KR100749941B1

KR100749941B1 - 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물과 건강 식품

Info

Publication number: KR100749941B1
Application number: KR1020050076894A
Authority: KR
Inventors: 박헌주; 배인경; 이상국; 손흥수
Original assignee: 롯데쇼핑주식회사
Priority date: 2005-08-22
Filing date: 2005-08-22
Publication date: 2007-08-21
Also published as: KR20070022907A

Abstract

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물과 건강 식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추냉이 추출물의 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase) 활성 유도물질로서의 작용을 확인함으로써 이를 암 예방 및 치료용 조성물에 적용할 수 있고, 이러한 효과를 가진 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 등의 각종 식품에 함께 배합하여 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있도록 한 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물과 건강 식품에 관한 것이다.

고추냉이 추출물, 퀴논 리덕타아제, 암 예방

Description

고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물과 건강 식품{Composition and food of liver cancer chemoprevention with extracts of Wasabia japonica}

도 1은 생쥐의 간세포 (mouse, hepatoma cell : Hepa 1c1c7 cell)를 이용하여 고추냉이 추출물 10 ∼ 100 ㎍/ml 농도에서 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase) 활성 유도효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 고추냉이 추출물이 퀴논 리덕타아제 mRNA 발현을 유도하는 효과를 나타내는 그림이다.

암은 우리나라 사람의 사망원인 중 하나로 발병사실을 알고 난 뒤 1년 이내에 사망하는 경우가 전체의 51.1 %이며, 치료 실적은 꾸준하게 향상되어 왔으나, 의학자들은 20 세기 말까지 완치율이 50 %를 넘지 못할 것이라고 보고 있고, 해마다 세계적으로 8 백만 명의 환자가 발생되고 있으며, 이 중 5 백만 명이 죽는 인류 최악의 병이다.

이러한 암의 유발인자인 발암물질로는 음식물, 흡연, 자외선, 화학물질, 기타 환경인자들이 있으며, 인간은 자의 또는 타의에 의하여 이러한 발암물질에 노출될 수밖에 없는 것이 현실이다.

따라서, 암 예방물질의 개발이 절실히 요구되고 있는데, 이러한 암 예방물질의 개발은 암 뿐만 아니라, 모든 질병을 억제하거나 치료하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이런 이유로, 암 예방물질의 개발이 암 연구의 새로운 방향으로 인식되고 관심이 집중됨에 따라, 암 예방물질 소재의 개발이 실제 의약분야 뿐만 아니라, 식품 화학분야에서도 활발하여 천연물 소재들에 대한 연구가 적극적으로 이루어지고 있는 실정이며, 또한 식품분야에도 실제 도입되어 오고 있다.

그 결과, 미생물이나 동물세포 등을 이용한 많은 분석계가 확립되어 새로운 암 예방물질의 탐색연구에 활용되고 있으며, 활성성분의 순수분리 및 작용기작의 분자 생물학적 연구 또한 활발히 진행되고 있다.

특히, 제 2 상계(Phase II) 무독화 효소는 각종 암세포에 대한 특이적인 세포독성을 나타내어 항암기능을 갖는 등의 발암 물질, 변이원성 물질, 활성산소종에 의한 DNA에 손상으로부터의 보호작용을 갖는다고 알려져 있다.

이러한 제 2 상계 (Phase II) 무독화 효소로는 글루타치온 설퍼 트란스퍼라제(glutathione sulfur transferase, GST), NAD(P)H : 퀴논 리덕타아제(quinone reductase, QR), 에폭사이드 하이드로라제(epoxide hydrolase), 글루쿠로노실 트란스퍼라아제(glucuronosyltransferase), 알데하이드 리덕타아제(aldehyde reductase) 등이 있다.

상기 제 2 상계(Phase II) 무독화 효소 중에서, 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase, E.C. 1.6.99.2)는 돌연변이 또는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호작용을 차단하는 효소이며, NAD(P)H를 이용하여 퀴논(Quinone)류의 환원을 촉매하는 플라보프로테인(flavoprotein)이다. 이러한 퀴논 리덕타아제는 분자량 54,000 달톤(daltons)이고, 동일한 구조의 모노머가 2개 결합된 호모 다이머(homodimer)로 각각의 모노머는 273개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 활성부위에는 플라빈 아데닌 디누클레오타이드(flavin adenine dinucleotide, FAD)를 함유하고 있는 플라보프로테인(flavoprotein)으로, 일명 메나디온 리덕타아제(menadione reductase), 비타민 K 리덕타아제(vitamin K reductase), DT-다이아포라아제(DT-diaphorase)로 명명된다.

상기와 같은 퀴논 리덕타아제는 다음과 같은 여러 가지 특징들을 갖고 있다. 첫째, NAD(P)H를 전자 공여체로 이용하고, 둘째, 2개의 전자를 이동시켜 세미퀴논(semiqquinone)을 형성하지 않으며, 셋째, 디쿠마롤(dicoumarol)과 같은 항혈액응고제에 의해 강한 저해를 받으며, 넷째, 많은 세포와 조직에서 여러 가지 외부물질들에 의해 유도되는 것이다.

특히 이러한 퀴논 리덕타아제는 퀴논(quinone)류 자체에 대한 보호효과가 있음은 물론, 다른 암 예방 효소계와 공통적으로 유도되며 항암작용이 있는 많은 화합물에 의해 유도되는 특징으로 인하여 제 2 상계(Phase II) 무독화효소 중 암 예방 물질 탐색의 지표가 되는 대표적인 효소로 선정될 수 있는 것이다[Lind, C., Vady, H. and Ernster, L. 1978, Arch. Biochem. Biophys. 190: 97-108; Wefers, H., Komai, T., Talalay, P. and Sies, H. 1984. FEBS Lett. 169: 63-66].

한편 퀴논 리덕타아제의 측정을 보다 신속, 간단하고 정확하게 하기 위해 여러 종류의 동물세포를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 생쥐의 간세포주(Hepa 1c1c7 murine hepatoma cell line)를 도입하였다.

이러한 세포주에 의해 퀴논 리덕타아제 유도활성이 나타나는 물질들로는 페놀(phenol)성 항산화물질, 친유성 아조(azo) 염색류, 황화합물 등이 있다. 이 중에서도 십자화과 식물(브로콜리, 양배추, 케일, 콜리플라워 등), 릴리아세(liliaceae)과 식물(양파, 마늘)과 바시니움(Vaccinium)속 식물에서 퀴논 리덕타아제 유도활성이 강하게 나타난다고 보고되어 있다.

상기한 것들 중에서도 특히, 현재까지 밝혀진 것 중 가장 활발한 연구가 진행중이며 강력한 유도제로는 브로콜리의 활성물질인 설포라판(sulforaphane)으로 이소티오시아네이트(isothiocyanate)의 일종이며, 유도기작 등 많은 연구가 되어있는 실정이다[Gerhauser, C., You, M., Liu, J., Moroarty, R.M., Hawthorne, M., Mehts, R.G., Moon, R.C. and Pezzuto, J.M. 1997. Cancer Res. 57:272-278; Posner, G.H., Cho, C.G., Green, G.V., Zhang, Y. and Talalay, P. 1994, J. Med. Chem. 37:170-176].

한편, 고추냉이[와사비아 자포니카(Wasabia japonica, W. koreana), 재팬 호오스래디쉬(Japanese horseradish)]는 십자화과에 속하는 식물로 일본산 고추냉이 [와사비아 자포니카(Wasabia japonica)]와 서양산 고추냉이[고추냉이무, 호오스래디쉬(Horseradish), 코코레리아 아모라시아(Cocholearia armoracia L.)]로 분류된다.

우리나라 울릉도 및 일본의 산과 계곡에 야생 또는 재배하는 다년생 초본으로 높이 30 cm 내외이고, 근경은 비후하며, 근생엽은 여러 겹으로 모여 나며 호생한다. 엽신은 심장형이고, 거치가 있으며 꽃은 5 ∼ 6 월에 줄기 끝에 백색의 십자화가 정생 또는 총생화서로 피고, 과실은 각과로 끝에 부리모양의 돌기가 있다. 생약으로는 근경을 사용하며 산규근[와사비애 리조마(Wasabiae Rhizoma)]이라 한다. 주요 성분으로는 근경에 시니그린(sinigrin), 아릴이소티오시아네이트(allylisothiocyanate), 부틸이소티오시아네이트(butylisothiocyanate) 등이 함유되어 있다.

상기 식물은 뿌리에 상처를 내거나 껍질을 벗기면 독특한 냄새와 매운맛을 나타내는데, 이러한 향미 때문에 서유럽에서는 적당히 가공하여 식욕증진이나 소화 촉진 식품으로 사용하여 왔다.

상기한 톡특한 향미의 주요성분은 고추냉이 정유의 주요 휘발성 성분인 아릴이소티오시아네이트로 밝혀졌다. 이러한 아릴이소티오시아네이트는 식물 내에 처음부터 존재하는 것이 아니라, 조직에 들어있는 티오글루코사이드의 일종인 시니그린이 불활성인 상태로 존재하다가 일단 조직을 절단하거나 상처를 입히면 조직 중에 들어있는 효소로서 미로설파타아제(myrosulfatase)와 티오글루코시다아제(thioglucosidase)의 복합효소인 미로시나제(myrosinase)의 작용으로 상기 시니그린이 가수분해되면서 글루코오즈와 황산수소 칼륨 및 아릴이소티오시아네이트가 생성된다.

아릴이소티오시아네이트는 맛과 향으로 인한 식욕 및 소화 촉진 작용 외에도 항균작용 등에 대한 보고가 있으며, 최근 향신료를 이용한 연구동향으로는 식품첨가물 뿐만 아니라 화장품 업계, 아로마 테라피(aroma therapy) 등 보다 넓은 영역에서 연구가 시도되어지고 있다.

예전부터, 고추냉이는 근경을 식욕증진, 신미건위, 방부, 살균에 사용하여 왔는데, 특히 일본에서는 민간에서 생선 및 조류고기의 중독에 즙을 내어 사용하고 있다.

한편, 고추냉이(와사비) 김치 제조방법이 개시되어 있고[한국특허등록 제10-0483249호], 고추냉이 저장용 그릇이 공지되어 있으며[한국실용신안등록 제20-0356802호], 양고추냉이로부터 추출한 양고추냉이 정유를 활성성분으로 함유하는 저장물 해충 방제제가 개시되어 있다[한국특허등록 제10-0391827호].

그러나, 상기 기술은 아직 범용화되지 못하고 있는 실정이며, 고추냉이를 이용한 대부분의 연구는 고추냉이 추출물의 항균효과, 고추냉이 근경의 아릴이소티오시아네이트 함량 또는 그 성분에 관한 연구가 대부분이다.

또한, 오늘날 암 예방 효능을 나타내는 천연물질에 대한 많은 연구에도 불구하고, 본 발명에서 나타낸 바와 같이 고추냉이 추출물이 암 예방효과를 갖는다는 것에 관한 연구는 국내외에 발표된 사례가 없다.

이에, 본 발명의 발명자들은 고추냉이 추출물이 기존의 퀴논 리덕타아제의 활성 유도물질들과 비교해서 보다 높거나 동등한 정도의 퀴논 리덕타아제(Quinone reductase)의 활성을 유도하여 탁월한 암 예방효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래에 고추냉이는 향신료로서 식욕증진, 신미건위, 방부, 살균 등에 제한적으로 사용하던 기존의 방법을 탈피하여 고추냉이 자체가 지니고 있는 다양한 생리적 활성을 살릴 뿐만 아니라, 퀴논 리덕타아제의 활성을 유도하여 암 예방 및 치료효과를 가지는 조성물로서 사용하고, 또한 다양한 음식물에 첨가 배합함으로써 간단하게 상용할 수 있도록 한 고추냉이 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물을 특징으로 한다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 건강 식품을 포함한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 고추냉이 추출물의 퀴논 리덕타아제 활성 유도물질로서의 작용을 확인함으로써 이를 암 예방 및 치료용 조성물에 적용할 수 있고, 이러한 효과를 가진 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 등의 각종 식품에 함께 배합하여 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있도록 한 고추냉이 추출물을 포함하는 간암 예방용 조성물과 건강 식품에 관한 것이다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 퀴논 리덕타아제의 활성 유도물질로 사용하여 암 예방 및 치료 효과를 가진 조성물로 사용하고 이를 식품에 적용하고자 하는 고추냉이 추출물의 새로운 용도에 관한 것이다.

본 발명의 고추냉이 추출물로는 일본산 고추냉이 및 국내산 고추냉이를 사용 가능하며, 물, 탄소수 1 ∼ 6 의 저급알코올, 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 추출한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 국내산 고추냉이를 사용하여 그 효능을 측정하였으며, 고추냉이를 용매로 에탄올을 사용하고, 초음파를 조사하여 추출하는 방법을 사용한다. 즉, 본 발명에서 고추냉이 추출물을 얻는 방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같 다.

먼저 시료인 고추냉이의 근경을 액체 질소로 순간 동결하여 분쇄기로 분말로 만든 후 에탄올을 넣고 초음파로 20 ∼ 40분 동안 2 ∼ 3회 반복 추출한 다음, 도요여지(Toyo filter) No.2로 여액을 얻어 감압농축기(Rotary vacuum evaporator)로 45 ∼ 55 ℃에서 감압농축시키고 농축물은 동결건조하여 연두색의 고추냉이 건조분말을 얻고, 이를 -70 ℃의 온도에서 보관하는 방법을 사용하였다.

상기와 같은 제조방법으로 제조된 고추냉이 추출물에 대하여 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정한 결과, 암 예방 효과가 우수함을 확인하고, 이를 츄잉검, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료, 초콜렛 등에 적용할 수 있는 바, 이렇게 음식물에 함께 배합함으로써, 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 것이다.

본 발명에서와 같이, 고추냉이 추출물을 음식물에 적용하는 경우에는 전체 조성물에 대하여 고추냉이 추출물을 필수적으로 0.1 ∼ 1.0 중량% 함유하도록 사용하는 것이 바람직하다. 만일 그 함량을 0.1 중량% 미만으로 하면 본 발명이 목적으로하는 효과를 얻을 수 없어 바람직하지 않고, 반면에 상기 범위를 초과하여 과량으로 첨가하면, 비경제적이면서 완성제품의 맛, 색깔에 영향을 미칠 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 고추냉이 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적 용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 고추냉이 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 고추냉이 추출물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 ∼ 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 ∼ 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ∼ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3 회 분할투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 고추냉이 추출물을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다. 상기 식품은 고추냉이 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식 품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하겠는 바 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

참고예 : 동물세포주 배양 및 실험동물 사육

본 발명에 사용된 동물세포주인 생쥐(mouse)유래의 간세포(Hepa 1c1c7 cell line)는 미국의 분양기관(The American Type Culture Collection, ATCC CRL 2026)으로부터 구입하였으며, 2 mM 글루타민(glutamine), 100 U/㎖ 페니실린 G(penicillin G), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 10% 피탈 보바인 시럼(fetal bovine serum)등을 포함하는 알파-엠이엠(α-MEM, minimum essential medium alpha modification) 배지를 첨가하여 37 ℃의 5% CO₂/95% air 환경의 CO₂ 배양기(incubator)내에서 계대배양하면서 실험에 이용하였다.

한편, 실험동물은 체중 85g 내외의 3주령 스프로그-돌리(Sprague-Dawley)계 흰쥐 암컷을 국립보건원의 동물사육실로부터 분양 받아 사용하였다. 동물사육 환경은 12시간 간격의 인공조명(오전 8시 ∼ 오후 8시), 조도 300 ∼ 500 lux, 온도 23± 1 ℃, 배기 10 ∼ 18 회/h 의 조건으로 유지하였으며, 고형사료(삼양사료)와 식 수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

제조예 : 고추냉이 추출물의 분리

본 발명에서 사용한 공시재료[일본산 고추냉이, Wasabia japonica]를 강원도 철원군에 소재한 재배 농가로부터 구입하여 세척 건조하고, 대략 2 × 2 × 2(가로× 세로× 두께, cm) 크기로 절단하여 액체질소로 급속동결 후 즉시 분쇄기로 분쇄한 분말상의 고추냉이를 사용하였으며, 추출용 용매인 에탄올은 1급 시약을 사용하였고, 나머지 기타 시약은 미국 시그마(Sigma), 프로메가(Promega), 퀴아젠(Qiagen) 제품 및 특급시약을 이용하였다.

즉, 시료인 고추냉이 분말 500 g에 에탄올 5 L를 넣고 초음파로 30 분간 3회 반복 추출한 다음, 도요여지(Toyo filter) No.2 로 여액을 얻어 감압농축기 (Rotary vacuum evaporator)로 50 ℃에서 감압농축시키고, 농축물은 동결 건조하여 연두색의 고추냉이 건조분말을 얻었다. 이후 시료를 -70 ℃에서 보관하면서 사용하였다.

실험예 1 : 생쥐의 간세포를 이용한 고추냉이 추출물의 퀴논 리덕타아제 유도활성 측정

퀴논 리덕타아제(Quinone reductase, E.C. 1.6.99.2) 활성저해 측정은 프로카스카[Prochaska H.J. and Santamaria A.B. 1988. Anal. Biochem. 169:: 328∼336, 1988]등이 제시한 방법을 일부 변형하여 측정하였다.

우선, 24 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 동일한 수(1.0 × 10⁴ cells/ml)의 생쥐의 간세포(Hepa 1c1c7 cells)를 분주하고, 24 시간 전 배양한 다음에 상기 제조예를 통해 얻어진 고추냉이 추출물을 첨가한 후, 다시 24 시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하였다. 그 다음에, 각 웰에 250 ㎕의 라이시스 완충액[lysis buffer(10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 140 mM NaCl; 15 mM MgCl₂; 0.5% NP-40)]을 첨가한 후, 25 ℃의 온도조건하에서 10 분간 서서히 흔들어주면서 세포를 용해시켰다. 여기에, 1 ml의 효소용액을 첨가하여, 5 분간 반응시킨후, 250 ㎕의 반응정지 용액[0.3 mM 디쿠마롤(dicoumarol); 0.5% 피리딘(pyridine); 5 mM 포타슘 포스페이트(potassium phosphate, pH 7.4)]로 효소반응을 정지시킨 다음, 610 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

또한 단백질량은 동일한 세트(set)의 웰 플레이트(well plate)에 대한 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색방법으로 정량하였다. 이때, 상기 효소용액은 반응액의 최종농도가 10 mM인 트리스 완충액(Tris-Cl, pH 7.4), 0.5 mg/ml 보바인 시럼 알부민(BSA), 0.008 % 트윈-20(Tween-20), 40 μM 플라빈 아데닌 디누클레오타이드(FAD), 0.8 mM 글루코즈 6-포스페이트(glucose 6-phosphate), 2 U/ml 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose 6-phosphate dehydrogenase), 25 μM 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오타이드(NA에), 40 ㎍/ml 의 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazo-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)] 및 1 mM 메나디온(menadione)이 함께 함유되어 있는 것을 사용하였다.

다음 수학식 1을 사용하여 퀴논 리덕타아제 활성도를 계산하였고, 그 결과를 첨부도면 도 1에 나타내었다.

첨부도면 도 1에 의하면, 연두색 고추냉이 추출물을 10, 25, 50, 100 ㎍/ml 농도로 생쥐의 간세포(Hepa 1c1c7 cell)에 처리한 다음, 퀴논 리덕타아제의 유도활성을 살펴본 결과, 고추냉이 추출물의 농도가 증가함에 따라 퀴논 리덕타아제의 유도활성이 농도 의존적으로 증가하였고, 100 ㎍/ml 농도에서는 고추냉이 추출물을 사용하지 않은 대조구에 비해 2.33배 증가하였음을 확인할 수 있다.

상기한 결과는 기존에 퀴논 리덕타아제의 유도활성이 있다고 알려져 있는 베타-나프토플라본[β-naphthoflavone, BNF] 2 μM과 거의 유사한 퀴논 리덕타아제의 유도활성을 나타냄을 확인할 수 있었고, 고추냉이의 주요한 성분으로 알려진 아릴 이소티오시아네이트 10 μM이 퀴논 리덕타아제의 유도활성을 1.85 배 증가시킨 것을 감안할 경우, 본 발명의 고추냉이 추출물은 상당히 높은 유도활성을 가짐을 확인할 수 있다.

실험예 2 : 스프로그 도올리계 쥐를 이용한 퀴논 리덕타아제의 저해활성 측정

스프로그-도올리(Sprague-Dawley)계 쥐(rat)에게 황금 추출물을 정상군을 포 함하여 총 5군으로 나누어 시험하되, 투여량을 각각 0, 200, 500, 1000 ㎎/㎏로하여 2주간에 걸쳐서 경구투여하였다. 그리고, 쥐의 간을 취하여 호모게나이징 완충액[homogenizing buffer(0.25 M sucrose, pH 7.4)]로 균질화한 후, 9,000 x g에서 20분간 원심분리(4 ℃)하여 상등액을 취하고 다시 100,000 x g에서 1시간 동안 초원심분리(4℃)하여 얻은 상등액을 퀴논 리덕타아제(quinone reductase) 유도효과의 측정에 이용하였다. 그리고, 상기 실험예 1과 동일한 방법을 사용하여 퀴논 리덕타제 활성도를 측정했을때 생쥐의 간세포(Hepa 1c1c7 cell)에서와 동일하게 고추냉이 추출물에 의하여 퀴논 리덕타제 활성이 증가되었다.

이는 생쥐의 간세포계(Hepa 1c1c7 cell culture system)에서 뿐만 아니라, 생체계(in vivo system)에서도 고추냉이 추출물에 의해 퀴논 리덕타아제 (quinone reductase)의 활성이 유도되고 있음을 나타내고 있다.

또한, 2주간 경구투여 후 체중을 측정한 결과, 정상군과 고추냉이 추출물 투여군과의 특이할 만한 차이를 관찰할 수 없었으며, 최종 도살시에 실시된 주요 장기의 육안관찰에서도 고추냉이 추출물은 정상군에 비해 변화를 유발시키지 못하였다.

그리고, 간독성의 지표인 혈중 글루타믹 파이루빅 트란스아미나아제[glutamic pyruvic transaminase(GPT)]와 글루타믹 옥살로아세틱 트란스아미나아제[glutamic oxaloacetic transaminase(GOT)〕 활성을 통상적인 방법을 사용하여 측정한 결과에서도 정상군에 비하여 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.

실험예 3 : 고추냉이 추출물의 퀴논 리덕타아제 mRNA 발현 유도효과

총 RNA는 트라이 시약(TRI reagent)를 첨가하여 세포를 충분히 라이시스(lysis) 시킨 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 여기에 50 ㎕의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고, 15초 동안 강하게 흔들어준 후, 다시 실온에서 10분간 방치하였으며, 이것을 12,000 xg 에서 15분간 원심분리하여 무색의 상층액을 조심스럽게 회수하였다. 여기에 0.5 ml의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 충분히 혼합한 후, 실온에서 10분간 방치하고, 12,000 xg에서 10분간 원심분리하여 RNA 펠렛(pellet)을 얻었다.

상기 RNA 펠렛에 0.5 ml의 70 % 에탄올(ethanol)을 넣고 강하게 흔들어 세척한 후, 12,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 후드(hood)에서 5분간 건조한 후 누클레아제(nuclease)를 함유하지 않는 증류수 40 ㎕로 용해시키고 70 ℃에서 5 분간 열충격(heat shock)을 준 다음 정량하고 1 ㎍/㎕를 역전사 시험에 이용하였다.

역전사는 20 ㎕의 5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM dNTP, 1 unit/㎕의 재조합 RNasin 리보누클레아제 저해제( recombinant RNasin ribonuclease inhibitor), 15 units/㎍ AMV 역전사효소(reverse transcriptase)와 0.5 ㎍ 올리고(dT)15 프라이머로 42 ℃에서 60 분간 역전사하였다.

퀴논 리덕타아제와 하우스키핑 염색체(housekeeping gene)인 베타-액틴 염색체(β-actin gene)의 증폭에 이용되어진 센스(sense) 및 안티센트(antisense) 프라이머로 예상되어지는 DNA 절편(fragments)은 각각 290, 591 bp로 다음과 같이 진행하였다.

PCR 믹스쳐는 Taq PCR 마스터 믹스 키트(Master Mix Kit), 2 ㎕ 역전사 효소 반응(reverse transcriptase reaction) 산물과 20 pmol 프라이머 쌍(primer pairs)으로 50 ㎕가 되도록 하였다.

PCR 반응의 조건은 94 ℃에서 1분간 변성(denaturation)시킨 후 매 싸이클(cycle)당 각각 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 45 초, 72 ℃에서 60 초 동안 총 25∼30 싸이클을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 2 % 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 방법으로 분리한 후 SYBR 그린 I으로 염색하고 α-이미저(α-Imager)를 이용하여 결과를 확인하여, 첨부도면 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이 생쥐의 간세포주(Hepa 1c1c7 cell)에 양성 대조구로 퀴논 리덕타아제 활성 측정과 동일하게 베타-나프토플라본[BNF(β-naphthoflavone)] 2 μM을 6 시간동안 처리한 결과 mRNA 수준이 강하게 증가됨을 관찰할 수 있었으며, 고추냉이 추출물 처리구는 25 ㎍/ml 처리시부터 mRNA 수준이 증가하기 시작하여 100 ㎍/ml 처리구에서는 더욱 강한 밴드(band)를 관찰할 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터 고추냉이 추출물에 의한 퀴논 리덕타아제 유도활성의 증가는 유전자의 전사(transcription)단계에서 조절받고 있음을 알 수 있었다.

실험예 3 : 독성실험

1) 실험용 쥐에 대한 경구 투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 래트(rat)를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 고추냉이 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

2) 실험용 쥐에 대한 비경구 투여 독성실험

상기 경구 투여 독성실험과 동일한 래트를 사용하여, 본 발명의 고추냉이 추추물을 2 mg 씩 근육주사 방법으로 투여하였다. 실험용 쥐 한 마리에는 2주 간격으로 2번, 다른 한 마리의 실험쥐에는 2 주 간격으로 2회 투여 후, 1 개월의 간격을 둔 다음 다시 2 주 간격으로 3회 투여를 실시하였다.

처음 주사 후 6 개월간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관 (physical examination), 혈액세포의 이상(haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타내었다.

실시예 1 : 츄잉껌(A)의 제조

껌베이스 20 중량%

설탕 76.5 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

후르츠향 1 중량%

물 2 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

실시예 2 : 츄임껌(B)의 제조

껌 베이스 25 중량%

솔비톨 72 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

페퍼민트 후레버 2.5 중량%

실시예 3 : 캔디(A)의 제조

설탕 54.5 중량%

물엿 45 중량%

고추냉이 추출물(실시예) 0.4 중량%

오렌지향 0.1 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 캔디를 제조하였다.

실시예 4 : 캔디(B)의 제조

말티톨 53.6 중량%

환원물엿 45 중량%

고추냉이 추출물(실시예) 0.5 중량%

천연허브향 0.14 중량%

실시예 5 : 비스켓의 제조

박력1급 밀가루 88 kg

중력1급 밀가루 76.4 kg

정백당 16.5 kg

식염 2.5 kg

포도당 2.7 kg

팜쇼트닝 40.5 kg

암모 5.3 kg

중조 0.6 kg

중아황산나트륨 0.55 kg

쌀가루 5.0 kg

비타민 B₁ 0.003 kg

비타민 B₂ 0.003 kg

밀크향 0.16 kg

물 71.1 kg

전지분유 4 kg

대용분유 1 kg

제일인산칼슘 0.1 kg

살포염 1 kg

분무유 25 kg

고추냉이 추출물(제조예) 1.7 kg

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 비스켓을 제조하였다.

실시예 6 : 아이스크림의 제조

유지방 10.0 중량%

무지유고형분 10.8 중량%

설탕 12.0 중량%

물엿 3.0 중량%

유화안정제(스팬,span) 0.5 중량%

향료(스트로베리) 0.15 중량%

물 63.05 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 아이스크림을 제조하였다.

실시예 7 : 음료의 제조

꿀 522 mg

치옥토산아미드 5 mg

니코틴산아미드 10 mg

염산리보플라빈나트륨 3 mg

염산피리독신 2 mg

이노시톨 30 mg

오르트산 50 mg

고추냉이 추출물(제조예) 1,003 mg

물 200 ml

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 음료를 제조하였다.

실시예 8 : 초콜렛의 제조

설탕 34.5 중량%

코코아 버터 34 중량%

코코아 매스 15 중량%

코코아 파우다 15 중량%

레시틴 0.5 중량%

바닐라향 0.5 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 초콜렛을 제조하였다.

제제화 예

상기에서 확인된 바와 같이, 고추냉이 추출물은 퀴논 리덕타아제 유도활성을 가지므로 암 예방 및 치료용 조성물로 제제화할 수 있다.

1) 시럽제의 제조

본 발명의 고추냉이 추출물 0.5 %(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같 은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 2g, 당 25.4g 을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0 g, 사카린 0.8 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르빈산 0.4 g 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

2) 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

3) 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 고추냉이 추출물이 퀴논 리덕타아제 (Quinone reductase)의 활성과 QR mRNA 발현을 유도함을 확인하였다.

본 발명에 의하면 고추냉이 추추물을 암 예방 및 치료용 조성물로서 다양한 방법으로 제제화하여 사용할 수 있고, 이를 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료, 초콜렛 등의 재료와 배합하여 각종 기능성 식품으로 제조할 경우 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 효과가 있다.

Claims

고추냉이 에탄올 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 예방용 조성물.
고추냉이 에탄올 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 예방용 건강 식품.
제 2 항에 있어서, 상기 식품은 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 간암 예방용 건강 식품.