KR20190137317A - 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 포함하며, 관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하는 것이다.
관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하며, 연골 보호 효과를 나타낼 수 있으며, 상기 조성물을 포함하는 골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 기호성이 높은 골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하며, 연골 보호 효과를 나타낼 수 있으며, 상기 조성물을 포함하는 골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 기호성이 높은 골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제함에 따라, 골관절염의 예방 또는 치료 효과가 우수한 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골 관절염(Osteoarthritis, OA)은 관절 연골의 퇴행성 변화에 의해 발생하는 질병으로서 아직까지 이를 완전히 퇴치시킬 수 있는 방법이 알려져 있지 않다.
골 관절염(Osteoarthritis, OA)은 관절 외상 및 노화와 관련된 가장 흔한 관절 질환으로 점진적 관절 연골의 파괴가 특징이다. OA의 다양한 원인 중 염증은 연골 세포의 대사 경로의 불균형을 유발하여 대사 항상성의 손실 및 세포 외 기질 (ECM)의 분해로 이어지는 OA 병인에 중요한 기여를 한다.
따라서 현재 시행되고 있는 골관절염 치료의 목표는 통증을 줄이고 관절의 파괴 및 변형을 예방하여 정상적인 관절을 유지하도록 하는 정도에 불과하다.
종래 골관절염의 통증을 완화하는 목적으로 사용되는 치료방법으로는 COX-1 또는 COX-2 억제제, 마약성 진통제, 글루코사민(Glucosamin) 및 콘드로이 틴(Chondroitin) 등의 경구투여 방법과 국소 도포제, 관절강 내에 스테로이드나 히알론산 등을 주사하는 국소 투여방법 등이 시행되고 있다. 통증이 비교적 경미한 경우에는 아세트아미노펜과 같은 약물이 사용된다.
그러나 아세트아미노펜의 투여에도 불구하고, 통증이 계속되는 환자나 통증이 심한 환자, 염증을 동반한 환자에서는 비스테로이드 소염제(NSAIDs)가 관절염 치료제로 주로 사용된다.
하지만 NSAIDs는 65세 이상의 노인이나 과거에 위궤양을 앓은 적이 있는 사람, 위출혈 같은 위장관 합병증이 있었던 사람, 스테로이드 제제 또는 항응 고제 치료를 받고 있는 사람의 경우에는 심각한 위장관 합병증이 생길 위험성이 높아 약물사용이 제한된다.
또한, 글루코사민(Glucosamin)이나 콘드로이틴(Chondroitin)은 유럽 류마티스학회에서 골관절염 환자의 통증 조절에 사용하도록 권유된 바 있으나, 아직 그 안정성에는 많은 논란이 있다.
염증성 사이토 카인 중에서 IL-1β는 OA 병인 발생과 관련된 염증 및 이화 작용 인자의 생성 및 분비를 유도하는데 중추적인 역할을 한다[Blasioli and Kaplan; 2014; Jotanovic et al., 2012; Rai and Sandell, 2011].
IL-1β의 수준은 OA 환자의 활액 및 연골에서 정상 개체보다 유의하게 높다[Panina et al., 2017; Ramonda et al., 2013]. 연골 세포가 IL-1β에 노출되면 IL-1β에 직접 관여하는 주요 프로테아제인 COX-2(cyclooxygenase-2), 유발성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide (NO) synthase, iNOS) 및 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinases, MMPs)와 같은 염증 매개체의 발현 연골 저하는 핵 인자-κB(NF-κB) 신호 전달 경로의 활성화를 통해 증가한다[Ding et al., 2013; Goldring and Otero, 2011; Roman-Blas and Jimenez, 2006]. 따라서 NF-κB는 OA 치료를 목표로 하는 치료 전략의 중요한 목표이다. 또한, 과도한 산화 스트레스는 연골 세포의 노화 및 세포 사멸에 따른 OA의 발병 및 진행에 기여하는 또 다른 중요한 요인으로 고려된다[Lepetsos and Papavassiliou, 2016; Li and Xie, 2012]. 현재 비스테로이드 성 소염제가 흔히 OA의 증상을 완화시키는 데 사용되지만 장기간 사용으로 인한 일부 부작용이 보고 되었으며 신뢰할 수 있고 효율적인 약제가 연구 대상으로 남아 있다[Klinge and Sawyer, 2013; Herndon, 2012].
이처럼 종래에 사용되고 있는 화학적 치료약물들이 모두 한계를 드러내고 있는 상황에서 국내에서는 각종 생약성분을 주제로 하는 골관절염 치료제들이 다양하게 개발되고 있다.
본 발명의 목적은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하며, 연골 보호 효과를 나타낼 수 있는 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 기호성이 높은 골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 포함하며, 관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하는 것이다.
상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출된다.
상기 줄의관말 추출물은 에탄올을 이용하여 추출한 줄의관말 에탄올 추출물이다.
상기 줄의관말 추출물은 줄의관말로부터 수득된 추출물을 유기 용매를 이용하여 분획한 분획물이다.
상기 줄의관말 추출물은 관절 연골 세포에서 IL-1β 염증 매개체 생성을 억제하며, 상기 IL-1β 매개 염증 매개체는 NO (nitric oxide), PGE2, MMP-1(matrix metalloprotenase 1), MMP-3(matrix metalloprotenase 3) 및 MMP-13(matrix metalloprotenase 13이다.
상기 줄의관말 추출물은 NF-κB의 핵 전이를 차단하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 골 관절염 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 줄의관말 추출물은 300㎍/ml의 농도 범위 이하로 포함되며, 관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제할 수 있다.
상기 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters)은 조체는 좁고 편평한 선상이며, 차상분지 또는 삼차상으로 분지하며, 높이 10 내지 20cm, 폭 2 내지 3mm인 갈조류로서, 조하대 깊은 곳에 생육하고, 우리나라에서는 울릉도, 독도, 제주도 문섬, 섶섬에서 분포하고 있는 것이 확인되고 있고 일본, 남아프리카, 유럽, 호주에도 분포한다.
최근 해양 생물 자원을 이용하여 각종 질병의 예방 및 치료에 관심이 집중되고있다. 그 중에서도 해조류는 다양한 약리학적 작용을 하는 생리 활성 물질이 풍부하기 때문에 골 관절염 예방제 개발의 잠재력이 크다[Fitton, 2011]. 예를 들어 인간에 대한 소규모 임상 연구에서 후코이단이 풍부한 갈조류 추출물의 경구 투여는 골 관절염 증상을 유의하게 억제했으며, 만성 염증 표지자인 IL-6의 감소와 관련이 있었다[Myers et al., 2010]. 또한, 플로로탄닌이 풍부한 감태(Ecklonia cava) 추출물은 리포 다당류(lipopolysaccharide)로 처리한 RAW 246.7 세포에서 PGE-2의 생성을 현저하게 억제하고 IL-1α에 의해 유도된 단백질 분해를 약화시켰다[Shin et al., 2006].
그러나 지금까지 해조류 추출물이 골 관절염에 미치는 영향에 대한 연구는 다양성에 관한 연구에 비해 제한적이었다.
이에 본 발명에서는 줄의관말로부터 추출물을 수득한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 이용하여, 관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제할 수 있는 골 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
다만, 조성물 내의 줄의관말 추출물은 300㎍/ml의 농도 범위 이하로 포함되며, 보다 구체적으로 50 내지 300㎍/ml의 농도 범위로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위인 300㎍/ml을 초과하는 경우에는 세포 독성으로 인해, 골 관절염 예방 또는 치료 효과가 미비한 문제가 있다.
상기 줄의관말 추출물은 초음파 추출법에 의해 추출할 수 있으며, 상기 초음파 추출은 줄의관말를 세척 및 분쇄한 후, 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매에 넣은 후, 20 내지 40℃의 온도 조건(실온)에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 초음파추출기로 약 1 내지 12 시간 동안 추출하는 것을 의미한다. 상기 초음파추출의 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며, 추출 결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.
보다 구체적으로 상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출되며, 바람직하게는 에탄올을 용매로 추출한 줄의관말 에탄올 추출물이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.
추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 상기 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다.
상기 추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 관절 연골 세포에서 IL-1β 염증 매개체 생성을 억제하며, 상기 IL-1β 매개 염증 매개체는 NO (nitric oxide), PGE2, MMP-1(matrix metalloprotenase 1), MMP-3(matrix metalloprotenase 3) 및 MMP-13(matrix metalloprotenase 13이다.
염증은 골 관절염 병인의 주요 원인 중의 하나로 알려져있다. 특히, IL-1β는 iNOS 및 COX-2와 같은 염증성 매개체의 자극을 통해 관절 연골 퇴화의 핵심 매개체로 작용한다[Blasioli and Kaplan; 2014; Rai and Sandell, 2011]. 상기 IL-1β는 골 관절염의 발달을 가속화 할 수 있으며, 발현을 억제하면 골 관절염의 발달을 저해할 수 있다.
이에 본 발명의 줄의관말 추출물은 IL-1β 염증 매개체 생성을 억제할 수 있고, 특히, IL-1β 매개 염증 매개체는 NO(nitric oxide), PGE2, MMP-1(matrix metalloprotenase 1), MMP-3(matrix metalloprotenase 3) 및 MMP-13(matrix metalloprotenase 13의 생성을 현저하게 억제할 수 있다.
뿐만 아니라. 줄의관말 추출물은 IL-1β에 의한 ROS 생산을 효과적으로 억제할 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 NF-κB의 핵 전이를 차단하여, 골 관절염의 예방 또는 치료 효과를 높일 수 있다.
NF-κB는 유도성 염증 매개체, 사이토 카인 및 골 관절염 발병 기전에서의 MMP 발현의 조절에 중요한 역할을 하는 전사 인자이다[Rigoglou and Papavassiliou, 2013; Roman-Blas and Jimenez, 2006]. 일반적으로, NF-κB는 억제성 소단위인 IκB-α와 관련된 불활성 형태로 세포질 내에 유지된다. IκB-α가 염증성 자극에 의한 인산화를 통해 분해될 때, NF-κB는 세포질에서 핵으로 전이되며 염증 매개체와 사이토카인 뿐만 아니라 이화 작용 효소의 전사 활성화를 유발한다[Schuliga, 2015; O'Dea and Hoffmann, 2010]. 따라서 NF-κB의 활성을 차단하는 것이 골 관절염의 예방 및 치료에 우수한 작용을 나타낸다고 할 것이다.
IL-1β 처리된 연골 세포에서 핵으로의 NF-κB의 전이 및 IκB-α의 분해가 증가하였으나 본 발명의 줄의관말 추출물은 NF-κB 활성화에 필수적인 단계인 NF-κB의 핵 전이를 효과적으로 차단할 수 있다.
이러한 NF-κB의 핵 전이 차단 효과로 인해, IL-1β-유도 발현된 iNOS, COX-2 및 MMP 발현을 억제하고, 이에 따라, 골 관절염의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
바람직하게, 상기 줄의관말 추출물은 줄의관말 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이다.
상기 분획물은 줄의관말 에탄올 추출물과 비교하여, 보다 우수한 골 관절염의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
보다 구체적으로, 줄의관말 추출물은 IL-1β 염증 매개체 생성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, NF-κB의 핵 전이 차단 효과로 인해, IL-1β-유도 발현된 iNOS, COX-2 및 MMP 발현을 억제하고, 이에 따라, 골 관절염의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명의 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 에탄올 추출물의 분획물을 발효시킨, 줄의관말 분획물의 발효물이다.
상기 발효물은 에탄올을 이용하여 초음파 추출법에 의해 줄의관말 에탄올 추출물을 제조하고, 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드를 분획 용매로 이용하여 분획물을 제조한 이후, 상기 분획물에 당을 혼합하고, 발효균을 접종시켜 3 내지 5일 정도 상온에서 발효시킨 제조하였다.
상기 분획물과 혼합한 당 성분은 미생물의 대사과정에서 탄소원으로 사용되어 알코올로 전환시키게 되므로, 천연물 내의 유효성분 특히, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테킨 등은 당화되어 안정한 화합물로 존재하게 되어 있어 발효를 통해 유효성분 함량 추출율을 증가시키고 당이 배제되어 활성화된 유효성분에 의해 골 관절염의 예방 또는 치료를 상승시킬 수 있다.
배지에 일정한 농도 (약 105 내지 107 CFU/ml)로 미생물을 접종하여 pH 5.5 내지 6.5, 온도 25 내지 35℃, 배양 시간은 48 내지 120시간의 조건을 유지하면서 배양한 후, 이 발효물을 이용하여 줄의관말 분획물의 발효물을 수득할 수 있다.
상기 발효에 사용하는 미생물로는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게 자형피(刺荊皮) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게 줄의관말 분획물의 발효물 및 자형피 추출물을 포함할 수 있다.
상기 자형피는 박태기나무(Cercis chinensis Bunge)의 껍질을 이용하여 추출한 것으로, 상기 박태기나무는 재배하는 낙엽관목으로 높이 35m에 달하며 피목이 많고 골속은 백색이다. 잎은 호생이며 단엽으로 딱딱하고 심장형이며 기부에 5출맥이 발달한다. 꽃은 자홍색으로 4월에 핀다. 열매는 협과로 8 내지 9월에 익는다. 종자는 편평한 타원형이고 황록색이다.
골 관절염의 예방 또는 치료 효과를 상승시키기 위하여, 줄의관말 에탄올 추출물의 발효물에 자형피 추출물을 소량 혼합 사용함에 따라 각 구성 성분의 혼합작용으로 인해, 골 관절염의 예방 또는 치료 효과가 더욱 상승한다.
이에, 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 추출물 10 내지 20 중량부로 포함할 수 있다.
상기 자형피 추출물은 자형피를 사용하여 추출물을 제조한 뒤 이를 발효한 것일 수 있다. 자형피 추출물을 발효하여 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 바람직하게 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 발효 추출물 10 내지 20 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 줄의관말 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 머루근 추출물은 상세하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 상세하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다. 본 발명의 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 줄의관말 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 줄의관말 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 줄의관말 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 상세하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 관절염 예방 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 줄의관말 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 줄의관말 추출물은 골 관절염의 예방 또는 치료를 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 줄의관말 추출물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 줄의관말 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
다만, 상기와 같이 줄의관말 추출물만 식품 조성물로 이용하거나, 자형피 추출물을 추가로 포함하는 조성물을 식품 조성물로 이용하는 경우에는 줄의관말 추출물 및 자형피 추출물 고유의 맛과 향으로 인해 기호성이 떨어지는 문제가 발생한다.
이에, 바람직하게는 수호초 추출물, 비비추 추출물 및 결명자 추출물을 추가로 포함하여, 기호성을 높이고, 골 관절염 예방 및 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
수호초(Pachysandra terminalis)는 나무 그늘에서 자라며 원줄기가 옆으로 벋으면서 끝이 곧추 서고 녹색이며 처음에는 잔 털이 있으나 점차 없어진다. 높이 30cm 내외로 자란다. 잎은 어긋나지만 윗부분에 모여 달리고 달걀을 거꾸로 세운 듯한 모양이며 윗부분에 톱니가 있다. 잎 표면 맥 위에 잔 털이 있고 밑부분이 좁아져 잎자루가 된다. 또한 꽃은 4 또는 5월에 피고 흰색이며 수상꽃차례에 달린다. 암꽃은 꽃이삭 밑부분에 약간 달리고 수꽃은 윗부분에 많이 달린다. 꽃받침은 4개로 갈라지고 꽃잎은 없다. 수술은 3 내지 5개이고 암술대는 2개로 갈라져서 젖혀진다. 열매는 핵과로서 달걀 모양이고 겉에 털이 없다. 한국, 일본, 사할린섬, 중국에 분포한다.
비비추(Hosta longipes)는 산지의 냇가나 습기가 많은 곳에서 잘 자라며 높이 30 내지 40cm이다. 잎은 모두 뿌리에서 돋아서 비스듬히 자란다. 잎은 타원형이며 끝이 뾰족하고 8 또는 9맥이 있다. 꽃은 연한 자줏빛으로 7 또는 8월에 피고 한쪽으로 치우쳐서 총상으로 달리며 꽃줄기는 길이 30 내지 40cm이다. 포는 얇은 막질이고 자줏빛이 도는 흰색이며 작은꽃자루의 길이와 거의 비슷하다. 화관은 끝이 6개로 갈라져서 갈래조각이 약간 뒤로 젖혀지고 6개의 수술과 1개의 암술이 길게 꽃 밖으로 나온다. 열매는 삭과로 긴 타원형이다. 종자는 검은색으로서 가장자리에 날개가 있다. 연한 순을 식용하며 관상용으로 심는다. 야생종은 한국·일본·중국 등지에 분포한다. 비비추는 원예종으로 다양한 품종이 개발되어 외국에서 정원식물로 인기가 높다.
결명자(Senna tora (L.) Roxb.)는 재배하는 일년초로 높이가 2m에 달한다. 잎은 짝수1회우상복엽으로 24쌍의 소엽이 달리고 소엽은 도란형이며 끝이 약간 뾰족해지고 예저 또는 원저이다. 꽃은 황색으로 꽃자루가 있으며 6 내지 8월에 잎겨드랑이에 12개 달린다. 열매는 협과로 활처럼 구부러져 있다.
보다 바람직하게, 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 발효 추출물 10 내지 20 중량부, 수호초 추출물 1 내지 5 중량부, 비비추 추출물 1 내지 5 중량부 및 결명자 추출물 10 내지 15 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다. 즉, 상기 범위 내에서 식품 조성물로 이용 시 기호성이 상승됨과 동시에, 각 추출물의 상호 작용에 의해 골 관절염의 예방 및 치료 효과가 더욱 상승한다.
본 발명은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물로, 관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하며, 연골 보호 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 기호성이 높은 골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 SW1353 연골 세포의 세포 생존 능력에 미치는 줄의관말 추출물 및 IL-1β의 영향에 관한 결과 그래프이다.
도 2는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 NO 및 PGE2 생산 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 3은 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 iNOS 및 COX-2 발현 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 4는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 MMP-1, -3 및 -13의 생성 저해에 대한 결과 그래프이다.
도 5는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 MMP-1, -3 및 -13의 발현 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 6은 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 ROS 생성에 미치는 영향에 대한 결과 그래프이다.
도 7은 줄의관말 추출물에 의한 IL-1β-자극된 SW1353 연골 세포에서의 NF-κB 핵 전좌 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 2는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 NO 및 PGE2 생산 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 3은 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 iNOS 및 COX-2 발현 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 4는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 MMP-1, -3 및 -13의 생성 저해에 대한 결과 그래프이다.
도 5는 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 IL-1β-유도된 MMP-1, -3 및 -13의 발현 억제에 대한 결과 그래프이다.
도 6은 줄의관말 추출물에 의한 SW1353 연골 세포에서의 ROS 생성에 미치는 영향에 대한 결과 그래프이다.
도 7은 줄의관말 추출물에 의한 IL-1β-자극된 SW1353 연골 세포에서의 NF-κB 핵 전좌 억제에 대한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 줄의관말 추출물의 제조]
EESS는 제주 바이오 자원 추출 은행(제주 테크노 파크, 제주)에서 구입하였다. 무한증식(immortalized) 인간 전정 신경초종 세포주(HEI193 세포)는 박환태(Park Hwan Tae) 박사(동아 대학교 의과 대학 부산 백병원 생리학 교실, 49201, 한국)가 제공하였다.
갈조류인 줄의관말(C. costata)은 울릉도 근처에서 수집하였다. 수집 후 줄의관말(C. costata)을 수돗물로 씻어 시료 표면에 부착된 판, 선상 모래 및 모래를 제거한 후 -20℃에서 보관하였다. 냉동된 샘플을 추출하기 전에 분쇄기를 사용하여 동결 건조시키고 균질화 하였다.
건조된 분말을 초음파 처리에 의해 70% EtOH (1:10 w/v)로 1시간(5 회) 추출한 후, 추출물(이하, EECC라 한다)을 진공에서 증발시켰다. 추출물을 실험에 사용하기 전에 디메틸설폭시드(DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 용해시켰다.
[실험예 1: 관절 연골 세포에서의 줄의관말 추출물의 항염 효과]
세포 배양
SW1353 연골 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 입수 하였다. 상기 세포는 10 % fetal bovine serum(Welgene Inc.), 100 U/ml 페니실린 및 streptomycin (Welgene Inc.)이 포함된 Dulbecco 's modified Eagle 's medium(Welgene Inc., 대구, 대한민국)을 37℃, 5% CO2를 포함하는 습한 대기 조건 하에서 배양 하였다.
세포 생존율 분석
SW1353 연골 세포에 대한 EECC의 세포 독성은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라 졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 분석을 사용하여 결정하였다.
간단히, 세포를 웰(well) 당 1x104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에서 배양 하였다. 24시간 인큐베이션 한 후, 상기 세포는 24시간 동안 IL-1β 처리 전에 1 시간 동안 다른 농도의 EECC를 처리하거나, IL-1β(40 ng / ml, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) 단독 처리하거나, 또는 다른 농도의 EECC 전처리를 하였다.
그 후 배지를 제거하고 0.5 mg / mL MTT (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 각 웰에 넣고 3시간 동안 37℃에서 배양 하였다. 이어서, 상등액을 동량의 DMSO(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 대체하여 청색 포르마잔(formazan) 결정을 10분 동안 용해시켰다.
광학 밀도는 마이크로 플레이트 판독기 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)를 사용하여 파장 540 nm에서 측정하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였다.
NO 및 PGE
2
측정
SW1353 연골 세포를 다양한 농도의 EECC로 1 시간 동안 처리 한 후 24 시간 동안 IL-1β로 자극하거나 자극하지 않았다. 배지 내의 아질산염 수준은 그리스(Griess) 반응(Sigma-Aldrich Chemical Co.)에 의해 평가하였다.
간략하게, 세포-배양 된 배지 100 ㎕를 10 분 동안 동일한 양의 그리스 시약과 혼합하고, 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 측정 하였다.
PGE2 수준을 조사하기 위해, 배양 상등액을 수집하고 시판되는 효소 결합 면역 측정(ELISA) 키트(R & D Systems)를 사용하여 검정하였다.
MMP 생산량의 측정
같은 조건에서 배양된 연골 세포로부터 방출된 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 단백질 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 특정 ELISA 키트 (R & D Systems)로 정량화 하였다.
웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
전체 세포 단백질을 추출하기 위해. 세포를 수집하고, ice-cold phosphate buffered saline(PBS)로 2회 세척 한 다음 세포 용해 완충액[25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM 1 % Nonidet-P40, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 5mM dithiothreitol]을 1 시간 동안 처리 한 후 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거하였다.
핵 및 사이토졸릭(cytosolic) 단백질은 제조자의 지시에 따라 핵 추출 시약 (Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 제조하였다. Bio-Rad 단백질 분석 키트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels)에서 전기 영동으로 같은 양의 단백질(30-50 μg)을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membranes, Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 첨가 하였다.
막은 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 분유로 블로킹 한 후 iNOS, COX-2, MMP-1, MMP-3, MMP-13, NF-κB p65, IκB-α, lamin B, β-actin에 대한 1 차 항체로 밤새 4 ℃에서 흔들어 주면서 탐침(probed)하였다.
0.1 % Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수(Tris-buffered saline)로 5 분 동안 3회 세척 한 후, 막을 상온에서 2시간 동안 상응하는 horseradish-peroxidase-결합된 2 차 항체로 배양하였다.
막은 강화된 화학 발광 용액(Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA)에 의해 가시화하고 X 선 필름에 노출시켰다.
RNA 분리 및 RT-PCR
TRIzol시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 총 RNA를 추출한 다음 정량화하였다. Moloney murine 백혈병 바이러스 역전사 효소를 함유한 AccuPower® RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)로 cDNA를 합성하기 위해 RT-PCR을 위한 주형으로 총 RNA 약 1μg을 사용 하였다.
RT 생성 cDNA는 다음 조건 하에서 선택된 프라이머(Bioneer)를 사용하여 증폭시켰다:
95 ℃에서 10 분, 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 1 분 간 40주기(cycles).
글리세롤 알데히드-3-인산 탈수소 효소(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 내부 대조군으로 사용하였다.
세포 내 ROS 수준의 검출(Detection of the intracellular ROS levels)
세포 내 ROS의 생성은 세포 투과성 형광 프로브, 5,6-carboxy-2', 7'- dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 사용하여 모니터링 하였다.
간단히 말해, SW1353 연골 세포를 300μg/ml EECC로 1 시간 동안 전처리 한 다음 IL-1β의 존재 또는 부재하에 2 시간 동안 배양 하였다. 세포를 수확하고 어두운 색에서 10μM DCF-DA(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 37 ℃에서 15 분 동안 염색 하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세정하고, 480nm 파장 및 525nm 방출 파장의 여기(excitation)에 대해, 유동 세포 계측기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 10,000개의 사건을 즉시 분석 하였다[Jeon et al. 2017].
형광 현미경 관찰에 의한 ROS 생산의 정도를 관찰하기 위해, 유리 커버 슬립에 부착된 세포를 EECC 처리 후 IL-1β의 존재 또는 부재하에 자극시켰다.
세포를 15분 동안 37℃에서 10μM DCF-DA로 염색하고 PBS로 두 번 세척 한 다음 20분 동안 4% 파라 포름 알데히드(pH 7.4)로 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 2 회 세척하고 형광 현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분석 하였다[Shin et al., 2017].
NF-κB의 면역 형광법(Immunofluorescence of NF-κB)
세포 내 NF-κB의 위치를 관찰하기 위해, 유리 커버슬립(coverslips)에 부착 된 SW1353 연골 세포를 300μg/ml EECC로 1시간 처리 한 다음 IL-1β가 없거나 존재할 때 1 시간 동안 배양하였다.
세포를 4% 파라 포름 알데히드로 20 분간 고정시키고, PBS로 3 회 세척하고, 실온에서 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 5분간 처리 하였다. 그 후, 세포를 1시간 동안 10% 염소 혈청으로 블로킹 한 다음, 밤새 4 ℃의 습도 챔버에서 p65 항체에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션 한 다음, 상온에서, 플루오레신 이소티오 시아네이트-결합된(fluorescein isothiocyanate-conjugated) donkey anti-rabbit IgG와 함께 1시간 동안 배양하였다.
마지막으로, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma-Aldrich Chemical Co.)이 함유된 배지에 넣어 핵을 염색하였다. 이미지는 형광 현미경으로 촬영하였다.
통계학적 분석
이 연구에서보고 된 모든 실험은 독립적으로 적어도 3회 수행되었으며 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 평가하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주된다.
결과
SW1353 연골 세포의 세포 독성에 미치는 EECC의 영향(Effect of EECC on SW1353 chondrocyte cytotoxicity)
SW1353 연골 세포에 대한 EECC의 세포 독성 효과는 MTT 분석에 의해 결정하였다.
도 1a에 도시 된 바와 같이, 50 내지 300㎍/ml의 농도 범위에서 EECC는 SW1353 세포에 대한 세포 독성 효과를 나타내지 않았지만, 400μg/ml EECC 처리군에서 유의한 세포 독성이 관찰되었다.
후속 실험은 EECC가 300μg/ml 이하의 농도에서 40ng/ml IL-1β 처리 SW1353 세포에 투여되었을 때 세포 생존 능력에 어떠한 부작용도 나타내지 않았다(그림 1B). 따라서, 다음 실험에서 300μg/ml까지의 EECC 농도를 사용하였다.
SW1353 연골 세포에서의 EECC에 의한 IL-1β-유도된 NO 및 PGE
2
생산 억제
EECC의 항 염증 효과를 평가하기 위해, NO 및 PGE2와 같은 염증 매개체 생성에 대한 EECC의 영향을 측정하였다. SW1353 세포를 24 시간 동안 40 ng / ml IL-1β로 자극하기 전에 1 시간 동안 다양한 농도의 EECC로 전처리 하였다. 이어서, Griess 반응에 의해 세포 현탁액 중의 NO 농도를 측정하고, PGE2의 수준을 ELISA 키트를 사용하여 측정 하였다. 도 2의 결과에서 볼 수 있듯이, IL-1β 자극은 비 자극 대조군에 비해 NO 및 PGE2 생산을 유의하게 증가 시켰지만 EECC-전처리 된 세포에서는 NO 및 PGE2 생산량이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다.
SW1353 연골 세포에서의 IL-1β에 의해 유발된 iNOS 및 COX-2 발현 억제에 대한 EECC의 효과 검토
우리는 다음으로 EECC가 IL-1β에 의한 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제 할 수 있는지 여부를 조사했다. 우리의 immunoblotting 결과에 따르면, IL-1β에 의한 iNOS 및 COX-2 단백질의 증가 된 발현은 EECC 전처리 조건 하에서 배양 된 세포에서 농도 의존적으로 감소 하였다(도 3A). 마찬가지로, RT-PCR 결과에서 전사 수준에서 두 유전자의 발현은 EECC 전처리에 의해 효과적으로 감소하였다(그림 3B).
SW1353 연골 세포에서 IL-1β가 매개하는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 증가 감소에 대한 EECC의 효과 검토
catabolic factor가 OA pathogenesis의 중요한 역할을 함에 따라, EECC가 연골 퇴행에 필수적인 부분을 갖는 MMP의 생성을 피할 수 있는지 여부를 조사하였다. 결과는 IL-1β로 자극 한 후 배양 상등액에서 MMPs(MMP-1, -2, -3 및 -13)의 방출이 증가하였다. 그러나, IL-1β에 의한 이들 MMP의 발현 증가는 EECC 전처리에 의해 억제되었고, 이 효과는 EECC 처리 농도에 의존적이다(도 4).
SW1353 연골 세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 발현 감소에 대한 EECC의 효과 검토
IL-1β 처리된 SW1353 연골 세포에서 EECC에 의한 MMP 생성 억제가 상기 유전자의 발현 감소와 관련이 있는지를 조사하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, 3 가지 MMPs 단백질의 발현은 IL-1β을 단독 처리한 경우, 크게 증가하였지만, EECC 전처리 조건 하에서 배양된 세포에서는 그 발현이 크게 감소하였다. 또한, EECC로 전처리함으로써 IL-1β에 의해 유도된 MMP의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 억제 하였다(도 5B).
SW1353 연골 세포에서의 IL-1β가 매개하는 ROS 생성 완화에 대한 EECC의 효과 검토
산화 스트레스가 ECM의 분해 및 연골 세포의 세포 사멸 유도에 중요한 역할을 하므로 EECC가 DCF-DA 프로브를 사용하여 IL-1β에 의한 산화 스트레스를 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 유동 세포 계측 결과는 ROS의 수준이 IL-1β의 처리에 따라 점차적으로 증가하고, 2시간이 지난 시점에 최고점에 이르렀으며, 그 후 감소하였다(데이터는 표시되지 않음).
그러나, IL-1β로 처리된 SW1353 세포에서 ROS 함량의 증가는 EECC의 첨가에 의해 극적으로 감소하였다.
또한, 예상대로, N-아세틸 시스테인(NAC), ROS 제거제의 전처리는 IL-1β에 의한 ROS 생산을 완전히 차단 하였다(도 6A). ROS 형성을 방지하는 효과는 형광 현미경을 사용하여 재확인하였다. 이는 유동 세포 계측법의 결과와 일치하여, IL-1β로 처리된 세포에서 관찰된 DCF-DA 형광 강도의 증가는 도 6B에 나타낸 바와 같이 EECC의 전처리에 의해 약화되었다.
SW1353 연골 세포에서 NF-κB p65의 IL-1β 유도 핵전이 억제에 대한 EECC의 효과 검토
EECC가 연골 세포에서 IL-1β 신호 전달의 중요한 중재자이고 염증 매개체와 MMPs의 전사를 조절하는 주요 인자이므로 IL-1β로 유도된 NF-κB 활성화를 억제 할 수 있는지 여부를 조사하였다.
도 7A에 도시 된 바와 같이, SW1353 세포가 IL-1β로 자극될 때, NF-κB p65의 핵으로의 전위는 대조군과 비교하여 유의하게 증가하였고, 1 시간 경과 시점에서 피크를 보였다.
대조적으로, 세포질에서 IκB-α의 수준은 IL-1β의 처리에 의해 점차적으로 감소하였다. 그러나 EECC는 NF-κB p65의 핵 전좌와 IL-1β에 의해 유도된 IκB의 분해를 유의하게 감소시켰다(그림 7A).
또한 세포를 EECC로 전처리시킨 경우, NF-κB p65가 IL-1β 자극 세포에서 NF-κB p65의 핵 염색이 명확하고 강화된 상태로 핵에 축적되었으며 NF-κB p65의 핵으로의 이동이 면역 형광법에 의해 확인하였다(도 7B).
[제조예 2: 줄의관말 분획물의 제조]
갈조류인 줄의관말(C. costata)은 울릉도 근처에서 수집하였다. 수집 후 줄의관말(C. costata)을 수돗물로 씻어 시료 표면에 부착된 판, 선상 모래 및 모래를 제거한 후 -20℃에서 보관하였다. 냉동된 샘플을 추출하기 전에 분쇄기를 사용하여 동결 건조시키고 균질화 하였다.
건조된 분말을 초음파 처리에 의해 70% EtOH (1:10 w/v)로 1시간(5 회) 추출물을 획득하였다.
줄의관말 에탄올 추출물을 증류수에 현탁 후, 현탁액과 메틸렌클로라이드를 1:1의 비율로 분획 깔대기에 넣고, 메틸렌클로라이드층과 물층을 분획하였고, 메틸렌클로라이드층을 다시 감압 농축하여 줄의관말 분획물(EECP)을 제조하였다.
[제조예 3: 줄의관말 발효물의 제조]
상기 제조예 2에서 제조된 분획물 100 중량부에 당류 5 중량부를 혼합하였다. 이후, 락토바실러스 살리바리우스를 106CFU/ml로 접종하고 pH 5.5 내지 6.5, 온도 23 내지 28℃의 조건을 유지하면서 72 시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 발효물을 섞어주었다. 발효에 사용한 미생물인 Saccharomyces cerevisiae KCTC7913는 접종 24시간 전에 35℃에서 액체 배양하여 준비하였으며, 이를 희석하여 발효의 접종균으로 사용하였다.
상기 발효물에 70% 에탄올을 발효물의 중량 대비 10 내지 20배로 첨가하여 발효물 내의 유효성분을 추출하고 1㎛ pore size의 paper filter를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 줄의관말 발효물(EECB)을 수득하였다.
[제조예 4: 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조]
1. 자형피 추출물(CCBE)의 제조
박태기나무 껍질을 세척하고, 건조한 이후, 분쇄기를 사용하여 분쇄하여, 자형피 분말을 제조하였다.
상기 자형피 분말을 초음파 처리에 의해 70% EtOH (1:10 w/v)로 1시간(5 회) 추출물을 획득하였다.
2. 천연 추출물의 제조
상기 자형피 추출물의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 비비추 추출물(HLME) 수호초 추출물(PTSE) 및 결명자 추출물(STRE)을 제조하였다.
3. 발효 자형피 추출물(CCBB)의 제조
상기 자형피 추출물은 줄의관말 발효물 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 발효 자형피 추출물을 제조하였다.
4. 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조
상기 줄의관말 추출물(EECC), 자형피 추출물(CCBE), 비비추 추출물(HLME) 수호초 추출물(PTSE) 및 결명자 추출물(STRE)을을 혼합하여 골 관잘염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하였다.
보다 구체적인 조성물의 함량은 하기 표 1과 같다.
WP1 | WP2 | WP3 | WP4 | WP5 | WP6 | WP7 | WP8 | WP9 | WP10 | |
EECC | 100 | 100 | 100 | 100 | - | - | - | - | - | - |
EECP | - | - | - | - | 100 | 100 | 100 | 100 | - | - |
EECB | - | - | - | - | - | - | - | - | 100 | 100 |
CCBE | 5 | 10 | 20 | 25 | 5 | 10 | 20 | 25 | 20 | - |
HLME | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 5 | 5 |
PTSE | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 5 | 5 |
STRE | 5 | 10 | 15 | 20 | 5 | 10 | 15 | 20 | 15 | 15 |
CCBB | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 |
(단위 중량부)[실험예 2: 관절 연골 세포에서의 항염 효과]
상기 실험예 1에서 EECC에 대한 IL-1β-유도된 NO 및 PGE2 생산 억제, IL-1β에 의해 유발된 iNOS 및 COX-2 발현 억제, IL-1β가 매개하는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 발현 감소, IL-1β가 매개하는 ROS 생성 완화 및 NF-κB p65의 IL-1β 유도 핵전이 억제 효과와 비교하여, WP1 내지 WP10의 효과를 비교 실험하였다.
EECC에 대한, IL-1β-유도된 NO 및 PGE2 생산 억제(A), IL-1β에 의해 유발된 iNOS 및 COX-2 발현 억제(B), IL-1β가 매개하는 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 발현 감소(C), IL-1β가 매개하는 ROS 생성 완화(D) 및 NF-κB p65의 IL-1β 유도 핵전이 억제 효과(E)를 모두 지수 5로 설정하고, WP1 내지 WP10에 대한 효과를 지수로 나타내었다.
상기 지수는 1 내지 10으로 평가되며, 점수가 높을수록 효과가 우수함을 나타낸다.
EECC | WP1 | WP2 | WP3 | WP4 | WP5 | WP6 | WP7 | WP8 | WP9 | WP10 | |
A | 5 | 4 | 6 | 7 | 4 | 4 | 7 | 8 | 6 | 8 | 9 |
B | 5 | 5 | 6 | 7 | 5 | 5 | 7 | 8 | 5 | 8 | 9 |
C | 5 | 4 | 7 | 7 | 6 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 8 |
D | 5 | 5 | 5 | 8 | 5 | 4 | 8 | 8 | 5 | 9 | 8 |
E | 5 | 5 | 6 | 7 | 5 | 4 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, WP2, WP3, WP6, WP7, WP9 및 WP10에서 EECC에 비해 상대적으로 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
즉, EECC만을 단독으로 사용하는 경우에 비해, 복합 추출물로 이용하는 경우, 골 관절염의 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인하였다.
[실험예 3: 관능 평가]
상기 WP1 내지 WP10이 기능성 식품조성물로 제공될 수 있도록 각 조합에 따른 향미와 맛에 대한 관능성을 평가하였다.
따라서 EECC, WP1 내지 WP10을 이용하여 차(茶) 음료로 제조하고, 성인남녀 20인에 대한 관능성 평가를 수행하였다. 관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
한편, 하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다.
EECC | WP1 | WP2 | WP3 | WP4 | WP5 | WP6 | WP7 | WP8 | WP9 | WP10 | |
향 | 3 | 3 | 5 | 7 | 4 | 4 | 6 | 7 | 6 | 8 | 9 |
맛 | 2 | 4 | 6 | 7 | 5 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
기호성 | 3 | 4 | 6 | 6 | 3 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
(단위 지수)
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, EECC만을 차로 이용하는 경우에는 향, 맛 및 기호성이 떨어지는 것을 확인하였다. 반면, 복합 추출물로 제조하는 경우에는 향, 맛 및 기호성이 우수한 기능성 식품 조성물로 제공이 가능함을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (8)
- 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 포함하며,
관절 연골 세포에서 IL-1β(interleukin-1β)에 의해 유발된 염증 반응을 억제하는 것인
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출되는
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 에탄올을 이용하여 추출한 줄의관말 에탄올 추출물인
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 줄의관말로부터 수득된 추출물을 유기 용매를 이용하여 분획한 분획물인
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 관절 연골 세포에서 IL-1β 염증 매개체 생성을 억제하며,
상기 IL-1β 매개 염증 매개체는 NO(nitric oxide), PGE2, MMP-1(matrix metalloprotenase 1), MMP-3(matrix metalloprotenase 3) 및 MMP-13(matrix metalloprotenase 13인
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 NF-κB의 핵 전이를 차단하는 것인
골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
골 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
골 관절염의 예방 또는 치료용 식품 조성물.
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