KR101236588B1 - 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 구절초 추출물을 포함하는 조성물은 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포를 회복시켜, 인슐린 분비가 원활히 이루어지도록 하고 당독성을 방지하는 작용을 할 수 있다.

Description

구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING DIABETS COMPRISING EXTRACT OF CHRYSANTHEMUM ZAWADSKII}
본 발명은 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료에 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 구절초 추출물을 함유하여 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 비만과 함께 국민 보건상 위협을 가하는 만성질환으로 매해 그 발명율이 증가되고 있다. 당뇨병은 1형 당뇨와 2형 당뇨 두 가지로 나누어 볼 수 있으며, 인슐린 의존성이 1형 당뇨병은 어린이에게 일반적으로 나타나는 것으로 자가 면역 장애에 의해 선천적으로 췌장베타세포에서 인슐린 생산을 할 수 없는 경우를 말한다. 반면, 주로 성인에서 나타나는 인슐린 비의존성인 2형 당뇨는 인슐린에 대한 말초조직의 저항성 증가에 의해 포도당 이동의 감소에 기인한 것이다.
Butler 등[Butler AE et al., Diabestes 52: 102-110]은 2형 당뇨에서 인슐린 분비의 감소는 베타-세포의 복제(replication)와 자멸사(apoptosis) 경로에 불균형이 야기되어 상대적으로 베타-세포의 자멸사가 증가하여 일어나는 것으로 보고하였다. 또한 베타-세포의 자멸사는 혈중 당(glucose) 농도에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있으며, 고농도의 당에 베타-세포의 장기간 노출은 인슐린의 유전자 발현(gene expression)을 감소시켜 베타 세포의 손상이 일어나도록 하는 당 독성(glucose toxicity) 현상을 일으킨다. 이뿐만 아니라 사이토카인(cytokine) 자극 후 유도되는 반응성 산화물(reactive oxygen species; ROS)와 질산(nitric acid; NO)도 췌장베타세포의 손상에 영향을 주는 것으로 알려지고 있는데 특히, ROS는 인슐린 합성을 억제하고 자멸사를 유도시키는 것으로 알려져 있다.
구절초는 쌍떡잎식물-초롱꽃목-국화과의 여러해살이의 식물로 같은 속에 다양한 종류가 포함되어 있으며, 민간요법에서 주로 활용되는 정도였다. 예컨대, 민간에서는 무월경, 폐렴, 기관지염, 해소, 감기, 인두염 등에 구절초를 사용된다.
본 발명자들은 구절초 추출물이 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진하는 기능이 있음을 발견하여 구절초 추출물을 당뇨질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서는 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진하는 효능을 갖는 구절초 추출물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 또한 구절초 추출물을 함유하는 당뇨질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 또한 구절초 추출물을 함유하는 당뇨질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일례에서는 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 구절초 건조물을 물, C1~C의 저급 알코올 및 이들의 혼합액 중 어느 하나를 이용하여 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 C1~C4의 저급 알코올 중 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포의 손상을 억제시키고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진하는 작용을 한다. 본 발명의 다른 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포에서 세포 자멸사를 억제하는 작용을 한다. 본 발명의 또 다른 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포에서 반응성산화물(ROS)의 생성을 억제하는 작용을 한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 고형분 기준으로 0.1 내지 50 중량부만큼 함유될 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제, 담체, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물은 식품학적으로 허용되는 첨가물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 구절초 추출물은 당뇨질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있으며, 당뇨질환의 예방 및 개선에도 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 구절초 추출물은 특히 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진시키는데, 상기 구절초 추출물을 함유하는 조성물은 당뇨질환 예방 및 치료에 적용할 수 있으며, 식품 조성물에 적용하여 당뇨질환을 예방 및 개선하도록 할 수 있다.
도 1은 2-deoxy-d-ribose(dRib) 처리에 따른 췌장베타세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 2-deoxy-d-ribose(dRib)에 의하여 손상된 췌장베타세포에 구절초 추출물을 처리함으로써 췌장베타세포의 생존율이 상승하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 2-deoxy-d-ribose(dRib) 처리에 따라 췌장베타세포가 손상되는 것을 보여주는 사진이다.
도 3c 및 도 3d는 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 함께 구절초 추출물을 처리함으로써 췌장베타세포가 회복되는 것을 보여주는 사진이다.
도 4는 2-deoxy-d-ribose(dRib)로 구절초 추출물로 췌장베타세포를 처리했을 때의 세포 자멸사(apoptosis) 정도를 보여준다.
도 5는 2-deoxy-d-ribose(dRib)로 구절초 추출물로 췌장베타세포를 처리했을 때의 반응성산화물(ROS)의 생성 정도를 보여준다.
본 발명의 일례에서는 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 일례에서는, 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하에서는 도면 및 실시예를 참고로 하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 또는 도면에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 적용되는 구절초는 구일초, 선모초, 들국화, 고뽕이라고도 하며, 한국, 일본, 중국, 시베리아 등지의 산기슭 풀밭에서 자란다. 흔히 말하는 생약 구절초는 줄기와 잎을 말린 것으로, 한방과 민간에서는 꽃이 달린 풀 전체를 치풍, 부인병, 위장병에 처방한 기록이 있다.
상기 구절초는 학명상으로는 "Chrysanthemum zawadskii"로 통칭하여 분류되기도 하는데, 여기에는, 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum), 포천구절초(Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum), 한라구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. soreanum), 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense), 바위구절초(Chrysanthemum zawadskii var. alpinum) 등이 포함된다.
따라서, 본 발명의 일례에 따른 구절초 추출물은 이들의 추출물 중 적어도 하나를 포함하는 것이다.
또한, 상기 "구절초 추출물"이라는 것은 구절초의 다양한 부분, 즉 구절초의 잎, 줄기 및 꽃 중 적어도 한 부분으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 이하 본 발명의 일례에서는 상기 구절초 추출물로서, 구절초의 전초로부터 얻은 추출물을 사용한다.
본 발명의 일례에 따르면, 구절초 추출물의 제조방법은 구절초를 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 구절초를 용매에 침지시켜 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하는 단계;를 포함한다.
상기 추출에 적용되는 방법으로는 천연물 또는 생약을 추출할 때 적용하는 방법을 제한 없이 적용할 수 있다. 당업자라면 공지된 추출방법으로부터 용도에 맞는 적절한 추출방법을 적의하게 선택할 수 있을 것이다. 하기 설명하는 본 발명의 일례에서는, 이러한 추출 방법 중 열탕 추출법을 적용하여 추출물을 획득한다.
상기 구절초 추출물은 구절초에 용매를 처리하여 얻어질 수 있다. 상기 구절초 추출에 적용될 수 있는 용매로서, 예를 들어, 물, 알코올, 아세트산, DMFO (dimethyl-formamide), DMSO(dimethy sulfoxide), 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 펜탄, 헥산, 클로로포름, 디에틸 에테르, 사염화탄소 및 THF 등이 있다. 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올 등과 같이 C1~C4의 알코올을 적용할 수 있다.
상기 구절초 추출물을 의약용 또는 식품 조성물로 사용하고자 하는 본 발명의 일례에 따르면, 상기 추출용매로서, 물, C1~C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합액 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 이들이 혼합된 혼합용매를 사용할 수도 있음은 물론이다.
상기 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 일반적으로 통용되고 있는 조추출물(crude extract)뿐만 아니라, 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fraction)한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 구절초 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 구절초 추출물에 포함될 수 있는 것이다.
즉, 본 발명에서 구절초를 언급하면서 사용되는 용어 "추출물"은 구절초에 추출용매를 처리하여 얻은 용매를 포함하는 액상의 추출 결과물, 상기 추출 결과물을 정제한 정제물, 상기 액상의 추출 결과물을 건조시킨 동결건조물, 및 상기 구절초 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 분말, 과립 등으로 제형화한 구절초 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
참고로, 상기 구절초 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물의 제조방법은, 구절초를 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 구절초를 용매에 침지시켜 추출하는 단계; 상기 추출물을 여과하는 단계; 여과액을 농축하는 단계; 및 상기 농축액을 동결건조하여 분말을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 구절초 추출물은 당뇨 질환의 예방 및 치료용 조성물에 적용될 수 있다.
상기 구절초 추출물은 용매 추출물 상태로 그대로 복용될 수 있다. 구절초 추출물은 용매 추출물 상태 자체가 당뇨 질환의 예방 및 치료용 조성물이 될 수 있다.
한편, 상기 구절초 추출물은 당뇨질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로 가공될 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 일례에 따른 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물은 (a) 상술한 구절초 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 약제학적 조성물인 것이 가능하다.
상기 "약제학적 유효량"은 상술한 구절초 추출물이 원하는 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 구절초 추출물을 이용하여 약제학적 조성물을 제조할 때 사용되는 성분들로서, 예를 들어, 희석제, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 등을 포함하며, 상기 담체가 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 물, 시럽, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Science(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 복용의 편의성 등을 고려하여, 이하 실시예에서는 경구 투여 방식으로 제조되는 것을 중심으로 설명한다.
상기 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 치료용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 다른 일례에서는 상기 구절초 추출물은 식품 조성물로 제공되어 당뇨질환의 예방 및 개선용으로 적용될 수 있다.
추출용매로서 물을 이용하여 추출한 구절초 추출물은 그대로 복용이 가능한 바, 본 발명의 일례에서는 추출물 자체를 식품 조성물로 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일례에 따른 구절초 추출물을 포함하는 당뇨질환의 예방 및 개선용 식품 조성물, (a) 상술한 구절초 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 첨가물;을 포함할 수 있다. 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은 "식품 첨가물"이라고도 한다.
구체적으로, 상기 구절초 추출물을 식품 조성물에 적용하는 경우, 상기 구절초 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 식품 첨가물들을 첨가할 수 있다. 상기 식품 첨가물의 예로는, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로서는, 예컨대, 포도당, 과당 등과 같은 단당류; 말토스, 수크로스, 올리고당 등과 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 다당류; 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등과 같은 당알콜류 등이 있다. 상기 향미제로서 천연 향미제, 합성 향미제 등이 적용될 수 있다.
본 발명의 일례에서, 상기 구절초 추출물을 포함하는 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는, 상기 구절초 추출물 이외에 식품 첨가물로서 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 첨가할 수 있다. 상기 식품 첨가물는 1종만 첨가될 수 있고 1종 이상 혼합되어 첨가될 수도 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
<실시예 1> 구절초 추출물의 건조분말 제조
구절초 추출물 제조를 위하여 완도군 노화도에서 음력 9월에 채취한 구절초의 전초를 사용하였다.
상기 채취한 구절초 전초를 음건한 후 분쇄절단기(Crush cutter)를 사용하여 2~4mm 크기로 절단하였다. 상기 절단된 구절초 전초 130g에 80%에탄올 500ml을 가하여 환류추출기를 이용하여 2시간 동안 추출하였다. 상기 추출에 의하여 얻어진 추출액을 wattman paper를 이용하여 여과한 후, 여과액을 농축기(Buchi rotavapor R-100)를 이용 2시간 동안 농축하였다. 상기 농축된 시료를 영하 70℃로 냉동시켜 동결건조기(Freeze dryer)를 이용하여 건조하여 20g의 분말을 얻었다.
하기 실험에서 구절초 추출물의 성분의 일정성 및 함량의 균일성을 위하여 건조분말 형대로 첨가된다. 또한 상기 구절초 추출물의 함량 역시 건조분말의 함량비로 표시된다. 상기 건조분말은 고형분이라고도 한다.
<실험예 1> 손상된 췌장베타세포의 회복 실험
1. 췌장베타세포의 배양
본 실험에서는 햄스터 췌장베타세포 유래의 인슐린 분비 세포주인 HIT-T15 세포를 사용하였다. 상기 HIT-T15 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 계대 배양을 하면서 본 연구에 이용하였다. 세포 배양에 사용된 배지인 RPMI-1640, FBS, penicillin, streptomycin은 Invirogen(USA)에서 구입하여 사용하였다.
세포의 배양을 위하여 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(100 unit/100 mg/mL)을 첨가한 RPMI-1640 배지(glucose 11.1 mM 포함)를 이용하였는데, 상기 배지가 담겨진 100 mm 배양접시에 상기 HIT-T15 세포를 접종한 후 37℃, 5% CO2 상태의 배양기에서 3일간마다 배지를 교환하면서 계대배양하였다.
2. 세포손상모델
손상된 췌장베타세포의 회복을 실험하기 위해서 본 실시예에서는 2-deoxy-d-ribose(이하 "dRib"라 함)를 이용하였다. 상기 dRib는 세포손상을 유도하는 기전으로서, 세포손상 및 세포회복과 관련된 실험에 일반적으로 적용되어 세포손상인자로서 작용한다.
구체적으로 본 실험예에서는, dRib로 처리하였을 때의 췌장베타세포가 손상되는 정도와, dRib와 함께 구절초 추출물로 처리하였을 때의 췌장베타세포의 손상 정도를 비교함으로써, 구절초 추출물에 의하여 손상된 췌장베타세포의 회복 정도를 평가하였다.
3. dRib(2-deoxy-d-ribose)에 의한 췌장베타세포의 세포손상
상기 RPMI-1640 배지에서 배양된 HIT-T15 세포를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 3회 세척하고 0.5%　FBS가 포함된 RPMI-1640에 각각 0mM, 20mM, 30mM, 50mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)을 처리한 후 24시간 배양시켰다. 상기 0mM로 처리된 것은 비교를 위하여 상기 dRib(2-deoxy-d-ribose)를 첨가하지 않고 배양한 것을 의미한다. 각 well에 대하여 CCK-8 시약 50㎕를 첨가하고 2시간 배양한 후 생성된 soluble formazan에 대하여　450nm에서 흡광도를 측정함으로써 생존능력(viability)을 평가하였다. 그 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에서 보면, 췌장베타세포에 dRib을 처리했을 때, 농도 의존적으로 세포의 생존능력이 감소됨을 확인할 수 있다. 예컨대 dRib 농도 30mM로 처리된 경우 상기 췌장베타세포의 생존능력이 비처리군(dRib 농도 0mM)에 비하여 50% 정도로 감소됨을 알 수 있다.
4. 구절초에 의한 췌장베타세포의 손상회복
구절초에 의한 췌장베타세포의 회복을 평가하기 위하여, 30mM의 dRib로 처리되는 췌장베타세포 배양 well에 대하여 각각 0.025 mg/ml, 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml의 농도로 구절초 추출물(건조분말)을 처리하여 세포생존능력을 비교하였다. 비교를 위하여 구절초 추출물로 처리하지 않은 것(0 mg/ml)을 대조군으로 하였다. 여기서 상기 구절초 추출물은 상기 실시예 1에서 제조된 구절초 추출물의 건조분말을 사용하였으며, 상기 구절초 추출물의 농도는 구절초 추출물의 건조분말의 함량비로 표시하였다.
구체적으로, 상기 RPMI-1640 배지에서 배양된 HIT-T15 세포를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 3회 세척하고 0.5%　FBS가 포함된 RPMI-1640에 각 농도의 구절초 추출물과 2-deoxy-d-ribose을 24시간 배양시켰다.　각 well에 CCK-8 시약 50 ㎕를 첨가하여 2시간 배양한 후 생성된 soluble formazan을　450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 2에 개시되어 있다.
도 2에서 보는 바와 같이 2-deoxy-d-ribose만을 처리하는 경우(구절초 추출물 0)에 비하여 구절초 추출물을 0.05 및 0.1 mg/ml의 농도로 함께 처리한 경우 세포 생존능력이 회복됨을 알 수 있다.
5. 췌장베타세포의 손상 회복 확인
도 3a는 아무런 처리를 하지 않은 췌장베타세포의 모습을, 도 3b는 dRib(2-deoxy-d-ribose)만이 처리된 췌장베타세포의 모습을 나타낸다. 또한, 도 3c 및 3d에서는 30mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)에 더하여 각각 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물로 처리된 췌장베타세포의 모습을 보여준다. 30mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)만이 처리된 시료(도 3b)와 비교하여, 구절초 추출물을 함께 처리한 시료(도 3c 및 도 3d)의 경우 세포손상이 완화 및 회복되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 2> 구절초 추출물에 의한 췌장베타세포 자멸사 회복능력
세포 자멸사(Apoptosis) 정량을 위해 cell death detection kit(Roche Molecular Biochemicals,　Germany)를 사용하였다. 상기 RPMI-1640 배지에서 배양된 MC3T3-E1 세포를 24개 well 배양 접시에 2×104 cells/well의 농도로 분주하여　2일 배양하고 30mM의 dRib 및 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 배양한 후 용해 완충액(lysis buffer) 100　㎕를 넣고 10분 방치하였다. 200 x g에서 10분간 원심분리한 상층을　streptoavidin-coated well에 옮겼다. Anti-histone-biotin과 anti-DNA-peroxidase의　혼합액을 80 ㎕ 첨가한 후, 2시간 incubation 하여 anti-histone antibody가　nucleosomes의 histone component에 결합시켰다. 동시에 biotinylation을 통해　streptavidin-coated microplate에 immunocomplex를 고정시키고　anti-DNA-peroxidase antibody는 nucleosomes의 DNA component와 반응시켰다. 완충 용액으로 세척하여 결합되지 않은 antibodies를 제거한 후, nucleosomes의 양은 immunocomplex에 보유된 peroxidase로 정량하며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 dRib와 구절초 추출물이 처리되지 않은 것을 대조군(control)으로 하여, dRib만 30mM 농도로 처리된 것과, 30mM 농도의 dRib 및 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물이 처리된 것과 비교하였다.
그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4에서 보면, 췌장베타세포에 dRib 30mM로 처리한 경우에는 대조군(control)에 비하여 세포 자멸사가 현저히 증가하였지만, dRib 30mM에 더하여 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물을 함께 처리한 경우에는 dRib 30mM로 처리한 경우에 비하여 세포 자멸사가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 3> 구절초 추출물에 의한 산화스트레스 회복능력
구절초 추출물에 의한 췌장베타세포에서의 산화스트레스 회복능력을 평가하기 위하여 활성산소(reactive oxygen species; ROS)를 측정하였다.
상기 ROS는 췌장베타세포의 훼손인자로서, ROS는 인슐린 합성을 억제하고 자멸사를 유도시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 췌장베타세포에서 ROS의 억제는 췌장베타세포의 생존 및 회복에 중요한 인자이고, 당뇨질환 예방 및 치료에 매우 중요한 요소이다.
참고로, 상기 활성산소(ROS)는 일반 산소분자(O2)보다 활성화된 상태의 산소분자와 그 관련물질을 말한다. 상기 활성산소는 생체 세포 내에서 에너지를 생산하기 위해 끊임없이 일어나는 산소 대사반응의 부산물로서 과산화 수소 (hydrogen peroxide, H2O2), 과산화물 (superoxide, O2-), 수산 라디칼 (hydroxy radical, OH-) 등이 있다. 특정의 세포에서 이러한 활성산소의 생성이 억제된다면 그만큼 그 세포의 활성 및 생존이 향상된다고 볼 수 있다.
활성산소는 DCFH-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 측정법으로 측정하였다(Kooy et al., 1994).
상기 실시예 2에서 배양된 HIT-T15 세포를 24개 well　plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 3회 세척하였다. 그리고 0.5% FBS가 포함된　배양액에 30mM의 dRib 및 구절초 추출물을 넣고 48시간 배양한 다음 세포를 PBS　용액으로 세척하였다. 이를 10mM의 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) 용액 무수 에탄올에 용해하고 -20℃ 어두운 곳에서 stock solution으로 저장하였다. 실험시 10μM의 DCFD용액을 배양접시에 넣고 37℃에서 20분간 배양하였다. 24 개의 well 배양 접시에 2×104 cells/well의 농도로 분주하여 2일 배양하고 apigenin 처리 후 2일 배양한 후, 배지를 버리고 완충액으로 세척한 다음 DCFH 용액을 첨가하였다. 지용성의　DCFDA는 esterase 또는 산화적 가수분해에 의해 비형광성인 DCFH로 탈아세틸화되고 DCFH는 활성산소에 의해 산화되었다. 그리고 생성된 2',7'-dichlorofluore scein(DCF)를 여기 파장 485nm 및 방출파장　530nm에서 Multiprex reader(Zenyth　3100, Austria)로 형광을 측정하였다.
그 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에서 보면, 췌장베타세포에 dRib 30mM로 처리한 경우에는 대조군(control)에 비하여 활성산소(ROS)의 양이 현저히 증가하였지만, dRib 30mM에 더하여 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물을 함께 처리한 경우에는 dRib 30mM로 처리한 경우에 비하여 활성산소(ROS)의 양이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
<실험예를 통해 얻어진 결론>
췌장베타세포를 dRib으로 처리했을 때, 농도 의존적으로 산화스트레스에 의한 세포손상이 초래되었다. 그러나, 구절초 추출물로 처리했을 때, 췌장베타세포의 증식과 세포손상의 회복이 관찰되었고, 세포손상의 원인인 세포 자멸사가 억제되고 반응성 산화물의 생성도 억제되는 효과가 있음을 확인하였다.
상기 결과들을 통해서 볼 때, 구절초 추출물은 췌장베타세포의 손상을 억제하거나 손상된 췌장베타세포를 회복시켜, 인슐린 분비를 원활하게 하고 당독성(glucode toxic)을 방지함으로써 당뇨질환의 예방 및 치료에 대해 효능을 발휘할 수 있다.
<실시예 2> 액상 추출물의 제조
전라남도 완도군 노화도에서 음력 9월에 채취한 구절초의 전초를 음건한 후 분쇄절단기(Crush cutter)를 사용하여 2~4mm 크기로 절단하였다. 상기 절단된 구절초 전초 200g에 물 1000ml을 가하여 환류추출기를 이용하여 2시간 동안 추출하였다. 상기 추출에 의하여 얻어진 추출액을 wattman paper를 이용하여 여과하여 액상의 구절초 추출물을 얻었다.
상기 구절초 추출물은 액상의 상태 그대로 음용 가능하다.
필요한 경우 상기 여과된 구절초 추출물을 농축할 수 있고, 나아가 분말화하여 고형분을 제조할 수도 있다.
<제조예>
이하, 상기 실시예 1에서 얻어진 구절추 추출물의 건조분말을 이용하여 하기 배합비로 다양한 제형의 제품 및 조성물을 제조한다. 본 발명에 따른 구절초 추출물을 포함하는 당뇨 질환의 예방 및 치료용 조성물에서 상기 구절초 추출물은 고형분, 즉 건조분말 기준으로, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50중량%정도 함유될 수 있다.
<제조예 1> 정제의 제조
성분 함량
구절초 추출물 (실시예 1) 100mg
유당 200mg
전분 200mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기 표 1의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<제조예 2> 캡슐제의 제조
성분 함량
구절초 추출물 (실시예 1) 100mg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기 표 2의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
<제조예 3> 액제의 제조
성분 함량
구절초 추출물 (실시예 1) 1000mg
설탕 20g
이성화당 20g
계피향 적량
정제수 to 1000ml
통상의 액제의 제조방법에 따라 상기 표 3의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다. 이때 상기 계피향 대신 다른 향을 사용할 수 있음은 물론이다. 레몬향과 같은 과일향을 사용할 수도 있고 한약재향을 사용할 수도 있다.
<제조예 4> 건강음료의 제조
성분 함량
구절초 추출물 (실시예 1) 1000mg
비타민 A 0.1mg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 C 10mg
무기질 혼합물 적량
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수 to 1000 ml
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기 표 4의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기의 비타민 및 무기질 혼합물의 조성비는 건강식품에 적합하다고 판단되는 성분의 일례를 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 또한 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 일례일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (10)

  1. 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구절초 추출물은 구절초 건조물을 물 및 C1~C4의 저급 알코올 중 어느 하나를 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 C1~C4의 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포의 손상을 억제하고 손상된 췌장베타세포의 회복을 촉진하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포에서 세포 자멸사(apoptosis)를 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구절초 추출물은 췌장베타세포에서 반응성산화물(ROS)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는, 희석제, 담체, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 식품학적으로 허용되는 첨가물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨질환 예방 및 치료용 조성물.
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