KR20210076253A - 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 프리바이오틱스 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 포함하는 프리바이오틱스 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 장내 유해균의 생장을 억제하고, 장내 유익균의 생장을 촉진함으로써, 마이크로바이옴을 조절할 수 있다.
Description
본 발명은 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 프리바이오틱스 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 장내 유해균의 생장을 억제하고/거나 장내 유익균의 생장을 촉진함으로써, 장내 마이크로바이옴의 균형을 조절할 수 있다.
사람의 위장(gastrointestinal track, GI) 내에는 수많은 미생물이 군집을 이루어 서식하고 있으며, 이와 같은 집단을 장내균총(enteric microbiota)이라고 한다. 이들은 장관 내부의 생태계를 구성하면서 면역 기능, 소화 및 신진대사에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 정상적인 위장의 생리와 기능에 필수적이다. 사람의 장내균총은 환경 변화에 상당히 저항적이지만 항생제, 스트레스, 식이 혹은 특정 질병 등과 같은 요인은 장내균총의 변화를 초래한다. 이러한, 장내균총의 구성과 기능의 변화를 장내 불균형(dysbiosis)이라 하며, 가장 일반적인 정의는 비피도박테리아, 락토바실러스와 같은 유익균과, 대장균과 같은 유해균의 불균형을 말한다. 이러한 불균형은 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 비만 등과 같은 다양한 질병들과 직간접적으로 연관되어 있다고 알려져 있다.
최근 들어 장내균총 변화와 여러 질환 내지 신체의 이상증상 간의 연관성이 밝혀짐에 따라, 장내균총의 불균형을 개선하고, 유익한 미생물의 활성을 증진시키려는 노력이 이루어지고 있다. 이러한 노력 중 가장 대중적이며 널리 이루어지는 것이 프로바이오틱스 제품을 섭취하는 것이다.
프로바이오틱스는 사람을 포함한 동물의 건강에 유익한 영향을 미치는 생균을 지칭하는데, 락토바실러스속 미생물, 비피도박테리아속 미생물, 락토코커스속 미생물 등과 같은 유산균이 주로 이용되고 있다.
그러나 이러한 프로바이오틱스들은 균의 종류에 따라 인체에 미치는 영향이 상이할 뿐 아니라, 섭취한 프로바이오틱스가 원하는 신체 부위, 즉 소장, 대장 등까지 살아서 도달하는 확률 또한 낮은 문제가 있다. 그에 따라, 프로바이오틱스의 체내 활성 및 수명을 증진시키기 위하여, 대개 프로바이오틱스의 먹이가 되는 유기물들, 즉 프리바이오틱스를 프로바이오틱스와 함께 섭취한다.
그러나, 프리바이오틱스는 섭취 후 이를 대사할 수 있는 유해균이나, 프로바이오틱이 아닌 균주(non-probiotics)에 의해 이용되어 유해한 영향을 미칠 수 있는 가능성이 항시 존재하기 때문에, 장내 유익균 및 유해균에 미치는 효과와 함께 체내이용시 안전성이 중요하게 고려되어야 한다.
이러한 프리바이오틱스 소재 개발의 특수성을 고려할 때, 예로부터 한약재, 식품 등을 활용되어 온 약용식물을 탐색해 볼 필요성이 대두되고 있다.
그럼에도 불구하고, 약용식물의 종류가 너무 많기 때문에, 적절한 약용식물 기반 소재를 발굴하는 데에는 상당한 어려움이 있다.
전술한 기술적 문제점을 해결하기 위해, 천연물로부터 안전한 프리바이오틱스 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 본 발명자들은 특정 재래감귤과 약용식물의 혼합 추출물이 장내 유해균의 증식을 억제하지만, 장내 유익균의 증식에는 불리한 영향을 미치지 않고 실질적으로 증식을 촉진하는 것을 확인함으로서, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 마이크로바이옴 조절용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 발명은 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는, 장내 유익균의 증식 촉진 및 장내 유해균의 생육 억제용 프리바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "장내 유익균"은 "프로바이오틱스"와 동일한 의미로 섭취되어 장에 도달하였을 때 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 의미하며, 위산과 답즙산에서 살아남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하며, 장관 내에서 유용한 효과를 나타내고, 독성이 없으며 비변원성인 조건을 만족하는 균주를 의미한다. 장내 유익균의 예로는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 락토바실러스 속(Lactobacillus), 락토코커스속(Lactococcus), 엔테로코커스 속(Enterococcus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus) 및 비피도박테리움 속(Bifidobacterium) 균주를 포함한다. 바람직하게는 상기 장내 유익균은 비피도박테리움 속, 락토바실러스 속 또는 스트렙토코커스 속 균주이고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 속 균주이다.
보다 바람직하게는 본 발명의 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)이고, 본 발명의 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이며, 본 발명의 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "장내 유해균"은 섭취되어 장에 도달하였을 때 장내 환경에 유해한 작용을 하는 균주를 의미한다. 예컨대, 에스체리키아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 스태필로코커스(Staphylococcus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 유박테리움 속(Eubacterium) 속, 박테로이드(Bacteroides) 속 균주를 포함한다. 바람직하게는, 상기 장내 유해균은 에스체리키아(Escherichia) 속, 스태필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주이고, 보다 바람직하게는 에스체리키아(Escherichia) 속 또는 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주이다.
보다 바람직하게는 본 발명의 에스체리키아(Escherichia) 속 균주는 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)이고, 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 또는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)이다.
본 발명에서 재래감귤은 제주도에서 오랫동안 재배해 온 재래 작물로서, 그 예로는 감자(C. benikoji hort. ex Tanaka), 금귤(C. japonica Thunb.), 당유자(C. maxima 'Dangyuja'), 동정귤(C. erythrosa hort. ex Tanaka), 병귤(C. platymamma hor. ex Tanaka), 빈귤(C. leiocarpa hort. ex Tanaka), 사두감(C. pseudogulgul hort. ex Shirai), 유감(C. suavissima hort. ex Tanaka), 유자(C. × junos Siebold ex Tanaka), 지각(C. × aurantium 'Jigak'), 진귤(C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka), 청귤(C. × nippokoreana Tanaka), 편귤(C. × tangerina 'Pyeongyul'), 홍귤(C. × tachibana (Makino) Tanaka), 홍팔삭(C. hassaku Hort. ex Y. Tan) 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 상기 재래감귤은 해당 재래감귤 품종 뿐 아니라, 그것의 개량 품종도 포함할 수 있다.
본 발명의 재래감귤 추출물은 감자, 금귤, 당유자, 동정귤, 병귤, 빈귤, 사두감, 유감, 유자, 지각, 진귤, 청귤, 편귤, 홍귤, 및 홍팔삭으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재래감귤로부터 얻은 추출물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재래감귤 추출물은 동정귤, 홍팔삭 및 청귤로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 재래감귤로부터 얻은 추출물일 수 있다.
본 발명의 재래감귤 추출물은, 상기 감자, 금귤, 당유자, 동정귤, 병귤, 빈귤, 사두감, 유감, 유자, 지각, 진귤, 청귤, 편귤, 홍귤, 및 홍팔삭의 미숙과 및/또는 숙과의 과피, 과육, 통과 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 추출 원액, 농축액, 또는 이들의 건조물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 약용식물은 식품, 한약재 등으로 오랫동안 사용되어 안전성이 입증된 천연식물을 의미하며, 그 예로는 큰뱀무(Geum aleppicum), 감국(Dendranthema indicum), 금은화(Lonicera japonica), 목향(Inula helenium L.), 지황(Rehmannia glutinosa Liboschitz var. purpurea Makino), 복령(Poria cocos Wolf) 등을 들 수 있다.
본 발명의 약용식물 추출물은 감국, 금은화, 목향, 지황, 및 복령으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약용식물로부터 얻은 추출물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약용식물 추출물은 감국, 금은화, 토목향 및 숙지황으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 약용식물로부터 얻은 추출물일 수 있다.
약용식물 추출물을 얻기 위해 사용할 수 있는 부위는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 뿌리, 잎, 줄기, 전초, 또는 이들의 조합일 수 있다.
감국의 지상부를 사용할 경우, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 한약재로 유통되는 것을 사용할 수 있다.
금은화의 지상부를 사용할 경우, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 한약재로 유통되는 것을 사용할 수 있다.
목향의 뿌리를 사용할 경우, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 한약재로 유통되는 토목향을 사용할 수 있다.
지황의 뿌리를 사용할 경우, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 한약재로 유통되는 숙지황을 사용할 수 있다.
복령을 사용할 경우, 시중에서 쉽게 구할 수 있는 한약재로 유통되는 토복령을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물은 추출용매를 처리하여 수득할 경우, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다.
극성 용매의 예로는, 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide)를 들 수 있다.
비극성 용매의 예로는, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸에테르, 디에틸설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, THF를 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 추출용매로서 (a) 물, (b) 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산, 또는 (j) 디에틸에테르가 사용될 수 있다.
더 바람직하게는, 물, 에탄올(주정), 또는 이의 혼합 용매를 추출용매로서 사용할 수 있다. 물과 에탄올의 혼합 용매에서 에탄올의 농도는 45 %(v/v) 이상, 50 %(v/v) 이상, 55 %(v/v) 이상, 60 %(v/v) 이상, 65 %(v/v) 이상, 70 %(v/v) 이상, 75 %(v/v) 이상, 80 %(v/v) 이상, 85 %(v/v) 이상, 90 %(v/v) 이상, 95 %(v/v) 이상, 100 %(v/v)일 수 있다. 60 %(v/v) 이상의 에탄올을 사용하는 것이 추출물의 수율 및 유효활성 수준을 고려할 때, 가장 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 전술한 것과 같이, 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물 각각은 전술한 추출용매를 이용하여 얻은 것 뿐만 아니라, 농축, 정제 또는 농축/정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 조추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리과정을 거친후 얻은 것, 추가적으로 다양한 분리/정제 방법을 통해 얻어진 분획 등도 본 발명의 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물 각각에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물 각각은 감압 증류, 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재래감귤 추출물은 물과 에탄올 혼합용매 추출물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약용식물 추출물은 물과 에탄올 혼합용매 추출물이다.
바람직하게는, 본 발명의 재래감귤 추출물은 장내 유해균의 증식을 억제하고, 더 바람직하게는 더 바람직하게는 에스체리키아(Escherichia) 속 균주, 스태필로코커스(Staphylococcus) 속 균주, 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주의 증식을 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.
바람직하게는, 본 발명의 재래감귤 추출물은 장내 유익균의 증식을 촉진하고, 더 바람직하게는 락토바실러스속 균주의 증식을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 또는 35% 이상 촉진한다.
바람직하게는, 본 발명의 약용식물 추출물은 장내 유해균의 증식을 억제하고, 더 바람직하게는 에스체리키아(Escherichia) 속 균주, 스태필로코커스(Staphylococcus) 속 균주, 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주의 증식을 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 억제한다.
바람직하게는, 본 발명의 약용식물 추출물은 장내 유익균 증식에 유리하게 작용하여 실질적으로 장내 유익균의 증식을 촉진하고, 더 바람직하게는 락토바실러스속 균주의 증식을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 또는 35% 이상 촉진한다.
본 발명의 프리바이오틱스 조성물은, 유효 성분으로서 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 각각 단독으로 또는 이들의 조합으로 포함하는 경우, 조성물 총중량에 대하여 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 프리바이오틱스 조성물은, 재래감귤 추출물과 약용식물 추출물을 혼합물로서 포함하는 경우, 중량을 기준으로 5:1 내지 1:5, 바람직하게는 3:1 내지 1:3, 가장 바람직하게는 3:1 내지 3:2의 혼합비로 포함할 수 있다. 상기 혼합비를 벗어나는 경우, 본 발명의 프리바이오틱스 조성물은 장내 유익균 생육 촉진에 관한 시너지 효과를 발휘할 수 없고, 장내 유해균 뿐만 아니라 장내 유익균의 생육에 불리하게 작용하여, 프리바이오틱스로서 제기능을 발휘할 수 없고, 나아가 마이크로바이옴의 장내 균형을 파괴할 수 있다.
본 발명의 재래감귤 추출물과 약용식물 추출물은 혼합 사용시, 시너지적으로 장내 유익균의 증식에 유래한 장내 환경을 조성할 수 있고, 그에 따라 실질적으로 장내 유익균의 증식을 촉진할 수 있으므로, 대상체에 더 유익한 효과를 제공할 수 있다.
본 발명은 재래감귤 추출물과 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 제공한다. 본 발명은 재래감귤 추출물과 약용식물 추출물은 장내 유익균을 증식 및 장내 유해균의 생육억제에 있어 시너지적으로 활성을 나타낼 수 있다. 그에 따라, 본 발명의 프리바이오틱스 조성물은 이를 섭취한 대상체의 체내에서 장내균총의 밸런스를 신진 대사, 신체 활동, 전반적인 건강 상태에 유리한 방향으로 조절할 수 있다. 본 발명의 재래감귤 추출물과 약용식물 추출물은 다양한 플라보노이드와 폴리페놀 성분을 다량 함유하고 있기 때문에, 항산화 활성이 높고, 면역력 증강에도 유익할 수 있다.
도 1은 본 발명의 재래감귤 추출물 각각에 대한 플라보노이드 함량 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 재래감귤 추출물이 장내 유해균(Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 재래감귤 추출물이 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 약용식물 추출물이 장내 유해균(Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 약용식물 추출물이 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물의 혼합 처치에 따른 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 재래감귤 추출물이 장내 유해균(Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 재래감귤 추출물이 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 약용식물 추출물이 장내 유해균(Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 약용식물 추출물이 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 저해 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물의 혼합 처치에 따른 장내 유익균(Lactobacillus plantarum)의 생육에 미치는 효과를 나타내는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
시료 및 사용 균주
본 실시예에서 사용한 재래감귤(동정귤 홍팔삭, 청귤)은 제주도, 서귀포시에 위치한 감귤연구소에서 입수하였다.
본 실시예에서 사용한 약용식물(큰뱀무, 감국, 금은화, 토목향, 숙지황, 토복령)은 충청북도 음성 소재 국립원예특작과학원 인삼특작부 약용작물과에서 분양받아 사용하였다.
균주는 한국생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type cultures, 대한민국)에서 분양받았으며, 장내 유해균으로는 에스체리치아 콜리, 클로스트리디움 부티리쿰, 클로스트리디움 퍼프린젠스을 사용하였다. 장내 유래 유익균은 락토바실러스을 사용하였다.
장내 유해균을 배양하기 위하여 시판 제품인 Luria-Bertani 배지와 Reinforced Clistridial 배지(Difco)를 구입하여 전배양 및 본 배양을 위한 증식배지로 사용하였으며, 장내 유해균들은 37℃ 혐기성 조건하에서 48시간 동안 배양하였다. 장내 유익균을 배양하기 위한 증식배지로는 시판 제품인 MRS 배지(deMan, Rogosa, Sharpe)(Difco)를 구입하여 사용하였으며, 균주는 실험에 사용하기 전 3회 이상 계대배양하여 활성화시킨 후 사용하였다.
[참고예 1]
재래감귤(동정귤 홍팔삭, 청귤)의 과피를 각각 건조 후 분쇄한 다음, 초음파를 이용하여 70 %(v/v) 에탄올로 1시간 동안 3회 추출하여 추출액을 모았다. 이렇게 모은 추출액을 0.22 ㎛ PVDF 필터(millipore)로 여과한 후, 감압 농축 후, 동결건조하여 시험예에 사용하였다.
[참고예 2]
약용식물(큰뱀무, 감국, 금은화, 토목향, 숙지황, 토복령)을 각각 건조 후 분쇄한 다음, 초음파를 이용하여 70 %(v/v) 에탄올로 1시간 동안 3회 추출하여 추출액을 모았다. 이렇게 모은 추출액을 0.22 ㎛ PVDF 필터(millipore)로 여과한 후, 감압 농축 후, 동결건조하여 시험예에 사용하였다.
[시험예 1] 재래 감귤의 플라보노이드 함량 분석
재래감귤의 플라보노이드 함량에 대해 알아 보기 위해 HPLC 분석을 실시하였다. 참고예 1에서 제조한 재래감귤 추출물을 용매에 녹여 0.22 μm PVDF 필터(millipore)로 여과한 후 HPLC(e2695 Separations module, Waters Co., Ltd., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 YMC-Triart C18(길이 x 내경=250x4.6 ㎜; 입자크기(PS): 5 ㎛; 기공크기: 8 ㎚)이었고, 검출기로는 UV/Visible Detector(Waters 2489)을 사용하였다. 유속은 1 ㎖/min을 유지하였고, UV 280 ㎚에서 흡광도를 검출하였다.
표준물질은 감귤류에 많이 함유되어 있는 10종의 플라보노이드를 사용하였으며 종류에 따라 3가지 조건으로 나누어 분석하였다. 루틴(Rutin), 나리루틴(narirutin), 나린진(naringin), 헤스페리딘(hesperidin), 네오헤스페리딘(neohesperidin) 분석을 위한 이동상 조건을 아세토니트릴(acetonitrile):20 mM 인산(phosphoricacid) = 2:8로 설정하였다. 퀘르세틴(Quercetin), 나린제닌(naringenin), 헤스페레틴(hesperetin)의 분석을 위한 이동상 조건을 아세토니트릴(acetonitrile):20 mM 인산(phosphoricacid) = 4:6으로 설정하였다. 모든 시약은 HPLC 등급을 사용하였다. 표준검량선 작성은 각각의 표준물질을 에탄올로 1:1 비율로 6단계 희석하여 15.625 ㎍/㎖부터 1,000 ㎍/㎖의 농도의 표준물질을 이용하여 작성하였다. 표준물질로 작성된 표준검량선으로 플라보노이드 성분들의 정량 분석에 사용하였다.
도 1에 나타낸 HPLC 분석결과에 따르면, 동정귤은 나리루틴의 함량이 가장 많았으며, 루틴 함량도 높은 것을 확인할 수 있었다. 홍팔삭은 네오헤스페리딘과 나린진의 함량이 높았고, 청귤은 감귤류에만 함유되어 있는 것으로 알려진 노빌레틴의 함량이 특히 높게 나타났다.
플라보노이드의 전체 함량은 동정귤이 다소 낮은 것으로 나타났는데, 동정귤의 수확시기가 12월이었기 때문에, 완숙에 따라 플라보노이드의 총 함량이 감소된 것으로 추정하였다. 반면, 청귤과 홍팔삭의 일반적인 수확시기는 각각 3-4월, 2-3월이나, 12월에 수확한 시료를 사용한 본 연구에서 두 품종은 미숙과 시기이므로, 상대적으로 플라보노이드 함량이 높은 것으로 파악되었다.
이로부터 재래감귤은 품종별, 수확시기별로 플라보노이드 함량이 달라지며, 그에 따라 활성도 다르게 나타날 수 있다는 것을 알 수 있었다.
[시험예 2] 재래감귤 추출물의 폴리페놀 함량과 항산화 활성 분석
재래 감귤의 총 폴리페놀 함량 분석
참고예 1에서 제조한 재래감귤 추출물의 총 폴리페놀 함량을 Folin-Denis 법을 이용하여 비색 정량하였다. 구체적으로, 추출물 100 ㎕에 증류수 900 ㎕를 넣고, Folin-ciocalteus' phenol reagent 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 5분간 반응시킨 후, Na2CO3 용액(7%, w/v) 200 ㎕와 증류수 700 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 흡광도는 SpectraMaxⓡ M3 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 720 ㎚에서 측정하였고, 갈산(gallic acid)를 이용하여 작성한 표준검정곡선을 이용하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 측정
DPPH 라디칼 소거 활성 실험은 Blosis 방법을 사용하였다. 0.2 mM로 준비된 DPPH 용액과 농도별로 준비된 시료를 섞어 실온에서 10분간 방치한 후, 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이 때 사용된 대조군으로는 아스코브산(ascorbic acid)을 사용하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성 측정
ABTS 라디칼 소거 활성은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM 과황화칼륨(potassium persulfate)을 혼합한 후, 실온의 암실에서 15시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시킨 후, 이 용액을 734 ㎚에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 준비하였다. 준비된 ABTS 용액 180 ㎕에 각각의 추출물 20 ㎕를 가하여 실온에서 15분 동안 방치한 다음 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 시료 용액을 첨가한 실험구와 무첨가한 대조구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
재래감귤 추출물의 폴리페놀 함량과 항산화 활성 분석 결과를 정리하면, 표 1과 같다.
1) DPPH 라디칼 소거활성 측정에 사용한 각 추출물의 기준 농도는 10 ㎎/㎖.
2) ABTS 라디칼 소거활성 측정에 사용한 각 추출물의 기준 농도는 1.25 ㎎/㎖.
표 1에 따르면, 시험한 재래감귤 추출물 모두 DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 우수한 것으로 나타났다. 동정귤의 총 폴리페놀 함량은 다른 재래감귤 품종에 비해 다소 낮은 것으로 나타나, 그에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 상대적으로 낮았으며, 이는 앞서 [시험예 1]의 플라보노이드 함량 분석 결과와도 부합하였다.
[시험예 3] 재래감귤 추출물의 장내 유해균 생육 저해효과
[참고예 1]에 따른 재래감귤 추출물의 장내 유해균에 대한 항균활성 측정을 위해 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 클로스트리디움 퍼프린젠스( Clostridium perfringens), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주를 사용하였다. 장내 유해균에 대한 활성은 96 well plate에 배지, 전배양한 미생물, 15 ㎎/㎖의 감귤추출물을 각각 30 ㎕씩 첨가한 다음, 2, 4, 6, 24시간 배양하면서 Microplate reader를 사용하여 생육억제율을 측정하였다 (무처리군: 배지만 첨가).
도 2에 나타낸 것과 같이, 재래감귤 추출물 모두 3종의 장내유해균에 대한 억제 활성을 80% 이상 나타내었다.
[시험예 4] 재래감귤 추출물의 장내 유익균 생육 촉진 효과
[참고예 1]에서 제조한 재래감귤 추출물이 장내 유익균에 대해 미치는 영향에 대해 알아 보기 위해, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 사용하였다. 장내 유익균에 대한 활성은 96 well plate에 배지, 전배양한 미생물, 15 ㎎/㎖의 재래감귤 추출물을 각각 30 ㎕씩 첨가한 다음, 2, 4, 6, 24시간 배양하면서 Microplate reader를 사용하여 생육억제율을 측정하였다 (무처리군: 배지만 첨가).
도 3에 나타낸 것과 같이, 장내 유익균으로 알려진 유산균인 L. plantarum에 대한 활성을 검증한 결과, 재래귤 중 동정귤만 약 40%의 생존율을 보였고 홍팔삭과 청귤 추출물에서는 유익균의 생장이 거의 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 5] 약용식물 추출물의 장내 유해균 생육 저해효과
[참고예 2]의 약용식물 추출물의 장내유해균에 대한 항균활성 측정을 위해 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주를 사용하였다. 장내유해균에 대한 활성은 96 well plate에 배지, 전배양한 미생물, 10 ㎎/㎖의 약용식물 추출물을 각각 20 ㎕씩 첨가한 다음, 2, 4, 6, 24시간 배양하면서 Microplate reader를 사용하여 생육억제율을 측정하였다(무처리군: 배지만 첨가).
도 4에 나타낸 것과 같이, 약용식물 추출물별로 3종의 장내유해균에 대한 억제 활성은 20 내지 100%로 나타나, 그 차이가 매우 컸다. 시험한 약용작물 중 큰뱀무, 토복령, 감국은 장내 유해균에 대한 항균활성이 약 70% 이상으로 높게 나타났고, 금은화, 토목향, 숙지황의 경우 항균활성이 약 10 내지 40% 수준으로 다소 낮게 나타났다.
[시험예 6] 약용식물 추출물의 장내 유익균 생육 촉진 효과
[참고예 2]에서 제조한 약용식물 추출물이 장내 유익균에 대해 미치는 영향에 대해 알아 보기 위해, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 사용하였다. 장내 유익균에 대한 활성은 96 well plate에 배지, 전배양한 미생물, 10 ㎎/㎖의 재래감귤 추출물을 각각 20 ㎕씩 첨가한 다음, 2, 4, 6, 24시간 배양하면서 Microplate reader를 사용하여 생육억제율을 측정하였다 (무처리군: 배지만 첨가).
도 5에 나타낸 것과 같이, 장내 유익균으로 알려진 유산균인 L. plantarum에 대한 활성을 검증한 결과, 약용식물 중 큰뱀무와 토복령의 경우 유익균의 생장이 거의 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 감국은 약간의 생육 억제 (약 20%)를 나타내었고, 금은화, 토목향, 숙지황의 경우 생육 촉진 활성을 나타내었다.
[시험예 7] 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물의 병용 처치에 따른 장내 유익균 생육 촉진 효과
재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물의 병용 처치시, 장내 유익균에 대해 미치는 영향에 대해 알아 보기 위해, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 사용하였다. 장내 유익균에 대한 활성은 96 well plate에 배지, 전배양한 미생물, 15 ㎎/㎖의 재래감귤 추출물(단독 처치시 30 ㎕; 병용 처치시 15㎕), 10 ㎎/㎖의 약용식물 추출물(단독 처치시 20㎕; 병용 처치시 10 ㎕)을 첨가한 다음, 2, 4, 6, 24시간 배양하면서 Microplate reader를 사용하여 생육억제율을 측정하였다.
도 6에 나타낸 것과 같이, 놀랍게도 동정귤 추출물과 약용식물 추출물인 감국, 금은화, 토목향, 숙지황 추출물을 함께 처치한 경우, 합계 처치량 (25 ㎕)이 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물 각각의 단독 처치량과 큰 차이가 없음에도 불구하고, L. plantarum의 생존도에 큰 영향을 미치지 않거나 오히려 증가하는 것으로 나타났다. 홍귤 추출물과 청귤 추출물의 경우, 토복령을 제외한 약용식물 추출물과 함께 처치시, 70% 이상 장내 유익균의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 숙지황, 감국, 금은화, 토목향, 큰뱀무 순으로 L. plantarum의 생존율에 미치는 영향이 큰 것으로 나타났다.
재래감귤 추출물 단독 처치시, L. plantarum의 생존율이 50% 미만으로 나타났음을 고려하면, 감국, 금은화, 토목향, 숙지황 추출물을 함께 처치시, 장내 유익균의 생장에 유리한 환경이 조성되어 실질적으로 증식이 촉진되는 것으로 볼 수 있다.
결론적으로, 재래감귤인 동정귤, 홍팔삭, 청귤과 약용식물인 숙지황, 감국, 금은화, 토목향은 함께 투여 또는 섭취할 경우, 장내 유해균의 생육을 억제하지만, 장내 유익균의 생육에는 불리한 영향을 미치지 않고, 실질적으로 장내 유익균의 증식을 촉진할 수 있으므로, 프로바이오틱스 소재로서 매우 유용하다. 나아가, 재래감귤인 동정귤, 홍팔삭, 청귤의 추출물과 약용작물인 숙지황, 감국, 금은화, 또는 토목향의 추출물은 함께 투여 또는 섭취할 경우, 장내 유해균의 생육에는 불리한 환경을 조성하는 반면고, 장내 유익균의 생육에는 실질적으로 유리한 환경을 조성할 수 있으므로, 장내 마이크로바이옴 조절용 기능성 소재로도 유용하다. 본 발명의 재래감귤 추출물은 다양한 플라보노이드와 폴리페놀 성분을 다량 함유하고 있기 때문에, 약용식물 추출물과 함께 사용시, 높은 항산화 활성을 나타내고, 면역력 증강에도 유익한 효과를 제공할 수 있으므로, 건강기능식품 소재로 활용가치가 높다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (15)
- 재래감귤 추출물 및 약용식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재래감귤은 동정귤, 홍팔삭 및 청귤로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재래감귤 추출물은 재래감귤의 미숙과, 숙과 또는 상기 둘 모두의 과피, 과육 또는 통과를 추출하여 얻은 추출물인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재래감귤 추출물은 재래감귤의 미숙과, 숙과 또는 상기 둘 모두의 과피, 과육 또는 통과를 초음파를 이용하여 에탄올 수용액으로 추출하여 얻은 추출물인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 에탄올 수용액의 농도는 60 %(v/v) 이상인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약용식물은 감국, 금은화, 토목향 및 숙지황으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약용식물 추출물은 감국, 금은화, 토목향 및 숙지황으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 약용식물을 초음파를 이용하여 에탄올 수용액으로 추출하여 얻은 추출물인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 에탄올 수용액의 농도는 60 %(v/v) 이상인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제1항에 있어서, 장내 유해균의 증식을 억제하고, 장내 유익균의 증식을 촉진하는 것인, 프리바이오틱스 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 장내 유해균은 에스체리키아(Escherichia) 속 균주, 스태필로코커스(Staphylococcus) 속 균주 및 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 균주이고,
상기 장내 유익균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주인, 프리바이오틱스 조성물. - 제10항에 있어서, 상기 에스체리키아(Escherichia) 속 균주는 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)이고, 상기 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)이며, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)이고, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 프리바이오틱스 조성물.
- 동정귤, 홍팔삭 및 청귤로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 재래감귤로부터 수득한 재래감귤 추출물; 및 감국, 금은화, 토목향 및 숙지황으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 약용식물로부터 수득한 약용식물 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는, 장내 마이크로바이옴 조절용 조성물.
- 제12항에 있어서, 장내 유해균의 생육을 억제하고, 장내 유익균의 생육을 촉진하는 것인, 장내 마이크로바이옴 조절용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 장내 유해균은 에스체리키아(Escherichia) 속 균주, 스태필로코커스(Staphylococcus) 속 균주 및 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 균주이고,
상기 장내 유익균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주인, 장내 마이크로바이옴 조절용 조성물. - 제14항에 있어서, 상기 에스체리키아(Escherichia) 속 균주는 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)이고, 상기 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)이며, 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)이고, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 장내 마이크로바이옴 조절용 조성물.
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| KR20170077567A (ko) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | 주식회사 서울식연 | 시트러스 추출물 또는 자몽종자 추출물을 함유하는 항균 조성물, 및 이를 포함하는 애완동물 위생용 제제 |
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