KR102122742B1 - 줄의관말 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
줄의관말 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과 나타내며, 신경 염증의 치료에 이용하더라도 부작용이 없는 신경 염증 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 기호도 높은 신경 염증 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 기호도 높은 신경 염증 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 줄의관말 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물로, 보다 구체적으로 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하여, TLR4 경로 및 ROS 생성 차단과 관련된 NF-κB의 불활성화를 통한 신경 염증의 예방 및 치료가 가능한 조성물에 관한 것이다.
중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 약 90%를 차지하며, 부피로는 뇌 전체의 약 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 세 종류로 분류할 수 있다.
이중, 성상세포는 신경계에서 가장 많은 수를 차지하는 세포로서 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제 거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 수행한다. 염증 자극시, 성상교세포가 증식하고 NO 및 TNF-α와 같은 다양한 세포질간 매개체를 생산하게 된다. 또한, 소교세포는 분화된 대식세포 (specialized macrophage)의 일종으로, 뇌에 널리 분포한다. 소교세포는 조직 잔해 및 죽은 세포들을 삼키는 식세포로서 작용할 뿐 아니라 뇌의 생체방어활동에 참여하는 역할을 한다.
또한, 소교세포는 만성뇌질환에 있어서 다양한 신경 독소 및 전염증 매개체를 분비함으로써 신경염증을 증가시켜신경세포사 및 탈수초의 원인이 된다. 뇌손상 또는 신경성염증 자극에 대한 반응으로, 소교세포는 산화질소(nitric oxide, NO), 반응성 산소종 (reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 등을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하며 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다.
그러나 염증세포로서의 성상세포 및 소교세포의 역할이 항상 유익한 것은 아니며, 현재 조절되지 않은 성상세포 및 소교세포의 활성화는 지속적으로 과도한 신경염증을 유발하여 퇴행성 신경질환을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인이 되는 것으로 여겨지고 있다.
즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물 질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하며, 이러한 소교세포의 활성화 및 신경염증과 관련된 질환으로는 뇌허혈, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 및 근위축성 측색경화증 등의 다양한 신경학적 및 신경퇴 행성 질환이 알려져 있다.
보다 구체적으로, 염증 신호에 반응하여 과발현된 소교세포는 뇌 신경 세포를 손상시키고 다양한 신경 퇴행성 질환의 발병 및 진행을 유발한다. 특히 병원성 내 독소는 Toll-like receptors(TLRs)에 결합하여 소교세포의 과도한 활성화를 유도한다.
그 중에서도 그람 음성 박테리아의 외막에 존재하는 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharides)는 TLR4와 특이적으로 결합한다. 이 신호는 포스파티딜 이노시톨 3'- 키나아제(PI3K, phosphatidylinositol 3'-kinase)/Akt 및 마이 토젠 - 활성화 단백질 키나아제(MAPK, mitogen-activated protein kinases)를 비롯한 다양한 세포 내 신호 전달 경로를 통해 핵 인자-κB (NF-κB)의 전사 활성화를 유도하여 신경 세포의 염증과 신경 변성을 촉진하는 일련의 염증 유전자이다. 또한 LPS에 의해 과민화된 소교세포는 염증 반응을 더욱 악화시키는 활성 산소 종(ROS)의 생성을 증가시킴으로써 산화 스트레스를 유도한다.
따라서, 소교세포의 과도한 활성화를 막는 것은 많은 뇌 질환의 유도 및 진행을 지연시키는 중요한 도구이다.
해초는 오랫동안 아시아 연안 지역 거주자들에 의해 의약품 및 식품의 원천으로 사용되어 왔다. 해초를 이용하여, TLR4 경로 및 ROS 생성 차단과 관련된 NF-κB의 불활성화를 통한 신경 염증의 예방 및 치료에 효과를 나타내며, 체내에서 부작용을 줄일 수 있는 천연 추출물에 대한 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과 나타내며, 신경 염증의 치료에 이용하더라도 부작용이 없는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신경 염증 예방 및 치료용 조성물은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하며, 상기 줄의관말 추출물은 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과를 나타낼 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출될 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 에탄올을 이용하여 추출한 줄의관말 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 1줄의관말로부터 수득된 추출물을 유기 용매를 이용하여 분획한 분획물일 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 면역 세포에서 TLR4에 대한 LPS의 결합에 대한 길항 효과를 나타내어, NF-Κb, PI3K/Akt 및 MAPKs 신호 전달 경로를 억제할 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 신경 염증 반응과 관련된 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 축적을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 줄의관말 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 신경 염증 예방 및 치료용 기능성 식품 성물은 상기 줄의관말 추출물을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 "신경염증"은 신경계, 즉 신경세포, 신경조직 등에 발생하는 염증성 반응을 총칭한다. 중추신경계에 존재하는 면역세포인 소신경교세포가 다양한 외인성, 내인성 물질로 인해 활성화되어, 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β, 일산화질소, 프로스타글란딘, 초과산화물 등의 물질을 생산, 방출하는 현상을 포함할 수 있 다. 이러한 물질들의 생성은 단기적으로는 면역반응을 유발하지만, 그 과도한 생산이나 지속적인 생산은 근접한 신경세포들의 사멸을 유도하여 결국 신경퇴행을 유발한다고 알려져 있다.
본 발명에서 "퇴행성 뇌신경 질환"은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유 발하는 질환을 총칭하며, 구체적으로 인지 기능, 학습 또는 기억력이 손상되거나, 신경염증 반응을 동반하는뇌 신경 질환을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 대표적인 퇴행성 뇌신경 질환에는 치매(dementia), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 루게릭병 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), 뇌졸중(Stroke), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 인지 장애, 학습 장애, 기억력 손상 등이 있다. 이 중에서 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 노인성 치매 중에서도 가장 중요하게 대두되고 있는 질환 으로, 아밀로이드베타 (amyloid beta, Aβ)의 뇌내 축적과 그로 인한 신경독성이 발병의 중요한 원인으로 알려 져 있다. 상기 Aβ는 아밀로이드 전구체(amyloid precursor protein, APP)가 막단백 가수분해 효소인 베타-세크 리테아제 1(BACE1)와 감마-세크리테아제의 연속적인 작용으로 만들어지는 것으로 알려져 있으며, 따라서 BACE1 단백질의 발현 억제를 통해 알츠하이머 병을 예방 또는 치료할 수 있음은 자명하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신경 염증 예방 및 치료용 조성물은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함한다.
상기 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters)은 조체는 좁고 편평한 선상이며, 차상분지 또는 삼차상으로 분지하며, 높이 10 내지 20cm, 폭 2 내지 3mm인 갈조류로서, 조하대 깊은 곳에 생육하고, 우리나라에서는 울릉도, 독도, 제주도 문섬, 섶섬에서 분포하고 있는 것이 확인되고 있고 일본, 남아프리카, 유럽, 호주에도 분포한다.
최근 해양 생물 자원을 이용하여 각종 질병의 예방 및 치료에 관심이 집중되고 있다. 그 중에서도 해조류는 다양한 약리학적 작용을 하는 생리 활성 물질이 풍부하기 때문에 신경 염증 예방 및 치료용으로 개발 잠재력이 크다.
그러나 지금까지 해조류 추출물이 다양한 약리적 효과가 있음을 보여주는 연구가 다수 진행되었으나, 소교세포에 대한 항 염증 효과를 확인한 실험은 진행된 적이 없다.
이에, 본 발명에서는 LPS에 의해 자극된 BV2 소교세포에서 줄의관말 에탄올 추출물의 항 염증 및 항산화 효능을 확인하고, LPS에 의한 TLR4 신호 전달 경로의 활성화에 대한 EECC의 효과를 확인하였다.
이에 본 발명에서는 줄의관말로부터 추출물을 수득한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 이용하여, 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과를 나타내는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
다만, 조성물 내의 줄의관말 추출물은 300㎍/ml의 농도 범위 이하로 포함되며, 보다 구체적으로 50 내지 300㎍/ml의 농도 범위로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위인 300㎍/ml을 초과하는 경우에는 세포 독성으로 인해, 신경 염증의 예방 또는 치료 효과가 미비한 문제가 있다.
상기 줄의관말 추출물은 초음파 추출법에 의해 추출할 수 있으며, 상기 초음파 추출은 줄의관말를 세척 및 분쇄한 후, 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매에 넣은 후, 20 내지 40℃의 온도 조건(실온)에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 초음파추출기로 약 1 내지 12 시간 동안 추출하는 것을 의미한다. 상기 초음파추출의 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며, 추출 결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.
보다 구체적으로 상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출되며, 바람직하게는 에탄올을 용매로 추출한 줄의관말 에탄올 추출물이지만, 상기 예시에 국한되지 않는다.
추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 상기 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다.
상기 추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
상기 줄의관말 추출물은 면역 세포에서 TLR4에 대한 LPS의 결합에 대한 길항 효과를 나타내어, NF-Κb, PI3K/Akt 및 MAPKs 신호 전달 경로를 억제하는 것이다.
또한, 신경 염증 반응과 관련된 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 축적을 억제할 수 있다.
줄의관말 추출물은 유의한 세포 독성없이 산화 질소(NO) 및 프로스타글란딘(prostaglandin) E2를 포함한 전 염증 매개체의 LPS 유발 분비를 유의하게 억제한다.
이러한 결과와 일치하여, 줄의관말 추출물은 유도성 NO 합성 효소 및 시클로 옥시제나제-2(cyclooxygenase-2)와 같은 조절 효소의 LPS-유도된 발현을 억제하였다. 줄의관말 추출물은 또한 프로-염증성 사이토 카인, 종양 괴사 인자-α 및 인터루킨-1β의 LPS-유도 생산 및 발현을 하향 조절한다.
항 신경 염증 효과에 대해, 줄의관말 추출물은 세포질에서 κB-α 억제제의 분해를 파괴함으로써 핵 인자-κB(NF-κB)의 핵 전좌 및 DNA 결합을 억제한다.
상기 줄의관말 추출물은 Toll-like receptor 4(TLR4) 및 골수 분화 인자 88의 발현 증강뿐만 아니라 LPS 처리된 BV2 세포에서의 LPS 및 TLR4의 결합을 효과적으로 억제한다.
상기 줄의관말 추출물은 LPS로 유발된 활성 산소종(ROS) 생성을 현저히 감소시켜 강력한 항산화 효과를 나타낸다. 이러한 사정에 비추어, 줄의관말 추출물은 TLR4 길항 및/또는 ROS 축적 제거에 의한 NF-κB 신호 전달의 불활성화를 통해 BV2 소교세포에서 LPS-매개 신경 염증 작용을 억제할 수 있다.
바람직하게, 상기 줄의관말 추출물은 줄의관말 에탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이다.
상기 분획물은 줄의관말 에탄올 추출물과 비교하여, 보다 우수한 신경 염증 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
보다 바람직하게, 본 발명의 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 에탄올 추출물의 분획물을 발효시킨, 줄의관말 분획물의 발효물이다.
상기 발효물은 에탄올을 이용하여 초음파 추출법에 의해 줄의관말 에탄올 추출물을 제조하고, 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드를 분획 용매로 이용하여 분획물을 제조한 이후, 상기 분획물에 당을 혼합하고, 발효균을 접종시켜 3 내지 5일 정도 상온에서 발효시킨 제조하였다.
상기 분획물과 혼합한 당 성분은 미생물의 대사과정에서 탄소원으로 사용되어 알코올로 전환시키게 되므로, 천연물 내의 유효성분 특히, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테킨 등은 당화되어 안정한 화합물로 존재하게 되어 있어 발효를 통해 유효성분 함량 추출율을 증가시키고 당이 배제되어 활성화된 유효성분에 의해 골 관절염의 예방 또는 치료를 상승시킬 수 있다.
배지에 일정한 농도 (약 105 내지 107 CFU/ml)로 미생물을 접종하여 pH 5.5 내지 6.5, 온도 25 내지 35℃, 배양 시간은 48 내지 120시간의 조건을 유지하면서 배양한 후, 이 발효물을 이용하여 줄의관말 분획물의 발효물을 수득할 수 있다.
상기 발효에 사용하는 미생물로는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게 자형피(刺荊皮) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게 줄의관말 분획물의 발효물 및 자형피 추출물을 포함할 수 있다.
상기 자형피는 박태기나무(Cercis chinensis Bunge)의 껍질을 이용하여 추출한 것으로, 상기 박태기나무는 재배하는 낙엽관목으로 높이 35m에 달하며 피목이 많고 골속은 백색이다. 잎은 호생이며 단엽으로 딱딱하고 심장형이며 기부에 5출맥이 발달한다. 꽃은 자홍색으로 4월에 핀다. 열매는 협과로 89월에 익는다. 종자는 편평한 타원형이고 황록색이다.
신경 염증의 예방 또는 치료 효과를 상승시키기 위하여, 줄의관말 에탄올 추출물의 발효물에 자형피 추출물을 소량 혼합 사용함에 따라 각 구성 성분의 혼합작용으로 인해, 신경 염증의 예방 또는 치료 효과가 더욱 상승한다.
이에, 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 추출물 10 내지 20 중량부로 포함할 수 있다.
상기 자형피 추출물은 자형피를 사용하여 추출물을 제조한 뒤 이를 발효한 것일 수 있다. 자형피 추출물을 발효하여 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 바람직하게 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 발효 추출물 10 내지 20 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 줄의관말 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 줄의관말 추출물은 상세하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 상세하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다. 본 발명의 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 신경염증 활성용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 줄의관말 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 줄의관말 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 줄의관말 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 상세하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증의 예방 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 줄의관말 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 줄의관말 추출물은 신경 염증의 예방 또는 치료를 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 줄의관말 추출물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 줄의관말 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
다만, 상기와 같이 줄의관말 추출물만 식품 조성물로 이용하거나, 자형피 추출물을 추가로 포함하는 조성물을 식품 조성물로 이용하는 경우에는 줄의관말 추출물 및 자형피 추출물 고유의 맛과 향으로 인해 기호성이 떨어지는 문제가 발생한다.
이에, 바람직하게는 수호초 추출물, 비비추 추출물 및 결명자 추출물을 추가로 포함하여, 기호성을 높이고, 신경 염증 예방 및 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
수호초(Pachysandra terminalis)는 나무 그늘에서 자라며 원줄기가 옆으로 벋으면서 끝이 곧추 서고 녹색이며 처음에는 잔 털이 있으나 점차 없어진다. 높이 30cm 내외로 자란다. 잎은 어긋나지만 윗부분에 모여 달리고 달걀을 거꾸로 세운 듯한 모양이며 윗부분에 톱니가 있다. 잎 표면 맥 위에 잔 털이 있고 밑부분이 좁아져 잎자루가 된다. 또한 꽃은 4 또는 5월에 피고 흰색이며 수상꽃차례에 달린다. 암꽃은 꽃이삭 밑부분에 약간 달리고 수꽃은 윗부분에 많이 달린다. 꽃받침은 4개로 갈라지고 꽃잎은 없다. 수술은 3 내지 5개이고 암술대는 2개로 갈라져서 젖혀진다. 열매는 핵과로서 달걀 모양이고 겉에 털이 없다. 한국, 일본, 사할린섬, 중국에 분포한다.
비비추(Hosta longipes)는 산지의 냇가나 습기가 많은 곳에서 잘 자라며 높이 30 내지 40cm이다. 잎은 모두 뿌리에서 돋아서 비스듬히 자란다. 잎은 타원형이며 끝이 뾰족하고 8 또는 9맥이 있다. 꽃은 연한 자줏빛으로 7 또는 8월에 피고 한쪽으로 치우쳐서 총상으로 달리며 꽃줄기는 길이 30 내지 40cm이다. 포는 얇은 막질이고 자줏빛이 도는 흰색이며 작은꽃자루의 길이와 거의 비슷하다. 화관은 끝이 6개로 갈라져서 갈래조각이 약간 뒤로 젖혀지고 6개의 수술과 1개의 암술이 길게 꽃 밖으로 나온다. 열매는 삭과로 긴 타원형이다. 종자는 검은색으로서 가장자리에 날개가 있다. 연한 순을 식용하며 관상용으로 심는다. 야생종은 한국·일본·중국 등지에 분포한다. 비비추는 원예종으로 다양한 품종이 개발되어 외국에서 정원식물로 인기가 높다.
결명자(Senna tora (L.) Roxb.)는 재배하는 일년초로 높이가 2m에 달한다. 잎은 짝수1회우상복엽으로 2 내지 4쌍의 소엽이 달리고 소엽은 도란형이며 끝이 약간 뾰족해지고 예저 또는 원저이다. 꽃은 황색으로 꽃자루가 있으며 68월에 잎겨드랑이에 12개 달린다. 열매는 협과로 활처럼 구부러져 있다.
보다 바람직하게, 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물은 줄의관말 분획물의 발효물을 포함하며, 상기 줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 발효 추출물 10 내지 20 중량부, 수호초 추출물 1 내지 5 중량부, 비비추 추출물 1 내지 5 중량부 및 결명자 추출물 10 내지 15 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다. 즉, 상기 범위 내에서 식품 조성물로 이용 시 기호성이 상승됨과 동시에, 각 추출물의 상호 작용에 의해 신경 염증의 예방 및 치료 효과가 더욱 상승한다.
본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 조성물로, 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과 나타내며, 신경 염증의 치료에 이용하더라도 부작용이 없는 신경 염증 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하는 신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 기호도 높은 신경 염증 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 BV2 소교세포의 세포 생존 능력에 대한 EECC 및 LPS의 영향에 대한 결과이다.
도 2는 BV2 소교세포의 세포 생존 능력에 대한 EECC 및 LPS의 영향에 대한 결과이다.
도 3은 LPS 자극 BV2 소교세포에서 EECC에 의한 NO 생산 정도에 대한 결과이다.
도 4는 LPS 자극 BV2 소교세포에서 EECC에 의한 PGE2 생산 정도에 대한 결과이다.
도 5는 LPS 자극 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 iNOS 및 COX-2 발현 억제에 대한 결과이다.
도 6은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, TNF-α 측정 결과이다.
도 7은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, IL-1β 측정 결과이다.
도 8은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, 표시된 항체 및 ECL 검출 시스템을 사용하여 TNF-α 및 IL-1β 단백질의 발현을 측정 결과이다.
도 9는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 NF-κB 활성화의 억제를 확인하기 위한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 10은 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 NF-κB 활성화의 억제를 확인하기 위한 EMSA에 의해 NF-κB의 DNA 결합 활성을 검정 결과이다.
도 11은 LPS에 의한 TLR4 및 Myd88의 발현 감퇴, BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS 및 TLR4 간의 상호 작용을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 12는 BV2 세포의 표면상의 LPS 결합을 유동 세포 계측기로 측정한 실험 결과이다.
도 13은 LPS에 의한 TLR4 및 Myd88의 발현 감퇴, BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS 및 TLR4 간의 상호 작용을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 14는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 ROS 생성의 저해를 확인하기 위하여, DCF 형광은 유동 세포 계측법에 의해 측정한 결과이다.
도 15는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 ROS 생성의 저해를 확인하기 위하여, DCF-DA로 염색 한 후, 형광 현미경(원래 배율, 200 배)을 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는 BV2 소교세포의 세포 생존 능력에 대한 EECC 및 LPS의 영향에 대한 결과이다.
도 3은 LPS 자극 BV2 소교세포에서 EECC에 의한 NO 생산 정도에 대한 결과이다.
도 4는 LPS 자극 BV2 소교세포에서 EECC에 의한 PGE2 생산 정도에 대한 결과이다.
도 5는 LPS 자극 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 iNOS 및 COX-2 발현 억제에 대한 결과이다.
도 6은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, TNF-α 측정 결과이다.
도 7은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, IL-1β 측정 결과이다.
도 8은 BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도 생산 및 친염증성 사이토 카인의 발현 억제를 확인하기 위한, 표시된 항체 및 ECL 검출 시스템을 사용하여 TNF-α 및 IL-1β 단백질의 발현을 측정 결과이다.
도 9는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 NF-κB 활성화의 억제를 확인하기 위한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 10은 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 NF-κB 활성화의 억제를 확인하기 위한 EMSA에 의해 NF-κB의 DNA 결합 활성을 검정 결과이다.
도 11은 LPS에 의한 TLR4 및 Myd88의 발현 감퇴, BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS 및 TLR4 간의 상호 작용을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 12는 BV2 세포의 표면상의 LPS 결합을 유동 세포 계측기로 측정한 실험 결과이다.
도 13은 LPS에 의한 TLR4 및 Myd88의 발현 감퇴, BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 LPS 및 TLR4 간의 상호 작용을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 14는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 ROS 생성의 저해를 확인하기 위하여, DCF 형광은 유동 세포 계측법에 의해 측정한 결과이다.
도 15는 BV2 소교 세포에서 EECC에 의한 LPS- 유도된 ROS 생성의 저해를 확인하기 위하여, DCF-DA로 염색 한 후, 형광 현미경(원래 배율, 200 배)을 이용하여 확인한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 줄의말관 추출물의 제조]
이 연구에서 사용된 줄의말관 추출물(이하 EECC라 한다)는 국립해양생물자원관에서 제공받아 사용하였다. EECC의 준비를 위해 줄의말관(C. costata)는 2016 년 3월 울릉도 근해에서 수집하였다. 수집된 줄의말관은 수돗물로 세척하여 시료 표면에 부착된 판, 선단 및 모래를 제거한 후 -20℃에서 보관하였다. 동결된 줄의말관 샘플은 추출 전에 분쇄기를 사용하여 동결 건조시키고 균질화하였다. 건조된 분말은 초음파 추출법에 의해 70 % 에탄올(1:10 w/v)로 1 시간(5회)동안 추출한 후, 상기 추출물(EECC)는 회전 증발기(Rikakikai Co., Ltd., 도쿄, 일본)를 이용하여, 진공 상태에서 건조시켰다. 추출물은 실험에 사용하기 전에 디메틸설폭시드(DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 용해하여 사용하였다.
[실험예 1: 줄의말관 추출물의 신경 염증 예방 및 치료에 대한 효과 확인]
1. 실험 방법
세포 배양 및 처리
BV2 소교세포(microglia)는 37 ℃에서 5 % CO2 및 95 % 공기를 함유하는 가습 조건에서, 10% (v/v) 소태아혈청(FBS, WelGENE Inc.), L- 글루타민(2mM), 페니실린(100 U/㎖) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(100U/㎖, WelGENE Inc.)이 포함된 Dulbecco Modified Eagle 's Medium(DMEM, Welgene Inc., 대한민국, 대구)에서 배양하였다.
BV2 세포에서 EECC의 효능을 확인하기 위해 배지를 신선한 DMEM으로 교환하고 지시된 기간 동안 EECC의 존재 또는 부재하에 100ng/ml LPS(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 첨가하였다.
세포 생존 능력의 평가
세포 생존력 연구를 위해, BV2 세포를 웰 당 1x104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 24시간 동안 다양한 농도의 EECC로 세포를 처리하거나 1시간 동안 다른 농도의 EECC로 전처리하고, 24시간 경과 후 LPS(100ng/ml) 처리하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 각 웰에 3-(4,5- 디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, 0.5 mg/ml, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 첨가하고, 37 ℃에서 3 시간 동안 추가 배양하였다. 상등액을 DMSO로 대체하여 청색 포르마잔 결정(blue formazan crystals)을 용해하였다.
10 분 후, 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 마이크로플레이트 판독기 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)를 사용하여 540 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정하였다.
염증 매개체 및 사이토 카인의 생산 측정
일산화질소(NO) 생산의 수준은 Griess 반응에 의해 배지에서 안정한 NO 카보 보레이트아질산염을 측정함으로써 간접적으로 결정하였다. 요약하면, 조건 매질을 동일한 부피의 그리스 시약(Sigma-Aldrich Chemical Co.)과 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 540 nm에서의 광학 밀도를 ELISA 마이크로플레이트 판독기로 측정하고, 아질산염의 농도는 아질산 나트륨의 공지된 농도로부터 생성된 표준 곡선에 따라 계산하였다. 배양 배지에서 프로스타글란딘 E2(PGE2), 종양 괴사 인자 (TNF)-α 및 인터루킨(IL)-1β의 수준을 상업적 ELISA 키트(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
단백질 분리 및 Western blot 분석
제작자의 프로토콜에 따라 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 세포질 및 핵 단백질을 분리하였다. Western-blotting의 경우 sodium-dodecyl sulfate (SDS) 겔 전기 영동으로 분리한 후 동일한 양의 단백질 시료를 polyvinylidene difluoride membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전기 영동으로 옮겼다. 그 후 막을 0.1 % Triton X-100 (TBST)이 포함된 5 % 탈지 분유/Tris 완충 식염수로 1 시간 동안 차단한 다음 4 ℃에서 밤새 특이 항체로 프로빙 하였다. TBST로 1 차 항체를 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 2 시간 동안 적절한 양의 horseradish-peroxidase(HRP)-conjugated 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 제조자의 지시에 따라 향상된 화학 발광 (ECL) 키트 (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA)에 의해 검출하였다.
전기 이동성 분석 (EMSA)
EMSA는 이전의 연구(Kang et al., 2017)에서 기술된 핵 추출물을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 합성 보완적인 NF-κB 결합 올리고뉴클레오타이드(NF-κB binding oligonucleotides, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)의 바이오티닐화(biotinylation)는 바이오틴 3'-말단 DNA 라벨링 키트(Pierce Biotechnology)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하고, 실온에서 30분 동안 어닐링하였다. 혼합물을 0.5X Tris-보레이트 완충액에서 60분 동안 예비전기영동 한 4% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동으로 분리한 다음 30분 동안 나일론 막 (Hybond ™ N +)으로 옮겼다. LightShift chemiluminescence EMSA 키트 (Pierce Biotechnology)를 사용하여 비오틴으로 표지된 DNA를 검출하였다.
세포 표면의 TLR4 발현 측정
세포 표면의 TLR4 발현에 미치는 EECC의 영향을 조사하기 위해 Alexa Fluor (AF) 488-접합 LPS(100ng/ml, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 BV2 세포로 처리에 앞서, 1 시간 동안 EECC로 전처리하거나 전처리하지 않고 BV2 세포로 처리하였다. 1 시간 배양 후 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)으로 2회 세척하고 0.005 % ethylenediaminetetraacetic acid(Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 수거한 후 유세포 분석기로 분석하였다. Alexa 488은 488개의 아르곤 이온 레이저 라인을 사용하여 여기 상태(excited)로 만들고, 530nm 방출 필터를 사용하여 FL1 채널에서 감지하였다. 샘플의 형광 방출은 이전에 설명한대로 유동 세포 계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 기록하였다.
세포 내 ROS 수준의 검출
세포 내 ROS의 생성은 세포 투과성 형광 프로브, 5,6-carboxy-2 ', 7'- dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 사용하여 모니터링하였다. 요약하면, 세포를 EECC로 1 시간 동안 처리하거나 EECC로 1 시간 동안 전처리 한 다음 LPS의 존재 또는 부재하에 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 어두운 색에서 10 μM DCF-DA (Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 37 ℃에서 15 분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2 회 세정하고, 여기 파장 480 nm 및 방출 파장 525 nm를 갖는 유동 세포 계측기를 사용하여 분석하였다.
형광 현미경 관찰에 의한 ROS 생산의 정도를 관찰하기 위해 유리 커버 슬립에 부착된 세포를 EECC 처리 후 1 시간 동안 100ng/ml LPS와 함께 또는 LPS 처리 없이 자극하였다. 세포를 DCF-DA로 염색하고, PBS로 2 회 세척한 다음, 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)로 20분간 고정시켰다. 고정된 세포는 형광 현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분석하였다.
통계 분석
데이터 값은 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 그룹 간 비교는 Dunnett의 다중 범위 테스트를 통해 수행하였다. 차이는 p <0.05에서 통계적으로 유의하다고 간주된다.
2. 실험 평가
BV2 소교세포의 세포 생존 능력에 대한 EECC 평가
실험 조건을 확립하기 위해, BV2 세포를 광범위한 EECC로 24 시간 동안 처리하고, 세포 생존력을 MTT 분석에 의해 조사하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 200 ㎍/㎖까지의 농도에서는 세포 독성 효과가 유발되지 않았지만, 300㎍/㎖ 농도의 처리 군에서는 세포 생존율이 현저하게 감소하였다.
또한, 100ng/ml LPS(도 2)의 존재 하에서도 200μg/ml까지의 EECC 농도에서 유의한 변화는 발견되지 않았다. 따라서 LPS로 자극된 BV2 세포에서 EECC의 항 염증 효과를 연구하기 위해 EECC의 최대 농도를 200μg/ml로 선택하였다.
EECC의 BV2 소교세포에서의 LPS에 의한 NO 및 PGE2 생성
LPS에 의한 NO 및 PGE2의 생성에 대한 EECC의 억제 특성을 결정하기 위해 대표적인 염증 매개 인자인 BV2 세포를 1 시간 동안 다양한 농도의 EECC로 전처리 한 다음 100 ng/ml LPS를 사용하거나 사용하지 않고 자극하였다. 배양 상등액 중의 NO 및 PGE2의 수준은 각각 Griess 반응 분석 및 ELISA에 의해 결정하였다도 3 및 도 4와 같이, LPS만 처리한 경우는, LPS 처리 없는 군과 비교하여 NO 및 PGE2 생성을 현저하게 증가하였다. 반대로, EECC는 BV2 세포에서 농도 의존적으로 LPS에 의한 NO 및 PGE2 분비를 유의하게 억제하였다.
EECC의 BV2 소교세포에서의 LPS로 유도된 NO 합성 효소(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현 정도
NO 및 PGE2 생산에 대한 EECC의 억제 효과가 각각 합성 효소, iNOS 및 COX-2의 발현 조절과 관련이 있는지를 결정하였다. 도 5에 도시 된 바와 같이, EECC는 LPS-자극된 BV2 세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하였다. 이는 EECC가 그들의 인코딩 유전자의 발현을 감소시킴으로써 NO 및 PGE2 생산을 억제한다는 것을 의미한다.
EECC의 LPS-자극 BV2 소교세포에서의 프로-염증성 사이토카인의 생성 및 발현 정도
TNF-α 및 IL-6를 포함하는 프로-염증성 사이토카인의 생성에 대한 EECC의 영향을 LPS-자극된 BV2 세포에서 조사하였다. ELISA 결과에 따르면, 도 6 및 도 7에 따르면, 사이토카인의 생산은 LPS-자극된 BV2 세포의 배양 배지에서 유의하게 증가하였으며, 이는 농도-의존적 방식으로 EECC의 존재하에 감소하였다. 또한, EECC에 의한 TNF-α 및 IL-6 생산의 저해는 그들의 발현 억제와 관련이있다(도 8).
BV2 소교세포에서의 EECC에 의한 NF-κB의 LPS-유도된 활성화 억제
EECC가 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 활성을 약화시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 세포질 및 핵 추출물을 사용하여 면역 블로팅 한 결과, EECC 전처리는 LPS-자극된 BV2 세포에서 κB-α(IκBα) 분해 억제제의 감쇠와 관련된 NF-κB p65 소단위(subunit)의 핵 축적을 억제하였다(도 4A). 이러한 결과와 일치하여, NF-κB의 DNA 결합 활성은 LPS- 처리된 세포에서 현저히 증가하는 반면, EECC를 사용한 전처리는 NF-κB의 전사 활성화를 약화시킴에 따라, NF-κB의 LPS-유도된 DNA 결합 활성을 억제하였다(도 10).
EECC의 BV2 소교세포에서의 LPS-유도된 TLT4 및 Myd88 발현 억제
EECC의 항염증 효과가 TLR 신호 전달 경로의 차단과 관련이 있는지를 결정하기 위해 LPS 및 EECC가 TLT4 및 골수분화인자88(Myd88)의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. immunoblotting 결과(도 11)에 따르면, TLT4와 Myd88 단백질의 수준은 이전 연구(Yoon et al., 2013)의 결과와 유사하게 시간 의존적 방식으로 LPS 치료에서 현저하게 증가하였다. 그러나 EECC가 전처리되었을 때, LPS에 의한 단백질의 발현은 농도 의존적으로 억제되어(도 12), EECC가 BV2 세포의 LPS 활성화 TLR4 신호 전달 경로를 억제할 수 있음을 의미한다.
BV2 소교 세포에서의 EECC에 의한 LPS 및 TLR4 사이의 LPS 매개 상호 작용의 차단
우리는 EECC가 LPS로 처리된 BV2 세포 표면에서 LPS와 TLR4 사이의 상호 작용을 억제하는지 더 평가하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 세포막 외부에 부착된 LPS의 형광 세기는 LPS 단독으로 처리 한 세포에서는 크게 증가하지만, EECC 존재하에 LPS로 처리 한 세포에서는 현저하게 약화되었다. 이것은 TLR4에 대한 LPS의 결합이 EECC의 존재 하에서 억제되었음을 나타낸다.
BV2 소교 세포에서의 EECC에 의한 LPS-유도된 ROS 생성의 감소
EECC의 항산화 능을 조사하기 위해 EECC가 LPS-유도된 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 형광 프로브 DCF-DA를 사용한 유동 세포 계측 결과는 ROS의 수준은 LPS의 치료와 함께 점차적으로 증가하고, 1시간이 최고점에 이르렀으며, 그 후 감소하였다. 그러나 EECC만을 처치한 군에서는 ROS 생성을 유도하지 않았고 EECC를 전처리한 군에서는 LPS에 의해 방출된 ROS 수준을 효과적으로 감소시켰다 (도 14). ROS 생성에 대한 EECC의 억제 효과는 형광 현미경을 사용하는 실험에서 유사하게 관찰되었다(도 15). 또한, 양성 대조군으로 사용된 N-아세틸 시스테인 (NAC)-전처리된 세포에서, LPS에 의한 ROS의 생성은 EECC가 강력한 ROS 소거 효과에 의해 완전히 차단되었다.
[제조예 2: 줄의관말 분획물의 제조]
갈조류인 줄의관말(C. costata)은 울릉도 근처에서 수집하였다. 수집 후 줄의관말(C. costata)을 수돗물로 씻어 시료 표면에 부착된 판, 선상 모래 및 모래를 제거한 후 -20℃에서 보관하였다. 냉동된 샘플을 추출하기 전에 분쇄기를 사용하여 동결 건조시키고 균질화 하였다.
건조된 분말을 초음파 처리에 의해 70% EtOH (1:10 w/v)로 1시간(5 회) 추출물을 획득하였다.
줄의관말 에탄올 추출물을 증류수에 현탁 후, 현탁액과 메틸렌클로라이드를 1:1의 비율로 분획 깔대기에 넣고, 메틸렌클로라이드층과 물층을 분획하였고, 메틸렌클로라이드층을 다시 감압 농축하여 줄의관말 분획물(EECP)을 제조하였다.
[제조예 3: 줄의관말 발효물의 제조]
상기 제조예 2에서 제조된 분획물 100 중량부에 당류 5 중량부를 혼합하였다. 이후, 락토바실러스 살리바리우스를 106CFU/ml로 접종하고 pH 5.5 내지 6.5, 온도 23 내지 28℃의 조건을 유지하면서 72 시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 발효물을 섞어주었다. 발효에 사용한 미생물인 Saccharomyces cerevisiae KCTC7913는 접종 24시간 전에 35℃에서 액체 배양하여 준비하였으며, 이를 희석하여 발효의 접종균으로 사용하였다.
상기 발효물에 70% 에탄올을 발효물의 중량 대비 10 내지 20배로 첨가하여 발효물 내의 유효성분을 추출하고 1㎛ pore size의 paper filter를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 줄의관말 발효물(EECB)을 수득하였다.
[제조예 4: 신경 염증의 예방 또는 치료용 조성물의 제조]
1. 자형피 추출물(CCBE)의 제조
박태기나무 껍질을 세척하고, 건조한 이후, 분쇄기를 사용하여 분쇄하여, 자형피 분말을 제조하였다.
상기 자형피 분말을 초음파 처리에 의해 70% EtOH (1:10 w/v)로 1시간(5 회) 추출물을 획득하였다.
2. 천연 추출물의 제조
상기 자형피 추출물의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 비비추 추출물(HLME) 수호초 추출물(PTSE) 및 결명자 추출물(STRE)을 제조하였다.
3. 발효 자형피 추출물(CCBB)의 제조
상기 자형피 추출물은 줄의관말 발효물 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 발효 자형피 추출물을 제조하였다.
4. 골 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조
상기 줄의관말 추출물(EECC), 자형피 추출물(CCBE), 비비추 추출물(HLME) 수호초 추출물(PTSE) 및 결명자 추출물(STRE)을을 혼합하여 골 관잘염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하였다.
보다 구체적인 조성물의 함량은 하기 표 1과 같다.
| SP1 | SP2 | SP3 | SP4 | SP5 | SP6 | SP7 | SP8 | SP9 | SP10 | |
| EECC | 100 | 100 | 100 | 100 | - | - | - | - | - | - |
| EECP | - | - | - | - | 100 | 100 | 100 | 100 | - | - |
| EECB | - | - | - | - | - | - | - | - | 100 | 100 |
| CCBE | 5 | 10 | 20 | 25 | 5 | 10 | 20 | 25 | 20 | - |
| HLME | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 5 | 5 |
| PTSE | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 0.5 | 1 | 5 | 10 | 5 | 5 |
| STRE | 5 | 10 | 15 | 20 | 5 | 10 | 15 | 20 | 15 | 15 |
| CCBB | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 |
(단위 중량부)[실험예 2: BV2 소교세포에서의 항염증 효과]
상기 실험예 1에서 EECC에 대한 LPS로 유도된 NO 합성 효소(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현 정도(A), 프로-염증성 사이토카인의 생성 및 발현(B), NF-κB의 LPS-유도된 활성화 억제 정도(C), LPS-유도된 TLT4 및 Myd88 발현 억제 정도(D), LPS 및 TLR4 사이의 LPS 매개 상호 작용의 차단 정도(E) 및 LPS-유도된 ROS 생성의 감소 정도(F)를 측정하고, SP1 내지 SP10의 효과를 비교 실험하였다.
EECC와의 상대적인 평가를 진행하기 위하여, LPS로 유도된 NO 합성 효소(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 발현 정도(A), 프로-염증성 사이토카인의 생성 및 발현(B), NF-κB의 LPS-유도된 활성화 억제 정도(C), LPS-유도된 TLT4 및 Myd88 발현 억제 정도(D), LPS 및 TLR4 사이의 LPS 매개 상호 작용의 차단 정도(E) 및 LPS-유도된 ROS 생성의 감소 정도(F)를 모두 지수 5로 설정하고, SP1 내지 SP10에 대한 효과를 지수로 나타내었다.
상기 지수는 1 내지 10으로 평가되며, 점수가 높을수록 효과가 우수함을 나타낸다.
| EECC | SP1 | SP2 | SP3 | SP4 | SP5 | SP6 | SP7 | SP8 | SP9 | SP10 | |
| A | 5 | 4 | 6 | 7 | 4 | 4 | 7 | 8 | 6 | 8 | 9 |
| B | 5 | 5 | 6 | 7 | 5 | 5 | 7 | 8 | 5 | 8 | 9 |
| C | 5 | 4 | 7 | 7 | 6 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 8 |
| D | 5 | 5 | 5 | 8 | 5 | 4 | 8 | 8 | 5 | 9 | 8 |
| E | 5 | 5 | 6 | 7 | 5 | 4 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, SP2, SP3, SP6, SP7, SP9 및 SP10에서 EECC에 비해 상대적으로 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
즉, EECC만을 단독으로 사용하는 경우에 비해, 복합 추출물로 이용하는 경우, 신경 염증의 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인하였다.
[실험예 3: 관능 평가]
상기 SP1 내지 SP10이 기능성 식품조성물로 제공될 수 있도록 각 조합에 따른 향미와 맛에 대한 관능성을 평가하였다.
따라서 EECC, SP1 내지 SP10을 이용하여 차(茶) 음료로 제조하고, 성인남녀 20인에 대한 관능성 평가를 수행하였다. 관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
한편, 하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다.
| EECC | SP1 | SP2 | SP3 | SP4 | SP5 | SP6 | SP7 | SP8 | SP9 | SP10 | |
| 향 | 3 | 3 | 5 | 7 | 4 | 4 | 6 | 7 | 6 | 8 | 9 |
| 맛 | 2 | 4 | 6 | 7 | 5 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
| 기호성 | 3 | 4 | 6 | 6 | 3 | 5 | 7 | 7 | 5 | 8 | 9 |
(단위 지수)상기 표 3에 나타낸 바와 같이, EECC만을 차로 이용하는 경우에는 향, 맛 및 기호성이 떨어지는 것을 확인하였다. 반면, 복합 추출물로 제조하는 경우에는 향, 맛 및 기호성이 우수한 기능성 식품 조성물로 제공이 가능함을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (8)
- 줄의관말(Carpomitra costata) 추출물을 포함하며,
상기 줄의관말 추출물은 염증 매개 인자 및 사이토카인의 생산을 감소시시켜, 소교세포의 항 신경 염증 효과를 나타내고,
자형피 발효 추출물, 수호초 추출물, 비비추 추출물 및 결명자 추출물을 더 포함하며,
줄의관말 분획물의 발효물 100 중량부에 대하여, 자형피 발효 추출물 10 내지 20 중량부, 수호초 추출물 1 내지 5 중량부, 비비추 추출물 1 내지 5 중량부 및 결명자 추출물 10 내지 15 중량부로 포함하는
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출되는
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 에탄올을 이용하여 추출한 줄의관말 에탄올 추출물인
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 줄의관말로부터 수득된 추출물을 유기 용매를 이용하여 분획한 분획물인
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 면역 세포에서 TLR4에 대한 LPS의 결합에 대한 길항 효과를 나타내어,
NF-Κb, PI3K/Akt 및 MAPKs 신호 전달 경로를 억제하는 것인
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 줄의관말 추출물은 신경 염증 반응과 관련된 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 축적을 억제하는
신경 염증 예방 및 치료용 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
신경 염증 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
신경 염증 예방용 기능성 식품 조성물.
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