장병, 및 고혈압 등에 사용되며, 대한미국 식품공전에 식품의 원료로 등재된 인체에 안전한 식물로 알려져 있다. 그러나 아직까지 상기 구절초의 항비만 활성에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명의 용어 “구절초 추출물”은 구절초의 다양한 부분, 즉 구절초의 잎, 줄기 및 꽃 중 적어도 한 부분으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 구절초 추출물로서, 구절초의 전초로부터 얻은 추출물을 사용하였다.
본 발명의 용어 "추출물 (extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 구절초 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 구절초 추출물은 일정 중량의 구절초를 분말로 파쇄하고 5 내지 10배의 용매를 가하여 추출하였다. 용매로는 유기용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 또한 상기 추출은 바람직하게 65 내지 85℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게 75℃에서 수행될 수 있다. 상기 추출은 수회 반복하여 수행되었으며, 추출한 시료는 여과 후 감압농축기로 농축하고 동결 건조하였다.
본 발명에서 상기 비만 예방 또는 치료는 지방전구세포의 지방세포로의 분화억제에 의해 달성되는 것일 수 있다. 본 발명의 구절초 추출물은 지방형성에 관여하는 핵심인자인 C/EBPα, C/EBPβ 및 PPARγ의 발현을 감소시킴으로써 지방세포 생성을 억제하는 활성을 나타낸다.
본 발명에서 용어 "C/EBP (CCAAT enhancer binding protein)"란, 염기성-루신 지퍼 모티프 (basic-leucine zipper motif)를 가진 전사인자 가운데 하나로, 이들은 지방세포에 한정되어 발현되지는 않으며, 과립구 (granulocyte)나 간세포에서도 발현하여 상기 세포들의 최종분화에 중요한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한, "PPAR-γ (peroxisome proliferator activated receptor-γ)"란, PPARs (peroxisome proliferator activated receptors)인 핵수용체 (nuclear hormone receptor) 수퍼패밀리 (superfamily)에 속하는 것으로, PPARα, PPARγ 및 PPARδ 등이 상기 수퍼패밀리에 포함되며 지방세포 분화 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 전사인자들은 지방전구세포 (preadipocyte)가 증식 및 분화되는 과정을 거쳐 성숙한 지방세포 (adipocyte)로 되는 과정인 지방세포형성 (adipogenesis)에 관여하는 일련의 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는데, 특히, PPARγ와 C/EBP 패밀리는 호르몬에 의해 지방세포분화가 유도되는 과정에서 중요하게 작용하는 전사인자로, 지방세포분화를 총괄적으로 조절하는 역할을 하며, 지방세포로 분화된 상태를 유지하는데 필수적인 인자이다. 또한, C/EBPβ는 PPARγ발현을 촉진시켜 지방전구세포의 초기 분화과정에서 중요한 역할을 하는 한편, PPARγ와의 강한 상승작용을 통해 지방전구세포의 말기 분화과정을 촉진하는 역할을 한다.
본 발명의 항비만 조성물은 체중감소, 체지방감소, 혈중 중성지방 함량 감소 및 혈중 콜레스테롤 함량 감소의 효과를 가진다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손 및 인슐린을 포함하는 지방세포 분화배지를 이용하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도한 경우, 상기 본 발명의 구절초 추출물을 첨가하여 지방세포 생성을 억제함으로써 추출물의 농도에 따라 중성지방 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
또한, 본 발명의 항비만 조성물은 체내 지방 흡수율을 저하시켜 비만의 예방, 개선 또는 치료 효과를 달성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 지방 소화효소인 췌장 리파아제의 활성 저해능 분석 실험으로 체내 지방 흡수율을 저하시켜 비만에 효과적이라는 것을 확인하였다 (도 2). 구체적으로 구절초 추출물의 농도별 처리를 통하여, 본 발명의 구절초 추출물이 리파아제의 활성을 농도 의존적으로 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
추가적으로 상기 본 발명의 항비만 조성물은 지방생성을 억제함으로써, 비만뿐만 아니라 비만과 직간접적으로 관련된 지방간 또는 지질관련 심혈관 질환에 대한 예방 또는 치료의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "지방간"은 지방질, 그 중에서도 특히 중성지방 (triglyceride)이 간세포에 축적되어 간 무게의 5% 이상을 차지하고 있는 질병이다. 음식물 등을 통하여 섭취한 지방질을 원활하게 처리하지 못하는 경우 발생하기도 하지만, 지방간을 일으키는 대표적인 원인은 술이다. 술은 간의 여러 가지 대사기능, 특히 지방산 산화 분해력을 감소시켜 간에 지방을 축적시킨다. 비만한 사람에게도 자주 지방간이 발생하며, 그 외, 당뇨병, 갑상선 기능 항진증 등의 내분비 질환, 스테로이드 호르몬의 과다 사용이나 심한 영양부족에 의해서도 발생할 수 있다. 특별한 증상이 없으므로 증상만으로 진단할 수 없으며, 간 질환의 일반적인 증상인 피로감, 식욕부진, 무기력 등이 나타날 수 있고, 오른쪽 갈비뼈 아래쪽에 불쾌감이나 둔통을 느끼기도 한다.
본 발명의 용어 "지질관련 심혈관 질환"은 지방산이나 콜레스테롤 등이 과도한 섭취나 대사 장애로 인해 축적되어 발생하는 질병이다. 특히 혈액 중의 중성지방의 농도가 비정상적으로 높아지는 고중성지방혈증은 미국 심장협회에 의해 심혈관질환의 위험인자로 규정되어 있다. 혈장중성지방은 식후 급격히 증가하여 약 8시간 후에는 식전수준으로 돌아온다. 중성지방은 당뇨병, 비만, 음주자에서 증가하며 당분을 많이 섭취하는 사람에서도 증가한다. 그 외 갑상선 기능저하, 신증후군, 신부전증, 피임약 및 대량의 이뇨제와 베타차단제도 중성지방을 증가시킬 수 있다. 혈중중성지방이 증가할수록 LDL (low density lipoprotein)-콜레스테롤이 증가하며, 상기 LDL은 죽상경화를 촉진시킨다. 상기 지질관련 심혈관 질환으로는 고지혈증, 심장병, 고혈압, 동맥경화증 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 구절초 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 구절초 추출물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 100 ㎎/체중 kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/체중 ㎏으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
따라서 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만의 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "개체"란 상기한 바와 같이 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 비만을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 비만 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 구절초 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 구절초 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 구절초 추출물은 천연 한약재를 원료로 하므로 약학적 조성물 또는 식품 첨가물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 구절초 추출물을 포함하는 조성물은 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고 췌장 리파아제 효소 활성을 억제시키는 능력을 가지므로 항비만 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 구체적으로 지방세포생성을 억제하므로 지방간, 또는 지질관련 심혈관 질환과 같은 불필요한 지방의 축적으로 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 구절초 추출물 (a) 및 양성 대조군인 아스코르브산 (b)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 구절초 추출물의 췌장 리파아제 (pancreatic lipase) 효소 활성 저해능을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 구절초 추출물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 구절초 추출물의 농도 의존적 지방생성 억제를 나타낸 도이다. 구절초 추출물을 각각 표기한 농도로 첨가하여 분화시킨 세포를 오일 레드 오 염색 (Oil red O staining)하여 현미경으로 관찰한 결과 (a) 상기 염색된 오일 레드 오를 탈색하여 정량함으로써 계산된 중성지방 함량 (b)을 도시하였다.
도 5는 본 발명의 구절초 추출물의 지방형성 유전자 및 단백질 발현에 대한 효과를 나타낸 도이다. 구절초 추출물 농도에 따른 지방형성 관련 유전자 및 단백질의 발현 정도를 RT-PCR (a) 및 웨스턴 블럿 혼성화 (b) 를 이용하여 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 구절초 추출물의 제조 및 수율
구절초 추출물을 제조하기 위하여 다음과 같은 방법으로 제조하였고, 수율을 계산하였다. 구절초 10 g을 측량하여 분말로 파쇄한 후 메탄올을 이용하여 추출하였다. 시료의 5 내지 10배의 메탄올 용매를 가한 후 75℃에서 추출하였으며, 상기 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 추출한 시료는 여과한 후 감압농축기 (N-1000S-W, EYELA, Japan)로 농축하고 동결건조 (FDU2100, EYELA, Japan)한 후 중량법으로 수율을 계산하였다. 상기 계산된 구절초 메탄올 추출물의 수율은 11.2%이며 이를 하기 표 1에 나타냈다.
수율 (%) DPPH (IC50, ㎍/㎖)
구절초 (Chrysanthemum zawadskii) 11.2 109.92
아스코르브산 ( = 비타민 C, 양성 대조군) 해당사항 없음 1.98
실시예 2: 구절초 추출물의 항산화능 분석 ( DPPH radical scavenging activity )
자유 라디칼 소거 활성을 통하여 구절초 추출물의 항산화능을 알아보기 위하여, DPPH 라디칼 (radical) 소거법을 이용하여 분석하였다. 전자공여능은 항산화 작용의 지표로 사용되고 있으며, 식물 추출물의 항산화능 측정에 널리 사용되고 있다. 전자공여 작용은 인체 내에서 생성되는 자유 라디칼의 전자를 공여하여 상기 자유 라디칼에 의한 노화 및 질병을 억제하는 작용을 한다. 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 구절초 추출물의 전자공여능을 측정하기 위하여 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성 (DPPH radical scavenging activity) 측정을 수행하였다. DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로써, 아스코르브산 (ascorbic acid), 토코페롤 (tocopherol), 폴리히드록시 방향족 화합물 (polyhydroxy aromatic compound) 또는 방향족 아민류 (aromatic amines)에 의해 환원되어 짙은 자주색이 탈색되는 원리를 이용하여 흡광도 측정에 의해 간편하게 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법이다.
구체적으로, 구절초 추출물을 농도별 (1.25 내지 320 ㎍/㎖)로 메탄올에 녹여 준비한 후, 96 웰 플레이트에 메탄올에 용해된 1.5×10-4 M 농도의 DPPH 40 ㎕와 다양한 농도별로 준비한 구절초 추출물 용액 160 ㎕를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성을 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군에 대한 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도 (IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 아스코르브산 (ascorbic acid, 비타민 C)을 사용하였으며, 측정값은 3회 반복 실험하여 평균값으로 나타내었다. 상기 자유 라디칼 소거능의 백분율을 계산하는 공식은 다음과 같다.
DPPH 라디칼 소거 활성 (%) = {1-(A-B)/C}×100
상기 A는 520 ㎚에서 시료의 흡광도, B는 520 ㎚에서 색 대조군 흡광도, C는 520 ㎚에서 대조군 흡광도이다.
본 발명의 구절초 메탄올 추출물의 라디칼 소거 활성 분석 결과는 도 1의 (a)에 나타내었다. 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이 구절초 추출물은 농도 의존적인 라디칼 소거능을 보였다. 한편, 대조군으로서 아스코르브산의 라디칼 소거 활성을 도 1의 (b)에 나타내었으며, 이들 각각에 대해 계산된 IC50 값을 상기 표 1에 수율과 함께 나타냈다. 구절초 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성에 대해 계산된 IC50 값은 109.92 ㎍/㎖로 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산 (1.98 ㎍/㎖)에 비해서는 활성이 낮았으나, 단일물이 아닌 추출물임을 감안하면 비교적 높은 항산화능을 보유한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 구절초 추출물의 췌장 리파아제 ( pancreatic lipase ) 효소 활성 억제능 분석
구절초 추출물의 리파아제 활성 억제능 보유 유무를 알아보기 위해 각 추출물의 농도별 처리에 따른 리파아제의 활성 변화를 분석하였다. 리파아제는 주로 췌장에서 분비되어 중성지방인 트리글리세라이드 (Triglyceride, TG)를 글리세롤 (glycerol)과 지방산 (fatty acid) 으로 가수분해하는 효소로서 지방소화효소인 췌장 리파아제의 활성 저해능은 시료가 보유한 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다. 본 실시예에서는 각 시료의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 리파아제 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다.
먼저 1.5 ㎖ 튜브에 0.25 M Tris (pH 7.7), 250 mM CaCl2, 5 mM 4-nitrophenyldodecanoate (PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 37 ℃에서 5 분간 예열하고, 0.25 M Tris (pH 7.7)에 녹인 리파아제와 시료를 넣어 37℃에서 10분간 반응시킨 후 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 4 ℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96-웰 조직 배양 플레이트에 분주하고 멀티플레이트 리더 (multi-plate reader)를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 시료 비처리 대조군 대비 백분율로 나타내었다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
상기와 같은 방법으로 리파아제 활성 억제능을 확인한 결과, 도 2에 제시된 바와 같이 구절초 추출물 처리 농도의 증가에 따라 (0, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 ㎍/㎖) 시료 비처리 대조군 대비 리파아제 활성이 감소됨을 확인함으로써 구절초 추출물이 리파아제 활성을 농도 의존적으로 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다 (도 2). 이러한 결과는 시료가 리파아제 저해제 (lipase inhibitor)로 작용하여 체내 지방 흡수율을 저하시켜 항비만 활성을 보유할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4: 구절초 추출물의 세포 독성 분석
본 발명의 구절초 추출물을 생체에서 안전하게 사용할 수 있는 지 여부를 확인하기 위하여 구절초 추출물의 세포 독성 분석을 실시하였다. 마우스 지방전구세포 (preadipocyte) 세포주인 3T3-L1을 American Type Culture Collection (ATCC, USA) 으로부터 구입하여 10% 송아지 혈청 (bovine calf serum (BCS)) 및 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) 배지에서 배양하였다. 24 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 105 개의 세포를 분주하여 24 시간 동안 부착시키고 다양한 농도 (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 ㎍/㎖)의 구절초 추출물 용액으로 각각 처리하였다. 72시간 경과 후 시료를 포함하는 배지를 제거하고 WST (Water-soluble tetraolium salt) 시약을 포함하는 신선한 배지로 교체하여 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션 하고 멀티플레이트 리더 (multiplate reader, Paradigm, Beckman, USA)를 이용하여 480 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 담체 (vehicle, dimethylsulfoxide, DMSO)를 처리한 대조군에 대한 %로 나타내었다.
상기 구절초 추출물을 처리하여 배양한 3T3-L1 지방전구세포의 구절초 추출물 용액 농도에 따른 생존율을 도 3에 나타내었다. 그 결과, 구절초 추출물은 500 ㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 전혀 유발하지 않는 안전한 물질임을 확인하였다.
실시예 5: 구절초 추출물의 지방생성 억제능 분석
구절초 추출물의 지방생성 억제효과를 확인하기 위하여, 지방세포로의 분화를 유도하고 그에 따른 지방생성 및 그 억제효과를 확인하였다.
먼저, 3T3-L1 지방전구세포 (preadipocyte)를 0.5 μM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (3-isobutyl-methylxanthine;IBMX), 1 μM 덱사메타손 (dexamethasone; DEX) 및 10 ㎍/㎖ 인슐린 (insulin)을 포함하는 지방형성 분화배지에 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 12 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 105 개의 세포를 분주하고 2일 후 10% 소 태아혈청 (fetal bovine syndrome, FBS)을 포함하는 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 IBMX, DEX 및 인슐린을 포함하는 배지로 교환하면서 구절초 추출물을 농도별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 인슐린 및 상기 추출물을 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 후 지방생성 억제능을 관찰하였다.
상기와 같이 MDI로 분화를 유도한 3T3-L1의 지방생성에 대한 효과를 확인하기 위하여, 오일 레드 오 염색 (Oil red O staining)을 이용하여 중성지방인 트리글리세라이드 (triglyceride, TG) 생성을 측정하였다. 지방세포로의 분화 유도 및 시료 처리가 완료된 세포를 1X 인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS)으로 세척한 다음 10% 포르말린 (formalin)으로 고정하고 오일 레드 오 염색 용액으로 처리한 후 30분 간 인큐베이션하였다. 염색이 완료된 후 100% 이소프로판올 (isopropanol)을 이용하여 세포에 침착한 염료를 추출하고 520 ㎚ 에서 상기 염료 추출액의 흡광도를 측정하였다.
도 4는 (A) 상기 구절초 추출물을 각각 농도별로 처리하여 (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ㎍/㎖) 배양한 3T3-L1의 오일 레드 오 염색결과를 현미경 상으로 확인한 결과 및 (B) 상기 염색된 오일 레드 오 염색을 추출하여 흡광도를 측정하여 계산한 중성지방 트리글리세라이드의 함량을 나타낸 결과이다. 도 4에 나타난 바와 같이 구절초 추출물은 농도 의존적으로 중성지방 생성을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 구절초 추출물이 지방 생성을 억제하는 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 6: 구절초 추출물의 지방형성 관련 유전자 및 단백질 발현에 대한 효과
상기 구절초 추출물의 항비만 활성에 대한 구체적인 기전을 확인하기 위하여 지방형성에 관여하는 핵심인자인 C/EBPα, C/EBPβ 및 PPARγ의 유전자 및 단백질 발현을 분석하였다. 즉, 상기 실시예 5에서 육안으로 관찰한 구절초 추출물의 지방형성 억제를 확인한 것과 더불어 구절초 추출물이 지방형성 관련 유전자 및 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 세포를 배양하고 구절초 추출물을 처리한 후, 세포를 회수하여 유전자 및 단백질 발현 분석을 위한 RNA 및 단백질을 분리하여 각각 RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction)과 웨스턴 블럿 혼성화 (western blot hybridization)로 분석하였다.
먼저, RT-PCR을 위해 구절초 추출물을 처리한 배양 세포에서 RNA를 추출하여 NanoVue plus 분광광도계 (GE Healthcare)로 흡광도를 측정하여 추출된 RNA 농도를 정량한 후 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하여 PCR을 수행하였다.
웨스턴블럿 혼성화를 통한 단백질 발현 분석을 위해서는 구절초 추출물을 처리한 배양 세포에서 세포 용해질 (cell lysate)을 추출하여 브래드포드 분석 (Bradford assay)으로 단백질 농도를 결정한 후 50 ㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동하고 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에 옮긴 후 분석 대상 단백질의 항체와 혼성화시켰다. 혼성화가 끝난 막은 세척한 후 HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 이차항체와 한 시간 동안 반응시킨 후 화학발광 검출 시스템(chemiluminescence detection system; FluoChem　FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 분석하였다.
도 5는 농도별로 구절초 추출물을 처리하여 (0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖) 배양한 세포에서 지방형성 관련 유전자 발현 및 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, MDI 처리에 의해 지방분화가 일어나는 대조군에서는 세 가지 지방형성 관여 유전자 (C/EBPα, C/EBPβ 및 PPARγ)의 유의적 증가가 발견된 반면, 구절초 추출물 처리에 의해서는 상기 증가된 유전자들의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 구절초 추출물은 지방형성에 관여하는 핵심 인자의 발현을 저해함으로써 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제함을 확인하였으며, 궁극적으로 항비만 활성을 나타냄을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 메탄올을 용매로 사용하여 65 내지 85℃의 온도에서 제조되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비만 예방 또는 치료는 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제에 의해 달성되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 체중감소, 체지방감소, 혈중 중성지방 함량 감소 및 혈중 콜레스테롤 함량 감소의 효과를 가지는 것이 특징인 조성물.
  6. 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품.



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