KR20120007887A - 산머루 씨 추출물을 함유하는 항염증 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산머루 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물 및 그의 유기용매 분획물은 독성이 없으며, 활성산소종의 생성을 저해하고, NF-kB 단백질의 발현을 억제함으로서 우수한 염증 반응 억제 효과를 나타내는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 체내에 대한 부작용도 없기 때문에 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 염증 증상을 개선할 수 있는 식품학적 용도로도 사용할 수 있다.

Description

산머루 씨 추출물을 함유하는 항염증 조성물{Composition comprising extracts of Wild Grape seeds for anti-inflammatory activity}

본 발명은 산머루 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물, 염증 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 및 염증 예방 또는 개선 효과를 나타내는 건강기능식품에 관한 것이다.

염증반응(inflammation)은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비 특이적인 방어 작용으로 조직의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역 세포가 관련되어 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상의 경우 염증반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히, 산화질소를 발생시키는 효소인 산화질소 합성효소(Nitric Oxide Synthase: NOS)와 프로스타글란딘(Prostaglandins: PGs)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는 과량의 산화질소(Nitric Oxide: NO) 및 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)을 형성하는 데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 화학반응, 대사과정, 과도한 스트레스 등 체내의 다양한 생화학적 자극에 의하여 생성되는데, 이러한 활성산소종은 지질 과산화, 효소 불활성화, DNA 및 세포막에 손상을 유발하여 암, 염증, 동맥경화 등 광범위한 질환의 원인을 제공하는 원인으로 알려져 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있다. 포유동물에서 분리된 NOS(Nitric Oxide Synthases)는 물리, 화학적 성상에 따라 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 의 3종류의 동종 효소로 나누어지며, 세포 속에 계속적으로 존재하는 지속적 NOS(constitutive NOS)에는 신경계에 존재하는 타입 nNOS(neuronal NOS)와 혈관계에 존재하는 Type Ⅲ eNOS(endothelial NOS)가 있고, 상대적으로 일부 세포에서 LPS, 사이토카인 및 박테리아 독소 같은 특수한 자극제들에 노출되는 경우에만 발현되는 Type Ⅱ인 유도성 NOS(inducible NOS: iNOS)가 있다. 이러한 NOS들은 L-아르기닌을 L-시트룰린으로 전환 시키면서 NO를 형성시킨다. 이들 NOS 중 iNOS에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며 이는 병리적으로 중요한 작용을 한다.

일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다. LPS, 염증유발인자, 방사선조사 등의 외부 자극에 의해 iNOS의 발현이 유도되면 많은 양의 NO가 4~6시간 동안 계속적으로 생성되고, 이는 인체에 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 경우 LPS의 외부 자극에 의해 대식세포에서 많은 양의 iNOS mRNA 및 단백질이 발현되고 여기서 생성된 NO는 미생물 살균 작용 등을 수행한다.

그러나 필요 이상의 과다한 NO의 생성은 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서 iNOS 활성 억제제의 개발은 이러한 질병치료제로서의 개발 가능성이 높으며, 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 물질은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 이용될 수 있다. 또한, 시클로옥시게나아제 (cyclooxygenase, COX)도 2종류의 이소형태가 존재하는데, COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장 기능의 유지 등의 정상적 생체기능에 작용하는 것에 반하여, COX-2는 염증반응 시 세포 내에서 급격히 증가되어 염증 매개물질인 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)을 형성시켜 염증 반응을 일으키는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

NO와 PGE₂의 생성을 증가시키는 iNOS 및 COX-2 등의 염증 인자는 다양한 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 결장암을 포함하는 만성 질환의 병인에 관여한다. NF-kB는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서, 세포질에서는 I-kB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, 유해산소(Reactive oxygen), TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1(Interleukin-1)과 같은 케모카인(chemokines) 및 지질다당체 (lipopolysaccharide, LPS)와 같은 다양한 자극에 의해 I-kB 키나아제(IKK)가 활성화된 후 인산화 과정을 통해 I-kB가 떨어져 나가게 된다. p50과 p65의 헤테로다이머 (heterodimer)로 구성된 NF-kB는 활성화된 후, 핵으로 이동하여 염증 반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 현재까지 항염증 약물의 사용은 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용되기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 보다 체내에 안전한 새로운 치료제의 개발이 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련 지어 최근에는 민간에서 사용되는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 부작용에 대한 우려가 없으면서도 염증 작용의 효과적인 억제 효능을 가진 식물소재를 도출하기 위해 다양한 식물을 대상으로 하여 연구를 수행하였다.

이에 본 발명자들은 산머루 씨로부터 수득한 용매분획 추출물이 우수한 항염증 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 염증 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 산머루씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 염증 억제 효과를 나타내는 산머루 씨 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 산머루의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 산머루 씨 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출한 용매 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 헥산, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매추출물은 산머루 씨 분말에 아세톤을 첨가하여 수득한 아세톤 가용 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매추출물은 산머루 씨 분말에 아세톤을 첨가하여 수득한 아세톤 추출물에 물을 첨가하여 용해한 후, 다시 n-헥산으로 분획화하여 수득한 n-헥산 분획층 및 물 분획층 중에서 물 분획층일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항염증은 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

나아가 본 발명은 산머루 씨 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 산머루 씨 추출물 및 그의 유기용매 분획물은 독성이 없으며, 활성산소 종의 생성을 저해하고, NF-kB 단백질의 발현을 억제함으로서 우수한 염증 반응 억제 효과를 나타내는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 체내에 대한 부작용도 없기 때문에 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 약학적 용도로 사용할 수 있으며, 나아가 염증 증상을 개선할 수 있는 식품학적 용도로도 사용할 수 있다.

도 1은 산머루 씨로부터 추출물 및 그의 분획물을 분리하는 과정이다.
도 2는 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 세포독성 여부를 MTS 어세이를 통해 확인한 그래프이다
도 3는 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 ROS(Reactive oxygen species) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 효과, NF-kB 억제인자인 IκBa와 NF-kB의 헤테로다이머 중 하나인 p65 단백질의 인산화 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 산머루의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

머루는 포도과에 속하는 낙엽 성 덩굴식물로 동북아시아 지역, 중국 및 한국 북반구의 해발 100∼1300m에 분포한다. 열매는 술을 담그기 위하여 오래전부터 와인처럼 머루주를 만드는데 쓰였으며, 민간처방으로 머루 잎 추출물은 구토와 설사, 동상, 빈혈에 사용되었다. 머루는 과실형태로 판매되기 보다는 과실주 형태로 유통되고 있으며, 머루를 주재료로 하여 제조한 머루주는 포도주보다 산미가 강하고 안토시아닌과 페놀성분이 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 머루는 아직까지 주로 술의 형태로 사용되고 있어 보다 다양한 적용이 필요하다. 한편 본 발명에서는 산머루 특히 산머루 씨의 추출물이 염증을 효과적으로 억제 할 수 있는 활성이 있음을 최초로 규명하였다는데 그 특징이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 언급되는 머루는 산머루(Vitis coignetiae) 및 이와 동일한 과(genus)에 속하는 왕머루( Vitis amurensis), 섬머루(Vitisamurensis for. glabrescens), 까마귀머루(Vitis Thunbergii var. sinuata), 새머루(Vitis flexuosa)를 모두 포함한다. 특히 산머루는 칼슘, 인 철분 등의 성분이 일반 포도보다 10배 이상 많아 심장 질환 예방 효과가 높고 저혈압, 위암, 폐 질환 및 각종 피부 질환 등에 효과가 있어 한약재로 쓰일 정도로 효능이 있는 열매로 알려지고 있다. 또한 인체의 정화를 도와주어 여성은 미용에 좋고 남성은 혈기가 왕성하고 혈관계 질환 예방에 효과가 탁월하고, 피를 맑게 한다. 그리고 보라색을 내는 안토시아닌계 색소가 동맥에 침전물이 생기는 것을 방해함으로써 심장병과 뇌졸중을 막아준다고 알려져 있다.

하지만 아직까지 산머루 씨에 대한 연구는 극히 미비하여 산머루 씨의 약학적 효능에 대해서는 알려진 바 없고, 더욱이 산머루 씨 추출물의 항염증 작용기전은 알려진 바 없다. 이에 본 발명자들은 산머루 씨를 이용한 약제를 연구하던 중, 산머루 씨에서 추출한 추출물이 활성산소종의 형성을 저해하고, IκB와 NF-kB의 헤테로다이머(heterodimer) 중 하나인 p65의 활성 억제를 통해 NF-kB를 불활성 시킨다는 사실을 확인하고, 상기 산머루 씨 추출물이 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 규명하였다.

따라서 본 발명은 산머루 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 산머루 씨 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있다.

상기 추출을 위한 적절한 용매로는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 아세톤을 사용할 수 있다.

본 발명의 산머루 씨 추출물은 통상의 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열수 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 산머루 씨 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 산머루 씨 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 산머루 씨 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 우선 산머루 씨를 동결 건조하여 마쇄한 후, 산머루 씨 시료 중량의 약 2 내지 15배, 바람직하게는 약 5 내지 10배에 달하는 부피의 물, 아세톤 또는 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜을 사용할 수 있다. 바람직하게는 70 내지 100%의 아세톤으로 실온에서 약 1시간 내지 1일 정도 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등으로 추출한 후, 감압여과 및 농축을 하여 제조할 수 있다. 또한 상기 추출방법은 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복하여 추출한 후 감압 농축할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물은 상기 기술된 용매를 단독으로 사용하여 수득할 수 있으며, 또는 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 각 용매 추출 분획을 수득할 수 있다. 이러한 과정은 추출물이 가지고 있는 약리효과를 최대로 나타내는 분획물(fraction)을 찾아내게 하는바, 필요 없는 물질 또는 약리효과가 없는 분획물을 분획화 과정을 통해 제거할 수 있고, 약리 효과를 나타내는 활성물질이 최대로 농축된 추출물 상태를 만들 수 있게 한다. 이러한 분획화 과정을 통해 천연식물의 추출물은 약학적 조성물 및 건강기능식품의 소재로서의 활용도를 높일 수 있게 된다.

이에 본 발명의 일실시예에서는, 산머루(Vitis amurensis) 씨를 통풍이 잘 되는 곳에서 음건하여 분쇄기로 갈아 분말로 제조한 후, 상기 분말 500g에 70% 아세톤을 가해 상온에서 24시간 동안 침지하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 그런 다음 얻어진 여액을 40℃에서 증류 농축시켜 70% 아세톤 추출물을 수득하였다. 이후 상기 아세톤 추출물에 다시 물을 가해 용해시킨 후, n-헥산을 상기 첨가한 물과 동량으로 첨가하여 분액깔때기에서 n-헥산(0.8897g) 가용성 분획물과 물 층에 있는 물 분획물(70% 아세톤 분획물)로 분리시켰다. 그 중 물 분획물 20g에 50% 메탄올(MeOH)과 66% 아세톤(acetone), 100% 아세톤(acetone)을 용매로 하여 각각 토요펄(Toyopearl) HW-40F(Tosoh, Tokyo, Japan) 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 6개의 서브 분획물(subfraction)을 각각 획득하였다. 상기 칼럼 크로마토그래피는 일반적인 지름 3cm, 길이 30 cm의 칼럼과 지름 15cm, 길이 10cm의 칼럼 두 가지를 이용하였으며 이는 전통적인 분석을 위한 칼럼 크로마토그래피의 결과와 차후 대량추출시의 결과를 예측해 보기 위한 방편으로 수행되었다. 추출용매는 동일한 용매를 사용하였고 두 가지 방법으로 분리한 각 fraction에 대해 TLC 분석 및 항염증활성을 비교 실험하였다. 상기 일실시예에 따른 산머루 씨 추출물과 각 분획물 제조과정은 도 1에 나타내었다.

한편, 상기와 같이 본 발명에 따라 산머루 씨로부터 물 및 유기용매처리에 의해 수득한 산머루 씨 추출물은 항염증 활성을 갖는 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 본 발명의 방법에 의해 수득한 산머루씨 추출물이 염증작용을 저하시킬 수 있는 효과가 있는지 확인하기 위해 RAW264.7 세포를 대상으로 산머루 씨 추출물을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군의 활성산소종(ROS), iNOS(inducible nitric oxide synthetase)와 COX-2 단백질 발현 및 p65과 IkBa(NF-kB의 억제제인 IkB를 구성하는 한 요소)의 인산화 작용에 대한 억제 활성을 측정한 결과, 전체적으로 산머루 씨로부터 수득한 분획물들이 항염증 능력이 있는 것으로 나타났다.

다양한 생화학적 자극에 의해 생성되는 활성산소종(ROS)은 지질과산화 및 세포막 손상 등을 통해 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명의 일실시예에서는 과산화수소로 활성산소종의 과다 생성 환경을 조성하여 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 활성산소종 형성 억제 효과를 살펴보았는데, 그 결과 산머루 씨의 분획물은 과산화수소 첨가로 인해 발생한 활성산소종의 발생을 억제하는 효과를 보였다(도 3 참조).

염증반응을 매개하는 것으로 널리 알려진 산화질소(NO)의 경우 또한, LPS로 산화질소의 과다 생성 환경을 조성하여 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 산화질소 형성 억제 효과를 살펴본 결과, 우수한 NO 생성 억제 활성을 나타내었다(도 4 참조).

염증반응을 유발하는 또 다른 인자로써, NO를 형성하는 것으로 알려진 효소iNOS와 염증매개물질인 PGE₂를 형성하는 것으로 잘 알려진 효소 COX-2를 염증반응 억제활성을 확인하기 위한 표지로서 이용하여, LPS로 상기 단백질들이 과다 생성되는 환경을 조성한 후, 산머루 씨 추출물과 그 분획물들을 첨가하여 이들의 억제활성을 살펴본 결과, 우수한 상기 효소들의 억제활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 일실시예에서는, 염증반응을 유도하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 알려진 NF-kB(nuclear factor kappa B)의 억제활성을 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 항염증 활성을 확인하기 위한 표지로 이용하였는바, 구체적으로 NF-kB의 억제인자인 IkB와 NF-kB의 헤테로다이머 중 하나로 NF-kB가 활성화될 경우 핵 내로 이동하여 유전자의 전사를 활성화시키는 p65 단백질을 항염증 효과 지표로 이용하였다. 왜냐하면 IkB가 인산화 되는 경우 NF-kB에서 떨어져나가 NF-kB를 활성화시키게 되고, NF-kB를 이루는 P65 또한 인산화 과정을 통해 활성화되어 핵 내로 들어가게 되기 때문이다.

따라서 본 발명자들은 산머루 씨 추출물과 그 분획물이 p-IkB(인산화된 IkB)와 p-p65(인산화된 p65)의 형성을 얼마나 효과적으로 억제할 수 있는지 확인하였다. 그리하여 본 발명의 일실시예에서는 LPS로 RAW264.7 세포를 자극한 후 본 발명의 추출물들을 첨가한 결과, IkB를 구성하는 IkBa, IkBb 및 IkBe 중 IkBa 및 p65 단백질의 인산화 억제 활성을 통해 산머루 씨 추출물이 결과적으로 NF-kB를 불활성화 시켜 염증 작용을 억제한다는 사실을 알 수 있었다(도 5 참조).

즉, 본 발명에 따른 산머루 씨 분말의 추출물은 항염 활성이 우수하다는 특징이 있다. 염증은 앞서 기술한 바와 같이 LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극이 인체 면역체계를 과도하게 항진시킬 경우, 대식세포와 같은 면역세포에서 프로스타글란딘(prostagladin) 및 산화질소(nitric oxide, NO) 등과 같은 염증유발물질을 과도하게 유도하여 유발되는 것으로 알려져 있는바, 상기 결과에서와 같이 산머루 씨 추출물은 염증유발물질의 발현양을 직접 혹은 간접적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다(실시예 3 내지 5 참조).

따라서 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물은 여러 염증유발 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 특징이 있으므로 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 염증 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염을 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명은 산머루씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 산머루 씨 추출물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 항염증 조성물은 약학적으로 유효한 양의 산머루 씨 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 염증질환 또는 암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 항염증 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항염증 조성물은 염증질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 산머루씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 항염증 조성물은 상기 우수한 항염증 효과를 통해 염증질환을 완화시키는 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다(실시예 2 참조).

따라서 본 발명의 항염증 조성물은 염증질환의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 항염증 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 “음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 염증질환의 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 항염증 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1>

하기 본 발명의 실시예에서 사용한 세포배양 조건, 시약 및 통계처리 방법은 다음에 기재된 바와 같이 수행하였다.

세포배양 및 시약

쥐의 대식세포주(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였으며, 상기 세포주는 10% FBS, 100㎍/ml 페니실린 및 100단위/ml 스트렙토마이신이 함유된DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. DMEM 배양액, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 하이클론 테크놀로지사 (Logan, UT)에서 구입하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5(3-카복시메토자이페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxy

methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, MTS)은 프로메가사(Promega Corporation, Madison,USA)에서, 디메틸 술폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 및 대장균(E.coli) 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccaride,LPS)는 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., MO, U.S.A)에서 구입하였다. COX-2, iNOS 및 퍼옥시다제 접합성 이차항체 (peroxidase conjugated secondary antibody)는 산타크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, CA, U.S.A)에서 구입하였으며, NF-kB p65 항체는 셀시그날링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)에서 구입하였다. 화학적 발광작용(Chemiluminescent)을 위한 기질의 슈퍼시그널(supersignal)은 피얼스사 (Pierce, Rockford, IL, U.S.A)에서 구입하였다.

통계처리

본 발명의 실시예에서 수행한 실험들의 분석결과는 평균±표준오차(S.E)로 표시하였고, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지(pachage)의 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 이용하여 듀칸의 멀티플 테스트(Duncan's multiple test)로 분석하였다.

< 실시예 1>

산머루 씨 추출물 및 분획물의 제조

산머루(Vitis amurensis) 씨를 통풍이 잘 되는 곳에서 음건하여 분쇄기로 갈아 분말로 만들었다. 분말 500 g을 70% 아세톤(acetone)에 24시간 동안 침지하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 그 여액을 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 40℃에서 농축하여 70% 아세톤 추출물을 얻었다. 70% 아세톤 추출물은 물에 녹인 후 n-헥산(Hexane)을 동량 첨가하여 분액깔때기에서 n-헥산(0.8897g) 가용성 분획물을 나누었으며, 물 층에 있는 분획물은 70% 아세톤 분획물로, 두 층 사이의 불용성층을 인터페이스(interface) 분획물로 구분하였다. 산머루 씨의 상기 70% 아세톤 추출물(물 분획물) 20g과 50% 메탄올(MeOH)과 66% 아세톤, 100% 아세톤을 용매로 하여 각각 토요펄(Toyopearl) HW-40F(Tosoh, Tokyo, Japan) 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 6개 서브 프랙션(subfraction)을 각각 얻었다(도 1 참조).

상기 칼럼 크로마토그래피는 일반적인 지름 3cm, 길이 30 cm의 칼럼과 지름 15cm, 길이 10cm의 칼럼 두 가지를 이용하였으며 이는 전통적인 분석을 위한 칼럼 크로마토그래피의 결과와 차후 대량추출시의 결과를 예측해 보기 위한 방편으로 수행되었다. 추출용매는 동일한 용매를 사용하였고 두 가지 방법으로 분리한 각 분획물에 대해 TLC 분석 및 항염증활성을 비교 실험하였다.

< 실시예 2>

본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 MTS 법 어세이를 통한 세포독성 검사

산머루 씨 추출물의 농도에 따른 RAW 264.7 세포에 대한 증식 억제 효과를 MTS[3-(4,5-dimethlylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] 어세이(assay)를 이용하여 조사하였다. 세포는 6-웰 플레이트에서 24시간 배양하여 각각 다른 농도로 샘플을 투여하고 72시간 동안 배양한 뒤, 세포 증식 어세이 키트(CellTiter 96 Aqueous nonradioactive cell proliferation assay kit)(Promega Corp.)를 이용하여 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물을 처리한 후 세포 생존능력(cell viability)을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 560nm의 흡광도로 측정한 결과, 산머루 씨 추출물의 모든 분획물에서 세포독성이 나타나지 않았다(도 2 참조).

< 실험예 3>

본 발명에 따른 산머루씨 추출물의 활성산소종 ( ROS ) 억제효과 측정

활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 생성 억제 효과를 평가하기 위해 형광 프로브 DCF-DA(dihydrodichloro fluoresceindiacetate)를 사용하였다. 96-웰 세포 배양판을 RAW264.7 세포에 부착시키고 20μM DCF-DA(DMSO에 녹임)를 처리하여 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, PBST(phosphate buffered saline+0.1% tween)로 세척하고, 산머루 씨 추출물의 분획물들을 처리한 다음, 1시간 배양하고 H₂O₂(Hydrogen peroxide, 1mM)를 처리하여 12시간동안 배양하였다. 배양 후에는 배지를 제거하고 생성된 ROS는 형광 멀티-디텍션 리더(fluorescence multi-detection reader)(Synergy HT™)의 마이크로플레이트 리더에서 485/528nm로 측정했다.

RAW264.7 세포주에서 산머루 씨 분획물이 ROS생성에 미치는 영향을 확인한 결과, 모든 분획물에서 유의적인 ROS 생성 억제 효과를 보였다(도 3 참조).

< 실시예 4>

본 발명에 따른 산머루씨 추출물의 산화질소( NO ) 억제 효과 분석

상기 실시예 1에서 얻은 산머루 씨 추출물의 산화질소 억제 효과를 측정하기 위하여, 쥐 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포에서 산화질소의 생성량을 측정하였다.

산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성 평가는 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵ cells/mL로 조절한 후, 24-웰 플레이트에 부착하고, 추출물 시료처리하고 2시간 후에 리포폴리사카라이드(LPS)(1μg/mL)를 처리하여 12시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스(Griess) 시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100μL와 그리스 시약 100μL를 혼합하여 96-웰 플레이트 에서 10분 동안 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 아질산나트륨(NaNO₂)을 기준으로 비교하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 산머루 씨 추출물의 모든 분획물에서 유의적인 산화질소의 생성 억제 활성을 보였다(도 4 참조).

< 실시예 5>

본 발명에 따른 산머루씨 추출물의 iNOS , COX -2 단백질 발현 및 p65 와 IκB의 인산화 억제 효과 측정

산머루 씨 추출물에 의한 iNOS 및 COX-2 단백질 발현과 p65및 IκB 인산화(phosphorylation)와의 상관성을 알아보기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot)으로 단백질의 발현을 조사하였다.

<5-1> 생성된 전체 단백질의 분리

세포로부터 단백질을 분리하는 과정으로 세포 배양판(cell culture plate)으로부터 배양액을 제거하고, 얼음으로 차갑게 만든 PBS로 2회 세척하였다. 플레이트를 얼음 위에 올려놓은 채 세포 용출 버퍼(cell lysis buffer)(50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 0.02% sodium acide, 0.1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholase, 1mM PMSF)를 넣어주고 세포 스크래퍼(scraper)로 긁어주어 세포를 수집하였다. 이를 얼음 상태에서 1시간 방치한 후 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액 만을 모아 새 튜브로 옮겼다. 단백질 정량은 BCA 단백질 어세이 방법으로 측정하였다.

<5-2> 전기영동

일정한 양의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electophoresis)로 분리한 다음, PVDF(polyvinylidene fluoride membrane)로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼(Transfer)가 완료된 PVDF 막을 5% 탈지분유(non-fat dry milk)를 함유한 PBST로 비특이적 단백질을 차단하기 위하여 한 시간 정도 반응시켰다. 계속하여 iNOS, COX-2, p65와 IκBα에 대한 항체와 하룻밤 반응시킨 후, 각 항체에 대한 이차항체(secondary antibody)인 항-토끼 IgG와 함께 1시간동안 반응시켰다. 각 반응 사이 PBST로 5분씩 5번 세척하였다. 마지막 세척이 끝나면 각 항체에 대한 대응 단백질 밴드는 슈퍼시그날 웨스트 피코(Supersignal west pico) 화학발광(chemiluminescent) 기질(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 발현을 확인하였다.

실험결과, 대조군으로서 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서는 iNOS와 COX-2 단백질, 인산화 된 p65와 IκB 단백질은 그 양이 뚜렷하게 증가하였으나, 산머루 씨 추출물의 여러 분획물을 첨가한 실험군에서는 iNOS, COX-2 단백질 발현 및 인산화 된 p65와 IκB 단백질의 발현이 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 특히 F5의 분획물에서 그 정도가 확연히 감소함을 알 수 있었다(도 5 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

1. 산머루 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 산머루 씨 추출물은 산머루의 씨 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출한 용매추출물인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 헥산, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 용매 추출물은 산머루 씨 분말에 아세톤을 첨가하여 수득한 아세톤 추출물에 물을 첨가하여 용해한 후, 다시 n-헥산으로 분획화하여 수득한 n-헥산 분획층 및 물 분획층 중에서 물 분획층인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
5. 산머루 씨 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품.

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