KR20190079202A - 감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도 - Google Patents

감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14) 균주를 이용하여 제조한 감귤류 열매 발효물은 항산화 활성 및 피부 재생효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 화장료, 건강기능식품, 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도{Fermentation method of lactic acid bacteria using citrus fruit and its use}
본 발명은 감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피 및 피하지방 조직의 3개의 층으로 이루어져 있으며, 외부환경으로부터 인체를 보호하는 일차 방어막 기능을 한다. 이중에서도 표피조직의 가장 바깥층에 위치하는 각질층은 각질과 지질로 구성되어 있으면서 유해물질 침투나 수분증발을 억제하고, 박테리아나 외부 자극으로부터 인체를 보호한다.
각질층은 4주(28일)를 주기로 탈피되어 새로 형성된다. 또한, 진피 윗부분에 주로 많이 분포하는 섬유아세포는 피부탄력 기능과 보호기능을 갖는 섬유 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴을 만들어 내는 모세포의 역할을 하고 있다. 그러나 외부의 온도 및 습도의 변화, 자외선, 공해물질뿐만 아니라 외부로부터의 과도한 물리적, 화학적 자극, 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 보습기능과 같은 정상기능을 심각하게 저하시키고, 피부의 노화현상을 촉진시켜 피부를 손상시키게 되는데, 이러한 현상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위해 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성물질들을 화장품에 함유하여 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키려는 노력이 있어 왔다.
섬유아세포에서 발현되는 엘라스타아제(elastase)는 피부 탄력을 관장하는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 단백질 분해효소이며, 엘라스틴은 세포조직의 탄성력을 갖게 하는 단백질 섬유로서, 피부연결조직을 구성하는 중요한 단백질이다. 엘라스타아제는 콜라겐 및 피브리노겐 면역계를 분해하고 외부에서 침입하는 미생물을 파괴하며, 세포재생에 필요한 공간과 단백질을 분해하기도 하며, 노화가 진행되면서는 발현량이 급증하고, 피부에 과도한 주름을 발생시킨다.
피부는 연령의 증가 또는 자외선, 외부 오염 물질 및 스트레스에 의해 점점 손상되고 이러한 요인들로부터 피부를 보호하는 기능이 약화됨으로써, 세포 보호 및 증식 능력이 떨어진다. 이 경우 우리 몸은 손상된 피부에 대하여 피부 재생 과정을 시작한다. 피부 재생은 손상에 대한 조직의 반응이며 조직회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제(differentiation and replication), 기질 단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생 및 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다.
피부가 손상되면 염증반응에 이어 세포증식 과정이 진행되는데, 이는 피부가 손상된 후 2일부터 3주까지 지속된다. 이 시기에 섬유아세포는 콜라겐을 축적시켜 손상된 피부의 흠을 채우고, 섬유아세포의 증식을 유도하며, 상처부위에서는 새로운 세포와 간질성분의 재구성이 일어난다. 육아과정이라고도 불리는 이 증식과정은 상처발생 2일부터 3주까지 지속된다. 새로운 세포에 의한 어린 피부는 피부 세포의 활성이 활발하여 진피(dermis)의 섬유아세포(fibroblast)가 피부의 탄력 및 주름형성 억제에 중요한 콜라겐(collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하다. 그리고 피부 보습에 필수적인 히루론산(hyaluronic acid)을 포함한 당단백질류인 GAGs(Glucosaminoglycans) 합성도 활발하여 피부에 탄력, 보습 및 유연성을 부여한다. 표피(epidermis)에서는 기저세포(basal layer cell)의 증식이 활발하고, 피부세포간의 결합을 강화시키는 라미닌, 인테그린 및 데스모좀과 같은 결합단백질(adhesion protein)의 생성이 균형적으로 이루어져 세포조직을 강화시켜 건강한 피부를 유지해 준다.
감귤류에는 플라보노이드류, 카르티노이드류, 쿠르마린류 및 정유류 등 다양한 생리활성 물질들이 포함돼 있어 예전부터 일본 및 국내를 중심으로 다양한 기능성 평가 작업이 활발히 진행되어 왔다. 특히, 감귤 과피가 가지고 있는 생리 활성 물질들 중 헤스페리딘 및 나린진 등 대표적인 플라보노이드 성분들에 대한 최근 연구에 관련 업계들의 시선이 집중되고 있다.
감귤은 운항과(Rutaceae) 감귤속(Citrus sp.)의 식용 식물로 6대륙 100개국 이상에서 재배되는 전 세계적으로 즐겨 먹는 과일 중 하나이다. 감귤에는 카로티노이드(carotenoid), 플라보노이드(flavonoid), 셀룰로오스(cellulose), 펙틴(pectin), 리모노이드(limonoid), 비타민류 등의 다양한 생리활성물질들이 다량 함유되어 있어 항산화, 항염, 항암 등 다양한 생리적 작용을 나타낸다고 보고되어 있다.
젖산균(lactic acid bacteria)은 당류를 발효하여 젖산 및 다양한 대사산물을 생산하는 미생물로 최근에는 건강증진과 질병을 예방하고자 하는 프로바이오틱스로서의 연구가 폭넓게 진행되고 있으며, 각종 발효식품, 사료첨가제 등의 제조에 널리 이용되고 있다. 또한, 발효식품을 통하여 인체 내로 섭취한 젖산균은 장 내로 유입되어 유익균주의 생육을 부양하고 유해세균을 억제하여 장내 유용미생물의 균형을 유지시킨다. 그리고 항산화작용, 항암작용, 면역 활성화 작용, 혈중 콜레스테롤 저하 등의 작용이 있어 질병을 예방하는데 도움이 된다고 보고되어 있다.
한편, 한국공개특허 제2013-0027227호는 감귤류 꽃을 이용한 피부 상태 개선용 화장료를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1651833호는 감귤류 과피 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 감귤류 열매를 이용한 유산균 발효 방법 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14, KACC91981P) 균주를 각각 접종하여 감귤류 열매 발효물을 제조한 경우, 발효 전보다 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 항산화 활성이 증가하였으며, 감귤류 열매 추출물보다 피부 재생효과가 우수할 뿐만 아니라, 다른 유산균 균주인 락토바실러스 플랜타룸(KCTC21004) 및 락토바실러스 람노서스(KCTC3237) 균주를 각각 접종하여 제조한 감귤류 열매 발효물에 비해 피부 세포 재생율이 현저히 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 선별된 감귤류 열매(Citrus fruit)를 세척하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 세척한 감귤류 열매에 물을 첨가하고 분쇄한 후 추출하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 감귤류 열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14) 균주를 이용하여 제조한 감귤류 열매 발효물은 항산화 활성 및 피부 재생효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 화장료, 건강기능식품, 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주(A) 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14, KACC91981P) 균주(B)를 각각 접종한 후, 발효시간에 따른 발효물의 pH 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주(A) 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주(B)를 각각 접종한 후, 발효시간에 따른 상기 2종의 유산균 균주의 생균수 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주(A) 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주(B)를 각각 접종하여 발효 전과 후의 총 폴리페놀의 함량변화를 확인한 결과이다.
도 4는 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주(A) 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주(B)를 각각 접종하여 발효 전과 후의 총 플라보노이드의 함량변화를 확인한 결과이다.
도 5는 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주(A) 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주(B)를 각각 접종하여 발효 전과 후의 항산화 활성 변화를 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 선별된 감귤류 열매(Citrus fruit)를 세척하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 세척한 감귤류 열매에 물을 첨가하고 분쇄한 후 추출하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 감귤류 열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법에서, 상기 감귤류 열매 추출물은 용매 추출, 물리적 추출, 효소적 추출 등의 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으나, 바람직하게는 물리적 추출 방법을 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출방법은 유효성분이 파괴되지 않고, 감귤류 열매로부터 활성이 높은 발효물을 얻을 수 있다.
또한, 상기 감귤류 열매 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.
또한, 상기 감귤류 열매는 감귤(Citrus unshiu), 레몬(Citrus limon), 오렌지(Citrus sinensis), 유자(Citrus junos), 자몽(Citrus paradisi) 또는 한라봉(Citrus hybrid Shiranuhi)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 감귤류 열매는 85% 이상 숙성된 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 또는 이들의 혼합 균주일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21)(KACC92083P) 균주, 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14)(KACC91981P) 균주(한국등록특허 제1655852호 참고) 또는 이들의 혼합 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21)(KACC92083P) 균주는 농업생명공학연구원에 2015년 7월 10일자로 기탁하였다.
또한, 상기 단계 3)에서 감귤류 열매 추출물에 1.0×107 내지 1.0×109 CFU/㎖의 유산균을 접종하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1.0×108 CFU/㎖의 유산균을 접종하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 3)에서 발효는 32~42℃에서 20~28시간 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 37℃에서 24시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 3)의 감귤류 열매 발효물의 유산균 생균수는 6.0×108 내지 1.0×1010 CFU/㎖일 수 있으며, 바람직하게는 6.0×109 CFU/㎖일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 2) 및 단계 3) 사이에 감귤류 열매 추출물에 효소를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 효소 처리는 셀룰라아제, 펙티니아제 또는 이들을 혼합처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부 재생용 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 피부 재생용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부 재생용 건강기능식품 조성물에서, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.
본 발명의 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 감귤류 열매 발효물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 감귤류 열매 발효물 이외에 함유하는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 감귤류 열매 발효물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 감귤류 열매 발효물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상처 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 감귤류 열매 발효물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 감귤류 열매 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 감귤류 열매 추출물 및 이의 발효물 제조
85% 이상의 숙성된 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉)를 선별하여 세척한 후, 세척한 감귤류 열매 1 중량부에 대비하여 1,000 중량부의 물을 첨가하고 마쇄기로 분쇄하여 감귤류 열매 추출물을 얻은 다음, 면포를 이용하여 여과하였다. 상기 여과한 감귤류 열매 추출물은 121℃에서 15분간 멸균한 후, 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14, KACC91981P) 균주를 1.0×108 CFU/㎖ 농도로 각각 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효시켜 각각의 감귤류 열매 발효물(이하 '시료'라 함)을 획득하였다.
비교대조군으로 사용한 감귤류 열매 물 추출물 및 감귤류 열매 에탄올 추출물은 상기 동일한 방법으로 감귤류 열매를 선별 및 세척한 후, 감귤류 열매 1 중량부에 대비하여 500 중량부의 물과 에탄올을 각각 첨가하여 80℃에서 6시간 동안 추출하여 제조하였다.
제조예 2. 셀룰라아제를 처리한 감귤류 열매 발효물 제조
85% 이상의 숙성된 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉)를 선별하여 세척한 후, 세척한 감귤류 열매 1 중량부에 대비하여 1,000 중량부의 물을 첨가하고 마쇄기로 분쇄하여 감귤류 열매 추출물을 얻은 다음, 면포를 이용하여 여과하였다. 상기 여과한 감귤류 열매 추출물에 셀룰라아제를 처리하여 반응시킨 후, 121℃에서 15분간 멸균한 다음, 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14, KACC91981P) 균주를 1.0×108 CFU/㎖ 농도로 각각 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효시켜 각각의 감귤류 열매 발효물(이하 '시료'라 함)을 획득하였다.
제조예 3. 펙티나아제를 처리한 감귤류 열매 발효물 제조
85% 이상의 숙성된 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉)를 선별하여 세척한 후, 세척한 감귤류 열매 1 중량부에 대비하여 1,000 중량부의 물을 첨가하고 마쇄기로 분쇄하여 감귤류 열매 추출물을 얻은 다음, 면포를 이용하여 여과하였다. 상기 여과한 감귤류 열매 추출물에 펙티나아제를 처리하여 반응시킨 후, 121℃에서 15분간 멸균한 다음, 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21, KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14, KACC91981P) 균주를 1.0×108 CFU/㎖ 농도로 각각 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효시켜 각각의 감귤류 열매 발효물(이하 '시료'라 함)을 획득하였다.
실시예 1. 감귤류 열매 발효물의 pH 및 유산균 수 변화
본 실시예 1에서는 제조예 1에서 제조한 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 각각 접종한 후, 24시간 동안 발효시키면서 2시간마다 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 3시간마다 발효물의 유산균 생균수를 BCP 첨가 평판측정용 배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 1 및 2에 개시한 바와 같이 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 대해 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14 균주를 접종하였을 때, 모두 발효시간에 따라 pH 값이 감소되고, 유산균 생균수가 증가되는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 사용된 유산균 균주 모두 pH 2 내지 4에서 생존 및 발육이 가능하고, 내산성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 감귤류 열매 발효물의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량 및 항산화 활성 변화
본 실시예 2에서는 제조예 1에서 제조한 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 대해 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 접종하여 발효 전과 후의 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 항산화 활성을 측정하여 비교하였다.
(1) 총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 인몰리브덴산(phosphomolybdate)과 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 약간 변형시켜 측정하였다.
감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물과 이에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 각각 접종하여 제조한 감귤류 열매 발효물을 50㎎/mL로 준비하여 이로부터 20㎕를 취해 2㎖의 튜브에서 1.4㎖의 증류수로 희석하고, 0.1㎖의 폴린-데니스 시약(Folin-Denis reagent)을 첨가하여 진탕하였다. 3분 후에 0.2㎖의 탄산나트륨(sodium carbonate) 포화용액을 첨가하고, 전체를 2㎖로 정용하여 잘 혼합한 후에 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 분광광도계(spectrophotometer, DU 650, Beckman Coulter Inc., Miami, FL, USA)를 이용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 감귤류 열매에 대해 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 각각 발효하였을 때, 발효 전보다 총 폴리페놀 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
(2) 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량은 모레노 등의 방법(Moreno et al., 2000, J. Enthrophamacol., 71, 109-114)에 따라 0.5㎖의 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 10% 질산알루미늄(aluminum nitrate) 및 1M 아세트산칼륨(potassium acetate)를 각 0.1㎖씩 첨가하고, 4.3㎖의 에탄올을 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치시킨 후 ELISA 리더(VERSA, USA)를 이용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 퀘르세틴(Quercetin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 감귤류 열매 추출물에 대해 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 각각 발효하였을 때, 발효 전보다 총 플라보노이드 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
(3) 항산화 활성
감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 추출물에 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 각각 접종하여 제조한 감귤류 열매 발효물을 80% 메탄올을 이용하여 용해하여 이용하였다. 상기 감귤류 열매 추출물 및 발효물 0.2㎖을 각각 시험관에 첨가한 후 0.2mM의 DPPH 용액(80% 메탄올에 용해) 0.8㎖을 가하여 와류 믹서(vortex mixer)로 10초간 혼합한 후, 실온에서 30분간 방치한 후에 525㎚에서 흡광도를 측정하였다. 하기식을 이용하여 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA)을 계산하였으며, 초기 DPPH 농도가 50% 감소될 때까지 필요한 시료의 농도를 EC50(Efficient Concentration)으로 산출하였다.
EDA(%) = (1 - 시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 감귤류 열매 추출물에 대해 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 각각 발효하였을 때, 발효 전보다 항산화 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 감귤류 열매 발효물의 피부재생 효능 평가
제조예 1에서 제조한 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 발효시킨 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 발효물(이하 '시료'라 함)의 피부 재생 효과를 확인하기 위해, 상처치유 어세이(wound healing assay)를 수행하였다.
먼저, 각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×105 세포/웰로 조절한 후 6-웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6-웰 플레이트에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 6-웰 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 뒤, 시료를 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 및 70% 농도로 처리하여 18시간 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하여 그 결과를 하기 표 1 내지 표 5에 개시하였다. 세포 재생율은 하기의 식에 의해 산출되었고, 양성대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였고, 음성대조군은 아무것도 처리하지 않은 것을 의미하며, 3 반복으로 실험을 실시하였다.
세포 재생율(%) = (시료 세포 재생율/음성대조군 세포 재생율) × 100
그 결과, 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주 및 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 발효시킨 감귤류 열매(감귤, 레몬, 오렌지, 유자, 자몽 및 한라봉) 발효물 모두 40% 처리농도까지 농도의존적으로 세포 재생율이 증가하는 것을 확인하였다(표 1 및 표 3).
또한, 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주와 이의 비교대조군인 락토바실러스 플랜타룸 KCTC21004 균주로 발효한 각각의 감귤류 열매 발효물의 세포 재생율을 비교한 결과, 가장 높은 세포 재생율을 보인 40% 처리농도에서, 본 발명의 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주를 이용하여 제조한 감귤류 열매 발효물이 비교대조군인 락토바실러스 플랜타룸 KCTC21004 균주를 이용하여 제조한 감귤류 열매 발효물보다 세포 재생율이 더 높아 피부 재생 효과가 더 우수하였으며(표 2), 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주도 마찬가지로, 비교대조군인 락토바실러스 람노서스 KCTC3237 균주로 발효한 감귤류 열매 발효물보다 세포 재생율이 더 높아 피부 재생 효과가 더 우수한 것을 확인하였다(표 4).
또한, 세포재생 효능에 대한 감귤류 열매 추출물과 발효물 간에 효능을 비교하기 위해, 대조군으로는 상기 제조예 1에서 제조한 감귤류 물 추출물과 에탄올 추출물을 이용하였고, 시험군은 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21 균주로 발효한 감귤류 열매 발효물의 세포활성에서 가장 높은 활성을 보인 40% 처리농도에서 비교하였다. 그 결과, 하기 표 5에 개시한 바와 같이 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주를 이용하여 발효한 감귤류 열매 발효물에 의한 세포재생효능이 감귤류 열매 물 추출물 및 에탄올 추출물에 비해 10% 이상 우수한 것을 확인하였다.
락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(KACC92083P) 균주를 이용하여 발효한 감귤류 열매 발효물 처리에 따른 세포 재생율 측정
시료 세포재생율(%)
양성
대조군		 시험군
1% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%
감귤 82.3 86.1 85.7 88.3 90.4 92.1 92.3 92.1 92.3
레몬 82.3 83.4 84.3 87.2 89.6 90.2 90.3 90.5 89.4
오렌지 82.3 84.2 84.6 86.3 88.6 91.7 91.3 91.4 90.5
유자 82.3 83.1 84.7 87.6 90.4 90.4 90.3 90.2 89.9
자몽 82.3 82.6 85.3 87.5 90.8 91.1 91.2 90.9 90.8
한라봉 82.3 83.3 85.1 86.3 89.7 92.7 92.3 92.4 92.6
락토바실러스 플랜타룸 균주별로 제조한 감귤류 열매 발효물의 세포 재생율 비교
구분 감귤 레몬 오렌지 유자 자몽 한라봉
비교대조군
(KCTC21004)		 84.2 83.7 85.1 82.4 83.6 84.2
시험군
(CBG-C21)		 92.1 90.2 91.7 90.4 91.1 92.7
락토바실러스 람노서스 CBG-C14(KACC91981P) 균주를 이용하여 발효한 감귤류 열매 발효물 처리에 따른 세포 재생율 측정
시료 세포재생율(%)
양성
대조군		 시험군
1% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%
감귤 82.3 85.4 85.0 87.6 89.7 91.4 91.6 91.4 91.6
레몬 82.3 82.7 83.6 86.5 88.9 89.5 89.6 89.8 88.7
오렌지 82.3 83.5 83.9 85.6 87.9 91.0 90.5 90.7 89.8
유자 82.3 82.4 84.0 86.9 89.7 89.7 89.6 89.5 89.2
자몽 82.3 81.9 84.6 86.8 90.1 90.4 90.5 90.2 90.1
한라봉 82.3 82.6 84.4 85.6 89.0 92.0 91.6 91.7 91.9
락토바실러스 람노서스 균주별로 제조한 감귤류 열매 발효물의 세포 재생율 비교
구분 감귤 레몬 오렌지 유자 자몽 한라봉
비교대조군
(KCTC3237)		 84.5 84.0 85.4 82.7 83.9 84.5
시험군
(CBG-C14)		 91.4 89.5 91.0 89.7 90.4 92.0
Figure pat00001
농업생명공학연구원 KACC92083P 20150710

Claims (11)

1) 선별된 감귤류 열매(Citrus fruit)를 세척하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 세척한 감귤류 열매에 물을 첨가하고 분쇄한 후 추출하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 감귤류 열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 감귤류 열매는 감귤(Citrus unshiu), 레몬(Citrus limon), 오렌지(Citrus sinensis), 유자(Citrus junos), 자몽(Citrus paradisi) 또는 한라봉(Citrus hybrid Shiranuhi)인 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 또는 이들의 혼합 균주인 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸 CBG-C21(Lactobacillus plantarum CBG-C21)(KACC92083P) 균주, 락토바실러스 람노서스 CBG-C14(Lactobacillus rhamnosus CBG-C14)(KACC91981P) 균주 또는 이들의 혼합 균주인 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)에서 발효는 32~42℃에서 20~28시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)와 단계 3) 사이에 감귤류 열매 추출물에 효소를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 효소 처리는 셀룰라아제, 펙티니아제 또는 이들을 혼합처리하는 것을 특징으로 하는 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 피부 재생효과를 가지는 감귤류 열매 발효물.
제8항의 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물.
제8항의 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 건강기능식품 조성물.
제8항의 감귤류 열매 발효물을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학 조성물.
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