KR101936887B1 - 황칠나무 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물 및 이를 포함하는 육모제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 황칠나무 잎 추출물, 이의 가지 추출물 및/또는 이의 수액 추출물을 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 모발관련세포인 피부유두세포(HHDPC)에 독성이 거의 없으며, 두피 개선, 항알러지, 항염증 기능성이 우수한 황칠나무 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물, 이를 포함하는 육모제 및 이의 응용제품을 제공할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

황칠나무 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물 및 이를 포함하는 육모제{Hair-growth agent composition containing dendropanax morbifera ferment extract as an active ingredient and Hair-growth agent containing the same}

본 발명은 황칠나무 추출물을 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물 및 이를 포함하는 육모제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 황칠나무 가지, 이의 잎 및/또는 이의 수액 추출물을 특정 미생물로 발효시킨 발효물을 이용한 육모제 조성물, 이를 이용한 육모제에 관한 것이다.

황칠나무(Dendropanax morbifera)는 한국 특산종으로서 주로 남쪽 섬에서 자라며, 높이는 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 그 잎은 달걀 모양 또는 타원형으로서 어긋나고, 잎 가장자리가 밋밋하지만, 어린 나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 연한 황록색으로 6월에 피고, 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm이고, 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이며, 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 황칠나무의 껍질에 상처를 내면 노란 액체가 흘러나오는데, 이것을 황칠(黃漆)이라고 하며 오래 전부터 가구의 도료로 사용하였으나, 최근의 연구 결과에 따르면 항암 효과, 간세포 재생, 당뇨 치료, 경조직 세포 재생 등에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

황칠나무와 관련한 특허를 보면, 대한민국 공개특허 제10-2011-0078527호는 황칠나무의 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 황칠나무의 추출물은 MMP-1 생성억제 효과, 콜라겐 합성증진 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 있음을 보여주고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1544176호에는 제주 황칠나무 추출물의 안정화 방법과 이의 방법으로 안정화된 황칠나무 추출물을 포함하는 미백 또는 항염 기능을 갖는 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있다.

현대사회에서 나타나는 탈모는 노화현상과 유전적 요인에 의해 발생한다는 기존의 개념과는 달리 스트레스, 서구화된 식습관으로 인한 영양 불균형 등 사회·문화적인 요인들의 변화에 의해 발생 하며, 탈모로 고통 받고 있는 인구가 늘어나고 있어 최근에는 20대 여성은 물론 젊은 학생들까지 탈모를 걱정하는 시대가 됨에 따라 탈모예방을 위한 다양한 정보와 탈모치료 관련시장이 증가하고 있다. 최근에는 모발성장과 관련하여 한약재와 생약추출물 등 천연물을 이용한 치료제 및 치료법에 대하여 많은 연구가 진행되고 있으며 전통적으로 한방에서는 많은 식물추출물들이 탈모예방 및 발모에 사용되어 왔으며 안전성에 있어서 우수한 것으로 알려져 있다.

그런데, 현재까지 황칠나무 가지, 잎 또는 수액 추출 발효물의 육모 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그에 관련된 특허는 아직 공개된 바가 없다.

이에, 본 발명에서는 모발관련세포인 피부유두세포(HHDPC, human hair dermal pailla cell)에 독성이 거의 없으며, 두피 개선, 항알러지, 항염증 기능성이 우수한 육모제 조성물, 육모제 및 이의 응용제품을 제안하고자 한다.

한국 공개특허번호 제2003-0028022호(공개일 2003.04.08) 한국 공개특허번호 제2003-00321287호(공개일 2008.04.14)

이에 본 발명자들은 황칠나무 가지 추출물, 황칠나무 잎 추출물 및/또는 황칠나무 수액을 발효시킨 발효물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물, 이를 이용한 육모제 및/또는 응용제품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 잎 추출물, 황칠나무 가지 추출물을 발효시킨 발효물 및 황칠나무 수액 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 과민성 두피개선, 항알러지 및/또는 두피 항염증 효과를 갖는 육모제 조성물 및 이를 포함하는 육모제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 황칠나무 추출물 및/또는 황칠나무 수액을 준비하는 단계; b) 상기 a)단계에서 준비한 황칠나무 추출물 및/또는 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 처리하여 발효시켜 발효물을 얻는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 발효물을 필터에 여과시키는 단계를 포함하며, a) 단계의 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 추출물 및/또는 황칠나무 가지 추출물을 포함하거나, 또는 황칠나무 잎 및 황칠나무 가지의 혼합물을 추출하여 제조한 혼합 추출물인 육모용 황칠나무 추출 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 육모용 황칠나무 발효액을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 갖는 응용제품을 제공한다.

본 발명의 황칠나무 추출 발효물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거능, ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) 라디칼 소거능이 우수하여 항산화 효과가 우수하다. 또한, NO 생성 억제 효과가 있는 바, 항염증 및/또는 두피 진정 효과가 우수할 뿐만 아니라, 베타-헥소스아미니다아제(β-hexosaminidase) 효소 생성 억제 효과가 우수하여 항알러지 효과도 우수할 뿐만 아니라, 항균 효과가 우수하고, 피부유두세포(HHDPC, human hair dermal pailla cell) 등에 대한 세포독성이 거의 없는 바, 새로운 육모제 조성물, 육모제 및/또는 이의 응용한 헤어용 기능성 제품(헤어용 샴푸, 헤어용 린스, 헤어용 트리트먼트, 헤어용 팩, 헤어용 로션, 헤어용 왁스, 헤어용 미스트(mist), 헤어용 에센스, 헤어용 세럼, 헤어용 에센스 등)을 제공할 수 있다.

도 1은 황칠나무 잎/가지 추출물 제조공정 및 이의 발효공정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 1은 황칠나무 잎/가지 추출물 제조공정 및 이의 발효공정에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2는 MRS 배지 및 실시예 3-1 및 실시예 3-2에서 제조한 발효물을 나타낸 사진이다.
도 3은 미생물 발효 시간에 따른 황칠나무 잎/가지 추출 발효물, 수액 발효물의 pH변화를 나타낸 그래프이다(A: Lactobacillus K2020, B: Lactobacillus K1785).
도 4는 미생물 발효 시간에 따른 황칠나무 잎/가지 추출 발효물, 수액 발효물의 생균 수 변화를 나타낸 그래프이다(A: Lactobacillus K2020, B: Lactobacillus K1785).
도 5는 황칠나무 추출물의 농도에 따른 세포생존율(A) 및 NO 생성 감소율(B) 측정 결과이다.
도 6a 내지 도 6b 각각은 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(K2020-20%, K1785-20%)의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 세포생존율 및 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과이다.
도 6c는 황칠나무 수액 발효물(K2020-1%, K1785-1%)의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과이다.
도 7은 황칠나무 추출물에 대한 RBL-2H3 비만세포 생존율(A) 및 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과(B) 측정 결과이다.
도 8a 내지 도 8b 각각은 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(K2020-20%, K1785-20%)의 RBL-2H3 비만세포주 세포 생존율 및 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과 측정 결과이다.
도 8c 내지 도 8d 각각은 황칠나무 수액 발효물(K2020-1%, K1785-1%)의 RBL-2H3 비만세포주 세포 생존율 및 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과 측정 결과이다.
도 9는 대장균에 대한 황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 황칠나무 수액 발효물에 대한 항균 측정 결과이다.
도 10는 황색포도상구균에 대한 황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 황칠나무 수액 발효물에 대한 항균 측정 결과이다.
도 11은 녹농균에 대한 황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 황칠나무 수액 발효물에 대한 항균 측정 결과이다..
도 12는 칸디다질염에 대한 황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 황칠나무 수액 발효물에 대한 항균 측정 결과이다.
도 13은 분양 받은 HHDPC 사진 및 이의 배양에 사용되는 T-75 플라스크 사진이다.
도 14는 HHDPC를 이용한 황칠나무 잎/가지 추출액과 발효물의 세포생존율 측정을 위해 시료를 농도별로 처리하여 48 시간 배양시킨 사진이다.
도 15는 도 14의 배양된 세포의 광학 현미경 측정 사진으로서, 좌측 사진은 세포 배양 0일차 측정 사진이고, 도 16의 우측사진은 세포배양 1일차 측정 사진이다.
도 16은 실시예 6의 HHDPC 세포 생존율 측정 실험의 MTT assay 측정사진 및 포르마잔 결정이 생성된 후 찍은 사진이다.
도 17은 미녹시딜을 양성대조군(positive control)로 지정하기 위해 농도에 따른 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 18은 HHDPC 세포 수에 따른 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 19는 배양시간에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 20은 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 농도가 1 mg/mL일 때, 종류에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 21은 발효물 농도에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 22는 발효물 배양 시간에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정 결과이다.
도 23은 HHDPC 세포 독성 측정 실험시, HHDPC 세포를 배양한 사진이다.
도 24 내지 도 27 각각은 표 7의 A, E, F 및 I의 배양시간에 따른 측정 결과이다.
도 28 내지 도 31 각각은 실시예 7의 피부유도세포의 세포 이동력을 측정한 측정 사진이다.
도 32는 실시예 7의 피부유도세포의 세포 이동력 측정 거리 데이타이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 황칠나무의 잎 및/또는 가지 추출물을 발효시킨 발효물, 황칠나무 수액 발효물의 항산화, 항알러지, 민감성 두피 개선 또는 항염증 효과에 대한 연구는 이루어진 바 없다.

본 발명의 발효물은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능이 우수하여 항산화 효과가 우수하여 민감성 두피 개선 효과가 있다.

본 발명의 발효물은 낮은 세포독성을 가지면서, NO 생성 억제 효과가 있는 바, 염증을 억제하고 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 발효물은 ?-헥소스아미니다아제(β-hexosaminidase) 효소 생성 억제 효과가 우수하여 항알러지 효과가 있다.

또한, 본 발명의 발효물은 피부유두세포 등의 두피, 피부 세포에 대한 독성이 없다.

따라서, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출 발효물 및/또는 황칠나무 수액 발효물을 유효성분으로 함유하는 육모제 조성물을 제공한다.

황칠나무는 높이 15m에 달하고 어린 가지는 녹색이며 털이 없다. 잎은 어긋나고 달걀모양 또는 타원형이다. 또한, 잎 가장자리가 밋밋하지만 어린나무에서는 3~5개로 갈라지고 톱니가 있다. 꽃은 6월에 연한 황록색으로 피고 양성화이며 산형꽃차례에 달린다. 꽃줄기는 길이 3~5cm이고 작은 꽃줄기는 길이 5~10mm이다. 꽃받침은 5개로 갈라지고 꽃잎과 수술은 5개씩이며 화반에 꿀샘이 있다. 암술머리는 5개로 갈라지고 핵과는 타원형이며 10월에 흑색으로 성숙하고 암술대가 남아 있다. 나무껍질에 상처를 내면 노란 액체가 나오는데 이것을 황칠이라고 하며 가구의 도료로 사용하였다. 한국 특산종으로 남쪽 섬에서 자란다.

본 발명에 있어서, 황칠나무 추출 발효물은 황칠나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질, 수액 및 종자 등)으로부터 추출 및 발효하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질, 수액 또는 뿌리로부터 얻은 추출 발효물이고, 보다 바람직하게는 잎, 가지 및/또는 수액으로부터 얻은 추출 발효물이며, 가장 바람직하게는 잎 또는 가지 각각으로부터 얻은 추출물을 각각 발효시킨 뒤 혼합한 발효물이거나, 또는 잎과 가지의 혼합물로부터 얻은 추출물을 발효시킨 발효물을 의미한다.

이하, 특별하게 언급하지 않는 "황칠나무 추출 발효물" 표현은 황칠나무 잎 추출 발효물, 황칠나무 가지 추출 발효물 및/또는 황칙나무 수액 발효물을 포함하는 의미이다.

본 발명의　육모제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조되는 데에 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 토닉 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는,　샴푸, 린스, 트리트먼트, 세럼, 미스트, 크림, 에센스, 로션, 팩 같은 제품을 제조하는 데 적용이 가능하다.

본 발명의　육모제 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출 발효물 이외에　항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출 발효물은 Lactobacillus속의 균으로 발효시키는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 Lactobacillus plantarum 균으로 발효시키는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균으로 발효시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Oriolus versicolor , Stereum hirustum , Phellinus linteus , Aspergillus oryzae , Bacillus속 균주,　 Fomes fomentarius , Coriolus sinensis 및 Lactobacillus속 균주를 이용하여 황칠나무 추출 발효물을 제조한 결과, Lactobacillus 속 균주에서 가장 높은 항염 효과를 나타냄을 확인하였다. 그 후, Lactobacillus 속 122종 중 9가지 균주 L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus , L. curvatus , L. plantarum , L. sakei , L. buchneri , L. fermentum 및 L. reuteri를 준비하여 항알러지, 항산화, 항염 등의 효과를 확인해 본 결과, Lactobacillus plantarum 균주로 발효시킨 경우, 가장 높은 항알러지, 항산화, 항염 효과를 확인할 수 있었다. 그 중에서 가장 높은 효과를 보인 두 종의 균주를 선별하였으며, 각각 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 및 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균으로 명명하였다.

본 발명에서 상기 발효는 26시간 내지 60시간 발효하는 것일 수 있다. 26시간보다 적게 발효할 경우, 충분히 2차 대사 산물이 생성되지 않아 항염증에 효과적이지 않을 수 있으며 60시간 이상 발효할 경우, 용액 내의 산도가 감소하고 발효균의 수가 급격히 감소하는 등의 부작용이 있다. 특히, 황칠나무 잎 추출물 및/또는 가지 추출물에 대한 발효는 26시간 내지 40시간 정도 발효시키는 것이 좋으며, 황칠나무 수액에 대한 발효는 36시간 내지 60시간 정도 발효시키는 것이 좋다.

본 발명에서 상기 황칠나무 추출 발효물은 상기 육모제 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 30.0 중량% 함유되는 것일 수 있다. 바람직하게는 황칠나무 잎 추출물 및/또는 황칠나무 가지 추출물 발효물인 경우, 육모제 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 25.0 중량%로 함유되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 20.0 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 황칠나무 추출 발효물의 함량이 증가함에 따라 세포 독성이 나타남을 알 수 있으므로, 육모제의 응용제품 원료로 사용 시 20 중량% 미만의 함량으로 사용하는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다.

본 발명은 황칠나무 추출 발효물을 함유하는 항염증 또는 민감성 두피 진정 효과를 갖는 헤어용 응용제품을 제공한다.

본 발명의　육모제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조되는 데에 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 토닉 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는,　미스트, 크림, 세럼, 에센스, 로션, 팩 등과 같은 타입의 헤어제품을 제조하는 데 적용이 가능하다.

본 발명의　헤어 제품에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출 발효물 이외에　헤어 제품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명은 a) 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 수액을 b) 상기 a)단계에서 준비한 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 처리하여 발효시켜 추출 발효물을 얻는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 추출 발효물을 필터에 여과시키는 단계를 포함하는 황칠나무 추출 발효물의 제조방법을 제공한다.

여기서, 상기 a) 단계의 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 추출물 및 황칠나무 가지 추출물을 포함하거나, 또는 황칠나무 잎 및 황칠나무 가지의 혼합물을 추출하여 제조한 혼합 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 a)단계 황칠나무 잎 추출물 및/또는 황칠나무 가지 추출물은 황칠나무 잎, 가지 또는 잎과 가지 혼합물의 중량대비(wt%) 8 내지 12배의, 바람직하게는 9 내지 11배의 정제수를 넣고, 70 내지 90 온도 조건에서 2 내지 4 시간 동안 추출하는 것일 수 있다. 이때, 70 온도 조건보다 낮은 온도에서 추출하거나, 2시간 이내로 추출하게 되면 황칠나무 잎 및/또는 가지로부터 유효성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 90 온도조건보다 높은 온도에서 추출하게 되면 황칠나무 잎으로부터 유효성분이 변형되어 항염 또는 두피 진정 효과가 충분하지 않을 수 있다. 또한, 4시간보다 긴 시간 동안 추출하게 되면, 유효성분 이외에 부수적인 성분들이 다량 추출되어 항염 또는 두피 진정 효과가 효과적이지 못할 수 있다.

본 발명의 상기 b)단계 발효는 6×10⁸ 내지 8×10⁸ cfu/ml의 균수로 미생물을 접종하고, 35℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 26 내지 60 시간 동안 발효하는 것일 수 있다.

만약, 6×10⁸ cfu/ml보다 적은 균으로 발효를 진행하면 충분하게 2차 대사 산물이 생성되지 않을 수 있고, 8×10⁸ cfu/ml보다 많은 균으로 발효를 진행하면 용액 내의 산도가 높아져 발효시간이 감소하여 유익한 발효물의 생성이 적어지는 부작용이 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 황칠나무 추출 발효물을 두 가지 균주로 발효시켰을 때, 황칠나무 잎/가지 추출물은 28 ~ 32시간째, 황칠나무 수액은 2일째에 가장 많은 pH 변화를 확인하였다. 또한, 28 ~ 32시간째 또는 2일째에 가장 많은 생균수를 확인하였다. 이를 통해 황칠나무 잎/가지 추출물은 26 ~ 36시간 동안 배양하는 것이, 황칠나무 수액은 46 ~ 54시간 정도 배양하는 것이 황칠나무 추출 발효물을 생산하는데 최적의 시간임을 확인하였다. 따라서 상기 b) 단계의 발효는 26 내지 60시간 동안 발효하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 28시간 내지 54시간 동안 발효하는 것일 수 있으며, 최적 발효시간은 발효 대상에 따라 차이가 있을 수 있다.

본 발명의 상기의 방법으로 제조된 항염증 또는 민감성 두피 개선 효과를 갖는 황칠나무 발효액을 제공한다.

상기 황칠나무 발효액은 황칠나무 잎 추출물, 황칠나무 가지 추출물, 및/또는 황칠나무 수액을 발효하여 얻은 발효액일 수 있다.

본 발명은 상기 발효액을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 민감성 두피 개선 효과를 갖는 헤어 제품을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 황칠나무 잎/가지 추출물의 제조 및 황칠나무 수액 준비

실시예 1-1. 황칠나무 잎/가지 열수 추출물(분말)의 제조

2016년 3월 제주특별자치도 제주시 조천읍에서 수득한 황칠나무 잎과 가지를 30에서 24시간 건조 후, 세절하였다. 다음으로, 세절된 잎과 가지 혼합물(잎:가지=1:1 중량비) 10 배수의 정제수를 넣고 80에서 3시간 동안 추출하였다. 그런 다음, 이 추출물을 감압 여과하여 황칠나무 잎/가지 열수 추출물을 수득하였다. 다음으로, 이를 농축한 후, 동결건조하여 분말화시켰다.

실시예 1-2. 황칠나무 수액 준비

2016년 3월 제주특별자치도 서귀포시에서 수득한 황칠나무 수액을 준비하였다.

실시예 2. 발효 균주의 선별

실시예 2-1 : 황칠나무 잎/가지 추출물 및 수액의 항염증 또는 미백 효과를 통한 발효 균주 선택

상기 실시예 1에서 제조한 황칠나무 잎/가지 추출물 또는 황칠나무 수액을 발효하는데 있어서 최적의 발효 균주를 선별하기 위하여, 하기 실험을 실시하였다.

Oriolus versicolor , Stereum hirustum , Phellinus linteus , Aspergillus oryzae, Bacillus속 균주,　 Fomes fomentarius , Coriolus sinensis 및 Lactobacillus속 균주를 준비하여, 황칠나무 잎/가지 추출물과 황칠나무 수액을 발효시켰다. 황칠나무 추출물 발효시 균수는 7×10⁸ cfu/ml로 접종하였고, MRS 배지에 황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 수액 각각을 20 중량% 비율로 제조하고, 배양액의 1%의 균(7×10⁸ cfu/ml)을 접종하였다. 그 후 48시간 동안 인큐베이터에서 배양 및 발효시켰다.

그 후, 황칠나무 잎/가지 추출물 발효물 또는 수액 발효물의 항염증 효과를 측정하기 위해 RAW264.7을 이용하여 NO assay를 실시하였고, 멜라닌 생성 억제능을 측정하기 위해 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다.

그 결과, Lactobacillus 속 균주로 발효한 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 발효물에서 가장 우수한 항염증 효과 및 멜라닌 생성 효과를 나타내었다.

실시예 2-2. 황칠나무 잎/가지 추출물 및 수액의 항염증 또는 미백 효과를 통한 Lactobacillus 속 균주 중 발효 균주 선택

상기 실시예 2-1에서 Lactobacillus 속 균주로 발효한 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 항염증 또는 미백 효과가 우수하였다. 이에, 가장 최적의 Lactobacillus 종을 확인하고자 하였다.

총 9가지 균주 L. acidophilus, L. delbrueckii , L. helveticus , L. curvatus, L. plantarum , L. sakei , L. buchneri , L. fermentum , L. reuteri를 준비하였다. 그리고 상기 실시예 2-1에서 실시한 바와 동일하게 준비된 균주로 황칠나무 잎/가지 추출물과 황칠나무 수액을 발효시켰다. 황칠나무 추출물 발효시 균수는 7×10⁸ cfu/ml로 접종하였고, MRS 배지에 황칠나무 잎/가지 추출물 및 수액을 20 중량% 비율로 제조하고, 배양액의 1%의 균(7×10⁸ cfu/ml)을 접종하였다. 그 후 48시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다.

그 후, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 발효물의 항염증 효과를 측정하기 위해 RAW264.7을 이용하여 NO assay를 실시하였고, 멜라닌 생성 억제능을 측정하기 위해 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다(자세한 실험방법은 이후 실시예 5 참조).

그 결과, Lactobacillus plantarum 균주로 발효한 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 발효물에서 가장 우수한 항염증 효과 및 미백 효과를 나타내었다.

본 발명자들은 Lactobacillus plantarum 균주 중 가장 우수한 항염증 효과 및 미백 효과를 나타내도록 발효시킬 수 있는 균주 2종을 선정하였으며, 각각을 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020(이하 약칭 K2020, 미생물 수탁번호: KACC 92132P), Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil1785(이하 약칭 K1785, 미생물 수탁번호: KACC 92131P)로 명명하고 미생물 수탁기관에 수탁하였다.

실시예 3. 황칠나무 추출 발효물의 제조

실시예 3-1. 황칠나무 잎/가지 추출 발효물의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 황칠나무 잎/가지 열수 추출물을 K2020와 K1785를 각각 사용하여 발효하였다. K2020 및 K1785 균주의 배양액은 MRS 배지(Difco^TM Lactobacilli MRS Broth, Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하였다. 황칠나무 잎 추출 발효물 제조 시 K2020 및 K1785 각각을 균 수 7×10⁸ cfu/ml로 동일하게 접종하였다.

MRS 배지에 황칠나무 잎/나무 추출물 함량을 0, 10, 20, 30, 40 중량% 비율로 각각 제조하고 배양액의 1%의 균(7×10⁸ cfu/ml)을 접종하였고, 그 이후, 48시간 동안 진탕 배양기에서 배양하였다. 그 후, 배양액은 10분간 원심분리(4,000 X g)하여 균이 없는 상층액을 포집하였다. 포집한 상층액은 필터링(0.22 ㎛ pore size)하여 최종적으로 황칠나무 잎/가지 추출 발효물을 확보하였다. 그리고, 황칠나무 잎/가지 열수 추출물 및 이를 발효시키는 대략적인 공정 개략도를 도 1에 나타내었다.

그리고, 대조군인 MRS 배지, 황칠나무 잎/가지 추출물을 적용시킨 발효 전의 MRS 배지, MRS 배지를 actobacillus plantarum K2020로 발효시킨 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(추출물 20 중량% 접종), MRS 배지를 Lactobacillus plantarum K1785로 발효시킨 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(추출물 20 중량% 접종) 각각의 사진을 도 2의 (A) 내지 (D)에 순서대로 나타내었다.

실시예 3-2. 황칠나무 수액 발효물의 제조

상기 실시예 1-2에서 수득한 황칠나무 수액을 각각 K2020과 K1785를 사용하여 발효하였다. K2020 및 K1785의 배양액은 MRS 배지를 사용하였다. 황칠나무 수액 추출 발효물 제조 시 K2020 및 K1785의 균수는 7×10⁸ cfu/ml로 동일하게 접종하였다.

MRS 배지에 황칠나무 수액 함량을 0, 0.5, 1.0, 2.0 중량% 비율로 각각 제조한 다음 균을 접종하였고, 그 이후, 48시간 동안 진탕 배양기에서 배양하였다. 그 후, 배양액은 10분간 원심분리(4,000 X g)하여 균이 없는 상층액을 포집하였다. 포집한 상층액은 필터링(0.22 ㎛ pore size)하여 최종적으로 황칠나무 수액 추출 발효물을 확보하였다. 그리고, MRS 배지를 actobacillus plantarum K2020로 발효시킨 황칠나무 수액 발효물(수액 1 중량% 접종), MRS 배지를 Lactobacillus plantarum K1785로 발효시킨 황칠나무 수액 발효물(수액 1 중량% 접종) 각각의 사진을 도 2의 (E) 내지 (F)에 순서대로 나타내었다.

실시예 3-3. 황칠나무 잎/수액 추출 발효물의 명명

상기 실시예 3-1 및 3-2에서 수득한 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 발효물은 하기 표 1과 같이 명명하였다.

Sample	황칠나무 잎/가지 추출물 함량 (%)	황칠나무 수액 함량 (%)	Lactobacillus K2020	Lactobacillus K1785	명명
A	-	-	-	-	Control (0%)
B	10	-	O	-	K2020-10%
C	20	-	O	-	K2020-20%
D	30	-	O	-	K2020-30%
E	40	-	O	-	K2020-40%
F	10	-	-	O	K1785-10%
G	20	-	-	O	K1785-20%
H	30	-	-	O	K1785-30%
I	40	-	-	O	K1785-40%
J	-	0.5	O	-	K2020-0.5%
K	-	1	O	-	K2020-1%
L	-	2	O	-	K2020-2%
M	-	0.5	-	O	K1785-0.5%
N	-	1	-	O	K1785-1%
O	-	2	-	O	K1785-2%

실시예 4. 황칠나무 잎/가지 추출물 또는 수액의 발효조건 설정

실시예 4-1. pH 변화에 따른 적정 발효일 설정

황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 추출 발효물의 적정한 발효기간을 확인하기 위하여, K2020 및 K1785 균주를 황칠나무 잎/가지 추출물 및 수액을 함유한 MRS 배지에 접종한 후, K2020-20%, K1785-20%, K2020-1% 및 K1785-1% 각각의 시간별 pH를 pH 미터 기기를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3의 (A) 및 (B)에 나타내었다.

도 3는 (A)는 K2020-20%, K2020-1%에 대한 측정결과이고, (B)는 K1785-20%, K1785-1% 에 대한 측정결과이다.

K2020 균주의 pH 변화는 배양 시간이 32시간 경과하였을 때, pH 7에서 3.0으로 가장 많은 변화를 보이며, 및 K1785 균주의 pH 변화는 배양 시간이 32시간 경과하였을 때, pH 7에서 3.5로 가장 많은 변화를 보였다.

따라서, 도3에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎/수액 추출 발효물에서의 두 균주의 pH 변화는 배양 시간이 추출물 및 수액의 발효 시간은 32 시간 이상으로 설정하였다.

실시예 4-2. 배양 시간에 따른 생균수 측정

황칠나무 잎/가지 추출 발효물 또는 수액 발효물의 배양 시간에 따른 생균수를 확인하기 위하여, K2020 또는 K1785 균주를 황칠나무 잎/가지 추출물 및 수액을 함유한 MRS 배지에 접종하였다(K2020-20%, K1785-20%, K2020-1% 및 K1785-1%). 그 후, 하루 간격으로 MRS 배지에 균주를 1X10⁴배 희석하고 스프리딩(spreading) 하였다. 스프리딩 후, 배양기에서 37, 15시간 배양 후 생성되는 콜로니 수를 세어 생균 수를 확인하였다.

그 결과, K2020-20% 및 K2020-1%의 경우, 생균 수가 30시간 배양 후 최대 균의 수로 증가하였으며 그 이후부터 균 감소를 보였다(도 4 (A)참조). 또한, K1785-20% 및 K1785-1%의 경우, 생균 수가 28시간 배양 후 최대 균의 수로 증가하였으며 그 이후부터 균 감소를 보였다(도 4 (A)참조).

이는 Lactobacillus plantarum 균주에 의해 생성되는 젖산의 양이 증가하면서 pH가 감소하기 때문에, pH 3.2 ~ 3.5에서 배양 조성의 변화로 Lactobacillus plantarum 균주의 사멸을 유발하기 때문으로 판단된다.

실시예 4-3. 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 젖산 분석

앞서 확인한 pH 변화와 생균 수가 젖산 생성에 기인한 것인지 확인하기 위하여, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 추출물의 발효에 따른 젖산생성을 분석하였다. 젖산의 정량은 유산탈수소효소(lactic acid dehydrogenase, LDH)를 이용하여 피루브산 형성 시 NAD⁺에서 형성하는 NADH를 340 nm에서 측정하는 방법을 사용하였다. 측정되는 NADH 는 젖산의 존재를 의미하며, 당량비가 같음을 의미한다.

이미 알고 있는 젖산의 양을 달리하여 검량선을 작성하고, 유산탈수소효소의 활성을 확인한 후, 시료와 유산탈수소효소를 반응시킨 후에 340nm에서 흡광도를 측정하여 젖산의 유무를 판단하였다. 젖산의 측정 원리는 하기 반응식 1에 기재하였다.

[반응식 1]

그 결과, 황칠나무 잎 추출 발효물의 경우 두 균주 모두 발효가 시작하고 약 28 ~ 32시간 정도 이후에 젖산의 가장 많이 검출되었다. 이는 생균수의 결과와 pH의 변화와 일치하는 결과로서 약 28 ~ 32시간 정도 후 생균 수가 감소하는 것은 젖산의 형성에 의한 생육환경의 변화에 기인하는 것으로 판단할 수 있다. 황칠나무 수액 추출 발효물의 경우에도 두 균주 모두 발효가 시작하고 약 28 ~ 32시간째 젖산이 가장 많이 검출되었다.

실시예 5. 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 효과 분석

실시예 5-1 : 항산화 효과 분석

MRS 배지 55g에 황칠나무 잎/가지 추출물 동결 분말 6.20g을 혼합하여 대조군을 준비하였다.

그리고, 상기 표 1의 K2020-20%, K1785-20%, K2020-1% 및 K1785-1%의 발효물을 준비하였다.

그리고, 이들의 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

이때, DPPH 라디칼 소거능은 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물을 희석한 용액을 제조하였으며, 각 희석 용액 160 ㎕을 96-웰 플레이트에 분주 후 0.15 M의 DPPH 용액 40 ㎕를 넣어 골고루 섞고 상온에서 30분간 암실 반응하였다. 그리고, 암실 반응 종결 후 ELISA 리더(reader) 기기(517 nm)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

또한, ABTS 라디칼 소거능을 측정은 14 mM의 ABTS 시약과 4.9 mM의 potassium persulfate 용액을 1:1 부피비로 혼합 후 상온에서 24시간 반응시켰다. 다음으로, 1.5 mL tube에 ABTS 시약 980 ㎕와 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물 희석액 20 ㎕를 넣어 반응시켰다. 그리고, 상온에서 10분간 암실 반응 후, ELISA reader 기기(734 nm)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

구분	DPPH 라디칼 소거능 (IC50, ㎍/㎖)	ABTS 라디칼 소거능 (IC50, ㎍/㎖)
대조군	133.47 ± 14.59	64.35 ± 2.22
K2020-20%	2561.96 ± 326.94	1611.05 ± 415.21
K1785-20%	2301.54 ± 353.21	1633.24 ± 290.98
K2020-1%	729.55 ± 152.50	345.15 ± 12.85
K1785-1%	806.94 ± 116.47	257.24 ± 6.02

상기 표 2를 살펴보면, 황칠나무 잎/가지 추출물을 K2020 또는 K1785 균주로 발효시킨 발효물 및 수액 발효물이 대조군 보다 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능 매우 우수함을 확인할 수 있다. 그리고, 수액 발효물 보다 황칠나무 잎/가지 추출물의 항산화 효과가 더 우수하였다. 이를 통해서, 본 발명의 황칠나무 잎/가지 추출 발효물, 황칠나무 수액 추출물이 우수한 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2 : 세포생존율 및 항염증 효과 분석

황칠나무 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7을 이용한 황칠나무 추출물, 황칠나무 추출 발효물의 생포생존율 및 항염증 효과를 측정하기 위해 NO assay를 실시하였다.

대식 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37 배양기에서 2~3회 계대 배양한 후 사용하였다. RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁶ cells/well이 되도록 분주하여 5% CO₂ 배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 이때, 대식 세포주 RAW264.7 cell의 염증을 유발하기 위하여 1mg/ml 농도의 지질다당류(lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich, USA) 10 ㎕를 각 웰에 주입하였다. 그 후, 상등액 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮겨 그리스 시약(griess reagent with 2.5% phosphoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-Naphtyl) ethylenediamine) 100 ㎕를 각 웰에 넣어 반응시켰다. 그 후, 540nm 파장에서 ELISA 리더기로 광학 밀도(optical density)를 측정하였다. 측정한 광학 밀도는 지질다당류(lipopolysaccharide)를 가한 세포에서의 광학 밀도 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

양성 대조군으로는 지질다당류를 가하지 않은 RAW264.7 cell에서의 광학 밀도 값이며, 음성 대조군으로는 NO 억제제로 작용하는 L?-Nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME, Sigma-Aldrich, USA)를 가한 세포에서의 광학 밀도 값이다.

아울러, RAW264.7의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트 1×10⁶ cells/well이 되도록 분주하여 5% CO₂ 배양기에서 20 내지 24시간 동안 예비 배양하고, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후, PBS에 녹인 MTT(5mg/ml) 용액 10 ㎕를 각 웰에 넣고 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 용해시켜 550nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔(formazan) 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

(1) 황칠나무 추출물의 농도에 따른 세포생존율 및 NO 생성 감소율 측정 결과를 도 5의 (A) 및 (B)에 각각 나타내었다. 도 5의 그래프를 살펴보면, 황칠나무 잎/가지 추출물의 세포 독성이 없음을 확인할 수 있으며, 황칠나무 잎/가지 추출물 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성 억제에 대한 측정 결과, control(MRS 배지)에서는 NO 생성 억제 효과가 없는 반면(not shown), 황칠나무 잎/가지 추출물에서 NO 생성이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 여기서, L-NAME는 NO 효소 활성 억제를 통한 NO 생성 억제제로 작용하는 시약으로 음성 대조군(negative control)로 사용한 것이다.

(2) 황칠나무 잎/가지 추출 발효물의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 세포생존율 및 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과를 도 6a 및 도 6b에 각각 나타내었다. 이때, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물은 K2020-20%, K1785-20%를 이용하여 실험한 것이다.

도 6a를 살펴보면, K2020-20%, K1785-20% 발효물 농도에 따른 세포 독성이 거의 없음을 확인할 수 있다.

그리고, 도 6b를 살펴보면, 황칠나무 잎/가지 추출물의 발효 전후 비교시 두 균주에 의한 발효물(Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020(K2020-20%), Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil1785(K1785-20%)에서 NO 생성 억제능이 증가함을 보였으며(황칠 잎/가지 추출물 : 22.42 μM at 100 ㎍/ml, 황칠 잎/가지 추출 발효물(K1785-20%) : 17.41 μM at 100 ㎍/ml).

그리고, control(MRS 배지)에서는 NO 생성 억제 효과가 없는 반면 K2020 및 K1785는 NO 생성이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.

(3) 황칠나무 수액 발효물의 함량에 따른 RAW264.7 대식세포주의 NO 생성에 대한 억제효과 측정 결과를 도 6c에 나타내었다. 이때, 황칠나무 수액 발효물은 K2020-1%, K1785-1%를 이용하여 실험한 것이다.

도 6c를 살펴보면, control (MRS 배지)에서는 NO 생성 억제 효과가 없는 반면(not shown), Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020(K2020-1%), Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil1785(K1785-1%)에서의 NO 생성이 농도 의존적으로 감소함을 보임을 확인할 수 있었다. 그리고, K2020-1% 보다 K1785-1%가 상대적으로 더 우수한 항염증 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(K2020-1% : 17.04 μM at 100 ㎍/ml, K1785-1% : 16.74 μM at 100 ㎍/ml).

실시예 5-3 : 항알러지 효과 분석

황칠나무 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(K2020-20%, K1785-20%), 황칠나무 수액 발효물의 항알러지 효과 분석을 위해 RBL-2H3 비만세포에 대한 세포 생존율 및 활성화된 비만세포로부터의 히스타민 방출에 대한 마커효소인 ?-헥소스아미니다아제(β-hexosaminidase) 효소 생성 억제 정도를 측정하였다.

항알러지 효과 측정은 랫 호염기구성 백혈병 세포주인 RBL-2H3 세포를 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였다. RBL-2H3 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 EMEM(ATCC, USA)배지에서 배양했다. 그리고, 상기 두 세포 모두 37, 5 부피% CO₂ 조건의 배양기에서 성장시켰다.

시료의 세포독성은 침투한 포르마잔(formazan) 염료를 MTT로 환원시키는 활성 미토콘드리아를 분석하는 MTT 분석을 수행하여 세포생존능을 확인하였다. RBL-2H3 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 4×10⁴ 세포로 분주하고 그 다음 날 37 조건에서 다양한 농도의 화합물을 처리하였다. 24시간 후, 각 웰에 MTT(5 mg/mL) 200 ㎕을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 200 ㎕의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 형성된 포르마잔을 용해시켰다. 플레이트를 실온에서 5분간 유지시키고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 측정하였다.

β-헥소사미니다아제(hexosaminidase) 방출 억제 효과는 RBL-2H3 세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 세포로 분주하고 항-DNP IgE(450 ng/mL)로 37℃에서 하룻밤 동안 자극시켰다. 그 후 세포를 시라가니안(Siraganian) 버퍼로 세척하고 인큐베이트 버퍼 160 ㎕을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 배양한 후, 추출물 20 ㎕를 10분 동안 세포에 처리하고 항원(DNP-BSA, 100 ㎍/mL) 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 세포가 과립을 형성하도록 자극하였다.

그 후, 얼음 수조에 10분 동안 담가 반응을 중단시켰다. 상층액 50 ㎕를 96-웰 플레이트로 옮기고 기질(1 mM p-nitrophenyl-Nacetyl-β-D-glucosaminide)이 녹아있는 0.1 M 시트르산염(citrate) 버퍼(pH 4.5) 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

그 후 정지액(0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃, pH 10.0) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시키고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 β-헥소사미니다아제(hexosaminidase) 방출 억제 효과를 측정하였다.

(1) 황칠나무 추출물에 대한 RBL-2H3 비만세포 생존율 및 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 그리고, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물의 RBL-2H3 비만세포 생존율 및 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과 측정 결과를 도 8a 및 도 8b에 각각 나타내었다.

(2) 도 7의 (A) 및 (B)를 살펴보면, RBL-2H3 비만세포주가 황칠나무 잎/가지 추출물 500 ㎍/ml 이상에서 세포독성을 나타내는 경향이 있었으며, 50 ㎕/ml 이하 농도 의존적으로 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

(3) 그리고, 도 8a의 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(K2020-20%, K1785-20%)의 RBL-2H3 비만세포주 세포 생존율 결과를 살펴보면, 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었으며, 도 8b를 살펴보면, 황칠나무 잎/가지 추출물 보다 이의 발효물들이 낮은 농도에서도 우수한 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다(잎/가지 추출물: 89.37% at 625 ㎍/ml(추정치), 잎/가지 추출 발효물 (Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020) : 54.47% at 100 ㎍/ml, 잎/가지 추출 발효물(Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil1785) : 44.43% at 100 ㎍/ml).

(4) 또한, 도 8c의 황칠나무 수액 발효물(K2020-1%, K1785-1%)의 RBL-2H3 비만세포주 세포 생존율 결과를 살펴보면, 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었으며, 도 8D를 살펴보면, 황칠나무 수액 발효물의 농도 의존적으로 β-헥소스아미니다아제 효소 생성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그리고, 저농도에서 K2020-1%가 K1785-1% 보다 높은 항알러지 효능을 나타냈으며(K2020-1%:71.73% 유출, 12.5 ㎍/ml, K1785-1%:99.12% 유출, 12.5 ㎍/ml), 그 이상을 농도에서는 비슷한 억제 효능을 나타내는 경향을 보였다.

실시예 5-4 : 항균 효과 분석

황칠나무 잎/가지 추출물, 황칠나무 잎/가지 추출 발효물(K2020-20%, K1785-20%), 황칠나무 수액 발효물(K2020-1%, K1785-1%) 각각에 대한 항균 효과를 측정하였다.

항균 효과에 사용된 균주는 하기 표 3과 같이 배양하였다. 그리고, 대장균(E. coli), 황색포도상구균(S. aureus), 녹농균(P. aeruginosa), 칸디다질염(C. albicans)에 대한 항균활성은 페이퍼 디스크 디퓨젼(paper disc diffusion) 방법을 사용하였다.

NB 또는 YM agar 배지에 균을 도말한 다음 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc)를 올리고 시료를 페이퍼 디스크(6 mm, GM Healthcare, UK)에 흡수시킨 후, 37 배양기(incubator)에서 24시간 배양한 다음, 디스크 주위의 생육 저해환(Clear zone) 생성 유무를 확인하였다.

분석 결과 사진을 도 9 내지 도 12에 각각 내었다(도 9 : Escherichia coli , 도 10 : Staphylococcus aureus , 도 11 : Pseudomonas aeruginosa , 도 12 : Candida albicans ).

또한, 도 9 내지 도 12 각각에서 (A)는 발효 전의 황칠나무 잎/가지 추출물 100% (B) 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 K2020-20%, (C)는 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 K1785-20%, (D)는 수액 발효물인 K2020-1%, (E)는 수액 발효물인 K1785-1%에 대한 측정 결과이다.

그리고, 도 9 내지 도 12 각각에서 (a)는 대조군(MRS 배지)이고, (b) ~ (c) 는 농도를 달리하여 적용한 것이고, (e)는 항생제(Antibiotics)를 적용한 후의 측정 결과이다.

(1) 하기 표 4는 대장균에 대한 항균 측정 결과로서, 생육 저해환(Clear zone) 크기를 잰 것이다.

구분	대조군 (a)	1mg (b)	2mg (c)	3mg (d)	항생제 (e)
황칠나무 잎/가지 추출물 100%(A)	-	-	-	-	3.2 ㎝
K2020-20%(B)	-	1.2 ㎝	1.7 ㎝	2.0 ㎝	3.2 ㎝
K1785-20%(C)	-	1.5 ㎝	1.7 ㎝	2.0 ㎝	3.2 ㎝
K2020-1%(D)	-	-	-	-	3.2 ㎝
K1785-1%(E)	-	-	-	-	3.4 ㎝

도 9 및 상기 표 4를 살펴보면, 대장균주에 대해 잎/가지 추출 발효물에서 농도 비례적으로 생육 저해환이 형성됨을 확인하였으며, 발효 전후 비교시 균주와 관계없이 발효 후 동량의 시료(3 mg)에서 항균성이 증가함을 확인하였다(발효 전 : 0.6 cm, 발효 후 K2020-20% : 2.0 cm, K1785-20% : 2.0 cm). 그러나, 황칠나무 수액 발효물은 항균성이 나타나지 않았다.

(2) 하기 표 5는 황색포도상구균에 대한 항균 측정 결과로서, 생육 저해환(Clear zone) 크기를 잰 것이다.

구분	대조군 (a)	50mg (b)	100mg (c)	150mg (d)	항생제 (e)
황칠나무 잎/가지 추출물 100%(A)	-	0.7 ㎝	0.8 ㎝	1 ㎝	3 ㎝
K2020-20%(B)	-	1.2 ㎝	1.3 ㎝	1.6 ㎝	2.8 ㎝
K1785-20%(C)	-	1.1 ㎝	1.3 ㎝	1.6 ㎝	2.7 ㎝
K2020-1%(D)	-	0.7 ㎝	0.8 ㎝	0.9 ㎝	2.7 ㎝
K1785-1%(E)	-	-	-	0.9 ㎝	2.8 ㎝

도 10 및 상기 표 5를 살펴보면, 황색포도상구균주에 대해 황칠나무 잎/가지 추출 발효물에서 농도 비례적으로 생육 저해환 형성됨을 확인하였으며, 발효 전후 비교시 두 발효 균주와 관계없이 발효 후 동량의 시료에서 항균성이 증가함을 확인하였다(발효 전 : 1 cm, 발효 후 K2020-20% : 1.6 cm, K1785-20% : 1.6 cm). 그러나, 황칠나무 수액 발효물은 K2020-1% 및 K1785-1% 경우 모두 100mg 이하 농도에서 항균력이 없었으며, 150mg 농도에서 0.8 cm의 생육 저해환이 형성되었다. 이를 통해서, 황칠나무 수액 발효물 보다 상대적으로 황칠나무 잎/가지 추출 발효물이 황색포도상구균에 대한 항균 효과가 다소 우수함을 확인할 수 있다.

(3) 하기 표 6은 녹농균에 대한 항균측정 결과로서, 생육 저해환(Clear zone) 크기를 잰 것이다.

구분	대조군 (a)	1mg (b)	2mg (c)	3mg (d)	항생제 (e)
황칠나무 잎/가지 추출물 100%(A)	-	-	-	-	-
K2020-20%(B)	-	0.8 ㎝	1.2 ㎝	1.6 ㎝	-
K1785-20%(C)	-	0.8 ㎝	1.3 ㎝	1.6 ㎝	-
K2020-1%(D)	-	-	-	0.8 ㎝	-
K1785-1%(E)	-	-	-	0.8 ㎝	-

도 11 및 상기 표 6을 살펴보면, 녹농균주에 대해 황칠나무 잎/가지 추출 발효물에서 농도 비례적으로 생육 저해환 형성됨을 확인하였으며, 발효 전후 비교시 두 발효 균주와 관계없이 발효 후 동량의 시료에서 항균성이 증가함을 확인하였다(발효 전 : 0 cm, 발효 후 K2020-20% : 1.6 cm, K1785-20% : 1.6 cm). 그러나, 황칠나무 수액 발효물은 K2020-1% 및 K1785-1% 경우 모두 2mg 이하 농도에서 항균력이 없었으며, 3mg 농도에서 0.8 cm의 생육 저해환이 형성되었다. 이를 통해서, 황칠나무 수액 발효물 보다 황칠나무 잎/가지 추출 발효물이 녹농균에 대한 항균 효과가 상대적 우수함을 확인할 수 있다.

(4) 칸디다질염에 대한 항균측정 결과인 도 12를 살펴보면, K2020-20%, K1785-20%, K2020-1% 및 K1785-1% 모두 칸디다질염에 대한 항균성이 없음을 확인할 수 있다.

실시예 6 : 피부유두세포에 대한 독성 측정

모발관련세포인 피부유두세포(HHDPC, human hair dermal pailla cell)는 모낭 하부에 위치한 세포로써 모낭의 발달 및 성장을 조절하는 세포이다. HHDPC는 에는 모세혈관이 분포하고 있어 이를 통해 모낭에 영양을 공급하고 성장인자(growth factor)와 저해인자(inhibition factor)를 분비하여 모낭 상피세포의 성장을 조절한다. 따라서, 인체 모발이 성장하기 위해서는 모낭 주위의 여러 인자들의 작용과 모낭 내에 있는 표피 세포와 모유두 세포의 상호작용이 매우 중요하다. 이러한, HHDPC는 여러 성장인자와 사이토킨(cytokine)을 생성하여 모발의 생성, 증식, 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

따라서, HHDPC에 대한 본 발명의 황칠나무 추출 발효물의 독성 측정하였다.

미녹시딜(Minoxidil)은 모낭의 기저에 위치한 중배엽 유래의 HHDPC의 아폽토시스(apoptosis)를 저해하여 HHDPC를 증식하고 모발성장을 촉진함이 알려져 있어 양성 대조군으로 비교 가능하여 대조군의 시료로 사용하였다.

(1) 세포 배양 및 광학현미경 측정 실험

HHDPC는 Innoprot사(Spain)로부터 분양 받아 사용하였다(도 13 참조, 도 13의 좌측 사진은 분양받은 HHDPC이고, 도 13의 우측 사진은 배양 된 T-75 플라스크임). 그리고, Poly-L-Lysine코팅을 한 T-75 플라스크에 배지(medium) 20 mL를 넣고 배양기(incubator, 37℃, 5 부피% CO₂)에 넣어 준비하였다. 이때, 배지(medium)은10% FBS(Fetal bovine serum, Welgene)와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신, 100x : welgene)를 첨가한 DMEM(Eagle's minimal essential medium) 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하였다.

그리고, 배양기에 미리 넣어 놓았던 T-75 플라스크를 클린벤치에 꺼내놓은 후, 37℃의 항 온조에서 셀 바이알(cell vial)을 녹였다.

그리고, 마이크로피펫을 이용하여 vial의 세포를 T-75 flask(medium 포함)에 넣고 퍼지도록 흔든 후, 5 부피% CO₂가 존재하는 37℃ 배양기(incubator)에서 16 시간 이상 배양시킨 후, 현미경으로 관찰하고 배지를 교체했으며, 2∼3회 계대 배양한 후 세포 실험에 사용하였다.

HHDPC를 이용한 황칠나무 잎/가지 추출액과 발효물의 세포생존율을 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였으며, HHDPC 를 24-웰 플레이트(well plate)에 1×10⁴ cells/well씩 분주하여 5 부피% CO₂ 배양기₍incubator)에서 24시간 동안 예비 배양한 후 시료를 농도별로 처리하여 48 시간 배양하였다(도 14 참조).

그리고, 배양된 세포의 광학 현미경 측정하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 이때, 광학현미경 측정은 ScopeTek사의 Scopephoto 프로그램으로 세포사진을 촬영하였다.

도 15의 좌측 사진은 세포 배양 0일차 측정 사진이고, 도 15의 우측사진은 세포배양 1일차 측정 사진이다. 포 배양 0 일차에 둥근 모양의 세포를 관찰되었고, 세포배양 1 일차에 세포의 돌기들이 돋아난 모양이 보이고 세포가 제대로 활성을 보임을 확인하였다. 이 실험결과로 실험에 사용한 배지는 실험에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

(2) HHDPC 세포 생존율 측정 실험

HHDPC과 미녹시딜(minoxidil)의 황칠나무 잎/가지 추출물에 의한 세포 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다.

이하, 세포 생존율 측정인 MTT assay 측정은 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

MTT assay 측정은 HHDPC를 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 세포 배양정도(confluency)가 80 ~ 85% 될 때까지 배양한 후, 세포가 적정 수준까지 자라면 세포를 분리하여, 24 웰 플레이트에 1×10⁴ cells/mL 되도록 세포를 접종한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 배양액을 흡인제거하고 항온조에서 37℃로 데워진 황칠나무 잎/줄기 발효물 및 대조군 배지를 500 ul씩 교환하였다. 다음으로, 일정시간 배양 후, 100 μL의 MTT 용액(5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하여 4 시간 동안 세포배양기에서 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 다음으로, 마이크로피펫을 이용하여 바이알(vial)의 세포를 배지(medium)을 넣은 T-75 플라스크에 넣고 퍼지도록 흔든 후, 배양기(37℃, 5 부피% CO₂)에 배양하였다.

다음으로, 배양액을 흡입하여 완전히 제거 후 각 웰에 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 DMSO 200 μL를 가하여 녹인 다음 96 웰 플레이트로 100 μL씩 옮겨 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 미녹시딜(Minoxidil)을 가한 HHDPC에서의 광학밀도 양성군(positive control)로 하였다(도 16 참조, 이때, 도 16의 좌측 사진은 MTT assay 측정사진이고, 도 16의 우측 사진은 포르마잔 결정이 생성된 후 찍은 사진임).

(2-1) 미녹시딜에 대한 HHDPC 세포 생존율 확인 및 범위 설정

1) 미녹시딜을 양성대조군(positive control)로 지정하기 위해 농도에 따른 세포 생존율을 확인하였고 그 결과를 도 17에 나타내었다. 측정 결과 미녹시딜의 양(1 mg/mL, 0.1 mg/mL)이 과량으로 들어갔을 때 세포독성이 높은 것으로 나타났으며, 미녹시딜의 양이 0.1 ug/mL 일 때 세포생존율이 126.3%로 가장 높게 나타났다. 따라서 미녹시딜이 HHDPC 세포 생존율(독성) 측정을 확인하는 양성대조군의 시료로서 적절함을 확인하였다.

2) 다음으로, HHDPC 세포 수에 따른 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이때, 대조군(control)은 미녹시딜 적용 안하고 배양시킨 것이다.

HHDPC 세포 수가 1×10² cell/mL일 때, 126.8%로 가장 높은 값이 나오지만 DMSO(blank = 0.44)와 광학밀도(optical density)값(0.88)의 차이가 크지 않아 신뢰도가 낮았다. HHDPC 세포 수가 1×10⁵ cell/mL일 때, HHDPC의 특성상 웰(well)에 부착하여 생장하기 때문에 웰당 세포의 수가 너무 많아 세포의 생장이 억제되어 세포 생존율이 미비하다고 사료된다. 따라서, 실험의 HHDPC 세포 수는 1×10⁴ cell/mL로 설정하였다.

3) 다음으로, 배양시간에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.

배양 시간이 2일 동안 배양시켰을 때 HHDPC 의 세포 생존율이 118.4%로 가장 높은 생존율이 나타났으며, 배양 시간이 2일 이상 배양시켰을 시 세포 생존율이 대조군(control, 미녹시딜 적용 안한 것)과 유사한 경향을 보였다. 이는 HHDPC의 특성상 웰(well)에 부착하여 생장하므로 일정시간이 지난 후 세포의 생장이 더 이상 이루어지지 않아 세포 생존율이 미비한 것으로 판단된다. 이후 실험의 배양시간은 48시간으로 설정하였다.

(2-2) 발효물 종류에 따른 HHDPC 세포 생존율 확인 및 범위 설정

1) 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 농도가 1 mg/mL일 때, 종류에 따른 HHDPC 세포 생존율을 측정하였고 그 결과를 도 20에 나타내었다.

이때, 시료 명명은 하기 표 7과 같다. 이때, 대조군은 황칠나무 추출물, 황칠나무 추출 발효물, 수액 발효물 및 미녹시딜 어느 것도 처리하지 않는 것이다.

구분	Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil 2020	Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil 1785	명명
A	-	-	대조군(Control, 0%)
B	-	-	황칠나무 추출물
C	-	-	황칠나무 추출물 + MRS medium
D	-	-	황칠나무 수액 + MRS medium
E	o	x	2020-황칠나무 추출 발효물(20%)
F	x	o	1785-황칠나무 추출 발효물(20%)
G	o	x	2020-황칠나무 수액 발효물(1%)
H	x	o	1785-황칠나무 수액 발효물(1%)
I	-	-	미녹시딜0.1 ug/mL

HHDPC 세포 생존율을 측정한 결과, 전체적으로 세포 생존율이 낮은 것으로 나타났는데, 이는 세포의 생장조건 중 하나인 pH의 변화에 의해 발효물 및 추출물의 낮은 산도가 원인이라고 사료된다. 따라서, 황칠나무 잎 및 수액 발효물의 농도를 스크리닝(screening) 하는 실험을 진행하였다.

2) 다음으로, 발효물 농도에 따른 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.

황칠나무 잎/가지 추물 발효물 및 수액 발효물의 세포 생존율 보다 황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물이 전반적으로 높은 세포 생존율을 나타냈으며, E[2020-황칠나무 추출 발효물(20%)], F[1785-황칠나무 추출 발효물(20%)], G[2020-황칠나무 수액 발효물(1%)], H[1785-황칠나무 수액 발효물(1%)] 총 4군에서 10 ug/mL일 때 높은 세포 생존율이 나타냈으며, E[2020-황칠나무 추출물(20%) 발효]일 때, 128.7%로 가장 높은 세포 생존율을 나타냈다.

3) 다음으로, 발효물 배양 시간에 따른 세포 생종율을 측정하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.

E[2020-황칠나무 추출 발효물(20%)], F[1785-황칠나무 추출 발효물(20%)], G[2020-황칠나무 수액 발효물(1%)], H[1785-황칠나무 수액 발효물(1%)] 총 4군을 10 ug/mL로 농도를 고정시키고 배양 시간에 따른 세포 생존율을 확인하였다.

G[2020-황칠나무 수액(1%) 발효], H[1785-황칠나무 수액(1%) 발효]인 수액 발효물에 비해 E[2020-황칠나무 추출물(20%) 발효], F[1785-황칠나무 추출물(20%) 발효]가 전반적으로 세포 생존율이 높게 나타났는데, 이는 액체상태의 추출물과 고체상태의 수액의 발효과정에서 육모성장에 필요한 유효성분이 생성됨을 시사한다.

황칠나무 잎/가지 추출 발효물 및 수액 발효물의 함량별과 배양 시간에 따른 HHDPC의 생존율의 관계를 종합한 결과 E[2020-황칠나무 추출 발효물(20%)], F[1785-황칠나무 추출 발효물(20%)]의 조건이 가장 적절한 조건임을 판단할 수 있었다.

(3) HHDPC 세포 독성 측정 실험

HHDPC에 미치는 황칠나무 추출 발효물, 수액 발효물의 독성을 가시적으로 알아보기 위하여 이중형광염색법을 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

HHDPC를 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 세포 배양정도(confluency)가 80 ~ 85% 될 때까지 배양한 후, 세포가 적정수준 까지 자라면 세포를 분리하여, 24 웰 플레이트(well plate)에 1?10⁴ cells/mL 되도록 세포를 접종한 후 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 배양액을 흡입제거하고 항온조에서 37℃로 맞추어진 황칠나무 잎·줄기 발효물 및 대조군 배지를 500 ul씩 교환 후, 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 48 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 배양액을 흡인하여 완전히 제거한 후, 각 웰을 멸균완충용액(DPBS)로 1회 세척한 후, 2 uM 칼세린-AM(Calcein-AM) 용액과 20 ug/mL 프로피디엄 아이오다이드(Propidium Iodide) 용액이 되도록 PBS(Phosphate Buffer Saline)에 녹여 첨가한 후, 배양기(37℃, 5부피% CO₂)에서 15분 간 배양하였다(도 23 참조). 다음으로, 칼세린-AM 은 490 nm에서, 프로피디엄 아이오다이드는 535 nm에서 여기(excitation)시켜서 형광 현미경으로 관찰하였고, 표 7의 A, E, F 및 I의 배양시간에 따른 측정 결과를 도 24 ~ 도 27에 나타내었다.

도 24 ~ 도 27을 살펴보면, 0 시간에 비해 48 시간일 때, 세포 수 및 모양에 확연한 차이가 관측되며, A(control)에 비해 48 시간 배양 후의 E[2020-황칠나무 추출 발효물(20%)], F[1785-황칠나무 추출 발효물(20%)], I(미녹시딜 0.1 ug/mL) 세포들이 시간이 지남에 따라 세포의 모양 및 개체수가 확연히 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 상기 MTT assay의 실험결과와 일치함을 확인할 수 있었다.

실시예 7 : 피부유두세포의 세포 이동력 측정

세포의 재생 및 이동변화를 확인하기 위하여 세포 이동력 확인 실험을 실시하였다.

HHDPC(Human hair dermal papilla cell)를 37℃, 5 부피% CO₂ 조건에서 세포 배양정도(confluency)가 90% 될 때까지 배양하였다. 다음으로, 200 μL 피펫팁(pipette tip, Fisher Scientific, USA)을 사용하여 세포배양접시 내에 형성된 단일 세포층을 3회 긁어낸 후, 배양액을 흡인제거하고 항온조에서 37℃로 맞추어진 황칠나무 잎/가지 발효물 및 대조군 배지를 500 ul씩 교환 후, 배양기(37℃, 5 부피% CO₂)에서 12 시간 동안 배양한 후, 광학현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다. 이때, 촬영한 이미지는 ScopeTek사의 Scopephoto 프로그램을 사용하여 um단위로 세포이동거리를 측정하였고, 그 측정 사진을 도 28 ~ 도 31에 나타내었으며, 측정 거리 데이터를 도 32에 나타내었다.

도 28 ~ 도 32을 살펴보면, 12 시간일 때, A(control)에 비하여 E[2020-황칠나무 추출 발효물(20%)], F[-황칠나무 추출 발효물(20%)] 및 I(미녹시딜 0.1 ug/mL)가 시간이 지남에 따라 세포가 이동하는 거리가 증가함을 확인할 수 있었다.

이를 통하여, 본 발명의 황칠나무 추출 발효물 및/또는 황칠나무 수액 발효물이 모발관련세포인 피부유두세포(HHDPC)를 활성화시킴을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 발효물이 육모 활성 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

제형예 　1. 헤어토닉

토닉의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 8 또는 표 9와 같이 제조하였다.

성분	함량( 단위:중량% )
황칠나무　잎(또는 수액) 추출 발효물 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 PEG 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2NA 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	3.0(또는 1.0) 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.1 미량 잔량
합계	100

성분	함량( 단위:중량% )
황칠나무　잎(또는 수액) 추출발효물 게니스틴 6-벤질아미노프린 POE(8몰)올레일 에테르 글리세린 L-멘톨 히노키티올 메틸파라벤 향료 95 부피% 에탄올 증류수	3.0(또는 1.0) 0.00001 0.05 1.5 3.0 0.1 0.3 0.1 0.3 50 잔량
합계	100

제형예 　2. 헤어에센스

에센스의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 10과 같이 제조하였다.

성분	함량( 단위:중량% )
황칠나무　잎(또는 수액) 추출 발효물 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	5.0(또는 1.0) 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100

제형예 　3. 헤어팩

팩의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 11과 같이 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
황칠나무　잎(또는 수액) 추출 발효물 폴리비닐알콜 셀룰로오스 검 글리세린 피이지1500 사이크로데스트린 DL - 판테놀 알란토인 글리시리진산모노암모늄 니코틴아미드 에탄올 피이지 40 경화피마자유 향, 색소, 방부제 증류수	3.0(또는 1.0) 15.0 0.15 3.0 2.0 0.15 0.4 0.1 0.3 0.5 6.0 0.3 미량 잔량
합계	100

제형예 　4. 헤어로션

로션의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 12와 같이 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
황칠나무　잎(또는 수액) 추출 발효물 다이진 6-벤질아미노프린 자당 미리스틴산 에스테르 POE(40)경화피마자유 프로필렌글리콜 구연산 L-멘톨 향료 95 부피% 에탄올 증류수	3.0(또는 1.0) 0.001 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1 0.005 50 잔량
합계	100

이상 본 발명의 실시예에서는 황칠나무 잎 추출물, 가지 추출물 및/또는 수액을 발효 시 Lactobacillus plantarum 균주를 사용하며, 발효 중에는 대사 산물로 젖산이 생성되므로 pH가 낮아짐을 확인하였다. 또한 발효 균주의 대사 작용이 배양 28 ~ 32 시간일 때 가장 활발할 것으로 사료되어 배양 시간을 28 ~ 32일로 설정하였으며, 황칠나무 잎 및/또는 가지 추출 발효물의 경우, 원액 또는 10배 희석하여 사용하였을 때 세포 생존율이 80% 미만이므로 육모제 원료로 사용 시 적절한 희석 배수가 요구된다는 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 수액 추출 발효물의 경우 고농도에서의 세포 생존율이 80% 이상이므로 육모제 원료로 사용하기에 안전하다고 판단된다.

또한, 황칠나무 추출 발효물의 함량이 증가함에 따라 세포 독성이 나타남을 알 수 있으므로 헤어 제품 원료로 사용 시 20 중량% 미만의 함량으로 사용하기를 권장된다. 황칠나무 수액 추출 발효물의 함량이 1 중량% 이상이 될 경우, 미백 효능은 우수하지만 멜라노마 세포에서의 세포 독성이 강해지는 것을 확인하였으므로 황칠나무 수액 추출 발효물을 육모제 원료로 사용 시 1 중량% 미만의 함량범위에서 사용되는 것이 권장된다.

결론적으로, 본 연구를 통하여 2종의 새로운 Lactobacillus plantarum 균주 K2020과 K1785를 이용하여 황칠나무 잎/가지 추출 발효물, 황칠나무 수액 발효물 제조를 위한 최적 공정을 확립하였으며, 발효액의 두피 개선, 육모 활성 관련 효능(항산화, 항염, 항균성, 항알러지)을 확인하였고, 황칠 발효액의 신규 적용분야 확대로 사업성 극대화가 가능할 것으로 판단된다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC92132P,KACC92131P 20160630

Claims (10)

1. 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출 발효물을 유효성분으로 함유하며,
   상기 황칠나무 추출 발효물은 황칠나무 가지 추출물의 발효물, 황칠나무 잎 추출물의 발효물 및 황칠나무 수액 발효물 중에서 선택된 1종 이상의 황칠나무 추출 발효물을 포함하되,
   상기 황칠나무 추출 발효물은 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균; 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균;으로 황칠나무 가지 추출물, 황칠나무 잎 추출물 및 황칠나무 수액 중에서 선택된 1종 이상을 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 하는 육모제 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 발효는 26시간 내지 60시간 발효시키는 것을 특징으로 하는 육모제 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 황칠나무 추출 발효물은 상기 육모제 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 내지 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 육모제 조성물.
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중에서 선택된 어느 한 항의 육모제 조성물을 함유하는 항염증 및 민감성 두피 개선 효과를 갖는 육모제.
6. 제5항에 있어서,
   상기 육모제는 헤어용 샴푸, 헤어용 린스, 헤어용 트리트먼트, 헤어용 팩, 헤어용 로션, 헤어용 왁스, 헤어용 미스트(mist), 헤어용 에센스, 헤어용 세럼, 및 헤어용 에센스로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 항염증 및 민감성 두피 개선 효과를 갖는 육모제.
7. a) 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 수액을 준비하는 단계;
   b) 상기 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 수액에 수탁번호 KACC92132P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangchil2020균 또는 수탁번호 KACC92131P로 표시되는 Lactobacillus plantarum ilchiwhangcil1785균을 처리하여 발효시켜 추출 발효물을 얻는 단계; 및
   c) 상기 추출 발효물을 필터에 여과시키는 단계;를 포함하며,
   a) 단계의 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 추출물 및 황칠나무 가지 추출물을 포함하거나, 또는 황칠나무 잎 및 황칠나무 가지의 혼합물을 추출하여 제조한 혼합 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 육모제용 황칠나무 추출 발효물의 제조방법.
8. 제7항에 있어서,
   a)단계의 황칠나무 잎 추출물은 황칠나무 잎 중량 대비 8 ~ 12배의 정제수를 넣고, 70℃ 내지 90℃ 온도 조건에서 2 내지 4 시간 동안 추출한 것이고,
   a)단계의 황칠나무 가지 추출물은 황칠나무 가지 중량 대비 8 ~ 12배의 정제수를 넣고, 70℃ 내지 90℃ 온도 조건에서 2 내지 4 시간 동안 추출한 것을 특징으로 하는 육모제용 황칠나무 추출 발효물의 제조방법.
9. 제7항에 있어서,
   a)단계의 혼합 추출물은 황칠나무 잎 및 황칠나무 가지의 혼합물의 중량 대비 8 ~ 12배의 정제수를 넣고, 70℃ 내지 90℃ 온도 조건에서 2 내지 4 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 육모제용 황칠나무 추출 발효물의 제조방법.
10. 제7항에 있어서,
    b)단계의 발효는 6×10⁸ 내지 8×10⁸ cfu/ml의 균수로 미생물을 접종하고, 35℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 26 내지 60 시간 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 육모제용 황칠나무 추출 발효물의 제조방법.

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