KR20050119336A - 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물의 제조방법은, 구아바 분말과 손바닥선인장 분말과 혼합한 다음, 가수하고, 멸균한 후 버섯균사체를 접종하고 배양하여 1차 발효하고, 1차 발효물을 분쇄 한 후 감귤 농축액과 혼합하고, 멸균한 뒤 미생물을 접종하고 배양하여 2차 발효시켜 발효 구아바 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명의 발효구아바 조성물의 농축분말은, 독성이 제거되어 안전성이 증진되었으며, 지방세포 분화를 억제하는 효과와, 당뇨병의 증상인 혈당 상승의 강하, 비만 예방 및 치료효과를 나타내며, 식품첨가제, 사료첨가제 등으로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물에 관한 것이다.
최근, 생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하고 운동부족 현상을 초래하며 과도한 스트레스에 노출되는 생활이 지속되면서 인슐린의 활성이 떨어져서 야기되는 제2형의 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병)이 증가하고 있다.
우리 나라 당뇨병 환자의 대부분은 이러한 제2형 당뇨병 환자로 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 심혈관 질환, 당뇨병성 신장 및 망막질환 등의 합병증을 유발하므로 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
현재, 제2형 당뇨병 치료제로 많이 사용하는 약물로는 혈당강하제가 많이 사용하는데, 혈당강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 설포닐우레아 계통, 비구아나이드 계통, 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해제, 피피에알 감마(PPAR-γ, Peroxisome proliferator activated receptor-gamma)를 활성화하는 피페리디온계 약물로 나눌 수 있다.
그러나, 경구용 혈당강하제만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로, 보다 안전한 당뇨병 치료제나 당뇨병 예방제의 개발이 시급한 실정이다.
또한, 지방세포 분화 저해제는 비만인에서 흔히 나타나는 인슐린 내성을 일으키는 과도한 지방조직의 축적을 감소시키기 때문에 근본적인 당뇨병 치료제로 개발될 가능성이 높다. 또한, 양식동물 및 어류에 있어서 과도한 지방의 축적을 제어할 수 있기 때문에 육질이 개선된 양식을 할 수 있는 가능성이 있다.
일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학이나 식용으로 사용해 온 소재들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다.
한편, 구아바(Psidium guajava L.)는 도금양과(Myrtaceae과) Psidium속의 미국산 열대성 식물이다.
구아바는 화분식물은 물론 잎, 나무껍질, 열매 등을 건강식 및 약용으로 이용할 수 있는 약용식물이다.
구아바에는 비타민C, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 비타민과 미네랄등이 많이 함유되어 있으며, 과산화변이억제 작용(암예방), 과산화수소 소거 작용(노화방지), 활성산소발생억제작용(미백효과), 항비만 작용(아밀라제 억제), 항당뇨증작용 ( 당흡수억제, 유사 인슐린 작용-함유하고 있는 폴리페놀 성분), 항 알레르기 작용(히스타민류 억제) 등이 보고되어 있다.
최근 국내에서 구아바를 이용한 건강보조식품이나 건강음료에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다.
대한민국 공개특허공보 10-2003-0005387(구아바잎을 주성분으로 한 당뇨병 치료용, 비만개선용, 노화방지용 차의 효과적인 조성물 및 이를 함유한 건강식품)에는 구아바열매를 가수습식분쇄기로 씨를 제거한 후 분쇄하고, 건조한 뒤 구아바 잎 분말 20.0 ~ 50.0 중량%와 구아바열매 분말 5.0 ~ 30.0 중량%, 유당, CMC-Ca, 스테아린산마그네슘, 비타민C 및 만니톨을 첨가하는 것을 특징으로 하는 타블렛 제조방법이 공개되어있다.
대한민국 특허등록 10-0380287-0000(상황버섯류 액체배양물을 함유한 기능성 음료 및 그 제조방법)에는 상황버섯류를 액체배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 침전시킨후 얻어진 상황버섯류 균사체와 배양액 부피의 4배가 되게 에탄올을 첨가한 후 열정제수에 0.01 ~ 30중량% 가 되도록 첨가하고 식품첨가물을 0.28 ~ 55중량% 첨가한후, 고온멸균하는 것을 특징으로 하는 방법이 공개되어있다.
대한민국 특허출원 10-2001-0031801(구아바로부터 얻은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 저해용 활성분획 조성물)에는 구아바를 분쇄한 후 알콜 수용액을 함량대비 3 ~ 10배를 넣어 용매 추출하여 얻어진 여액을 농축하고 농축액을 실리카겔 레진에 로딩한 후 혼합용매를 사용하여 비활성 부분을 제거한 후 메탄올을 사용하여 용출하고 용출액을 농축하여 RP - 18레진에 로딩한 다음 40% 아세토나이트릴을 사용하여 활성물을 용출, 농축하여 엑기스를 얻어 1 ~ 2배의 증류수에 현탁하여 동결건조 시키는 방법이 공개되어 있다.
그러나, 이러한 구아바를 활용한 생물소재의 이용에는 본래 구아바가 갖고 있는 독성을 해결하고자 한 노력 등은 없었으며, 기능적 측면만을 부각시키는데 멈추어 구아바 관련 소재의 장기적인 경구 섭취시 문제가 발생할 수 있는 문제가 있게 된다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 버섯균사체등의 미생물과 젖산균, 효모, 바실러스등의 미생물을 이용하여 독성이 제거된 발효 구아바 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방세포 분화 억제 기능, 당뇨병 예방과 치료제, 가축 및 양식어류 등의 육질개선제 등으로 이용될 수 있는 발효 구아바 조성물의 농축분말 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물은, 구아바 분말과 손바닥선인장 분말을 10 : 1 의 중량비율로 혼합하는 제1공정, 제1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균한 다음, 25 ℃로 냉각하는 제2공정, 제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 버섯균사체를 접종하여 1차발효시키는 제3공정, 제3공정에서 얻어진 1차발효물을 분쇄하여 분말화하는 제4공정, 제4공정에서 얻어진 분말에 물을 1 : 10(w/v)의 비율로 가하여 1차발효 조성물을 제조하는 제5공정, 제5공정에서 얻어진 1차발효 조성물에 감귤농축액 또는 감귤생과 분쇄물을 1차발효물의 중량대비 3 중량%를 넣고 혼합하는 제6공정, 제6공정에서 얻어진 감귤첨가 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각하는 제7공정, 제7공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 젖산균, 효모, 바실러스 중에서 선택된 1 종 이상의 미생물을 접종하고 2차 발효시키는 제8공정에 의해 발효 구아바 조성물을 제조하는 것으로 구성된다.
또한, 본 발명의 미생물 발효에 의해 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물의 농축분말은, 상기의 발효 구아바 조성물을 물을 첨가하여 100 ℃에서 2 시간 동안 1차추출하는 제1공정, 제1공정에서 얻어진 1차추출물을 1차추출물 부피의 10 ~ 20 %로 감압농축하여 제1농축액을 제조하는 제2공정, 제2공정에서 얻어진 제1농축액에 물 또는 유기용매를 첨가하여 2차추출하는 제3공정, 제3공정에서 얻어진 2차추출물을 냉각하고 여과시키는 제4공정, 제4공정에서 얻어진 여과물을 감압농축하여 제2농축액을 제조하는 제5공정, 제5공정에서 얻어진 제2농축액을 건조하는 제6공정, 제6공정에서 얻어진 건조물을 분쇄하여 분말로 제조하는 제7공정에 의해 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하는 것으로 구성된다.
한편, 본 발명의 주래료인 구아바는 도금양과(Myrtaceae과) Psidium속의 미국산 열대성 식물로서, 화분식물은 물론 잎, 나무껍질, 열매 등을 건강식 및 약용으로 이용할 수 있는 약용식물이다.
구아바에는 비타민C, 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 비타민과 미네랄등이 많이 함유되어 있으며, 과산화변이억제 작용(암예방), 과산화수소 소거 작용(노화방지), 활성산소발생억제작용(미백효과), 항비만 작용(아밀라제 억제), 항당뇨증작용 ( 당흡수억제, 유사 인슐린 작용-함유하고 있는 폴리페놀 성분), 항 알레르기 작용(히스타민류 억제) 등이 보고되어 있다.
본 발명의 발효 구아바 조성물은, 구아바(Psidium guajava L.), 캐틀레이 구아바(Cattley Guava), 스트로우베리 구아바(Strawberry Guava ; Psidium cattleranum Sabine), 브라질리안 구아바(Brazilian Guava ; Feijoa sellowiana Berg.), 구이사로(Guisaro ; Psidium guinense SW.), 코스타 리칸 구아바(Costa Rican Guava ; Psidium friendrichsthalianum Ndz.), 파라 구아바(Para Guava ; Psidium acutangulum DC.), 구아바베리(Guavaberry ; Myrciaria floribunda Berg.), 파인애플 구아바(Pineapple Guava ; feijoa) 중 선택된 1 종을 이용하여 본 발명의 발효 구아바 조성물을 제조한다.
본 발명의 발효 구아바 조성물 및 발효 구아바 조성물의 농축분말 제조방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.
1. 발효 구아바 조성물의 제조
1)제1공정 : 혼합
구아바를 구입한 후 세척하여 준비한다.
준비한 구아바의 잎 또는 줄기 또는 뿌리를 60 ℃에서 건조하고, 분쇄기로 1mm 이하의 직경으로 분쇄하여 분말로 준비한다.
손바닥선인장은 시중에서 구입한 후 세척하여 준비한다.
준비한 손바닥선인장의 열매 또는 줄기를 분쇄하여 분말로 준비한다.
준비한 구아바 분말과 손바닥선인장 분말을 10 : 1의 중량비로 혼합한다.
2) 제2공정 : 멸균 및 냉각
제 1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각한다.
고체 배양인 경우에는 구아바, 손바닥선인장 혼합물의 습도가 50 ∼ 70 %가 되게 가수하여 혼합한 후 멸균하며, 이때 상부방향으로 통기가 되는 병에 주입하여 120 ℃에서 30 분간 멸균하고 냉각한다.
액체배양인 경우에는 제1공정의 혼합물에 1 : 10 ∼ 1 : 30(W/V)의 비율로 가수한 다음, 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각한다.
3) 제3공정 : 1차발효
제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 버섯균사체를 3 % (w/v) 접종한다.
이때, 버섯균사체로는 상황버섯(Phelinus linteus), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 차가(Innonotus obliqus), 노루궁뎅이(Hericium erinaceum), 신령버섯(Agaricus blazei), 표고버섯(Lentinus edodes), 운지버섯 (Coriolus versicolor) 균사체들을 포함하는 버섯균사체 중 1 종을 접종하고 배양하여 1차 발효시킨다.
그러나, 상기 미생물에 한정되지 않는다.
배양온도 및 기간은 버섯균사체의 생장특성에 따라 다르게 된다. 그 중 상황버섯의 경우는 액체배양시 25 ℃에서 7 일간 배양하고, 고체배양시 25 ℃에서 15 일간 배양여 1차발효한다.
4) 제4공정 : 분쇄
제 3공정에서 획득한 고체발효물은 분쇄한다.
5) 제5공정 : 1차발효 조성물
제4공정의 고체발효물 분말에 1 : 10 ∼ 1 : 30 (W/V)의 비율로 가수하여 혼합한다.
5) 제6공정 : 감귤첨가 혼합물
제 5공정에서 얻은 1차발효 조성물에 감귤농축액 또는 감귤생과를 분쇄하여 당도를 60 brix까지 농축한 농축액을 상기의 혼합액의 부피대비 1 %(V/V)가 되도록 첨가하여 혼합한다.
제4공정에서 얻은 발효물이 액상 발효물인 경우에는 가수하지 않고, 감귤농축액을 상기 액상발효물의 10 L 부피대비 3 %(V/V)가 되도록 혼합한다.
6) 제7공정 : 멸균 및 냉각
제6공정의 감귤농축액 첨가혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각 한다.
7) 제8공정 : 2차발효
제 6공정의 멸균된 혼합물에 젖산균, 효모, 바실러스 중 1종 이상의 미생물을 3 % (w/v)를 접종하여 2차 발효한다.
미생물 중 젖산균은 스트렙토코코스 더모필루스 (Streptoco ccus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus),락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 플란타룸 (Lactoba cillus plantarum) 등이 대표적이고, 효모는 사카로마이세스세레비세 (Saccharomyces cerevisiae) 등이 대표적이고, 바실러스는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등이 대표적이다.
배양온도 및 기간은 접종미생물의 생장특성에 따라 달라진다. 그 중 젖산균이 포함된 경우에는 38 ℃ 에서 7 일 동안 배양하여 2차발효한다.
그러나, 상기 미생물들에 한정되지 않는다.
2. 발효 구아바 조성물의 농축분말 제조방법
1) 제1공정 : 1차추출
상기에서 제조한 발효 구아바 조성물을 준비한다.
발효 구아바 조성물에 물을 1 : 0.1 ∼ 1 : 2(V/V)의 비율로 첨가하고 100 ℃에서 2 시간 동안 추출한다.
2) 제2공정 : 감압농축
제1공정의 1차추출물을 1차추출물 부피의 10 ∼ 20 %로 감압농축한다.
3) 제3공정 : 2차추출
제2공정의 농축액에 물 또는 유기용매를 1 : 5 ∼ 1 : 10(V/V)의 비율로 첨가하여 90 ℃ 에서 24 시간 추출한다.
이 때, 유기용매로는 알코올, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 등을 사용한다.
3) 제4공정 : 냉각 및 여과
제3공정의 2차추출물을 23 ℃로 냉각 하고 여과(≤1㎛)한다.
4) 제5공정 : 감압농축
제4공정의 여과물을 여과물의 부피의 5 ~ 10 %로 감압농축한다.
5) 제6공정 : 건조
제5공정의 농축액을 건조한다.
이때, 부형제를 이용하는 경우는 분무건조기로 건조하며, 부형제를 이용하지 않는 경우는 동결건조기로 건조한다.
6) 제7공정 : 분쇄
제6공정의 건조물을 분쇄하여 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조한다.
본 발명의 발효 구아바 농축분말은 항당뇨와 지방세포 분화 억제효과를 나타내었다.
본 발명은 세포배양에 독성을 나타내는 구아바를 미생물 발효에 의해 처리하여 독성을 감하하고 지방세포 분화 억제와 당뇨병 효과에 대해 측정하였다.
발효 구아바 추출물을 전지방세포(preadipocyte)인 3T3-L1에 처리하여 지방세포 분화를 억제하였다.
간세포주인 HepG2 세포에 처리한 결과 포도당의 흡수(glucose uptake)가 개선된 효과를 보이는 당뇨병 예방과 치료효과를 보였다.
또한, 양식어류 및 웅성 랫트(Wister 종)에 발효 구아바 분말 또는 그 추출물을 사료로 함유하여 섭취시킨 뒤에 지방세포, 미성숙 지방세포, 섬유아세포 및 혈관세포 등의 세포수를 조사한 결과 육질개선 효과를 보였다.
즉, 발효 구아바 및 그 추출물이 독성을 나타내지 않고 지방세포 분화를 저해하고, 포도당의 흡수가 개선된 효과를 갖고 있는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료 및 향장품 첨가제, 어류 및 가축의 육질을 개선하는 활성 조성물을 개발하였다.
본 발명에 따른 활성 조성물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 타블렛, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.
상기 활성 분획물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 1000 mg/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 발효 구아바 조성물의 제조 1
구아바(Psidium guajava L.) 잎, 손바닥선인장 열매, 감귤 농축액 시중에서 준비하였다.
준비한 구아바와 선인장 열매와 줄기는 분쇄하여 미세한 분말로 준비하였다.
구아바 잎 분말과 손바닥선인장 열매 분말은 각각 10 : 1(w/w)로 혼합하고, 1 : 10 (w/v)으로 가수하여 혼합한 후 120 ℃ 에서 25 분 동안 멸균하였다.
멸균후, 25 ℃로 냉각 하여 상황버섯균사체를 3 %(w/v) 접종하여 25 ℃에서 15 일간 배양하여 1차 발효물을 제조하였다.
1차 발효후 고형 발효물을 분쇄하여, 1 : 10(w/v)의 비율로 가수하여 1차발효 조성물을 제조하였다.
당도를 60 brix까지 농축한 감귤 농축액을 1차발효 조성물에 3 %(w/v)가 되도록 혼합한 후, 멸균하고 25 ℃로 냉각하였다.
냉각 후 바실러스 종(Bacillus spp), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 7 일간 배양하여 본 발명의 발효 구아바를 제조하였다.
<실시예 2> 발효 구아바 조성물의 제조 2
상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
이 때, 2차 발효시 접종한 미생물은 바실러스 종(Bacillus spp), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38℃에서 7일간 배양하여 본 발명의 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
<실시예 3> 발효 구아바 조성물의 제조 3
상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
이 때, 2차 발효시 접종한 미생물은 바실러스 종(Bacillus spp), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 25 ℃에서 7 일간 배양하여 본 발명의 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
<실시예 4> 발효 구아바 조성물의 제조 4
상기 실시예 1과 같은 방법으로 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
이 때, 2차 발효시 접종한 미생물은 락토바실러스 종(Lactobacillus spp)과 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp)혼합액 3 %(w/v)를 접종하여 38 ℃에서 7 일간 배양하여 본 발명의 발효 구아바 조성물을 제조하였다.
<실시예 5> 발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조 1
실시예 1에서 제조한 발효 구아바 조성물을 준비하였다.
발효 구아바 조성물에 1 : 5의 비율로 90 % 에탄올을 첨가하여 100 ℃에서 2 시간 동안 1차추출하고, 전체를 20 ~ 30 %로 감압 농축하였다.
이 농축액에 1 : 5의 비율로 90 % Et-OH로 첨가하여 90 ℃ 에서 24 시간 동안 2차추출하였다.
실온으로 냉각 후 여과하여 농축하고, 동결건조하여 분말화하여 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.
<실시예 6> 발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조 2
실시예 2에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.
실시예 5와 같은 방법으로 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.
<실시예 7> 발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조 3
실시예 3에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.
실시예 5와 같은 방법으로 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.
<실시예 8> 발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조 4
실시예 4에서 제조한 발효구아바 조성물을 준비하였다.
실시예 5와 같은 방법으로 발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.
<실시예 9> 발효 구아바 조성물의 농축분말을 이용한 타블렛의 제조
실시예 5에서 제조한 발효 구아바 조성물의 농축분말을 준비하였다.
준비한 발효 구아바 조성물의 농축분말 10 g과, 락토스 70 g, 결정성 셀룰로오스 15 g, 마그네슘 스테아레이트 5 g의 총량 100 g을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법에 의해 타블렛을 제조하였다.
각 타블렛의 총량은 100 mg이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 mg이다.
<실시예 10> 발효 구아바 조성물의 농축분말을 이용한 캡슐제의 제조
실시예 5에서 제조한 발효 구아바 조성물의 농축분말을 준비하였다.
준비한 발효 구아바 조성물의 농축분말 10 g과, 옥수수 전분 50 g, 카르복시 셀룰로오스 40 g의 총량 100 g을 잘게 부숴 혼합한 후 분말을 제조하였다.
9 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
<비교예 1> 비발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조
구아바 잎은 시중에서 준비하였다.
준비한 구아바 잎은 분쇄하여 미세한 분말로 준비하였다.
구아바 잎 분말은 1 : 10 (w/v)으로 가수하여 혼합한 후 혼합물에 1 : 5의 비율로 90 % 에탄올을 첨가하여 24 시간 추출하였다.
실온으로 냉각 후 여과하여 농축하고, 여기에 부형제를 이용하여 건조하여 분말화하여 비발효 구아바 조성물의 농축분말을 제조하였다.
<실험예 1> 발효 구아바 농축분말의 지방세포분화 억제효과 실험
1. 실험 재료 준비
실시예 5 내지 실시예 8의 발효 구아바 조성물의 농축분말을 준비하였다.
또한, 비교예 1의 비발효 구아바 농축분말을 준비하였다.
2. 세포 배양
전지방세포(preadipocyte) 3T3-L1는 한국 세포주 은행에서 분양받아 10% 우태아혈청 (Sigma)과 1% penicillin-streptomycin(penicillin 10,000U/㎖, streptomycin 10,000㎍/㎖; Gibco BRL.)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle media; Gibco BRL.)을 이용하여 5% CO2 와 37℃ 조건에서 배양하였다.
세포는 4일 마다 기존 배지를 제거하고 1×PBS로 세척한 뒤 트립신-EDTA (Gibco BRL.)로 세포를 수확하여 원심분리한 후 새로운 배지로 희석하여 계대 배양하였다.
지방세포(adipocyte)로 분화를 유도하기 위하여 지방전구세포(preadipocyte)를 2일동안 배양한 후, post-confluence 상태에서 10% FBS/DMEM, 10㎍/㎖ 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1- 메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 0.5mM 덱사메타손(dexamethasone ; Sigma chemical company)를 처리하였다.
2 일후 기존 배지를 제거하였고 10% FBS/DMEM, 10㎍/㎖ 이슐인(insulin)만을 처리하여 2 일 동안 배양하였다.
그 후 10 % FBS/DMEM만을 처리하여 총 8 일동안 분화유도를 시켰다.
3. MTT assay
세포 생존율에 미치는 발효 구아바 조성물의 농축분말의 영향을 분석하기 위해서 3T3-L1 전지방세포(preadipocyte)를 96well plate(2.0×104 cells/well)에 24시간 동안 배양한 후 일정 농도의 구아바(1000㎍/㎖∼62.5㎍/㎖)를 첨가하여 72시간 동안 배양하였다.
3 일 후 배양세포에 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma) 50 ㎕를 첨가하여 4 시간 동안 배양한 후 생성된 포마즌(formazan)을 DMSO 150 ㎕에 녹여 ELISA(BIO-TEK)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 세포 고정
지방 세포로 분화가 유도된 세포를 1×PBS로 2 번 세척하고 10 % 포르말린/PBS로 1 시간 동안 고정시켰다.
고정시킨 후 증류수로 3번 세척하였고 0.6% Oil Red O(Sigma) 염색약으로 1시간동안 실온에서 염색시켰다.
그 후 증류수로 2번 세척하여 90% Glycerol/PBS로 마운팅하였다.
5. 실험결과
각 발효 구아바 조성물의 농축분말의 3T3-L1 전지방세포의 지방세포 분화 저해효과는 도 4과 같다.
<실험예 2>. 발효 구아바 농축분말의 독성제거 및 당뇨개선 효과
1. 세포배양
본 발명에서는 간암세포주인 HepG2 세포를 사용하였다.
세포는 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 10% 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum)이 포함된 Dulbecco's Minimal Essential Medium (D-MEM)을 사용하여 5% CO2와 37℃가 유지되는 배양기에서 배양되었다.
2. MTT assay
세포 배양후 배양액을 제거하고 200 ㎕의 MTT reagent (Sigma)를 섞어 37 ℃에서 30 분에서 1 시간정도 반응시킨 후 반응액을 제거하고 200 ㎕의 isopropanol을 첨가하여 발색반응을 유도하고 흡광도는 570 nm에서 측정하였다.
본 실험에서는 HepG2 세포를 영양결핍배지에서 3시간동안 배양한 후에 구아바 추출물을 각각 처리하여 농도군(62.5, 125, 250, 500, 1000 ug/ml)에 따라 세포 생존능의 변화를 조사하였다 (도 5).
즉 대조군(A)에서는 처리농도가 250 ug/ml군에서 세포생존능이 급격히 떨어지고 이후 500 ug/ml과 1000 ug/ml의 고농도 처리군에서는 더욱 감소되는 결과를 얻었다 (도 6).
또한 대조군(A)인 비발효 구아바 조성물의 농축분말은 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말보다 뚜렷하게 세포독성이 나타났다(도 5).
처리군 B와 D의 고농도 처리군(500 ug/ml)도 약간의 세포독성을 보여주고 있으나 그 이하 저농도 처리군에서는 H2O2에 의해 유도되는 세포사멸현상을 억제하는 것으로 나타났다.
3. 세포 사멸 실험
세포의 생존이나 세포사멸의 여부를 조사하기위해 세포내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 H33342 (Sigma)를 배양중인 세포에 넣고 37 ℃에서 30 분간 배양후 CoolSNAP-Pro color digital camera가 장착된 형광현미경하에서 관찰하였다.
세포핵의 응축정도와 아폽토틱 바디(apoptotic body)의 형성여부를 관찰하여 세포의 생존 또는 세포사멸의 지표로 사용하였다.
대조군(도 7)에서 농축분말이 H2O2 에 의해 유도되는 세포사멸 현상의 억제효과를 보이며 특히 250 ug/ml과 500 ug/ml의 농도처리군에서는 핵의 모양이 비정상적으로 많이 응축된 형태를 나타내고 있다.
이러한 현상은 처리군 D의 500 ug/ml군에서도 관찰되고 있다.
결론적으로 H33342 염색결과는 MTT assay의 결과와 유사한 결과를 보여주고 있으며, 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말이 농도의존적으로 H2O2에 의해 유도되는 세포사멸현상을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
4. 세포내 ROS 측정
세포내 ROS의 측정을 위해서 세포막 투과성 ROS 탐색자(probe) 인 2'.7'-dichlorofluorescin diacedtate (H2DCFDA)를 사용하여 세포질내 ROS의 생성과 축적을 측정하였다.
배양이 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 H2DCFDA를 함유한 PBS에서 37℃ 10분간 배양한 후 multiwell 형광측정기를 이용하여 485 nm/535 nm 파장에서 형광의 강도를 측정하였다.
각 실험군(A, B, C, D, E)들을 다양한 농도군(62.5, 125, 250, 500, 1000 ug/ml)에 따라 처리하여 발효 구아바 조성물의 농축분말의 항산화 활성을 검증하였다.
먼저 HepG2 간암세포주를 영양결핍 배지에서 3시간동안 배양한 후에 각각의 발효추출물을 1시간동안 전처리하고 그 다음으로 H2O2 (10 mM)을 처리한다.
과산화수소 처리 후 15분 후에 세포내 활성산소물질 (reactive oxygen species, ROS)의 함량변화를 측정하였다.
형광표지인자인 H2DCFDA를 사용하여 세포내에 과산화수소(hydrogen peroxide)가 있을 경우에 발광하는 형광의 세기를 ROS의 지표로 간주하였다.
간암세포주에서 구아바 추출물들이 과산화수소에 의해 야기된 세포내의 ROS를 농도의존적으로 감소시키는 경향이 관찰되었다(도 11).
그런데 실험군 B와 D에서는 ROS의 농도의존적인 감소현상이 확실하게 관찰되었으나 실험군 C와 E에서는 처리농도에 따른 ROS의 농도의존적 감소현상이 뚜렷한 결과를 보이지 않았다.
5. 세포의 포도당 흡수 조절효과 측정
세포의 포도당 흡수 조절효과를 측정하기 위해 배양중인 HepG2 세포에 준비한 발효 구아바 조성물의 농축분말을 각각 전처리한 후 기저 포도당 흡수율의 변화를 측정하였다.
포도당(glucose)의 농도 측정은 글루코스 에세이 키트(glucose assay (ELASA) kit)(Sigma aldrich company)를 사용하였다.
먼저 영양결핍배지에서 3시간 배양된 HepG2 세포주에 다양한 농도의 발효추출물들을 처리하고 난 뒤 24 시간 후에 배양액에 잔존하는 포도당의 농도를 측정함으로써 역으로 HepG2 세포의 포도당 흡수활성을 측정하였다.
도 9의 결과에서 대조군(A)은 저농도 처리군(62.5, 125 ug/ml)에서 농도의존적인 포도당 흡수현상의 증가를 보이며, 오히려 고농도 처리군 (250 ug/ml 이상)에서는 처리농도에 따라 오히려 감소현상을 보여준다.
그리고 실험군 B와 D에서는 62.5, 125, 250 ug/ml 농도군까지 포도당 흡수의 증가현상이 관찰되었다.
이 결과는 대조군의 경우와 마찬가지이고 고농도군에서는 포도당 흡수의 감소현상이 관찰되었다.
그러나 실험군 C와 E에서는 고농도군에서도 여전히 포도당 흡수의 증가가 관찰되었다.
또한 이러한 포도당 흡수의 증가현상은 HepG2 세포주를 24 시간과 48 시간을 배양하였을 때 배양시간에 따른 변화는 거의 관찰되지 않았다(도 12, 도 13).
이러한 발효 구아바 조성물의 농축분말의 glucose uptake의 증가양상은 인슐린에 의한 포도당 증가보다도 더욱 높게 나타나는 결과를 얻었다.
따라서 본 발명의 결과는 발효 구아바 조성물의 농축분말이 세포에 대한 독성이 없이 인슐린처럼 포도당의 흡수를 개선시키는 효과를 가지고 있음을 나타내고 있다.
본 발명에 의해 독성이 제거되어 안전성이 증진된 발효 구아바 조성물과 그 제조방법이 제공된다.
또, 본 발명에 의해 독성이 제거되어 안전성이 증진되고, 지방세포 분화 저해효과가 뛰어나고, 당뇨병 예방 및 치료효과가 뛰어난 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말 및 그 제조방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 가축 및 양식어류의 육질개선용 사료로 사용될 수 있는 발효 구아바 조성물의 농축분말이 제공된다.
도 1은 본 발명의 발효 구아바 조성물의 제조공정도
도 2는 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말의 제조공정도
도 3은 본 발명의 발효 구아바 농축분말의 농도별 세포재생력에 대한 그래프
도 4는 본 발명의 발효 구아바 농축분말의 지방세포 분화 억제도
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
D : 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
도 5는 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말이 세포활성에 미치는 영향에 대한 그래프
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
C : 젖산균, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
D : 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
E : 젖산균, 효모에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
도 6은 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말이 세포생존능 변화실험결과
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
도 7은 비발효 구아바 조성물의 농축분말이 과산화수소에 의한 apoptotic HepG2 세포에 미치는 영향을 나타내는 사진
도 8은 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말이 과산화수소에 의한 apoptotic HepG2 세포에 미치는 영향을 나타내는 사진
도 9는 젖산균, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말이 과산화수소에 의한 apoptotic HepG2 세포에 미치는 영향을 나타내는 사진
도 10은 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말이 과산화수소에 의한 apoptotic HepG2 세포에 미치는 영향을 나타내는 사진
도 11은 젖산균, 효모에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말이 과산화수소에 의한 apoptotic HepG2 세포에 미치는 영향을 나타내는 사진
도 12는 본 발명의 발효 구아바 조성물의 농축분말이 세포내 ROS 함량에 미치는 영향에 대한 그래프
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
C : 젖산균, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
D : 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
E : 젖산균, 효모에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
도 13는 24시간 처리한 발효 구아바 조성물의 농축분말에 의한 세포의 포도당 흡수에 미치는 영향에 대한 그래프
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
C : 젖산균, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
D : 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
E : 젖산균, 효모에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
도 14는 48시간 처리한 발효 구아바 조성물의 농축분말에 의한 세포의 포도당 흡수에 미치는 영향에 대한 그래프
A : 비발효 구아바 조성물의 농축분말
B : 젖산균, 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
C : 젖산균, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
D : 효모, 바실러스에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
E : 젖산균, 효모에 의한 발효 구아바 조성물의 농축분말
Claims (10)
- 구아바 조성물의 제조방법에 있어서,구아바 분말과 손바닥선인장 분말을 10 : 1 의 중량비율로 혼합하는 제1공정,제1공정에서 얻어진 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균한 다음, 25 ℃로 냉각하는 제2공정,제2공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 버섯균사체를 접종하여 1차발효시키는 제3공정,제3공정에서 얻어진 1차발효물을 분쇄하여 분말화하는 제4공정,제4공정에서 얻어진 분말에 물을 1 : 10(w/v)의 비율로 가하여 1차발효 조성물을 제조하는 제5공정,제5공정에서 얻어진 1차발효 조성물에 감귤농축액 또는 감귤생과 분쇄물을 1차발효 조성물의 중량대비 1 중량%를 혼합하는 제6공정,제6공정에서 얻어진 감귤첨가 혼합물을 120 ℃에서 25 분간 멸균하고, 25 ℃로 냉각하는 제7공정,제7공정에서 얻어진 멸균 혼합물에 젖산균, 효모, 바실러스 중에서 선택된 1종 이상의 미생물을 접종하고 2차 발효시켜 발효 구아바 조성물을 수득하는 제8공정으로 구성된,발효 구아바 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,제1공정의 구아바분말은, 잎 또는 줄기 또는 뿌리를 분쇄하여 얻어진 것이고,손바닥선인장 분말은 열매 또는 줄기를 분쇄하여 얻어진 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,제1공정의 구아바분말 제조시 사용된 구아바는, 구아바(Psidium guajava L.), 캐틀레이 구아바(Cattley Guava), 스트로우베리 구아바(Strawberry Guava ; Psidium cattleranum Sabine), 브라질리안 구아바(Brazilian Guava ; Feijoa sellowiana Berg.), 구이사로(Guisaro ; Psidium guinense SW.), 코스타 리칸 구아바(Costa Rican Guava ; Psidium friendrichsthalianum Ndz.), 파라 구아바(Para Guava ; Psidium acutangulum DC.), 구아바베리(Guavaberry ; Myrciaria floribunda Berg.), 파인애플 구아바(Pineapple Guava ; feijoa) 중 선택된 1 종인 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,제 3공정의 버섯균사체는 상황버섯균사체, 영지버섯균사체, 차가균사체, 노루궁뎅이균사체, 신령버섯균사체, 표고버섯균사체, 운지버섯균사체 중에서 선택된 1 종인 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,제7공정의 2차 발효시, 젖산균은 스트렙토코커스 더모필루스 (Streptoco ccus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus),락토바실러스 에시도필루에서 선택된 1 종이고, 효모는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactoba cillus plantarum) 에서 선택된 1 종이고, 효모는 사카로마이세스세레비세 (Saccharomyces cerevisiae)이며, 바실러스는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)인 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 제조방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된,발효 구아바 조성물.
- 구아바의 농축분말의 제조방법에 있어서,제6항의 발효 구아바 조성물을 물을 첨가하여 1차추출하는 제1공정,제1공정에서 얻어진 1차추출물을 1차추출물 부피의 10 ~ 20 % 로 감압농축하여 제1농축액을 제조하는 제2공정,제2공정에서 얻어진 제1농축액에 물 또는 유기용매를 첨가하여 2차추출하는 제3공정,제3공정에서 얻어진 2차추출물을 냉각하고 여과시키는 제4공정,제4공정에서 얻어진 여과물을 감압농축하여 제2농축액을 제조하는 제5공정,제5공정에서 얻어진 제2농축액을 건조하는 제6공정,제6공정에서 얻어진 건조물을 분쇄하여 농축분말을 제조하는 제7공정으로 구성된,발효 구아바 조성물의 농축분말 제조방법.
- 제7항에 있어서,제3공정의 2차추출시, 유기용매는 알코올, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 중 선택된 1종인 것이 특징이며,선택된 유기용매를 제2공정의 제1농축액의 부피대피 1 : 5 ~ 10의 부피비율로 첨가하여 90 ℃에서 24 시간동안 추출하는 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 농축분말 제조방법.
- 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 발효 구아바 조성물의 농축분말.
- 제8항의 발효 구아바 조성물의 농축분말에 있어서,식품첨가제, 당뇨병 예방 및 치료, 가축 및 어류의 사료로 사용되는 것이 특징인,발효 구아바 조성물의 농축분말.
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