KR20070079465A - 진피발효추출물, 그 제조방법 및 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체 건강의 증진을 크게 도모할 수 있게 하기 위한 진피발효추출물, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다. 이러한 본 발명은 진귤의 진피로부터 추출한 진피추출물에 동량(同量)의 물과 5%의 설탕을 첨가하고 ph조절후 가압멸균하여 조성한 혼합물에 기 배양된 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하여 전체 배지의 5%로 접종한 다음 당밀을 3% 첨가 후 배양하여 발효액을 얻고, 그 발효액을 동결건조하여 분말화한 발효분말로부터 용매추출한 것이다.

진귤, 진피, 발효, 항산화

Description

진피발효추출물, 그 제조방법 및 그 용도{Fermented extract of Citrus Sunkii Hort, Method for processing thereof, and Use}

도1은 진피추출물과 진피발효추출물의 DPPH의 소거활성을 나타낸 그래프도,

도2는 세포내 ROS 함량에서 진피추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도3은 아질산염 산물(nitrite production)에서 Raw264.7 세포, 쥐의 거식세포에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 그래프도,

도4는 생화학 특성을 나타낸 염증성 흐름도,

도5는 Raw264.7에서 Cox-2 and phospho-IkBa의 단백질 수준의 변화를 나타낸 도면,

도6은 LDH활성(A) 또는 영양물질 유용률(B)에 따라 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도7은 Raw264.7 세포에서 poly-ADP ribosyltransferase의 보전 및 ERK1/2활성에 대한(A), 그리고 세포 생존능에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도8은 HepG2 세포에서 세포 생존능과 영양물질 유용률에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도9는 HepG2 세포에서 LDH활성에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래 프도,

도10은 CHO-IR 세포에서 세포핵 농도의 정도에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 도면,

도11은 CHO-IR 세포에서 세포핵 농도의 정도에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 도면

도12는 CHO-IR 세포에서 영양물질 유용과 LDH활성에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 그래프도,

도13은 CHO-IR 세포에서 ERK1/2 및 PKB/Akt의 활성 또는 손상되지 않은 caspase-3 단백질 의 세포내 함유량에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 도면,

도14는 분획 진피발효추출물의 DPPH 소거능 활성을 나타낸 그래프도,

도15는 분획 진피발효추출물에 의한 일산화질소 산물(nitric oxide production)의 억제능을 나타낸 그래프도,

도16은 Raw264.7 세포의 생존능에 대한 분획 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도17은 CHO-IR 세포의 생존능에 대한 분획 진피발료추출물의 효과를 나타낸 그래프도,

도18은 97일동안 고지방식이(HFD)로 또는 없이 진피발효추출물 식이(FS)에 의한 체중변화를 나타낸 그래프도,

도19는 97일동안 고지방식이(HFD)로 또는 섭취함 없이 진피발효추출물 식이(FS)에 의한 생활자의 히스토로지칼(Histological) 특성을 나타낸 도면이다.

본 발명은 진피발효추출물, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 진귤의 진피로부터 추출한 진피추출물에 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하고 배양하여 발효액을 얻고 그 발효액을 동결건조하여 분말화한 발효분말로부터 용매추출한 추출물을 제공함에 의해, 인체 건강의 증진을 크게 도모할 수 있도록 한 진피발효추출물, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다.

일반적으로 고려사기의 기록에 따르면 백제 문주왕 시대에 제주도의 감귤이 공물로 헌상되었다는 내용으로 보아 그 이전부터 제주도에 재래종 감귤이 재배되었음을 알 수 있는데 현재까지 이들에 대한 식물분류학적 분석은 충분하지 못하다. 현재 제주도에서 대표적인 과질로 재배되고 있는 것은 20세기 초 일본으로부터 도입된 온주밀감류가 대부분이며, 재래 감귤로는 12종이 자생하고 있는 것으로 확인되어 있는데, 제주자생 재래귤중 진귤(Citrus Sunkii Hort. ex Tanaka)은 제주지역에서 "산물"로 불리는 것으로 다른 이름으로는 산귤로 불리기도 한다.

진귤의 과피를 건조시킨 것을 진피라 부르는데 한의학에서는 없어서는 안될 필수적인 한약재로 사용하여 왔으나, 최근에는 일반 온주밀감의 건조과피를 진피로 잘못 인식하여 한약재로 사용하고 있어 이를 바로 잡을 필요가 있다. 진귤등의 재래감귤류와 은주밀감류는 모두 분류학상으로는 Citrus 속에 해당되며 최근 성분조사, 생리활성에 관한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 특히 과피의 기능성에 대 한 관심들이 집중되어 있는데 예를 들면 항염작용 및 설사억제효능, 항알러지효과, 대식세포의 활성증대들과 같은 약리활성들이 보고된 바 있다.

따라서 본 발명의 목적은 진귤의 진피로부터 추출한 진피추출물에 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하고 배양하여 발효액을 얻고 그 발효액을 동결건조하여 분말화한 발효분말로부터 용매추출한 추출물을 제공함에 의해, 인체 건강의 증진을 크게 도모할 수 있도록 하기 위한 진피발효추출물, 그 제조방법 및 그 용도를 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 진귤의 진피로부터 추출한 진피추출물에 동량(同量)의 물과 5%의 설탕을 첨가하고 ph조절후 가압멸균하여 조성한 혼합물에 기 배양된 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하여 전체 배지의 5%로 접종한 다음 당밀을 3% 첨가 후 배양하여 발효액을 얻고, 그 발효액을 동결건조하여 분말화한 발효분말로부터 용매추출한 것을 특징으로 한다.

상기 진피추출물은 건조된 진피분말로부터 용매추출하고 여과하여 상등액을 얻고 그 상등액으로부터 용매를 제거한 후 진공 동결건조한 것임이 바람직하다.

또한 본 발명은 진귤의 진피를 건조 분쇄하여 얻은 진피분말로부터 용매추출하고 여과하여 상등액을 얻고 그 상등액으로부터 용매를 제거한 후 진공 동결건조하여 진피추출물을 얻는 단계; 상기 진피추출물에 동량의 물과 5%의 설탕을 첨가하고 ph를 7.0으로 조절한 후 가압멸균하여 혼합물을 조성하는 단계; 상기 혼합물에 기 배양된 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하여 전체 배지의 5%로 접종한 다음 당밀을 3% 첨가 후 배양하여 발효액을 얻는 단계; 상기 발효액을 동결건조하고 분쇄하여 발효분말을 얻는 단계; 및 상기 발효분말로부터 용매추출하는 단계를 거쳐 제조됨을 특징으로 한다.

상기 젖산균 배양액은 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)균을 3×106cells/mL의 농도로 배양한 것임이 바람직하다.

또, 상기 효모 배양액은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)균을 4×106cells/mL의 농도로 배양한 것임이 바람직하다.

한편 본 발명의 기능성 건강식품은 상기 제조방법에 따라 제조되는 진피발효추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 목적 및 장점 그리고 다른 특징은 첨부 도면을 참조한 아래의 설명으로 부터 명백할 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

〈실시예〉

제주지역에서 친환경재배법으로 재배된 진귤을 구입하여 사용하였다. 벗겨낸 진피를 충분히 건조시킨 후 분쇄하여 얻은 분말시료(100ｇ)를 80% 에탄올 1L로 실온에서 7일간 추출한 후 Whatmann GF/C filter로 여과하여 상등액을 얻은 후 회전 농축기로 에탄올을 제거하고 남은 수층 시료를 진공 동결건조하여 진피추출물을 얻고 밀봉하여 냉동보관하였다.

발효과정은 상기 진피추출물과 동량(同量)(w/w)의 물과 5%(w/w) 설탕을 첨가 하고 NaOH를 pH를 70.으로 조절한 후 가압멸균(120℃, 25분)하였다. 젖산균(락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum), ATCC8014)은 MRS 배지에서 38℃, 3일간 혐기, 정치배양하였고, 효모(사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), IFO 0203)는 YM 배지에서 25℃, 5일간 호기, 교반배양하였다. 각 배양액을 혼합하여(젖산균 3×106cells/mL; 효모 4×106cells/mL) 전체 배지의 5%(w/v)로 접종하고 당밀을 3%(w/v) 첨가한 후 38℃에서 7일간 혐기배양하였다. 배양이 완료된 발효액은 급속냉동후 동결건조하고 건식분쇄기로 분말화하였다. 발효분말의 용매추출(부탄올(butanol), 헥산(hexane), 클로로폼(chloroform), 에틸아세테이트(ethylacetate))은 Yoo와 Hwang(8)의 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 시약은 별도로 표시된 것 외에는 모두 Sigma사(St. Louise, MO. USA)로부터 구입하여 사용하였다.

〈실험예1;자유유리기 소거능 측정〉

Blios(9)의 방법에 따라 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 사용하여 자유유리기(free radicals) 소거능을 측정하였다. 20 mM DPPH 용액에 동량의 측정시료를 넣고 혼합하여 10분간 방치한 후 525 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 자유유리기 소거능은 1-(측정시료군의 흡광도/무첨가군 흡광도)×100(%)으로 표시하였다.

〈실험예2;세포배양〉

본 실험에서는 간암세포주인 HepG2, 대식세포주의 하나인 Raw264.7 세포 및 chinese hamster overy(CHO) 세포들을 한국세포주은행(서울)로부터 공여받아 사용 하였다. HepG2, 및 Raw264.7 세포는 100 U/mL 페니실린(penicillin), 100㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycin), 10% 우태아형정(fetal bovine serum)이 포함된 Dulbecco's Minimal Essential Medium(D-Mem) 액을, CHO 세포는 Ham's F-12 배양액을 사용하였으며 5% CO2 및 37℃가 유지되는 배양기에 배양되었다. 세포는 T75 배양용기에서 배양된 후 우태아혈청이 제거된 무혈청(serum-free) 배양액에서 일정시간동안 전배양(serum-starvation)하고 난 뒤 시료의 처리실험에 사용하였다.

〈실험예3;배양세포내 활성산소물질(Reactive Oxygen Species, ROS)의 측정〉

ROS의 측정을 위해서 세포막 투과성 ROS 탐색자(probe)인 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(H2DCFDA)를 사용하여 세포질내 ROS의 생성과 축적을 측정하였다(10). 배양이 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 10 nM의 H2DCFDA를 함유한 PBS에서 37℃, 10분간 배양한 후 multiwell 형광측정기(Tecan, Austria)를 이용하여 485nm/535nm의 파장에서 형광의 광도를 측정하였다.

〈실험예4;일산화질소(Nitric oxide;NO) 측정〉

Raw264.7 세포로부터 생성된 NO의 배양액내 농도는 Sigma 사의 Griess reagent(11)를 사용하여 측정하였다. 표준용액 및 배양액을 동량의 Griess reagent를 섞어 10분간 반응시킨 뒤 ELISA reader(Tecan, Austria)를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

〈실험예5;Lactate dehydrogenase(LDH) 활성도 측정〉

세포에 대한 비특이적(nonspecific) 상해의 지표가 되는 LDH 활성도를 측정 하여 시료가 배양세포에 독성을 나타내는 지를 조사하였다. 시료처리가 끝난 세포배양액과 LDH assay reagent(Takara, Japan)를 각각 0.1 ml씩 섞어 10분간 상온에서 반응시킨 뒤 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이때 기저흡광도는 배양에 사용하지 않은 배양액으로부터 측정하였고 각 실험군의 흡광도로부터 기저흡광도를 제한 값을 실제 LDH 활성도로 계산하였다.

〈실험예6;MTT assay〉

세포독성 또는 세포의 생존능은 mitochondria의 활성을 측정하기 위하여 MTT 측정법을 사용하였다(12). 시료의 처리가 끝난 뒤 세포배양액과 동량의 MTT reagent(1 mg/mL in D-Mem)를 섞어 37oC에서 30분 동안 더 배양한 후 상층액을 제거하고 200 μl isopropanol을 넣어 발색반응을 유도하였으며 흡광도는 570-690nm에서 측정하였다.

〈실험예7;H33342 염색〉

세포의 생존, 또는 세포사멸 여부를 조사하는 또다른 방법으로 세포내 DNA특이적인 형광색소인 H33342를 최종농도가 1 μg/mL이 되도록 배양중인 세포에 투여하고 37oC에서 30분간 배양 후 CoolSNAP-Pro color digital camera(Media Cybernetics, Housten, USA)가 장착된 형광현미경 아래에서 관찰하였다(10). 세포핵의 응축정도와 apoptotic body의 형성 여부를 관찰하여 세포의 생존 또는 세포사멸의 지표로 삼았다.

〈실험예8;전기영동 및 Western blot 분석〉

배양이 끝난 세포를 직접 5%의 2-mercaptoethanol을 포함한 cell lysis buffer (13)에 녹여 균질화시켰다. 70oC에서 10분간 가열하고 4-12%의 polyacrylamid gel에 전기영동하고 poly(vinylidene difluoride)(PVDF)에 흡착시켰다. PVDF membrane을 blocking buffer(Tris-buffered saline-0.1%(w/v) Tween-20)(TBS-T)으로 상온에서 1시간동안 반응시키고 난 뒤 여러 가지 1차항체(1:1000-1:3000)가 들어있는 TBS-T에서 1시간(25oC) 또는 16시간(4oC)동안 반응시켰다. TBS-T로 3회 세척하고 HRP-conjugated 2차 항체와 상온에서 30분 반응시킨 뒤 Enhanced Chemiluminescence(ECL) 방법으로 각 band의 영상을 얻었다.

〈결과〉

과일, 야채, 해조류 등의 유효성분들은 여러 퇴행성, 대사성 질환의 발생을 억제하는 것으로 밝혀지고 있는데 여기에는 포함되어 있는 영양성분 뿐 아니라 polyphenol, 특히 flavonoids에 의한 항산화효과에 기인할 것으로 추측되고 있다. 이미 감귤류에는 naringin, hesperidin등과 같은 flavonoids들이 풍부하게 포함되어 있으며 이들이 항산화효과의 중요한 요인들로 작용하는 사실들이 밝혀지고 있다.

도1은 진피추출물과 진피발효추출물의 DPPH의 소거활성을 나타낸 그래프도이다.

시험관에서의 항산화활성을 DPPH 라디칼 소거활성 측정법으로 조사하였다. 발효과정 전후의 진피추출물의 항산화활성을 비교하였다. 유효소거능을 50% 억제농도로 비교하였을 경우 발효과정을 거친 진피추출물의 활성이 발효전에 비하여 뚜렷하게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 진피성분이 세포수준에서 직접 생화학 적인 항산화과정을 거쳐 산화스트레스를 극복하며 특히 발효과정 후에 이러한 생리적 기능이 더욱 증강되었음을 의미하는 것이다.

As2O3 (arsenic trioxide), *SE (Sanmul-extract, ug/ml)

도2는 세포내 ROS 함량에서 진피추출물의 효과를 나타낸 그래프도로서, HepG2세포는 3시간동안 전배양된 것이고, 30분동안 진피추출물로 기 처리된 것이고, H2DCFDA에서 30분동안 H2O2와 As2O3을 함유하는 배양액에서 배양된 것이다. 형광 강도는 흥분 발광하는 동안 485nm/595nm 파장에서 multiwell 형광측정기로 측정한 것이다.

진피추출물의 항산화효과를 시험관법(DPPH)이 아닌 세포수준에서의 변화로 측정하고자 세포내에 존재하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 특이형광염색물질인 2‘.7’-dichlorofluorescin diacetate (H2DCF-DA)로 추적하여 진피추출성분의 항산화효과를 확인할 수 있었다.

도2의 결과, 간암세포주의 일종인 HepG2 배양세포에서 진피추출물의 처리는 세포내 ROS의 함량을 나타내는 H2DCFDA의 유도체인 DCF의 형광의 강도를 기저수준에서도 감소시킬 뿐 아니라 외인성 ROS인 과산화수소 (hydrogen peroxide)의 첨가로 증가된 세포내 ROS 함량도 현저히 억제시키는 효과를 보임으로서 전체적으로 본 연구에서 사용될 진피발효추출물의 기질인 진피 추출물 자체로도 유효한 항산화효과를 나타낼 수 있음을 인지할 수 있었다.

도3은 아질산염 산물(nitrite production)에서 Raw264.7 세포, 쥐의 거식세포에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 그래프도로서, Raw264.7 세포는 3 시간동안 전배양된 것이고, 상이한 분량의 추출물로 기 처리됨 아울러 18시간동안 lipopolysaccharide (LPS, 1ug/ml)에서 배양된 것이다. 그 처리 후, 배양세포는 분리되고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 제시되고, 유도된 nitric oxide synthase(iNOS, NOS2)(A)의 노출 수준을 측정하기 위해서 immunoblotted된다. 이와 달리, 동량의 배지는 배양액에서 아질산염물(nitirte conten)을 측정하기 위해 Griess assay가 사용된다(B).

활성산소종(ROS)은 세포의 종류 및 세포내, 체내 잔존량의 정도에 따라 정상적인 생리활성을 저해하므로서 세포의 손상을 야기하는 측면이 있는 반면, 병원균의 침투시 이에 대항하는 거식세포(macrophage)의 활성을 자극하므로서 외부병원균에 대항하는 면역작용을 일으키는 데 중요한 매개역할을 하기도 하였다. 따라서 본 실험에서는 항염증(anti-inflammation) 과정의 초기단계 모델로서 병원성 세균의 독소성분중 하나인 lipopolysaccharides (LPS)에 노출시 거식세포가 ROS를 생성하여 외부 병원균에 대항하는 과정에서 진피발효추출물의 역할을 조사하였다.

도3의 결과에서, 배양중인 macrophage 세포(Raw264.7)에 E. coli 유래 toxin중 하나인 LPS를 처리할 경우 ROS의 일종인 nitric oxide (NO)의 생성이 급격히 증가하며 여기에 진피발효추출물을 처리할 경우 농도의존적으로 감소하였다.

(* 배양액내의 NO는 sodium salt와 반응하여 stable nitrite를 생성하며 Griess reaction은 nitrite 함량을 측정하므로서 NO의 생성을 나타냄.)

또한 nitric oxide synthase (inducile)의 단백질발현 수준 결과에서도, LPS는 세포내 NOS2 단백질의 수준을 급격히 증가시키며 진피발효추출물의 처리는 NOS2 단백질의 발현증가를 억제하는 결과를 보였다.

이러한 결과는 진피발효추출물이 단백질발현수준에서의 조절단계를 통해 NO의 과다한 생성을 적절히 조절할 가능성을 시사하는 결과이다.

전통적으로 진피는 한약재의 중요한 재료로 사용되어 왔으나 자세한 약리기전은 알려지지 않은 상태이며 특히 민간에서는 호흡기계 감염에 의한 염증증상을 완화하는 목적으로 사용되고 있는데 기인하여, 본 실험에서는 염증에 수반되는 세포의 생화학적 변화지표에 진피 발효추출물이 미치는 효과를 조사하고자 하였다.

도4는 생화학 특성을 나타낸 염증성 흐름도이다. 도5는 Raw264.7에서 Cox-2 and phospho-IkBa의 단백질 수준의 변화를 나타낸 도면이다. 세포는 3시간동안 전배양된 것이고, 상이한 분량의 추출물(E*)로 기 처리됨 아울러 18시간동안 lipopolysaccharide (LPS, 1ug/ml)에서 배양된 것이다. 그 처리 후, 배양세포는 분리되고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 제시되고, 표시된 바와 같이 단백질 수준들의 수준을 측정하기 위해서 immunoblotted된다.

도4에서 보여지는 염증관련 유발인자중 초기변화현상중 하나인 IkB의 인산화에 의한 IkB 단백질의 가수분해(ubiquitination-protein degradation)현상 및 최종 염증유발인자인 PGE2 합성효소인 cyclooxygenase-2 (Cox-2)의 활성증가는 염증유발의 대표적인 표시지표로서 본 실험에서는 위의 두가지 변화를 측정하였다.(도5참조)

도5의 결과로부터, 진피발효추출물의 처리는 LPS로 증가된 염증유발인자인 Cox-2 단백질 및 인산화된 IkBa 단백질의 수준을 현저히 감소시켰다. 도4의 모식도로부터, IkBa 단백질의 인산화증가는 IkBa 단백질의 가수분래를 촉진하므로서 NFkB 단백질을 유리(release)시켜 전사인자(transcription factor)로서의 활성을 증가시켜 궁극적으로 염증유발을 촉진시키는 단백질인 Cox-2 및 NOS2 단백질의 신합성을 증가시키게 되는데, 진피발효추출물의 성분은 이러한 염증유발과정을 효과적으로 저해하는 결과를 보여주는 것으로 나타났다.

다음 실험으로는 진피발효추출물이 거식세포(macrophage)인 Raw264.7 세포에 독성을 미치는 지, 또는 영양대사활성에 미치는 지를 조사하였다. 이는 거식세포 자체에는 독성을 미치지 않으면서 세포내 생화학적 변화만을 조절하여야 하는 ‘항상성’의 측면에서 중요한 지표임. 이를 위하여 세포독성의 지표인 lactate dehydrogenase (LDH) 및 세포에 의한 영양물질(glucose)의 유용도를 측정하였다.(도6 참조)

도6은 LDH활성(A) 또는 영양물질 유용률(B)에 따라 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. Raw264.7 세포는 3시간동안 전배양된 것이고, 상이한 분량의 추출물(E*)로 기 처리됨 아울러 18시간동안 lipopolysaccharide (LPS, 1ug/ml)에서 배양된 것이다. 그 처리 후, 동량의 배지는 LDH활성(Takara, Japan의 시약으로 평가하는데 사용) 또는 영양물질 농도(Sigma, TrinderTM의 의 시약으로 평가)의 측정을 위해서 사용된다.

도6의 결과로부터, 진피발효추출물 자체는 거식세포주인 Raw264.7 세포에 유의할 만한 세포독성을 나타내지 않으며 세포의 영양대사 과정에도 유의할 만한 변 화를 미치지 못하였다.

이상의 결과에서, 진피발효추출물이 거식세포에 독성을 미치지 않으면서 과도한 염증을 적절히 억제하는 활성을 보임. 그러나 진피발효추출물이 배양액내 지속적인 LPS의 존재로 인해 야기될 수 있는 macrophage의 세포사멸, 또는 세포증식 속도에 어떠한 영향을 미치는 지는 밝혀지지 않았으며 다음 실험에서 조사하고자 하였다(도7 참조).

도7은 Raw264.7 세포에서 poly-ADP ribosyltransferase의 보전 및 ERK1/2활성에 대한(A), 그리고 세포 생존능에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. 세포는 3시간동안 전배양된 것이고, 상이한 분량의 추출물(E*)로 기 처리됨 아울러 18시간동안 lipopolysaccharide(LPS, 1ug/ml)에서 배양된 것이다. 그 처리 후, 배양세포는 분리되고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 제시되고, (A)에 표시된 바와 같이 단백질 수준들의 수준들을 측정하기 위해서 immunoblotted된다. 이와 달리 배양세포는 MTT 시약을 사용한 세포 생존능을 측정하기 위해서 MTT 활성 시약에 제시된다.

도7의 결과에서, 무혈청(serum-free) 배지에 LPS를 첨가하면 세포사멸의 한 지표인 PARP 단백질의 가수분해가 관찰되는데 여기에 진피발효추출물을 첨가하면 PARP 단백질의 가수분해가 억제된다. 또한 세포의 증식능에 관여하는 효소로 알려져 있는 ERK1/2의 활성 또한 진피발효추출물에 의해 증가되는 결과를 보였다. 한편 이전의 결과(도6 참조)에서 LPS의 처리가 세포의 독성(LDH)의 증가를 야기하지는 않았으나 MTT 실험결과 Raw264.7세포의 생존능은 유의하게 감소하였다. 그러나 진 피발효추출물의 처리는 LPS에 의한 세포 생존능의 감소를 억제하였는데 이러한 결과는 LPS에 의해 macrophage 자체는 염증반응에 의한 세포괴사(necrosis)를 일으키지는 않으나 세포죽음의 또 다른 한 형태인 세포사멸(apoptosis)는 일으킬 수 있음을 의미한다. 그러나 진피발효추출물은 이러한 LPS 유도성 세포사멸을 억제하는 효과가 있음이 보여지며 이는 거식세포에 의한 면역-방어체계에 진피발효추출물이 유익한 효과를 발휘함을 보여주는 결과로 판단할 수 있다.

이상의 실험(도1-7)들에서 진피발효추출물은 세포 수준에서의 항산화효과, 항염증효과, 거식세포의 생존능자극효과들을 가지며 이러한 효과들은 체내에서의 면역-방어 체계에 중요한 역할을 담당하는 사실을 의미한다.

그러나 진피발효추출물 성분이 악성종양세포에 대한 항종양효과를 보이는 지에 대해서는 알려지지 않으며 따라서 이후의 실험에서는 진피발효추출물이 종양세포의 증식억제, 세포사멸(apoptosis)의 유도와 같은 생리활성들을 가지고 있는 지를 규명하고자 하였다.

이를 위하여 서로다른 2가지의 종양세포주를 사용하였다(HepG2 세포와 CHO-IR 세포).

먼저, 사람의 간암세포주의 일종인 HepG2 세포에서 진피발효추출물이 세포의 생존능과 영양물질 대사에 미치는 영향을 조사하였다(도8 참조).

도8은 HepG2 세포에서 세포 생존능과 영양물질 유용률에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. 세포는 24시간동안 전배양된 것이고, 진피발효추출물과 과산화수소(hydrogen peroxide)로 또는 없이 48시간동안 처리된 것이다. MTT활성과 영양물질 유용정도는 상기된 바와 같이 측정된 것이다.

혈청이 결핍된 배지 (serum-free medium, control)에 HepG2 세포를 48시간 배양하면 산물발효추출물의 처리는 세포의 생존능을 대조군에 비해 더욱 감소시키는 경향을 보이며, 배양액에 과산화수소(hydrogen peroxide)와 같은 ROS를 첨가하였을 때 발생하는 생존능의 감소를 더욱 촉진하는 효과가 보였다(도8A).

또한 같은 조건에서, 진피발효추출물의 처리는 (고농도에서) HepG2 세포에 의한 glucose의 흡수정도를 유의하게 감소시키며 배양액내 과산화수소의 첨가에 따른 glucose의 흡수감소를 더욱 촉진하는 효과가 있음이 관찰되었다(도8B).

이러한 결과로부터, 진피발효추출물이 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과가 세포독성(cytotoxicity)을 수반하는 현상인 지를 조사하기 위하여 LDH 활성을 측정하였다(도9 참조).

도9는 HepG2 세포에서 LDH활성에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. 세포는 24시간동안 전배양된 것이고, 진피발효추출물과 과산화수소(hydrogen peroxide)로 또는 없이 48시간동안 처리된 것이다. LDH활성은 상기된 바와 같이 측정된 것이다.

이전의 실험에서 진피발효추출물이 세포의 생존능을 감소시키며 glucose 흡수정도를 감소시켰는데, 도8의 결과에서도 지속적인 진피발효추출물의 처리는 세포독성지표인 LDH의 활성증가를 역시 유발하였다. 이는 체내에서와 달리 체외배양 조건에서는 세포사멸(apoptosis) 현상이 장기간 지속될 경우 세포괴사(necrosis)에 의한 세포내 LDH 효소의 배양액내 누출로 인한 결과로 여겨진다.

간암세포주(HepG2)에서 진피발효추출물이 세포의 생존능을 감소시키는 현상을 보인데 대하여 그 기전을 보다 세밀히 밝히기 위하여 HepG2 세포에 비해 배양조건에 따른 세포생존능의 변화 정도가 보다 뚜렷한 세포주인 CHO-IR 세포주를 사용하였다.(* CHO-IR; chinese hamster ovary cells expressing human insulin receptors)

먼저, 혈청이 결핍된 배지(serum-free medium, Ham's F-12)에 진피발효추출물을 첨가하고 18시간동안 배양한 뒤 세포사멸의 한 지표인 세포핵의 응축현상을 관찰하기 위하여 세포막투과성 DNA-특이적 형광제인 H33342를 배양세포 배지에 직접 투여하여 세포핵의 응축정도를 관찰하였다(도10 참조).

도10은 CHO-IR 세포에서 세포핵 농도의 정도에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 도면이다. 세포는 4시간동안 전배양된 것이고, 진피발표추출물(E*)로 또는 없이 18시간동안 처리된 것이고, H33322 (10ug/ml)로 착색시킨 것이다.

CHO-IR 세포를 혈청결핍배지(serum-free, control)에 18시간동안 배양할 경우 세포핵의 염색질이 응축된 세포의 수가 증가하며, 저농도(100ug/ml)의 진피발효추출물의 처리군에서는 대조군에 비해 변화가 관찰되지 않으나 고농도(1000ug/ml) 처리군에서는 대부분의 세포들에서 응축된 핵을 가진 ‘세포사멸(apoptosis)' 현상을 관찰할 수 있었다.

혈청결핍배지에서 진피발효추출물은 세포사멸의 지표인 세포핵응축을 증가시켰는데, 다음 실험으로는 세포사멸을 억제하는 효과가 있는 인슐린과 함께 진피발효추출물을 동시에 처리후 변화를 관찰하였다(도11 참조).

도11은 CHO-IR 세포에서 세포핵 농도의 정도에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 도면이다. 세포는 4시간동안 전배양된 것이고, 진피발표추출불(E*) 및 인술린(insulin;100nM)로 또는 없이 18시간동안 처리된 것이고, H33342로 착색시킨 것이다.

혈청결핍배지에서 배양시 나타나는 세포사멸 현상(세포핵 응축)은 anti-apoptotic factor인 인슐린을 처리할 경우 억제되나, 고농도(1000ug/ml)의 진피발효추출물을 처리할 경우 이러한 인슐린의 효과가 저해된다. 즉, 진피발효추출물은 종양세포의 세포사멸을 유도하는 효과를 가지고 있는 것으로 판단되었다.

이러한 CHO-IR 세포에서의 세포사멸 유발효과가 HepG2 세포에서 관찰되었던 세포독성(LDH activity)과 glucose 흡수정도의 변화를 수반하는 지를 관찰하였다(도12 참조).

도12는 CHO-IR 세포에서 영양물질 유용과 LDH활성에 대한 진피발효추출물(E*)의 효과를 나타낸 그래프도이다. 세포는 4시간동안 전배양된 것이고, 진피발효추출물 및 인술린(100nM)로 또는 없이 배양된 것이다.

HepG2 세포에서의 결과와 마찬가지로 CHO-IR 세포에서도 진피발효추출물의 처리는 glucose 흡수능을 저해하였으며 세포독성지표인 LDH의 활성도 증가시켰다. 이러한 결과는 진피발효추출물의 처리로 인해 영양물질(glucose) 흡수 저해로 인한 영양결핍성 세포사멸이 유발되며, 체외배양조건에서의 세포사멸조건 장기간 지속시 나타나는 세포괴사(necrosis)의 현상 또한 유발됨을 의미하는 결과다.

마지막으로, 포도당흡수과정 또는 세포증식속도에 관여하는 효소인 인슐린의 존성 protein kinase B (Akt), ERK1/2의 활성, 세포사멸 유발효소인 caspase-3 활성이 진피발효추출물에 의해 CHO-IR 세포에서 어떠한 변화가 유발되는지를 조사하였다(도13 참조).

도13은 CHO-IR 세포에서 ERK1/2 및 PKB/Akt의 활성 또는 손상되지 않은 caspase-3 단백질 의 세포내 함유량에 대한 진피발효추출물의 효과를 나타낸 도면이다. CHO-IR 세포는 4시간동안 전배양된 것이고, 10분(A) 또는 18시간(B)동안 시약 처리된 것이다. 그 처리후, 세포는 분리되고 상기된 바와 같이 immunoblotting을 위해서 제시된다.

인슐린의존성 glucose uptake에 중요한 역할을 하는 효소인 PKB/Akt의 활성은 진피발효추출물의 처리로 억제되었으나 세포증식과정에 직접 관여하는 효소중 하나인 ERK1/2의 활성에는 큰 변화가 없었다.

또한 세포사멸 과정에서 핵심적인 매개역할을 하는 효소인 caspase-3의 활성은 진피발효추출물의 처리로 증가하였다(*intact caspase-3는 불활성 상태이며 자가가수분해에 의해 intact protein이 감소하고 cleaved caspase-3가 증가할수록 활성이 증가함. 즉, 결과에서 intact caspase-3의 band density의 정도는 활성과는 반비례하고 있음).

이러한 결과는 진피발효추출물이 어떠한 경로를 통해 glucose 흡수에 중요한 역할을 하는 PKB/Akt의 활성을 저해하여 세포의 ‘영양결핍’ 상태를 초래하며 이로부터 세포사멸이 유도될 가능성을 시사한다.

이상의 결과로부터 진피발효추출물의 항산화, 항염효과등이 입증되었으며 다 음으로는 진피발효추출물을 용매분획후에 항산화활성 (DPPH 소거능 측정)(도14 참조) 및 항염증지표의 하나인 산화질소 생성에 미치는 효과(도15 참조)를 측정하였다.

도14는 분획 진피발효추출물의 DPPH 소거능 활성을 나타낸 그래프도이다. 여기서 A는 부탄올, B는 헥산, C는 클로로포름, D는 에틸아세테이트 용매를 각각 나타낸다.

도15는 분획 진피발효추출물에 의한 일산화질소 산물(nitric oxide production)의 억제능을 나타낸 그래프도이다. 각 막대는 평균 ± S.E. (n=3-4)를 나타낸다. CTL: control (0.1% DMSO), LPS (100 ng/mL). 여기서 A는 부탄올, B는 헥산, C는 클로로포름, D는 에틸아세테이트 용매를 각각 나타낸다.

이전의 결과들에서 진피발효추출물의 항산화, 항염증, 세포증식억제 효과가 보여졌으나 추출물의 어떤 구성성분이 이러한 역할을 담당하는지를 알기 위해서는 단계별 분획, 순수정제과정을 거친 성분들의 활성을 세밀하게 분석하여야 한다. 본 실험에서도 진피발효추출물을 부탄올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트의 분획추출물을 얻어 각각의 활성을 조사하였는데 DPPH 소거활성의 경우 에틸아세테이트 분획에서 가장 우수한 소거능이 관찰되었으며 그 뒤로 부탄올, 클로로포름, 헥산 분획의 순이었다.(도14 참조).

또한 Raw264.7 세포에서 LPS 유도성 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였는데 LPS와 함께 각 분획추출물을 24시간 처리하였을 때 DPPH 소거활성과는 반대로 클로로포름, 헥산 분획에서의 NO 생성억제 효과가 높았고 부탄올 분획의 경우 NO 생성 억제효과가 전혀 관찰되지 않았다. 두 실험결과로부터, DPPH 소거활성과 NO 생성 억제활성이 모두 강하게 나타나는 분획은 에틸아세테이트 분획이었다.

도16은 Raw264.7 세포의 생존능에 대한 분획 진피발효추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. 각 막대는 평균± S.E. (n=3-4)를 나타낸 것이다. CTL: control (0.1% DMSO), LPS (100 ng/mL). 여기서, A는 부탄올, B는 헥산, C는 클로로포름, D는 에틸아세테이트 용매를 각각 나타낸다.

LPS를 48시간 처리하여 세포사멸을 유발하였을 때에도 세포사멸을 억제하는 효과는 역시 에틸아세테이트 분획에서 보여졌으며(도16A 참조), 헥산, 클로로포름 분획의 경우 높은 비특이적 세포독성(LDH 활성)이 관찰되었다(도16B 참조). 이상의 결과들을 종합하여 보면 진피발효추출물 분획들 중, Raw264.7 세포에서의 항산화, 항염활성, 세포생존능강화 활성들은 주로 에틸아세테이트 분획의 성분에서 비롯된 것임을 추측할 수 있다.

도17은 CHO-IR 세포의 생존능에 대한 분획 진피발료추출물의 효과를 나타낸 그래프도이다. 배양세포는 사멸세포핵(apoptotic cell nuclei) 또는 세포핵 농도를 볼 수 있도록 착색한 DNA-비형광성(DNA-specific fluorescent)을 H33342로 스트레인시킨 것이다(A). 각 막대는 평균 ± S.E. (n=3-4) (B)를 나타낸 것이다. 여기서, A는 부탄올, B는 헥산, C는 클로로포름, D는 에틸아세테이트 용매를 각각 나타낸다.

도18은 97일동안 고지방식이(HFD)로 또는 없이 진피발효추출물 식이(FS)에 의한 체중변화를 나타낸 그래프도이다.

도19는 97일동안 고지방식이(HFD)로 또는 섭취함 없이 진피발효추출물 식이(FS)에 의한 생활자의 히스토로지칼(Histological) 특성을 나타낸 도면이다.

그러나 CHO-IR 세포의 증식억제 실험에서, 부탄올 분획은 혈청제거 배양액에 24시간동안 배양했을때 나타나는 세포사멸 현상을 강하게 억제하는 것으로 나타났으며, 나머지 분획에서는 모두 세포증식을 억제하는 것으로 나타났다(도17 참조). 따라서, 세포의 증식을 억제하는 항종양 성분은 부탄올 분획을 제외한 전 분획에 모두 포함되어 있으며 구체적으로 어느 성분이 세포증식을 억제할 것인 지는 각 분획으로부터 보다 정교한 분리정제를 거친 성분연구가 수행되어야 규명될 수 있을 것으로 사료된다.

이상의 시험관, 배양세포에서의 실험결과 진피발효추출물의 항산화, 항염효과가 분명히 관찰되었으나 실제 실험동물이 장기간 섭취하였을 경우 나타나는 변화를 조사할 필요가 있었다.

따라서, 생후 4주령의 수컹생쥐(ICR mice)를 4개의 실험군(대조군, 고지방사료군, 진피발효추출물군, 고지방사료+진피발효추출물군)으로 나누어 최대 97일까지 진피발효추출물을 음용수에 0.2%의 농도로 식이하게 하면서 체중의 변화 및 간독성지표, 간조직의 변화를 관찰하였다(도18 및 도19 참조)

97일간 체중변화를 관찰한 결과(도18 참조), 대조군에 비해 진피발효추출물을 음용수에 섞어 섭취한 군에서 유의할 만한 차이를 보이지 않았다. 그러나 고지방사료를 섭취케 하여 비만을 유도하고 동시에 진피발효추출물 음료를 함께 섭취한 군에서는 약 7% 정도의 체중감소 효과가 관찰되었다. 추출물 섭취에 위한 간독성 유발 유무를 조사하기 위하여 혈액내 AST/ALT의 농도를 측정하였으나 실험군간 유의할 만한 차이는 관찰되지 않았다.

도19의 결과에서, 고지방사료의 장기간 섭취는 실험동물의 간조직에 광범위한 지방분포(지방간)를 유발하였는데 발효추출물의 병행섭취는 이러한 지방간 형성을 뚜렷하게 억제하였다.

상술한 바와 같이 본 발명에 의하면, 진피추출물과 진피발효추출물의 1차 항산화할성을 검색하여 발효후 추출물이 더욱 효과적인 활성이 가지고 있는 사실을 발견하였고 이를 바탕으로 대식세포인 Raw264.7 세포에서 산화질소의 생성, 염증 유발 단백질(NOS2, Cox-2)의 수준을 억제할 뿐만 아니라 동 세포의 생존능을 개선시키는 효과가 있다.

그러나 상피세포유래 세포주인 CHO-IR 세포 및 사람의 간암세포주인 HepG2 세포의 생존능은 반대로 발효후 추출물에 의해 억제되는 것으로 나타났는데 이러한 결과들은 진피의 발효후 추출물이 대식세포의 항염증활성을 증가시키는 반면, 종양세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 다양한 약리효과를 가지고 있음을 의미한다.

또한 본 발명은 고지방식이에 의한 체중증가를 억제하고 지방간의 형성을 억제하며 혈액 생화학적 분석으로부터 유의한 간세포독성을 유발하지 않게 하는 효과가 있다.

Claims (6)

1. 진귤의 진피로부터 추출한 진피추출물에 동량(同量)의 물과 5%의 설탕을 첨가하고 ph조절후 가압멸균하여 조성한 혼합물에 기 배양된 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하여 전체 배지의 5%로 접종한 다음 당밀을 3% 첨가 후 배양하여 발효액을 얻고, 그 발효액을 동결건조하여 분말화한 발효분말로부터 용매추출한 것을 특징으로 하는 진피발효추출물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 진피추출물은 건조된 진피분말로부터 용매추출하고 여과하여 상등액을 얻고 그 상등액으로부터 용매를 제거한 후 진공 동결건조한 것임을 특징으로 하는 진피발효추출물.
3. 진귤의 진피를 건조 분쇄하여 얻은 진피분말로부터 용매추출하고 여과하여 상등액을 얻고 그 상등액으로부터 용매를 제거한 후 진공 동결건조하여 진피추출물을 얻는 단계;

   상기 진피추출물에 동량의 물과 5%의 설탕을 첨가하고 ph를 7.0으로 조절한 후 가압멸균하여 혼합물을 조성하는 단계;

   상기 혼합물에 기 배양된 젖산균 배양액과 효모 배양액을 혼합하여 전체 배지의 5%로 접종한 다음 당밀을 3% 첨가 후 배양하여 발효액을 얻는 단계;

   상기 발효액을 동결건조하고 분쇄하여 발효분말을 얻는 단계; 및

   상기 발효분말로부터 용매추출하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 진피발효추출물 제조방법.
4. 제3항에 있어서,

   상기 젖산균 배양액은 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)균을 3×106cells/mL의 농도로 배양한 것임을 특징으로 하는 진피발효추출물 제조방법.
5. 제3항에 있어서,

   상기 효모 배양액은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)균을 4×106cells/mL의 농도로 배양한 것임을 특징으로 하는 진피발효추출물 제조방법.
6. 제3항에 따라 제조되는 진피발효추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.

Images