KR101278801B1 - 구절초 추출물을 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
구절초 추출물을 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 구절초 추출물을 포함하는 조성물은 혈관내피세포의 손상을 억제하고 손상된 혈관내피세포의 회복을 촉진하는 작용을 할 수 있다.
Description
본 발명은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 구절초 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관내피 세포의 손상을 억제하고 손상된 혈관내피 세포의 회복을 촉진하는 구절초 추출물 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다.
수명이 길어지면서 고령화가 되고, 식생활이 서구화로 진행되고 있는 우리나라의 경우 성인병의 예방과 치료가 중요한 사회문제로 대두되고 있다. 이러한 성인병 중 대표적인 질환중의 하나가 심혈관계 질환이다.
심혈관계 질환은 2011년 세계보건기구(WHO)가 발표한 세계 10대 사망원인 중 1위를 차지할 정도로 발병율이 높은 질환이다. 이러한 심혈관계 질환의 주요 위험인자는 고혈압과 고지혈증, 당뇨병인데, 고혈압과 고지혈증은 그 자체가 심혈관계 질환이면서 동시에 다른 심혈관계 질환의 위험인자도 된다.
혈관은 심장으로부터 제공된 혈액을 인체의 구석구석까지 공급하는 역할을 하는 통로로서, 각 장기 및 조직에 있는 세포들에 산소, 영양분을 공급하며, 세포로부터 생성되는 노폐물을 처리하여 모든 세포들이 건강한 상태로 유지하는데 필수적인 기관이다.
혈관의 기능을 조절하고 항상성을 유지하는데 가장 중요한 역할을 하는 세포는 혈관의 내막을 구성하여 혈액과 직접 접하고 있는 혈관내피세포층이다. 상기 혈관내피세포층을 형성하는 혈관내피세포는 다양한 생리활성 물질을 분비하여 혈관의 확장, 혈전의 저해, 혈관벽의 선택적인 대사산물들의 투과 및 이동을 조절하고, 세포표면에 다양한 세포막 단백질을 발현하여 혈액의 흐름 및 백혈구와 혈소판의 부착을 조절하는 역할을 한다. 혈관내피세포는 발생단계에서 중배엽에서 생성된 내피전구세포인 혈관모세포 (angioblast)가 분화하여 인체의 다양한 기관에 생리적, 생화학적, 형태적으로 특이한 내피조직을 구성하며, 이러한 기관 특이적인 내피조직은 기관에 존재하는 주변세포 혹은 환경적 요인에 의한 내피세포의 특이적인 분화가 유도되어 형성될 것으로 여겨지고 있다 (Jain RK., Nat. Med., 9, p685-93, 2003).
정상적인 성인에 있어서 내피조직은 이를 구성하는 세포들의 신진대사가 활발히 진행되지만 기존의 조직이 그대로 유지되어 이를 구성하는 혈관내피세포의 재편성은 매우 느리게 진행된다.
혈관벽에 가해지는 박동성 스트레스, 혈관에 미치는 장력에 의한 물리적 요인, 혈액 내 과다한 지질 및 글루코스와 같은 다양한 체액성 요인, 혈관폐쇄에 의한 산소 및 영양분의 고갈, 활성산소 등은 혈관내피세포의 사멸, 치밀이음부의 이상, 조기노화를 유발하고, 이로 인한 혈관기능의 이상은 혈관염증반응, 심근경색, 허혈성 뇌손상, 당뇨성 망막염 등 다양한 인체 질환의 중요한 원인이 된다. (O'Riordan E et al., Kidney Int., 67(5), p1654-1658, 2005; Oda M et al., Clin Hemorheol Microcir., 23, p199-211, 2000; Brandes RP et al., Cardiovasc. Res., 66(2), p286-294, 2005).
따라서, 혈관내피세포의 사멸 및 치밀이음부의 소실 등과 같은 내피세포의 손상을 방어하고 혈관기능의 항상성을 높이는 물질은 상기한 다양한 혈관성 질환의 예방 및 개선에 매우 긴요하게 활용될 수 있다. 특히 부작용이 적은 천연물로부터 이러한 유효성 물질을 얻을 수 있다면 심혈관계 질환의 치료와 예방에 매우 도움이 될 것이다.
구절초(CHRYSANTHEMU ZAWADSKII)는 쌍떡잎식물-초롱꽃목-국화과의 여러해살이의 식물로서 예로부터 다양한 질환에 효험이 있다고 알려져 민간요법에서 활용되고 있다. 예컨대, 무월경, 폐렴, 기관지염, 해소, 감기, 인두염, 고혈압병 등에 사용된다.
그러나, 현재까지 상기 구절초와 심혈관계 질환 특히 혈관내피세포와의 상관 관계에 대한 보고는 없는 실정이다.
본 발명자들은 구절초 추출물이 혈관내피세포의 손상을 억제하고 손상된 혈관내피세포의 회복을 촉진하는 기능이 있음을 발견하여 구절초 추출물을 심혈관계 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서는 혈관내피세포의 손상을 억제하고 손상된 혈관내피세포의 회복을 촉진하는 효능을 갖는 구절초 추출물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명서는 또한 구절초 추출물을 함유하는 심혈관계 치료 또는 예방용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명서는 또한 구절초 추출물을 함유하는 심혈관계 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일례에서는 구절초 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 구절초 건조물을 물, C1~C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합액 중 어느 하나를 이용하여 추출한 것일 수 있다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 C1~C4의 저급 알코올 중 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 혈관내피세포의 증식을 활성화시키는 작용을 한다. 본 발명의 다른 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 혈관내피세포의 회복을 촉진할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 혈관내피세포의 항산화관련 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 일례에 따르면, 상기 항산화관련 유전자는 SOD-2, SOD-3 및 GPX-4 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 고형분 기준으로 0.1 내지 50중량% 만큼 함유될 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일례에 따르면 상기 심혈관계 질환은 혈관염증반응, 심근경색, 허혈성 뇌손상 및 당뇨성 망막염을 포함한다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물은 식품학적으로 허용되는 첨가물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이 구절초 추출물은 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있으며, 심혈관계 질환의 예방 및 개선에도 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 구절초 추출물은 특히 혈관내피세포의 증식을 활성화시키고 혈관내피세포의 회복을 촉진한다.
도 1은 2-deoxy-d-ribose(dRib) 처리에 따른 혈관내피세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 2-deoxy-d-ribose(dRib)에 의하여 손상된 혈관내피세포에 구절초 추출물을 처리함으로써 혈관내피세포의 생존율이 상승하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 2-deoxy-d-ribose(dRib) 처리에 따라 혈관내피세포가 손상되는 것을 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 4d는 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 함께 구절초 추출물을 처리함으로써 혈관내피세포가 회복되는 것을 보여주는 사진이다.
도 5는 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때의 세포 자멸사(apoptosis) 정도를 보여준다.
도 6은 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때의 반응성 산화물의 생성 정도를 보여준다.
도 7은 리포다당류인 LPS로 혈관내피세포를 자극했을 때 염증에 관여하는 인자인 COX-2 생성율을 보여준다.
도 8은 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때 항산화관련 유전자의 발현 정도를 보여준다.
도 2는 2-deoxy-d-ribose(dRib)에 의하여 손상된 혈관내피세포에 구절초 추출물을 처리함으로써 혈관내피세포의 생존율이 상승하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 2-deoxy-d-ribose(dRib) 처리에 따라 혈관내피세포가 손상되는 것을 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 4d는 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 함께 구절초 추출물을 처리함으로써 혈관내피세포가 회복되는 것을 보여주는 사진이다.
도 5는 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때의 세포 자멸사(apoptosis) 정도를 보여준다.
도 6은 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때의 반응성 산화물의 생성 정도를 보여준다.
도 7은 리포다당류인 LPS로 혈관내피세포를 자극했을 때 염증에 관여하는 인자인 COX-2 생성율을 보여준다.
도 8은 2-deoxy-d-ribose(dRib)와 구절초 추출물로 혈관내피세포를 처리했을 때 항산화관련 유전자의 발현 정도를 보여준다.
본 발명의 일례에서는 구절초(Chrysanthemu zawadskii)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 일례에서는 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 심혈관계 질환은 혈관염증반응, 심근경색, 허혈성 뇌손상 및 당뇨성 망막염을 포함한다. 상기 질환외에 다른 질환도 포함될 수 있음은 물론이다.
이하에서는 도면 및 실시예를 참고로 하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 또는 도면에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 적용되는 구절초(Chrysanthemu zawadskii)는 구일초, 선모초, 들국화, 고뽕이라고도 하며, 한국, 일본, 중국, 시베리아 등지의 산기슭 풀밭에서 자란다. 흔히 말하는 생약 구절초는 줄기와 잎을 말린 것으로, 한방과 민간에서는 꽃이 달린 풀 전체를 치풍, 부인병, 위장병에 처방한 기록이 있다.
상기 구절초는 학명상으로는 "Chrysanthemu zawadskii"로 통칭하여 분류되기도 하는데, 여기에는, 구절초(Chrysanthemu zawadskii var. latilobum), 포천구절초(Chrysanthemu zawadskii var. tenuisectum), 한라구절초(Chrysanthemu zawadskii subsp. soreanum), 낙동구절초(Chrysanthemu zawadskii subsp. Naktongense), 바위구절초(Chrysanthemu zawadskii var. alpinum) 등이 포함된다.
따라서, 본 발명의 일례에 따른 구절초 추출물은 이들의 추출물 중 적어도 하나를 포함하는 것이다.
또한, 상기 "구절초 추출물"이라는 것은 구절초의 다양한 부분, 즉 구절초의 잎, 줄기 및 꽃 중 적어도 한 부분으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 이하 본 발명의 일례에서는 상기 구절초 추출물로서, 구절초의 전초로부터 얻은 추출물을 사용한다.
본 발명의 일례에 따르면, 구절초 추출물의 제조방법은 구절초를 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 구절초를 용매에 침지시켜 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하는 단계;를 포함한다.
상기 추출에 적용되는 방법으로는 천연물 또는 생약을 추출할 때 적용하는 방법을 제한 없이 적용할 수 있다. 당업자라면 공지된 추출방법으로부터 용도에 맞는 적절한 추출방법을 적의하게 선택할 수 있을 것이다. 하기 설명하는 본 발명의 일례에서는, 이러한 추출 방법 중 열탕 추출법을 적용하여 추출물을 획득한다.
상기 구절초 추출물은 구절초에 용매를 처리하여 얻어질 수 있다. 상기 구절초 추출에 적용될 수 있는 용매로서, 예를 들어, 물, 알코올, 아세트산, DMFO (dimethyl-formamide), DMSO(dimethy sulfoxide), 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 펜탄, 헥산, 클로로포름, 디에틸 에테르, 사염화탄소 및 THF 등이 있다. 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올 등과 같이 C1~C4의 알코올을 적용할 수 있다.
상기 구절초 추출물을 의약용 또는 식품 조성물로 사용하고자 하는 본 발명의 일례에 따르면, 상기 추출용매로서, 물, C1~C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합액 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 이들이 혼합된 혼합용매를 사용할 수도 있음은 물론이다.
상기 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 일반적으로 통용되고 있는 조추출물(crude extract)뿐만 아니라, 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fraction)한 분획물도 포함할 수 있다. 즉, 구절초 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 구절초 추출물에 포함될 수 있는 것이다.
즉, 본 발명에서 구절초를 언급하면서 사용되는 용어 "추출물"은 구절초에 추출용매를 처리하여 얻은 용매를 포함하는 액상의 추출 결과물, 상기 추출 결과물을 정제한 정제물, 상기 액상의 추출 결과물을 건조시킨 동결건조물, 및 상기 구절초 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 분말, 과립 등으로 제형화한 구절초 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
참고로, 상기 구절초 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일례에 따르면, 상기 구절초 추출물의 제조방법은, 구절초를 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 구절초를 용매에 침지시켜 추출하는 단계; 상기 추출물을 여과하는 단계; 여과액을 농축하는 단계; 및 상기 농축액을 동결건조하여 분말을 얻는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 구절초 추출물은 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 적용될 수 있다.
상기 구절초 추출물은 용매 추출물 상태로 그대로 복용될 수 있다. 구절초 추출물은 용매 추출물 상태 자체가 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물이 될 수 있다.
한편, 상기 구절초 추출물은 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로 가공될 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 일례에 따른 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물은 (a) 상술한 구절초 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 약제학적 조성물인 것이 가능하다.
상기 "약제학적 유효량"은 상술한 구절초 추출물이 원하는 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 구절초 추출물을 이용하여 약제학적 조성물을 제조할 때 사용되는 성분들로서, 예를 들어, 희석제, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 등을 포함한다. 상기 담체가 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 물, 시럽, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Science(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 복용의 편의성 등을 고려하여, 이하 실시예에서는 경구 투여 방식으로 제조되는 것을 중심으로 설명한다.
상기 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 다른 일례에서는 상기 구절초 추출물은 식품 조성물로 제공되어 심혈관계 질환의 예방 및 개선용으로 적용될 수 있다.
추출용매로서 물을 이용하여 추출한 구절초 추출물은 그대로 복용이 가능한 바, 본 발명의 일례에서는 추출물 자체를 식품 조성물로 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일례에 따른 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물은 조성물은, (a) 상술한 구절초 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 첨가물;을 포함할 수 있다. 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은 "식품 첨가물"이라고도 한다.
구체적으로, 상기 구절초 추출물을 식품 조성물에 적용하는 경우, 상기 구절초 추출물뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 식품 첨가물들을 첨가할 수 있다. 상기 식품 첨가물의 예로는, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로서는, 예컨대, 포도당, 과당 등과 같은 단당류; 말토스, 수크로스, 올리고당 등과 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 다당류; 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등과 같은 당알콜류 등이 있다. 상기 향미제로서 천연 향미제, 합성 향미제 등이 적용될 수 있다.
본 발명의 일례에서, 상기 구절초 추출물을 포함하는 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는, 상기 구절초 추출물 이외에 식품 첨가물로서 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 첨가할 수 있다. 상기 식품 첨가물는 1종만 첨가될 수 있고 1종 이상 혼합되어 첨가될 수도 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
<실시예 1> 구절초 추출물의 건조분말 제조
구절초 추출물 제조를 위하여 완도군 노화도에서 음력 9월에 채취한 구절초의 전초를 사용하였다.
상기 채취한 구절초 전초를 음건한 후 분쇄절단기(Crush cutter)를 사용하여 2~4mm 크기로 절단하였다. 상기 절단된 구절초 전초 130g에 80%에탄올 500ml을 가하여 환류추출기를 이용하여 2시간 동안 추출하였다. 상기 추출에 의하여 얻어진 추출액을 wattman paper를 이용하여 여과한 후, 여과액을 농축기(Buchi rotavapor R-100)를 이용 2시간 동안 농축하였다. 상기 농축된 시료를 영하 70℃로 냉동시켜 동결건조기(Freeze dryer)를 이용하여 건조하여 20g의 분말을 얻었다.
하기 실험에서 구절초 추출물의 성분의 일정성 및 함량의 균일성을 위하여 건조분말 형대로 첨가된다. 또한 상기 구절초 추출물의 함량 역시 건조분말의 함량비로 표시된다. 상기 건조분말은 고형분이라고도 한다.
<실험예 1> 혈관내피세포의 손상 회복 및 증식 실험
1. 혈관내피세포의 배양
본 실험에서는 세포주로서 소의 폐혈관내피 세포(CPAE; calf pulmonary arterial endothelial cells)를 사용하였다. 상기 소의 폐혈관내피 세포(이하 "CPAE"라 함)는 폐동맥의 수축, 이완기전, 약물 반응 등의 연구에 널리 사용되는 세포주이며, ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
세포의 배양을 위하여 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(100 unit/100 mg/mL)을 포함하는 M199 media 배지를 이용하였는데, 상기 배지가 담겨진 100mm 배양접시에 상기 CPAE를 접종한 후 37℃, 5% CO2 상태의 배양기에서 3일간마다 배지를 교환하면서 계대배양하였다.
2. 세포손상모델
손상된 혈관내피세포의 회복을 실험하기 위해서 본 실시예에서는 2-deoxy-d-ribose(이하 "dRib"라 함)를 이용하였다. 상기 dRib는 세포손상을 유도하는 기전으로서, 세포손상 및 세포회복과 관련된 실험에 일반적으로 적용되어 세포손상인자로서 작용한다.
구체적으로 본 실험예에서는, dRib로 처리하였을 때의 혈관내피세포가 손상되는 정도와, dRib와 함께 구절초 추출물로 처리하였을 때의 혈관내피세포의 손상 정도를 비교함으로써, 구절초 추출물에 의하여 손상된 혈관내피세포의 회복 정도 또는 혈관내피세포의 ×손상억제 정도를 평가하였다.
3. dRib(2-deoxy-d-ribose)에 의한 혈관내피세포의 세포손상
상기 M199 media 배지에서 배양된 CPAE(소의 폐혈관내피 세포)를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 3회 세척하고 0.5% FBS가 포함된 alpha-MEM에 각각 0mM, 10mM, 20mM, 30mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)을 처리한 후 24시간 배양시켰다. 상기 0mM로 처리된 것은 비교를 위하여 상기 dRib(2-deoxy-d-ribose)를 첨가하지 않고 배양한 것을 의미한다. 각 well에 대하여 CCK-8 시약 50㎕를 첨가하고 2시간 배양한 후 생성된 soluble formazan에 대하여 450nm에서 흡광도를 측정함으로써 생존능력(viability)을 평가하였다. 그 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에서 보면, 혈관내피세포에 dRib을 처리했을 때, 농도 의존적으로 세포의 생존능력이 감소됨을 확인할 수 있다. 예컨대 dRib 농도 20mM로 처리된 경우 상기 혈관내피세포의 생존능력이 비처리군(dRib 농도 0mM)에 비하여 50% 정도로 감소됨을 알 수 있다.
4. 구절초에 의한 혈관내피세포의 회복
구절초에 의한 혈관내피세포의 회복을 평가하기 위하여, 20mM의 dRib로 처리되는 혈관내피세포 배양 well에 대하여 각각 0.001mg/ml, 0.005 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml의 농도로 구절초 추출물(건조분말)을 처리하여 세포생존능력을 비교하였다. 비교를 위하여 구절초 추출물로 처리하지 않은 것(0mg/ml)을 대조군으로 하였다. 여기서 상기 구절초 추출물은 상기 실시예 1에서 제조된 구절초 추출물의 건조분말을 사용하였으며, 상기 구절초 추출물의 농도는 구절초 추출물의 건조분말의 함량비로 표시하였다.
구체적으로, 상기 M199 media 배지에서 배양된 CPAE(소의 폐혈관내피 세포)를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 3회 세척하고 0.5% FBS가 포함된 alpha-MEM에 각 농도의 구절초 추출물과 2-deoxy-d-ribose을 24시간 배양시켰다. 각 well에 CCK-8 시약 50 ㎕를 첨가하여 2시간 배양한 후 생성된 soluble formazan을 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 2에 개시되어 있다.
도 2에서 보는 바와 같이 2-deoxy-d-ribose만을 처리하는 경우(구절초 추출물 0)에 비하여 구절초 추출물을 0.01 내지 0.1 mg/ml의 농도로 함께 처리한 경우 세포 생존능력이 회복됨을 알 수 있다.
5. 혈관내피세포의 손상회복 및 증식의 확인
도 3a 내지 3c에서는 각각 0mM, 20mM, 30mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)로 혈관내피세포를 처리한 경우 혈관내피세포의 모습을 보여준다. 여기서는 상기 dRib의 농도가 증가될수록 혈관내피세포가 손상된다는 것을 확인할 수 있다.
도 4a 내지 4d에서는 20mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)에 더하여 각각 0.005 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물로 처리된 혈관내피세포의 모습을 보여준다. 20mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)만이 처리된 시료(도 3b)와 비교하여, 구절초 추출물을 함께 처리한 경우 세포손상이 완화 및 회복되었음을 확인할 수 있다. 도 4a 내지 4d에 개시된 사진을 보면 또한, 구절초 추출물의 함량이 증가할수록 세포증식이 보다 더 활발함을 알 수 있다.
<실험예 2> 구절초 추출물에 의한 혈관내피세포 자멸사 회복능력
세포 자멸사(Apoptosis) 정량을 위해 cell death detection kit(Roche Molecular Biochemicals, Germany)를 사용하였다. 상기 M199 media 배지에서 배양된 CPAE(소의 폐혈관내피 세포)를 24개 well 배양 접시에 2×104 cells/well의 농도로 분주하여 2일 배양하고 20mM의 dRib 및 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 배양한 후 용해 완충액 (lysis buffer) 100 ㎕를 넣고 10분 방치하였다. 200 x g에서 10분간 원심분리한 상층을 streptoavidin-coated well에 옮겼다. Anti-histone-biotin과 anti-DNA-peroxidase의 혼합액을 80 ㎕ 첨가한 후, 2시간 incubation 하여 anti-histone antibody가 nucleosomes의 histone component에 결합시켰다. 동시에 biotinylation을 통해 streptavidin-coated microplate에 immunocomplex를 고정시키고 anti-DNA-peroxidase antibody는 nucleosomes의 DNA component와 반응시켰다. 완충 용액으로 세척하여 결합되지 않은 antibodies를 제거한 후, nucleosomes의 양은 immunocomplex에 보유된 peroxidase로 정량하며 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 dRib와 구절초 추출물이 처리되지 않은 것을 대조군(control)으로 하여, dRib만 20mM 농도로 처리된 것과, 20mM 농도의 dRib 및 0.1mg/ml 농도의 구절초 추출물이 처리된 것과 비교하였다.
그 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에서 보면, 혈관내피세포에 dRib 20mM로 처리한 경우에는 대조군(control)에 비하여 세포자멸사가 현저히 증가하였지만, dRib 20mM에 더하여 0.1mg/ml 농도의 구절초 추출물을 함께 처리한 경우에는 dRib 20mM로 처리한 경우에 비하여 세포자멸사가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 3> 구절초 추출물에 의한 산화스트레스 회복능력
구절초 추출물에 의한 혈관내피세포에서의 산화스트레스 회복능력을 평가하기 위하여 활성산소(reactive oxygen species; ROS)를 측정하였다.
참고로, 상기 활성산소(ROS)는 일반 산소분자(O2)보다 활성화된 상태의 산소분자와 그 관련물질을 말한다. 상기 활성산소는 생체 세포 내에서 에너지를 생산하기 위해 끊임없이 일어나는 산소 대사반응의 부산물로서 과산화 수소 (hydrogen peroxide, H2O2), 과산화물 (superoxide, O2-), 수산 라디칼 (hydroxy radical, OH-) 등이 있다. 특정의 세포에서 이러한 활성산소의 생성이 억제된다면 그만큼 그 세포의 활성 및 생존이 향상된다고 볼 수 있다.
활성산소는 DCFH-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 측정법으로 측정하였다(Kooy et al., 1994).
상기 실시예 2에서 배양된 혈관내피세포를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 3회 세척하였다. 그리고 0.5% FBS가 포함된 배양액에 20mM의 dRib 및 구절초 추출물을 넣고 48시간 배양한 다음 세포를 PBS 용액으로 세척하였다. 이를 10mM의 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) 용액 무수 에탄올에 용해하고 -20℃ 어두운 곳에서 stock solution으로 저장하였다. 실험시 10μM의 DCFD용액을 배양접시에 넣고 37℃에서 20분간 배양하였다. 24 개의 well 배양 접시에 2×104 cells/well의 농도로 분주하여 2일 배양하고 apigenin 처리 후 2일 배양한 후, 배지를 버리고 완충액으로 세척한 다음 DCFH 용액을 첨가하였다. 지용성의 DCFDA는 esterase 또는 산화적 가수분해에 의해 비형광성인 DCFH로 탈아세틸화되고 DCFH는 활성산소에 의해 산화되었다. 그리고 생성된 2',7'-dichlorofluore scein(DCF)를 여기 파장 485nm 및 방출파장 530nm에서 Multiprex reader(Zenyth 3100, Austria)로 형광을 측정하였다.
그 결과는 도 6에 도시되어 있다. 도 6에서 보면, 혈관내피세포에 dRib 20mM로 처리한 경우에는 대조군(control)에 비하여 활성산소(ROS)의 양이 현저히 증가하였지만, dRib 20mM에 더하여 0.1mg/ml 농도의 구절초 추출물을 함께 처리한 경우에는 dRib 20mM로 처리한 경우에 비하여 활성산소(ROS)의 양이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 4> LPS로 자극한 혈관내피세포에서의 COX-2 발현 억제
리포다당류인 LPS로 혈관내피세포를 자극하여, 염증에 관여하는 인자인 COX-2의 생성 및 발현을 관찰하였다. COX-2는 염증을 유발하는 물질인 Prostaglandin E2 가 생성되게 하는 효소로서 염증에 관여하는 중요한 인자이다. 따라서 혈관내피세포에서 Cox-2를 억제하면 염증이 억제되고 그 결과 혈관내피세포의 기능 및 생존율은 높아질 것이다.
COX-2의 측정은 ELISA kit (R&D system, USA)를 사용하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1의 M199 media 배지에서 배양된 CPAE(소의 폐혈관내피 세포)를 24개 well plate에 각 well당 2×104 cells/well의 농도로 분주하였다. 48시간 후에 인산 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 용액으로 3회 세척하고 0.5% FBS가 포함된 alpha-MEM에 각 농도의 LPS와 동결 건조된 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 배양시켰다. 이때 상기 LPS와 구절초 추출물이 처리되지 않은 시료를 대조군(control)으로 하였고, 10ng/ml의 LPS로 처리한 시료, 10ng/ml의 LPS와 0.05mg/ml 농도의 구절초 추출물로 처리한 시료 및 10ng/ml의 LPS와 0.1mg/ml 농도의 구절초 추출물로 처리한 시료를 준비하여 COX-2의 발현을 비교하였다.
상기 배양된 세포의 배양상층액을 수거하여 분석시까지 영하 80℃에 보관하였다. 100㎕의 배양액 시료와 표준물질을 IC Diluent #4 로 희석하여 분주하여 실온에서 2시간 배양하였다. 400ng/mL 농도의 항체용액 100㎕를 넣고 2시간 실온에서 방치하였다. 세척용액으로 2회 세척하였다. IC Diluent #1으로 희석한 Streptavidin-HRP 100㎕를 넣고 세척하였다. 100㎕의 기질용액을 넣고 빛을 차단한 상태에서 30분간 방치하였다. 50㎕의 반응정지용액을 넣고 20분 후에 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 시료의 농도를 구하였다.
그 결과는 도 7에 도시되어 있다.
도 7에서 보면, 혈관내피세포에 10ng/ml의 LPS로 처리한 경우에는 대조군에 비하여 COX-2의 생성이 현저히 증가하였지만, 10ng/ml의 LPS에 더하여 0.05mg/ml 농도의 구절초 추출물 및 0.1mg/ml 농도의 구절초 추출물로 처리한 시료에서는 COX-2의 생성이 현저히 감소했다는 것을 알 수 있다.
삭제
<실험예 5> 혈관내피세포에서 항산화관련 유전자발현
구절초 추출물을 처리하였을 때 혈관내피세포의 회복능력을 유전자 수준에서 확인하기 위하여, 혈관내피세포의 유전자들 중 산화자극에 대한 항산화관련 유전자의 발현정도를 실험하였다.
20mM의 dRib로 자극된 혈관내피세포에서 구절출 추출물을 처리하였을 때 항산화관련 유전자발현을 확인하기 위하여 상기 실험예 1(손상된 혈관내피세포의 회복 실험)에서 사용되었던 혈관내피세포 시료를 사용하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1에서 사용되었던 시료들 중, 20mM 농도의 dRib(2-deoxy-d-ribose)로 처리된 혈관내피세포 시료와, 상기 20mM 농도의 dRib에 더하여 각각 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml 농도의 구절초 추출물로 추가로 처리된 혈관내피세포 시료에 대하여 유전자 발현을 분석을 하였다. 대조군으로서 dRib와 구절초 추출물이 처리되지 혈관내피세포 시료를 사용하였다. 본 실험예에서 분석한 유전자는 SOD-1, SOD-2, SOD-3, Catalase, GPX-1 및 GPX-4 유전자였다.
각 시료에 대한 유전자발현 분석 방법은 다음과 같다.
1. RNA 추출
100mm 배양접시에 1×106개의 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 unit/ml의 penicillin, 100 ㎍/ml의 streptomycin 이 함유된 배지에서 2일간 배양하고, 신선한 medium으로 4번 세척하였다. 0.5% FBS, penicillin (100 unit/ml), streptomycin (100 ㎍/ml) 이 첨가된 배지로 시료와 함께 2일 배양하였으며, 각각의 배양접시를 PBS용액으로 세척하였다. RNA의 추출은 Chomczynski 등(1987)의 single step method를 변형하여 시행하였는데 그 방법은 다음과 같다. 세포를 균질화 용액 (4M guanidinium thiocyanate, 25mM sodium citrate, 0.1M β -mercaptoethanol, 0.5% sarkosyl) 1ml을 넣어 균질화시킨 다음 전체 용액의 0.1 volume의 3mM sodium acetate (pH 4.0), 1 volume의 water-saturated phenol과 0.2 volume의 chloroform-isoamyl alcohol(49:1 v/v)을 혼합하였다. 15분간 얼음 위에 방치한 후 4℃에서 20 분간, 10,000 × g 로 원심분리하여 상층액만을 얻어 이 용액의 1 volume의 isopropanol과 혼합한다. -70℃에서 1시간 동안 방치한 후 4℃에서 20분간, 10,000×g로 다시 원심분리하여 RNA 압착결정을 얻었다. 75% 에탄올로 세척한 후 진공건조기로 말리고, 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 처리한 멸균증류수에 용해한 다음 UV spectrophotometer로 260-280 nm에서 RNA를 정량하였다.
2. cDNA합성
모든 용액과 반응액은 RNA의 변성을 막기 위해서 얼음 위에 놓는다. 100mM dATP 용액, 100mM dCTP 용액, 100mM dGTP 용액, 100mM dTTP, 5mM Biotin-11-dCTP, Biotin-11-dATP, 5mM-Oligo(dT)12-18 Primer, RNase-free 증류수, 5x First-Strand 완충액, 0.1mM DTT, RNaseOut™, SuperScript™ II Reverse Transcriptase, RNase H, 내부표준물 혼합-Silverquant, RNA 검체 등을 얼음 위에서 녹인다. 100mM dATP 와 dCTP 를 RNAse-free 증류수에 녹여 최종농도가 16mM이 되도록 만든다. 즉, 10 ㎕이 필요할 시에는 1.6㎕ dATP(100 mM)와 1.6㎕ dCTP(100 mM)에 8.4㎕ RNase-free 증류수를 섞어서 준비한다. 5mM dTTP, 5mM dGTP, 800μM dATP, 800μM dCTP, 800 μM Biotin-11-dATP 그리고 800μM Biotin-11-dCTP을 섞어서 10배의 Biotin-dNTP 혼합액을 만든다. 1배의 반응혼합액을 만들고 내부표준 혼합-Silverquant 2㎕, Oligo(dT)12-18 Primer(0.5 ㎍/㎕) 2㎕, al RNA 총량(10㎍)을 넣고 RNase-free 증류수를 넣어서 최종 용량이 10㎕가 되게한다. 가볍게 흔들어서 원침한 후에 70℃에서 1분간 반응시킨다. 얼음 위에서 50분간 방치하고 5x First-Strand Buffer 4 ㎕, 0.1M DTT 2㎕, 10x Biotin-dNTP 혼합액 2㎕, RNaseOut™ (40U/㎕) 1㎕ 를 넣고 혼합한다. 앞서의 반응액 10㎕과 혼합하고 원침한다. 얼음 위에서 5분간 방치하고 1.5 ㎕의 SuperScript™ II Reverse Transcriptase(200U/㎕) 넣고 혼합한다. 42℃에서 90분간 반응시킨다. 다시 1.5㎕의 SuperScript™ II Reverse Transcriptase (200 U/ ㎕) 넣고 혼합한다. 42℃에서 90분간 반응시킨다. 가볍게 원침하고 70℃에서 15분간 반응시킨다. 1㎕의 RNase H(2U/㎕)을 넣고 가볍게 흔든 후에 37℃에서 20분간 반응시킨다. 가볍게 혼합하고 95℃에서 3분간 방치하여 반응을 중지시킨다. 얼음 위에 놓고 교합반응을 실시한다.
3. 유전자발현 분석을 위한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time RT-PCR)
분석 대상 유전자인 SOD-1, SOD-2, SOD-3, Catalase, GPX-1 및 GPX-4의 발현 차이를 분석하기 위하여 Roche LightCycler 480 system (Roche Diagnostics, GmbH Mannheim, Germany) 및 Roche Universal ProbeLibrary (UPL) kit를 사용한 Taqman method를 사용하여 Real-time PCR를 수행하였다. 상대적인 유전자 발현(gene expression)은 Comparative CT method를 사용하여 측정하였다. 10.0㎕ 2X UPL master mix, 1.0㎕ 5′primer(10 pmol/㎕), 1.0㎕ 3′primer (10 pmol/ml), 0.2 ㎕ UPL probe, 1.0㎕ cDNA 및 6.8㎕ sterile water를 함유한 반응혼합물의 총 부피 20㎕에서 반응을 수행하였다. PCR을 위한 thermal cycling conditions은 initial denaturation의 경우 95℃에서 10min, 이어 94℃에서 10s 동안 40cycles, 60℃에서 30s이다. 해당 유전자의 발현에 사용한 primers는 Roche ProbeFinder assay tool로 고안한 것이다. RT-PCR analysis를 위하여, 각각의 cDNA를 위하여 duplicate PCRs을 수행한다. Specific amplification을 확인하고자 negative controls(except templates)을 PCR reaction에 포함시킨다. quantitative PCR 분석을 위하여 LightCycler 480 software version 1.2(Roche)를 사용하였다. 각 시료에서 얻은 값은 HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 발현으로 보정한다. 모든 실험군에서 각각의 유전자발현 수준은 대조군과 비교하였다.
그 결과는 도 8에 개시되어 있다. 도 8에서 control은 대조군을 의미하며, dRib는 20mM의 dRib로 처리한 시료에 대한 것이며, 구절초 0.05와 구절초 0.1은 각각 20mM의 dRib에 더하여 각각 0.05 mg/ml 및 0.1 mg/ml의 구절초 추출물로 처리한 시료를 의미한다.
도 8에서 보는 바와 같이, 혈관내피세포를 20mM의 dRib로 자극하였을 때 항산화관련 유전자의 발현이 저하되었으나, 구절초 추출물을 투여시 항산화관련 유전자의 발현이 회복되는 것을 알 수 있다. 특히 SOD-2, SOD-3, GPX-4 유전자의 경우 구절초 추출물의 추가로 인하여 유전자 발현이 유의하게 회복되었으며, SOD-1과 GPX-1은 큰 차이가 없었다. 참고로, Catalase는 dRib 처리시에 오히려 증가하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 혈관내피세포를 손상시키는 인자가 포함되어 있는 환경에 구절초 추출물을 첨가함으로써 혈관내피세포의 손상이 완화되는 것을 알 수 있다. 이와 같이 구절초 추출물은 혈관내피세포의 손상을 억제시켜 혈관내피세포가 건강한 상태를 유지할 수 있도록 도움을 주며, 그 결과 혈관내피세포에 기인하는 심혈관계 질환을 치료 및 예방할 수 있다.
<실시예 2> 액상 추출물의 제조
전라남도 완도군 노화도에서 음력 9월에 채취한 구절초의 전초를 음건한 후 분쇄절단기(Crush cutter)를 사용하여 2~4mm 크기로 절단하였다. 상기 절단된 구절초 전초 200g에 물 1000ml을 가하여 환류추출기를 이용하여 2시간 동안 추출하였다. 상기 추출에 의하여 얻어진 추출액을 wattman paper를 이용하여 여과하여 액상의 구절초 추출물을 얻었다. 상기 구절초 추출물은 액상의 상태 그대로 음용 가능하다. 필요한 경우 상기 여과된 구절초 추출물을 농축할 수 있고, 나아가 분말화하여 고형분을 제조할 수도 있다.
<제조예>
이하, 상기 실시예 1에서 얻어진 구절추 추출물의 건조분말을 이용하여 하기 배합비로 다양한 제형의 제품 및 조성물을 제조한다. 본 발명에 따른 구절초 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에서 상기 구절초 추출물은 고형분, 즉 건조분말 기준으로, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50중량%정도 함유될 수 있다.
<제조예 1> 정제의 제조
| 성분 | 함량 |
| 구절초 추출물 (실시예 1) | 100mg |
| 유당 | 200mg |
| 전분 | 200mg |
| 스테아린산 마그네슘 | 적량 |
상기 표 1의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<제조예 2> 캡슐제의 제조
| 성분 | 함량 |
| 구절초 추출물 (실시예 1) | 100mg |
| 유당 | 50mg |
| 전분 | 50mg |
| 탈크 | 2mg |
| 스테아린산 마그네슘 | 적량 |
상기 표 2의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
<제조예 3> 액제의 제조
| 성분 | 함량 |
| 구절초 추출물 (실시예 1) | 1000mg |
| 설탕 | 20g |
| 이성화당 | 20g |
| 계피향 | 적량 |
| 정제수 | to 1000ml |
통상의 액제의 제조방법에 따라 상기 표 3의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다. 이때 상기 계피향 대신 다른 향을 사용할 수 있음은 물론이다. 레몬향과 같은 과일향을 사용할 수도 있고 한약재향을 사용할 수도 있다.
<제조예 4> 건강음료의 제조
| 성분 | 함량 |
| 구절초 추출물 (실시예 1) | 1000 mg |
| 비타민 A | 0.1 mg |
| 비타민 E | 1.0 mg |
| 비타민 B1 | 0.13 mg |
| 비타민 B2 | 0.15 mg |
| 비타민 B6 | 0.5 mg |
| 비타민 C | 10 mg |
| 무기질 혼합물 | 적량 |
| 구연산 | 1000 mg |
| 올리고당 | 100 g |
| 매실농축액 | 2 g |
| 타우린 | 1 g |
| 정제수 | to 1000ml |
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기 표 4의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기의 비타민 및 무기질 혼합물의 조성비는 건강식품에 적합하다고 판단되는 성분의 일례를 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 또한 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상으로 본 발명의 특정 실시예, 실험예 및 제조예를 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 하나의 일례일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
Claims (12)
- 구절초 전초 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 고형분 기준으로 0.1 내지 50중량% 만큼 함유하며, 혈관내피세포의 증식을 활성화시키고 혈관내피세포의 회복을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 구절초 전초 추출물은, 구절초 전초의 건조물을 물 및 C1~C4의 저급 알코올 중 어느 하나를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 C1~C4의 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 구절초 전초 추출물은 혈관내피세포의 항산화관련 유전자인 SOD-2, SOD-3 및 GPX-4 중 적어도 하나의 발현을 증진시키는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제, 충전제, 증량제, 결합제, 붕해제, 붕해 억제제, 흡수 촉진제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 및 착향제 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 식품학적으로 허용되는 첨가물를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 식품학적으로 허용되는 첨가물은, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물.
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