KR20150015164A - 항산화 활성을 갖는 와송의 디클로로메탄 또는 헥산 분획물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 와송의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로 보다 구체적으로는 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 세포독성이 없고, DPPH 라디칼 소거능이 있으며 항산화 효과가 있다고 알려져 있는 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화 개선에 유용한 약학적 조성물 및 건강기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 와송 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로 보다 구체적으로는 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
항산화 활성이란 생체 내 활성산소의 생성을 방지하고 세포에 회복 불가능한 손상을 야기하는 산화현상을 방지하는 활성을 말한다. 안정한 상태의 산소(triplet oxygen)는 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 라디칼, 하이드록시 라디칼, 과산화수소와 같은 반응성이 큰 활성산소(ROS)로 전환되어 세포구성성분을 비가역적으로 파괴한다. 이들 활성산소의 작용은 체내 방어기구인 수퍼옥사이드디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxydase)등의 항산화성 효소 및 비타민 C, 비타민 E, 글루타티온(glutathione) 등의 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 활성산소에 노출될 경우 이 균형이 깨어져서 활성산소가 지질, 단백질, DNA 등을 비가역적으로 파괴하게 된다. 그 결과, 노화, 암, 복합성 동맥경화, 관절염 및 파킨슨병과 같은 각종 질병이 유발된다.
지금까지 개발된 합성 항산화제로는, BHA(butylated hydroxy anisole), BHT (butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(nordihydro-guaiare tic acid) 등이 있으며, 천연 항산화제로는 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 퍼옥시다아제, 카탈라아제, 글루타티온 퍼옥시다아제 등의 항산화효소와 토코페롤(비타민 E), 비타민 C(Vitamin C, ascorbic acid), 카로테노이드, 글루타티온 등의 비효소적 항산화물질 등이 있다.
그러나, 합성 항산화제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양을 발생시킬 수 있는 단점이 있으며 온도에 약해 한번 열을 가하면 쉽게 파괴되는 단점이 있다. 반면에 천연 항산화제는 합성 항산화제에 비해 생체에 안전하다는 장점이 있으나 그 효과가 약하다는 단점이 있다.
따라서 항산화 활성이 탁월하고 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 와송 추출물, 보다 구체적으로 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물이 우수한 항산화 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 디클로로메탄을 추가로 첨가하여 수득한 분획물이며, 헥산 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 헥산을 추가로 첨가하여 수득한 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 상기 조성물에 0.01 ~ 200ug/ml의 양으로 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 DPPH라디칼 소거능이 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 대식세포에서 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성을 갖거나 Keap1의 발현을 억제하는 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 와송의 디클로로메탄에 U0126 억제제를 추가로 더 포함할 수 있거나, 와송 헥산 분획물에 SB203580억제제를 추가로 더 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 세포독성이 없고, DPPH 라디칼 소거능이 있으며 항산화 효과가 있다고 알려져 있는 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화 개선에 유용한 약학적 조성물 및 건강기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물의 농도처리에 따른 항산화 효과를 알아보기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물의 항산화 단백질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물에 HO-1, Nrf2 및 Keap1을 처리하여 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리하여 HO-1, Nrf2 및 Keap1의 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 RAW 264.7 대식세포에 키나아제 억제제로 알려진SB203580, SP600125 및 U0126을 30분간 전처리하고, 와송 에탄올 분획물 100 μg/ml를 1시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물의 항산화 단백질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물에 HO-1, Nrf2 및 Keap1을 처리하여 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리하여 HO-1, Nrf2 및 Keap1의 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 RAW 264.7 대식세포에 키나아제 억제제로 알려진SB203580, SP600125 및 U0126을 30분간 전처리하고, 와송 에탄올 분획물 100 μg/ml를 1시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과이다.
본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
와송(Orostachys japonicus)은 돌나물과의 다년생 초본 식물로서, 오랫동안 간염, 폐렴, 지혈, 습진, 화상, 부종의 치료를 위한 치료제로 사용해 왔으며, 약리 작용으로는 혈관 수축작용, 호흡 흥분 작용, 장관의 긴장도 증강 작용, 혈압강화, 이뇨 작용 및 해열 작용이 있다고 알려져 있다.
한편 본 발명자들은 이러한 와송을 이용한 항산화용 조성물을 개발하기 위해 연구하던 중, 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물에 DPPH 라디칼 소거능이 있으며, 항산화 효과가 있다고 알려져 있는 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성을 가지고 있다는 사실을 확인함으로써, 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 항산화용 조성물로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이러한 사실을 입증하기 위해 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 즉, 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물 처리에 의한 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물의 처리 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 이러한 효과는 항산화 효과가 높다고 알려진 양성 대조군인 아스코르브산과 DPPH 라디칼 소거능 정도가 비슷하게 나타났음을 알 수 있었다(도 1 참조).
또한, 다른 일실시예에 의하면, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물이 항산화 효소로 알려져 있는 HO-1, Nrf2 및 Keap1 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리한 결과, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물 농도와 시간 의존적으로 HO-1 및 Nrf2의 발현량이 증가되었으며, Keap1의 발현량은 와송 디클로로메탄과 헥산 분획물에서 감소되었으며, 특히 와송 디클로로메탄 분획물에서 가장 많이 감소되었음을 알 수 있었다(도 2 내지 3 참조).
나아가 본 발명자들은 대식세포에 본 발명의 와송 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 처리할 경우 MAPK의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 키나아제 억제제로 알려진 SB203580, p38 억제제, SP600125, JNK 억제제, U0126 및 ERK 억제제를 30분간 전처리하였으며, HO-1 단백질 발현량을 웨스턴블롯으로 측정한 결과, 와송 디클로로메탄 분획과 U0126 억제제를 같이 처리하였을 때 HO-1의 발현이 확연히 억제되었으나, 와송 디클로로메탄에 SB203580 또는 SP600125 억제제를 처리하였을 때는 HO-1의 발현이 억제되지 않았다. 또한, 와송 헥산 분획에 SB203580억제제를 처리하였을 때는 HO-1의 발현이 확연히 억제되었음을 알 수 있었다(도 4 참조).
이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물에 DPPH 라디칼 소거능이 있으며, 항산화 효과가 있다고 알려져 있는 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성이 있어 항산화 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 용매로서 디클로로메탄 및/또는 헥산을 사용하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있는데, 본 발명에 따른 와송 유래 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
바람직하게 본 발명의 항산화 활성을 가지는 와송 추출물은 유기용매로서 디클로로메탄 및/또는 헥산을 사용하는 추출방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 용매추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 공정을 수행할 수 있고, 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하는 과정을 수행할 수 있다.
따라서 본 발명에 있어서 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 제조하는 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계; (b) 에탄올 추출물을 헥산과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 헥산 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계; (c) 상기 (b) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 디클로로메탄과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계를 통해 수득한 물 분획물에 에틸아세테이트와 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.
이러한 각종 유기용매를 이용하여 추출물을 분획화하는 과정은 추출물(또는 분획물)이 가지고 있는 약리효과를 최대로 나타내는 분획물(fraction)을 찾아내게 하는 바, 필요 없는 물질을 분획화 과정을 통해 제거하여, 특정 효과를 나타내는 활성물질만이 최대로 농축된 추출물 상태를 만들 수 있게 한다. 이러한 분획화 과정을 통해 천연식물의 추출물은 약학적 조성물 및 건강기능식품의 소재로서의 활용도를 높일 수 있게 된다.
따라서 본 발명은 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 항산화 효과를 이용한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 0.01 ~ 200ug/ml로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항산화용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 항산화 효과를 이용하여 다양한 질병을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항산화용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항산화용 조성물은 항산화 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 항산화용 약제를 제공할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 항산화 활성을 가지는 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 세포에 대해 독성을 유발시키지 않는 특징이 있고, 또한 천연물인 와송을 사용함을 특징으로 하고 있어, 체내의 독성 및 부작용 염려 없이 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 상기 조성물은 항산화 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 항산화 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 조성물은 항산화 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항산화 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 항산화 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항산화용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1>
<1-1>
시약
DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 소태아혈청 및 항생제는 Hyclone (Logan, UT)에서 구입하였고, LPS, SB 203580 (p38 inhibitor), SP 600125 (JNK 억제제) 및 U0126 (ERK 억제제)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, HO-1, Nrf2, Keap1, Goat anti-rabbit IgG-HRP 이차 항체 및 GAPDH에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
<1-2>
세포배양
쥣과 동물 (Murine) RAW 264.7 마크로파지 세포 라인(macrophage cell line)은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% FBS와 1% 스트렙토마이신/페니실린이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2/air 환경 하에서 배양하였으며, 세포들을 매 2 ~ 3일마다 1:5의 분할비율로 계대 배양하였다.
통계
모든 실험결과는 평균± 표준편차로 표기하였고, 그 결과들의 통계 분석하기 위하여 one-way ANOVA(SystatInc.,Evaston,IL,USA)를 수행하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
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실시예
2>
와송의
용매
분획물
제조
밀양 거북이 와송을 식품용 및 의약용으로 사용하기 위하여 추출 용매는 약전 에탄올을 사용하였다. 자연 건조시킨 와송을 40메쉬(40mesh)이하로 잘게 분쇄하고 분말화 시킨 후, 95% 에탄올에 3시간 동안 침지하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 그 여액을 증류 농축장치(rotary evaporator)를 이용해 40℃에서 농축하여 에탄올 추출물을 제조하였고, 이후 상기 농축 에탄올 추출물을 계통분획법에 따라 용매분획을 실시하였다.
먼저 상기 추출된 와송 에탄올 추출물에 물과 헥산이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 헥산 분획과 물 분획으로 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 디클로로메탄과 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 디클로로메탄 분획과 물 분획으로 다시 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 에틸아세테이트와 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 에틸아세테이트 분획과 물 분획으로 분리하였다. 이후 분획이 완료된 각 와송의 용매 추출 분획물들은 rotary evaporator를 이용하여 건조시킨 후 하기 실험에 사용하였다.
<
실시예
3>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄 및
헥산
분획물의
MTS
법에 의한 세포독성 검사
상기 실시예 2에서 수득한 용매 분획물들 중 와송의 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 대상으로 처리농도에 따른 RAW 264.7 대식세포에 대한 증식 억제 효과를 MTS[3-(4,5-dimethlylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt]분석을 이용하여 조사하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 각 웰당 5 × 104 cells/well를 37℃, 5% CO2의 환경에서 다양한 농도의 와송 헥산 분획물 또는 와송 헥산 분획물과 LPS를 함께 처리한 분획물을 24시간 동안 배양한 다음, 와송의 디클로로메탄 분획물과 헥산 분획물을 각각 다른 농도(0, 25, 50, 75, 100ug/ml)로 세포에 처리한 다음, 20㎕ Cell Titer 96 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식 분석 키트(Promega Corporation, Madison, USA)용액을 처리하고 흡광기(fluorescence multi-detection reader, Synergy™ HT, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 490㎚파장으로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 와송의 디클로로메탄 분획물과 헥산 분획물을 RAW 264.7 대식세포에 농도별로 처리한 결과, 농도가 증가함에 따라 세포독성이 증가하였으나 모든 농도에서 24시간 배양하였을 때 높은 생존율을 보이는 것으로 나타남에 따라 세포 독성이 거의 없는 것을 알 수 있었다(결과 미도시).
<
실시예
4>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄 및
헥산
분획물의
DPPH
라디칼
소거능
측정
본 발명자들은 실시예 2의 방법으로 제조된 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물에 항산화 효과가 있는지 알아보기 위하여 Khlifi et al의 방법을 이용하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.
먼저, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 다양한 농도의 시료(0 ~ 200μg/mL)에 DPPH 라디칼의 메탄올 솔루션(DPPH의 최종 농도가 0.2mM)을 첨가한 다음,암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 실험에서 아스코르브산은 양성대조군으로 사용하였다.
반응 혼합물의 낮은 흡광도는 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냄을 아래 식에 의하여 알 수 있었다.
DPPH radical scavenging activity (%) = (1-Abssample/Abscontrol)×100
도 1에서 나타난 바와 같이 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물은 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물의 IC50은 각각 32.05 μg/mL와 205.76 μg/mL로 나타나 높은 항산화 효과를 보임을 알 수 있었다. 또한, 와송 디클로로메탄 분획물은 항산화 효과가 높다고 알려진 양성 대조군인 아스코르브산과 DPPH 라디칼 소거능이 비슷하게 나타났다.
<
실시예
5>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄 및
헥산
분획물이
HO
-1 발현에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물이 항산화 효소로 알려져 있는 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 웨스턴 블럿을 이용하여 측정하였다.
먼저, 준비된 40μg의 HO-1 단백질을 모은 다음 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하였으며, 전기영동 후 겔을 PVDF 멤브레인으로 일렉트로블로팅에 의해 전이시킨 후, 트랜스퍼(Transfer)가 완료된 PVDF 막을 5% 탈지분유(non-fat dry milk)를 함유한 PBST로 비특이적 단백질을 차단하기 위하여 2시간 정도 반응시킨 후 1차 antibody로 4℃에서 12시간 반응시키고 막을 PBST 버퍼로 10분간격으로 3번 세척하였다. ECL 용액을 적용시킨 다음 암하에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.
와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리한 결과, 항산화 효소인 HO-1는 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물에서 증가하였으며, 넓은 범위의 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물에서 HO-1가 검출되었음을 알 수 있었다(도 2A 참조).
또한, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물 농도의존적으로 HO-1의 발현이 증가되었음을 알 수 있었다(도 3A 참조).
<
실시예
6>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄 및
헥산
분획물이
Nrf2
활성에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 HO-1 발현의 중재에 전사인자 Nrf2가 어떠한 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 웨스턴블롯팅으로 Nrf2의 발현량을 측정하였다.
먼저 RAW 264.7 대식세포에 LPS를 첨가하여 12시간 동안 자극킨 다음 웨스턴블롯팅으로 Nrf2의 발현량을 확인한 결과, 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물이 아닌 다른 유기용매들과 비교하였을 때 와송의 디클로로메탄 및 헥산 분획물에서의 Nrf2의 발현량이 확연히 증가하였음을 알 수 있었다(도 2B 참조).
Keap1의 기능은 다양한 자극에서 Nrf2의 세포간 스트레스를 불활성시키는 억제제로서 기능을 한다. 본 발명자들은 Nrf2와 Keap1 사이의 상호작용을 조사하기 위하여 Keap1 유기용매 분획물의 치료 효과를 웨스턴블롯을 측정한 결과, Keap1의 발현은 와송 디클로로메탄과 헥산 분획물에서 감소되었으며, 특히 와송 디클로로메탄 분획물에서 가장 많이 감소되었음을 알 수 있었다(도 2C 참조).
또한, 와송 디클로로메탄과 헥산 분획의 Nrf2 활성은 농도와 시간 의존적으로 월등히 증가하였으나 Keap1의 발현은 농도와 시간 의존적으로 감소하였음을 알 수 있었다(도 3 참조).
<
실시예
7>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄 및
헥산
분획물이
MAPK
의 활성에 미치는 영향
본 발명의 와송 디클로로메탄 및 헥산 분획물이 MAPK의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 먼저 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에 다양한 키나아제 억제제로 알려진 SB203580, p38 억제제, SP600125, JNK 억제제, U0126 및 ERK 억제제를 30분간 전처리하였으며, HO-1 단백질 발현량을 웨스턴블롯으로 측정하였다.
그 결과, 와송 디클로로메탄 분획과 U0126 억제제를 같이 처리하였을 때 HO-1의 발현이 확연히 억제되었으나, 와송 디클로로메탄에 SB203580 또는 SP600125 억제제를 처리하였을 때는 HO-1의 발현이 억제되지 않았음을 알 수 있었다.
또한, 와송 헥산 분획에 SB203580억제제를 처리하였을 때는 HO-1의 발현이 확연히 억제되었음을 알 수 있었다(도 4 참조).
따라서, 도 4의 결과로 와송 분획별로 HO-1의 발현을 억제시킬 수 있는 키나아제 억제제 종류가 다름을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 디클로로메탄 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 디클로로메탄을 추가로 첨가하여 수득한 분획물이며, 헥산 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 헥산을 추가로 첨가하여 수득한 분획물인 것을 특징으로 하는 항산화용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
와송의 디클로로메탄 및/또는 헥산 분획물은 상기 조성물에 0.01 ~ 200ug/ml의 양으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항산화용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분획물은 DPPH라디칼 소거능이 있는 것을 특징으로 하는 항산화용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분획물은 대식세포에서 HO-1 및 Nrf2의 발현을 증가시키는 활성을 갖거나 Keap1의 발현을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항산화용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 와송의 디클로로메탄에 U0126 억제제를 추가로 더 포함할 수 있거나, 와송 헥산 분획물에 SB203580억제제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 약학적 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 항산화용 건강기능성 식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130090843A KR20150015164A (ko) | 2013-07-31 | 2013-07-31 | 항산화 활성을 갖는 와송의 디클로로메탄 또는 헥산 분획물 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020130090843A KR20150015164A (ko) | 2013-07-31 | 2013-07-31 | 항산화 활성을 갖는 와송의 디클로로메탄 또는 헥산 분획물 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150015164A true KR20150015164A (ko) | 2015-02-10 |
Family
ID=52571743
Family Applications (1)
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| KR1020130090843A KR20150015164A (ko) | 2013-07-31 | 2013-07-31 | 항산화 활성을 갖는 와송의 디클로로메탄 또는 헥산 분획물 및 이의 용도 |
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| KR20180110411A (ko) * | 2017-03-29 | 2018-10-10 | 인제대학교 산학협력단 | 와송 추출물을 포함하는 피부 개선 화장료 조성물 |
| KR102304571B1 (ko) | 2021-02-10 | 2021-09-24 | (주)오픈스카이앤귀일 | 기능성 두유 및 이의 제조방법 |
| KR102660553B1 (ko) * | 2022-12-14 | 2024-04-29 | (주)파이토에코 | 와송 폴리올 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 조성물 |
-
2013
- 2013-07-31 KR KR1020130090843A patent/KR20150015164A/ko active Search and Examination
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| WO2022173145A1 (ko) * | 2021-02-10 | 2022-08-18 | (주)오픈스카이바이오 | 기능성 두유 및 이의 제조방법 |
| KR20220129988A (ko) | 2021-02-10 | 2022-09-26 | (주)오픈스카이바이오 | 와송 및 아마씨를 포함하는 건강음료 및 이의 제조방법 |
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